KR20240029769A - 융합단백질 및 이의 응용 - Google Patents
융합단백질 및 이의 응용 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20240029769A KR20240029769A KR1020247003118A KR20247003118A KR20240029769A KR 20240029769 A KR20240029769 A KR 20240029769A KR 1020247003118 A KR1020247003118 A KR 1020247003118A KR 20247003118 A KR20247003118 A KR 20247003118A KR 20240029769 A KR20240029769 A KR 20240029769A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- amino acid
- fusion protein
- region
- acid sequence
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 189
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 189
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 258
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 148
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 140
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 139
- 101000788682 Homo sapiens GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 claims abstract description 133
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 110
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 106
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 64
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 39
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 67
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 62
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 49
- 102200029613 rs35593767 Human genes 0.000 claims description 46
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 42
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 40
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 40
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 102220544910 N-terminal Xaa-Pro-Lys N-methyltransferase 1_Y19F_mutation Human genes 0.000 claims description 27
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 claims description 26
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 21
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 claims description 11
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 9
- 102220519058 Conserved oligomeric Golgi complex subunit 3_Y19L_mutation Human genes 0.000 claims description 8
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 8
- 102200067660 rs80359182 Human genes 0.000 claims description 7
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 claims 3
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 claims 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 56
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 40
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 40
- 108010005794 dulaglutide Proteins 0.000 description 35
- 229960005175 dulaglutide Drugs 0.000 description 31
- 108010086246 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Proteins 0.000 description 26
- 102000007446 Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Human genes 0.000 description 25
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 20
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 13
- 101001070498 Homo sapiens Golgin subfamily A member 6A Proteins 0.000 description 11
- 101000877314 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase EHMT1 Proteins 0.000 description 11
- 102000055817 human GOLGA6A Human genes 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 7
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 6
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 3
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 3
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 3
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 3
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 3
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 3
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102220091351 rs876657955 Human genes 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000016622 Dipeptidyl Peptidase 4 Human genes 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 2
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 2
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000010757 Reduction Activity Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000030136 gastric emptying Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 2
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000007410 oral glucose tolerance test Methods 0.000 description 2
- 230000000291 postprandial effect Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 229940013051 trulicity Drugs 0.000 description 2
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102100032882 Glucagon-like peptide 1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 102400000324 Glucagon-like peptide 1(7-37) Human genes 0.000 description 1
- 101800004266 Glucagon-like peptide 1(7-37) Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 101001015516 Homo sapiens Glucagon-like peptide 1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 102220359780 c.84C>G Human genes 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000056448 human GLP1R Human genes 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- MGXWVYUBJRZYPE-YUGYIWNOSA-N incretin Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 MGXWVYUBJRZYPE-YUGYIWNOSA-N 0.000 description 1
- 239000000859 incretin Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007257 malfunction Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 235000006286 nutrient intake Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000029054 response to nutrient Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- -1 tripeptides Proteins 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/53—Hinge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
본 출원은 융합단백질 및 이의 응용에 관한 것으로, 상기 융합단백질은 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체와 면역글로불린 Fc 영역을 포함하며; 여기서 SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 적어도 2개의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 적어도 2개의 아미노산 돌연변이는 W31, K26 및 Y19로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에 위치한다. 본 출원은 또한 상기 융합단백질이 질환 또는 병증을 치료함에 있어서의 응용을 제공한다.
Description
본 출원은 생물 의학 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 GLP-1 폴리펩티드 변이체와 면역글로불린 Fc 영역의 융합단백질 및 이의 응용에 관한 것이다.
글루카곤유사펩티드(glucagon-like peptide-1, GLP-1)는 소장 상피 L-세포에서 분비되는 인크레틴으로, 건강한 개체의 경우 GLP-1은 체내 영양소 섭취에 반응하여 인슐린 방출을 촉진하고 글루카곤 분비를 억제할 수 있다. II형 당뇨병을 앓고 있는 환자의 경우, 생리적 농도를 상회하는 용량의 GLP-1을 주입하면 내인성 인슐린 분비가 회복시키고, 혈당을 떨어뜨리게 된다.
디펩티딜 펩티데이즈 IV(DPPIV)의 효소 분해와 신장의 제거 작용으로 인해 천연 GLP-1의 혈장 반감기가 짧다. 반감기를 연장하기 위해 수식받은 여러 GLP-1R 작용제(예컨대, 둘라글루타이드(Dulaglutide))가 II형 당뇨병의 치료를 위해 개발되었지만, 최소한의 부작용을 유지하면서도 효과적인 장기 치료 방안을 개발해야 할 필요는 여전하다.
본 출원은 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합단백질을 제공한다. 상기 융합단백질은 우수한 약물동태학 성질을 가지며, 예를 들어, 바교적 긴 반감기(t1/2)가 길거나, 비교적 높은 노출량이다. 본 출원의 융합단백질은 쉽게 제거되지 못하고, 천연 GLP-1의 반감기를 현저히 증가시키며, 체내에서 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 기능을 촉진하고 약효를 향상시키며 사용량을 감소시킨다.
본 출원은 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 및 면역 글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합단백질을 제공하며; 여기서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 적어도 2개의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 적어도 2개의 아미노산 돌연변이는 W31, K26 및 Y19로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에 위치한다.
일부 실시양태에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 C단에 위치한다.
일부 실시양태에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG로부터 유래되는 Fc 영역이다.
일부 실시양태에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역이다.
일부 실시양태에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역이다.
일부 실시양태에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 SEQ ID NO: 32-35 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 아미노산 돌연변이를 포함하고, 아미노산 돌연변이가 없는 면역글로불린 Fc 영역과 비교하면, 상기 아미노산 돌연변이는 상기 면역글로불린 Fc 영역과 Fc 수용체의 결합 친화력을 선택적으로 향상시킨다.
일부 실시양태에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 EU에 따라 코딩된 M252, S254 및 T256 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 M252Y, S254T 및/또는 T256E로 이루어진 그룹의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 아미노산 돌연변이는 M252Y, S254T 및 T256E이다.
일부 실시양태에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 SEQ ID NO: 36에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 융합단백질은 힌지 영역을 포함하고, 상기 힌지 영역은 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체와 상기 면역글로불린 Fc 영역 사이에 위치한다.
일부 실시양태에서, 상기 힌지 영역은 IgG로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 상기 힌지 영역은 IgG1 또는 IgG4로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 상기 힌지 영역은 SEQ ID NO: 30-31 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 힌지 영역은 IgG1로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 상기 힌지 영역은 SEQ ID NO: 30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 융합단백질은 또한 링커를 포함하고, 상기 링커는 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체와 상기 힌지 영역 사이에 위치한다.
일부 실시양태에서, 상기 링커는 펩티드 링커이다.
일부 실시양태에서, 상기 링커는 5-20개 아미노산의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 상기 링커는 15개 아미노산의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 상기 링커는 SEQ ID NO: 27-29 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 링커는 SEQ ID NO: 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 인간 GLP-1의 적어도 일부 활성을 갖는다.
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, K26 및 Y19로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에서 적어도 2개의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31 및 K26 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31 및 Y19 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 K26 및 Y19 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, K26 및 Y19 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 상기 W31에서 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 W31Y, W31R, W31K 또는 W31A이다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 상기 W31에서 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 W31Y이다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 상기 Y19에서 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 Y19A, Y19L, Y19T, Y19F, Y19I, Y19V 및 Y19S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 임의의 하나의 아미노산 치환이다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 상기 Y19에서 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 Y19A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 임의의 하나의 아미노산 치환이다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 상기 K26에서 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 K26R이다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 26에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 4-25 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열에 포함된 아미노산 돌연변이는 W31Y, K26R 및 Y19A이다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 25에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열에 포함된 아미노산 돌연변이는 W31Y 및 K26R이다.
일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 4에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 융합단백질은 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 및 상기 면역글로불린 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 4 또는 25에 제시되는 아미노산 서열을 포함하고, 일부 실시양태에서, 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, 상기 Fc 영역은 EU에 의해 코딩된 아미노산 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 Fc 영역은 SEQ ID NO: 36에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 융합단백질은 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 및 상기 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 4 또는 25에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 힌지 영역은 IgG1로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 상기 힌지 영역은 SEQ ID NO: 30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 융합단백질은 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체, 상기 면역글로불린 Fc 영역 및 상기 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 4 또는 25에 제시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, 상기 힌지 영역은 IgG1로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 상기 Fc 영역은 EU에 의해 코딩된 아미노산 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 Fc 영역은 SEQ ID NO: 36에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 힌지 영역은 SEQ ID NO: 30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 융합단백질은 N단에서 C단으로 순차적으로 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체, 상기 링커, 상기 힌지 영역 및 상기 면역글로불린 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 융합단백질은 SEQ ID NO: 37-45 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 융합단백질은 SEQ ID NO: 43-44 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
다른 한편으로, 본 출원은 분리된 핵산 분자를 제공하는 것으로, 상기 핵산 분자는 상기 융합단백질을 코딩한다.
다른 한편으로, 본 출원은 벡터를 제공하는 것으로, 상기 벡터는 상기 분리된 핵산 분자를 포함한다.
다른 한편으로, 본 출원은 상기 융합단백질, 상기 분리된 핵산 분자 또는 상기 벡터를 포함하거나 발현하는 세포를 제공한다.
다른 한편으로, 본 출원은 약학 조성물을 제공하는 것으로, 상기 조성물은 상기 융합단백질, 상기 분리된 핵산 분자, 상기 벡터 및/또는 상기 세포 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
다른 한편으로, 본 출원은 면역접합체를 제공하는 것으로, 상기 면역접합체는 상기 융합단백질을 포함한다.
다른 한편으로, 본 출원은 상기 융합단백질, 상기 분리된 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 세포, 상기 약학 조성물 및/또는 상기 면역접합체가 약물의 제조에 있어서의 용도를 제공하는 것으로, 상기 약물은 대사성 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 상기 대사성 질환 또는 병증은 GLP-1 관련 대사성 병증을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 대사성 질환 또는 병증은 당뇨병을 포함한다.
다른 한편으로, 본 출원은 대사성 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하는 것으로 상기 방법은 수요가 있는 피시험자에게 상기 융합단백질, 상기 분리된 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 세포, 상기 약학 조성물 및/또는 상기 면역접합체를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 대사성 질환 또는 병증은 GLP-1 관련 대사성 병증을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 대사성 질환 또는 병증은 당뇨병을 포함한다.
다른 한편으로, 본 출원은 상기 융합단백질, 상기 분리된 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 세포, 상기 약학 조성물 및/또는 상기 면역접합체를 제공하는 것으로, 대사성 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 상기 대사성 질환 또는 병증은 GLP-1 관련 대사성 병증을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 대사성 질환 또는 병증은 당뇨병을 포함한다.
다른 한편으로, 본 출원은 수요가 있는 피시험자의 인슐린 발현을 증가 또는 촉진시키는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 상기 피시험자에게 유효량의 상기 융합단백질, 상기 분리된 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 세포 및/또는 상기 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
당업자는 이하 상세한 설명으로부터 본 출원의 기타 방면 및 우세를 용이하게 알아낼 수 있을 것이다. 이하 상세한 설명은 단지 본 출원의 예시적인 실시양태를 보여주고 서술하였을 뿐이다. 당업자가 알아낼 수 있는 바와 같이, 본 출원의 내용은 당업자로 하여금 본 출원이 관련된 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 개시된 특정 실시양태를 변경할 수 있도록 한다. 이와 상응하게, 본 출원의 도면 및 명세서 설명은 단지 예시적인 것일 뿐 제한적인 것이 아니다.
본 출원에 관련된 발명의 구체적인 특징은 첨부된 청구범위에 나타내는 바와 같다. 이하 상세하게 설명될 예시적인 실시양태 및 도면을 통해 본 출원과 관련된 발명의 특징 및 우세를 보다 잘 이해할 수 있다. 도면의 간단한 설명은 다음과 같다:
도 1은 링커가 서로 다른 본 출원에 기재된 융합단백질 GM-RY-L1H2-Fc4, GM-RY-L2H2-Fc4 및 GM-RY-L3H2-Fc4의 약물동태학 검출 결과를 도시하였다.
도 2는 링커가 서로 다른 본 출원에 기재된 융합단백질 GM-ARY-L2H2-Fc4 및 GM-ARY-L2H1-Fc4의 약물동태학 검출 결과를 도시하였다.
도 3은 Fc 영역이 YTE 돌연변이를 포함한 본 출원에 기재된 융합단백질 GM-RY-L2H1-Fc4m의 약물동태학 검출 결과를 도시하였다.
도 4는 Fc 영역이 YTE 돌연변이를 포함한 본 출원에 기재된 융합단백질 GM-ARY-L2H1-Fc4m 및 GM-RY-L2H1-Fc4m의 약물동태학 검출 결과를 도시하였다.
도 5는 힌지 영역이 다르고 YTE 돌연변이를 포함한 본 출원에 기재된 융합단백질 GM-ARY-L2H2-Fc4m, GM-RY-L2H2-Fc4m, GM-ARY-L2H1-Fc4m 및 GM-RY-L2H1-Fc4m의 약물동태학 검출 결과를 도시하였다.
도 6은 본 출원의 융합단백질에서 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열에 대한 넘버링 예시를 도시하였다.
도 7은 본 출원의 융합단백질은 둘라글루타이드와 동일한 수준의 GLP-1 수용체 활성화 능력이 있다는 검출 결과를 도시하였다.
도 8A는 K26R-W31Y, K26R-Q23T, K26R-Q23S, K26R-Q23N, K26R-Y19L, K26R-Y19T 및 K26R-Y19F 이중 돌연변이의 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 8B는 K26R-W31Y, K26R-Q23E, K26R-Y19I, K26R-Y19V, K26R-Y19A 및 K26R-Y19S 이중 돌연변이의 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 8C는 K26R-W31Y, K26R-Q23N, K26R-Q23S 및 K26R-Q23T 이중 돌연변이의 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 8D는 W31Y 및 Y19에 있는 아미노산 돌연변이의 이중 돌연변이의 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 8E는 W31Y-Y19A 및 W31Y-Q23E의 아미노산 이중 돌연변이의 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 8F는 GM-WY 및 GM-WYFL과 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 9A는 K26R-W31Y 이중 돌연변이 및 K26R-W31Y-Q23에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이의 융합단백질이 모두 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있음을 도시하였다.
도 9B 및 도 9C는 K26R-W31Y-Y19에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이의 융합단백질이 모두 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있음을 도시하였다.
도 9D 및 도 9F는 K26R-W31Y-Q23에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이의 융합단백질 및 K26R-W31Y-Y19에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이 융합단백질이 모두 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있음을 도시하였다. 도 9E는 K26R-W31Y-Q23에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이의 융합단백질이 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있음을 도시하였다.
도 10A는 본 출원의 융합단백질 GM-KRWY의 약물동태학 효과를 도시하였다.
도 10B는 본 출원의 융합단백질 GM-KRWYYL, GM-KRWYYA 및 GM-KRWYYI의 약물동태학 효과를 도시하였다.
도 10C는 본 출원의 융합단백질 GM-KRWYQN, GM-KRWYQE 및 GM-KRWYYA의 약물동태학 효과를 도시하였다.
도 11A 내지 도 11B는 본 출원의 융합단백질 GM-KRWY의 경구 당부하 시험에서의 혈당감소 활성을 도시하였다.
도 11C 내지 도 11D는 본 출원의 융합단백질 GM-KRWYYA 및 GM-KRWYQE의 경구 당부하 시험에서의 혈당감소 활성을 도시하였다.
도 1은 링커가 서로 다른 본 출원에 기재된 융합단백질 GM-RY-L1H2-Fc4, GM-RY-L2H2-Fc4 및 GM-RY-L3H2-Fc4의 약물동태학 검출 결과를 도시하였다.
도 2는 링커가 서로 다른 본 출원에 기재된 융합단백질 GM-ARY-L2H2-Fc4 및 GM-ARY-L2H1-Fc4의 약물동태학 검출 결과를 도시하였다.
도 3은 Fc 영역이 YTE 돌연변이를 포함한 본 출원에 기재된 융합단백질 GM-RY-L2H1-Fc4m의 약물동태학 검출 결과를 도시하였다.
도 4는 Fc 영역이 YTE 돌연변이를 포함한 본 출원에 기재된 융합단백질 GM-ARY-L2H1-Fc4m 및 GM-RY-L2H1-Fc4m의 약물동태학 검출 결과를 도시하였다.
도 5는 힌지 영역이 다르고 YTE 돌연변이를 포함한 본 출원에 기재된 융합단백질 GM-ARY-L2H2-Fc4m, GM-RY-L2H2-Fc4m, GM-ARY-L2H1-Fc4m 및 GM-RY-L2H1-Fc4m의 약물동태학 검출 결과를 도시하였다.
도 6은 본 출원의 융합단백질에서 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열에 대한 넘버링 예시를 도시하였다.
도 7은 본 출원의 융합단백질은 둘라글루타이드와 동일한 수준의 GLP-1 수용체 활성화 능력이 있다는 검출 결과를 도시하였다.
도 8A는 K26R-W31Y, K26R-Q23T, K26R-Q23S, K26R-Q23N, K26R-Y19L, K26R-Y19T 및 K26R-Y19F 이중 돌연변이의 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 8B는 K26R-W31Y, K26R-Q23E, K26R-Y19I, K26R-Y19V, K26R-Y19A 및 K26R-Y19S 이중 돌연변이의 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 8C는 K26R-W31Y, K26R-Q23N, K26R-Q23S 및 K26R-Q23T 이중 돌연변이의 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 8D는 W31Y 및 Y19에 있는 아미노산 돌연변이의 이중 돌연변이의 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 8E는 W31Y-Y19A 및 W31Y-Q23E의 아미노산 이중 돌연변이의 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 8F는 GM-WY 및 GM-WYFL과 GLP-1 수용체의 결합 활성을 도시하였다.
도 9A는 K26R-W31Y 이중 돌연변이 및 K26R-W31Y-Q23에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이의 융합단백질이 모두 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있음을 도시하였다.
도 9B 및 도 9C는 K26R-W31Y-Y19에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이의 융합단백질이 모두 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있음을 도시하였다.
도 9D 및 도 9F는 K26R-W31Y-Q23에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이의 융합단백질 및 K26R-W31Y-Y19에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이 융합단백질이 모두 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있음을 도시하였다. 도 9E는 K26R-W31Y-Q23에 있는 아미노산 돌연변이의 삼중 돌연변이의 융합단백질이 GLP-1 수용체를 활성화시킬 수 있음을 도시하였다.
도 10A는 본 출원의 융합단백질 GM-KRWY의 약물동태학 효과를 도시하였다.
도 10B는 본 출원의 융합단백질 GM-KRWYYL, GM-KRWYYA 및 GM-KRWYYI의 약물동태학 효과를 도시하였다.
도 10C는 본 출원의 융합단백질 GM-KRWYQN, GM-KRWYQE 및 GM-KRWYYA의 약물동태학 효과를 도시하였다.
도 11A 내지 도 11B는 본 출원의 융합단백질 GM-KRWY의 경구 당부하 시험에서의 혈당감소 활성을 도시하였다.
도 11C 내지 도 11D는 본 출원의 융합단백질 GM-KRWYYA 및 GM-KRWYQE의 경구 당부하 시험에서의 혈당감소 활성을 도시하였다.
본 출원 발명의 실시양태는 이하에서 특정된 구체적인 실시예로 설명하며, 당업자는 본 명세서에 개시된 내용으로부터 본 출원 발명의 기타 장점 및 효과를 용이하게 이해할 수 있다.
용어에 대한 정의
본 출원에서, 용어 "GLP-1"이란 통상적으로 글루카곤유사펩티드-1(glucagon like peptide 1)을 가리킨다. 천연 GLP-1 분자는 체내에서 가공을 거치면서 앞 6개 아미노산이 절단되므로, 당업계에서는 GLP-1의 아미노산 서열의 N단의 첫 번째 아미노산을 7번째 위치로 정하고, C단 마지막 아미노산을 37번째 위치로 정하는 것이 관례이다. 가공을 거친 펩티드는 체내에서 한층 더 수식을 받을 수 있고, C단의 글리신 잔기를 제거하고 아미드기로 대체한다. GLP-1은 통상적으로 두 가지 생물학적 활성 형태이며, 이는 각각 GLP-1(7-37)OH 및 GLP-1 (7-36)NH2이다. 본 출원에 기재된 "GLP-1"은 천연적, 인공합성 또는 수식된 GLP-1 단백질을 포함하며, 또한 온전한 GLP-1 단백질 또는 이의 기능성 프래그먼트 및 상이한 생물학적 활성 형태의 GLP-1 단백질을 포함한다. 예를 들어, 야생형 인간 GLP-1은 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이의 N 말단의 아미노산 잔기 H가 7번째 위치로 표시된다. 따라서, 본 출원의 용어 "K26"이란 통상적으로 GLP-1 단백질 N단 7번째 위치의 H부터 기산하여, 26번째 위치의 아미노산의 위치를 가리키며, SEQ ID NO: 1에 제시되는 아미노산 서열에서 26번째 위치의 아미노산은 K이고; 용어 "W31"이란 통상적으로 GLP-1 단백질 N단 7번째 위치의 H부터 기산하여, 31번째 위치의 아미노산의 위치를 가리키며, SEQ ID NO: 1에 제시되는 아미노산 서열에서 31번째 위치의 아미노산은 W이다. 본 출원에서, 아미노산 돌연변이 및/또는 치환을 설명할 때, GLP-1 폴리펩티드 변이체에 대한 아미노산 잔기의 넘버링에 대한 설명은 Fc 영역의 아미노산 잔기의 넘버링 설명과 구별되며, Fc 영역의 아미노산 잔기의 넘버링은 EU에 따라 코딩된다.
상기 인간 GLP-1은 개조될 수 있고, 개조된 후의 GLP-1의 변이체에는 개조 전의 인간 GLP-1의 적어도 일부 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 예시적인 야생형 인간 GLP-1의 개조된 후 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같을 수 있다.
본 출원에서, 용어 "인간 GLP-1의 적어도 일부 활성"이란 통상적으로 인간 GLP-1 단백질의 하나 이상의 활성을 가지거나, 또는 인간 GLP-1 단백질의 적어도 20%(예를 들어, 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 또는 그 이상)의 활성을 갖는 것을 가리킨다. 상기 "인간 GLP-1의 적어도 일부 활성"의 인간 GLP-1은 야생형일 수 있으며, 예컨대 SEQ ID NO: 1에 제시되는 아미노산 서열이다. 상기 "인간 GLP-1의 적어도 일부 활성" 중, 인간 GLP-1은 야생형 인간 GLP-1 개조된 후의 GLP-1 변이체일 수 있으며, 예컨대 SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열이다. 예를 들어, 본 출원의 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같은 인간 GLP-1의 적어도 일부 활성을 가질 수 있다. 일부 다른 상황에서, 본 출원의 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같은 인간 GLP-1의 적어도 일부 활성을 가질 수 있다.
상기 활성은 인간 GLP-1 단백질과 동일한 수준의 활성을 가져야 하는 것을 강요하지 않고, 인간 GLP-1 단백질의 활성보다 높거나 근사하거나 또는 낮을 수 있다. 일부 상황에서, "인간 GLP-1의 적어도 일부 활성"이란 GLP-1 수용체와 결합하는 활성, GLP-1 수용체를 활성화시키는 활성, 아데닐사이클라제 활성화시키는 활성, 세포내 고리형 아데노신 일인산(cAMP, Cyclic adenosine monophosphate) 수준 향상을 촉진시키는 활성, 세포내 Ca2+ 수준을 양성 조절하는 활성, 인슐린 분비를 자극시키는 활성, 간 글리코겐 저장량을 증가시키는 활성, 위 배출을 지연시키는 활성, 위 활력을 억제시키는 활성, 식욕을 저하시키는 활성, β세포 사멸을 억제시키는 활성, 식후 글루카곤 분비를 억제시키는 활성, 저혈당을 완화시키는 활성 및 체중을 감소시키는 활성으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 가리킬 수 있다. 예를 들어, GLP-1 수용체와의 결합 능력, cAMP의 발현 수준을 측정함으로써 이를 측정할 수 있다. 예를 들어, 이는 루시퍼라제 방법을 이용하여 cAMP/PKA 신호 경로의 활성화 수준을 검출함으로써 검출할 수 있다. 상기 "인간 GLP-1의 적어도 일부 활성"은 인간 GLP-1의 융합단백질(예를 들어, Fc 영역의 융합단백질)의 적어도 일부 활성을 포함한다.
본 출원에서, 용어 "폴리펩티드"란 통상적으로 아미드 결합(펩티드 결합이라고도 칭함)을 통해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성되는 분자를 가리킨다. 용어 "폴리펩티드"는 두 개 이상의 아미노산을 갖는 임의의 사슬일 수 있으며, 특정 길이의 생성물을 가리키지는 않는다. 본 출원에 기재된 폴리펩티드는 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 아미노산 사슬 또는 두 개 이상의 아미노산을 갖는 임의의 기타 사슬을 포함하며, 용어 "폴리펩티드"란 이러한 용어 중 임의의 하나를 대체 가능하거나 또는 서로 교환해서 사용할 수 있다. 용어 "폴리펩티드"란 또한 폴리펩티드가 발현한 후 수식된 생성물을 가리킬 수 있으며, 이는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아실화, 공지된 보호성/차단성 원자단에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 분열 또는 비천연적으로 존재하는 아미노산에 의한 수식을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 재조합 기술을 통해 생성될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "변이체"란 통상적으로 천연 생물학적 활성 단백질과 서열 상동성을 갖는 단백질 분자를 가리킨다. 본 출원에 기재된 폴리펩티드 변이체는 하나 이상의 아미노산 잔기에 대한 첨가(삽입 포함), 결실, 수식 및/또는 치환을 통해 바뀐 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하며, 이는 동시에 부모 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열)의 적어도 하나의 치료적 및/또는 생물학적 활성을 보유하면서 부모 서열과 상이하다. 예를 들어, 변이체는 부모 단백질과 적어도 0%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 변이체는 천연적 또는 비천연적으로 존재할 수 있다. 비천연적으로 존재하는 변이체는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 본 출원의 폴리펩티드 변이체는 보존적 또는 비보존적인 아미노산 치환, 삭제 또는 첨가를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "돌연변이"는 통상적으로 서열(핵산 또는 아미노산 서열)에 대한 임의 형태의 변경 또는 수식을 포함하며, 아미노산 또는 뉴클레오티드의 결실, 절단, 비활성화, 파괴, 치환 또는 전위를 포함한다. 본 출원에서, 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환일 수 있고, 용어 "치환"이란 통상적으로 상이한 "대체" 아미노산 잔기로 미리 결정된 부모 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 대체하는 것을 가리킨다. 상기 하나 이상의 대체된 아미노산 잔기는 "천연적으로 존재하는 아미노산 잔기"(즉 유전자 코드에 의해 코딩)일 수 있다.
용어 "아미노산 치환"이란 부모 서열에 존재하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 가리킨다. 부모 서열의 아미노산은 예를 들어, 화학적 펩티드 합성 또는 당업계에 공지된 재조합 방법을 통해 치환될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "Fc 영역"이란 통상적으로 파파인으로 온전한 항체를 소화시켜 생성될 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C단 영역으로부터 유래되는 도메인을 가리킨다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있으며, 여기서 "상기 아미노산 돌연변이가 없는 면역글로불린 Fc 영역"은 각각 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 Fc 서열에 대응하는 SEQ ID NO: 32-35 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 가리킨다. 본 출원에 기재된 면역글로불린의 Fc 영역은 통상적으로 2개의 불변 도메인(CH2 도메인 및 CH3 도메인)을 포함하며, 달리 설명되지 않는 한 힌지 영역을 포함하지 않으며, 선택적으로 CH4 도메인을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "YTE 돌연변이"는 IgG의 Fc 영역에 있는 일련의 돌연변이를 지칭한다. YTE 돌연변이는 인간 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 증가시킬 수 있으며, 상기 YTE 돌연변이를 포함하는 Fc 영역의 융합단백질의 혈청 반감기를 변화시킬 수 있다. YTE 돌연변이를 포함하는 Fc 영역은 Kabat의 EU 색인에 따라 넘버링된 M252Y, S254T 및 T256E의 세 가지 아미노산 돌연변이의 조합을 포함한다.
본 출원에서, 용어 "힌지 영역"은 통상적으로 이의 N단 또는 C단의 폴리펩티드 부분이 독립적으로 이동할 수 있도록 허용하는 15-30개 아미노산 길이 사이의 유연한 아미노산 서열을 지칭한다. 힌지 영역은 통상적으로 면역글로불린 중쇄의 CH1 및 CH2 기능 영역 사이의 영역로부터 유래된다. 힌지 영역은 통상적으로 IgG로부터 유래되며, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래될 수 있다. 본 출원의 힌지 영역은 IgG로부터 유래되는 천연 힌지 영역에 비해, 힌지 영역의 기능이 여전히 유지되는 한, N단 또는 C단에 하나 이상의 아미노산 잔기가 첨가되거나, 하나 이상의 아미노산 잔기가 삭제되거나, 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "면역글로불린"이란 통상적으로 대체로 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 가리킨다. 공지된 면역글로불린 유전자는 κ, λ, α(IgA1 및 IgA2), γ(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), δ, ε 및 μ 불변 영역 유전자, 및 수많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 일반적으로, 면역글로불린은 약 150,000돌턴의 이종사량체 당단백질일 수 있으며, 이는 두 개의 동일한 경쇄(L)와 두 개의 동일한 중쇄(H)로 구성된다. 전장 면역글로불린 "경쇄"(약 25KD 및 214개 아미노산)의 NH2 말단(약 110개 아미노산)은 가변 영역 유전자에 의해 코딩되고, COOH-말단은 κ 또는 λ 불변 영역 유전자에 의해 코딩된다. 천연 면역글로불린은 대체로 면역글로불린 힌지 영역을 통해 연결되는 두 개의 Fab 분자와 Fc 영역으로 구성된다.
본 출원에서, 용어 "링커"는 통상적으로 두 개의 이질성 폴리펩티드 또는 이의 프래그먼트를 연결하는 아미노산 서열을 지칭한다. 본 출원에서, 링커는 융합 폴리펩티드를 형성하기 위해 폴리펩티드를 공유 결합하는 아미노산 서열일 수 있다. 링커는 10-20개 아미노산의 길이을 가질 수 있다. 링커는 유연하거나 경직할 수 있다.
본 출원에서, 상기 "선택적으로 향상"은 통상적으로 특정 pH 범위, 특정 온도 범위, 특정 연결 방법, 특정 샘플 소스 또는 특정 반응 시간 등일 수 있는 특정 조건 하에서 향상되는 것을 지칭한다. 예를 들어, 특정 pH 범위 밖에서 Fc 영역이 Fc 수용체에 결합하는 능력을 크게 변화시키지는 않으면서, 상기 특정 범위 내에서 Fc 영역이 Fc 수용체에 결합하는 능력을 향상시키는 Fc 영역의 아미노산 돌연변이를 "선택적으로 향상"이라고 칭할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "융합단백질"이란 통상적으로 아미노산 서열이 직접 또는 간접적(예를 들어, 연결 펩티드와 같은 링커를 통해)으로 이질성 폴리펩티드(예를 들어, 이전 폴리펩티드 또는 이의 도메인과 무관한 폴리펩티드)의 아미노산 서열에 융합될 수 있는 폴리펩티드를 포함하거나 또는 이러한 폴리펩티드로 이루어진 보다 긴 폴리펩티드를 가리킨다.
본 출원에서, 용어 "면역접합체"란 통상적으로 폴리펩티드 또는 단백질이 관심 있는 활성 물질(예를 들어 단백질, 핵산, 약물 또는 표지 분자 등)이 직접 또는 간접적으로 연결(예를 들어, 링커를 통한 공유 연결)됨으로써 형성되는 접합체를 가리킨다.
본 출원에서, 용어 "핵산 분자"란 통상적으로 천연 환경으로부터 분리되거나 또는 인공합성되는 임의의 길이의 분리형식 뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이들의 유사체를 가리킨다.
본 출원에서, 용어 "벡터"란 통상적으로 적합한 숙주세포에서 자기 복제 가능한 핵산 분자를 가리키며, 이는 삽입된 핵산 분자를 숙주세포 내 및/또는 숙주세포 사이에 전이시킨다. 상기 벡터는 주로 DNA 또는 RNA를 세포에 삽입하기 위한 벡터, 주로 DNA 또는 RNA를 복제하기 위한 벡터, 및 주로 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역의 발현을 위한 벡터를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 또한 상술한 여러 가지 기능을 구비한 벡터를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 적합한 숙주세포에 도입될 때 전사되어 폴리펩티드로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 통상적으로, 상기 벡터를 포함하는 적합한 숙주세포를 배양함으로써, 상기 벡터는 원하는 발현 생성물을 생성할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "세포"란 통상적으로 본 출원에 기재된 핵산 분자를 포함할 수 있거나 이미 이를 포함하고 있는 플라스미드 또는 벡터, 또는 본 출원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 프래그먼트를 발현할 수 있는 개체 세포, 세포계 또는 세포 배양물을 가리킨다. 상기 숙주세포는 단일 숙주세포의 자손을 포함할 수 있다. 자연적, 우발적 또는 의도적 돌연변이로 인해 자손 세포와 원시 부모 세포는 형태 또는 유전체 면에서 완전히 일치하지는 않을 수 있으나, 본 출원에 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 프래그먼트를 발현할 수만 있으면 충분하다. 상기 숙주세포는 본 출원에 기재된 벡터를 사용하여 체외에서 세포를 형질전환시킴으로써 얻을 수 있다. 상기 숙주세포는 원핵 세포(예를 들어, 대장균)일 수 있고, 진핵 세포(예를 들어, 효모세포, 예를 들면 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, COS-1 세포, NS0 세포 또는 골수종 세포)일 수도 있다. 상기 재조합 숙주세포는 특정 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 포함한다.
본 출원에서, 용어 "대사성 질환 또는 병증"이란 통상적으로 체내의 정상적인 대사 과정을 방해하여 기체로 하여금 에너지를 정상적으로 사용 및/또는 저장할 수 없게 만드는 질환 또는 병증을 가리킨다. 상기 대사성 질환 또는 병증은 당질대사 장애인 질환, 지방 대사 장애인 질환 및/또는 세포 사립체 장애인 질환을 가리킬 수 있다. 상기 대사성 질환 또는 병증은 음식, 독소 또는 감염과 관련될 수도 있고, 유전성 질환일 수도 있다. 상기 대사성 질환 또는 병증은 대사 관련 효소의 결핍, 또는 대사 관련 효소의 기능 이상으로 인해 일으킨 질환 또는 병증을 포함할 수 있다. 본 출원에 기재된 대사성 질환 또는 병증은 당뇨병 및 기타 GLP-1 관련 대사성 병증으로부터 선택될 수 있다.
본 출원에서, "둘라글루타이드(dulaglutide)"란 통상적으로 GLP-1 유사체를 포함하는 이질성 융합단백질을 가리키며, 이는 GLP-1 유사체(아미노산 서열이 SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같음)와 인간 IgG4 유래 Fc 영역이 소분자 펩티드를 통해 공유 결합되어 형성된다. 둘라글루타이드의 상품명은 TRULICITY® 또는 트루리시티®라고 한다. 둘라글루티드는 SEQ ID NO: 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다(PCT 특허 WO2009009562 및 미국 특허 US7452966 참조).
본 출원에서, 용어 "포함"이란 통상적으로 명시된 특징을 포함하나 기타 요소를 배제하지 않다는 것을 가리킨다.
본 출원에서, 용어 "약"이란 통상적으로 지정된 수치 이상 또는 이하 0.5%-10%의 범위 내에서 변동되며, 예를 들어 지정 수치 이상 또는 이하 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5% 또는 10%의 범위 내에서 변동되는 것을 가리킨다.
발명에 대한 상세한 설명
GLP-1 폴리펩티드 변이체
일 측면에서, 본 출원은 인간 GLP-1의 적어도 일부 활성을 갖는 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체를 포함하는 융합단백질을 제공한다. 일부 상황에서, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 GLP-1 수용체와 결합하는 활성, GLP-1 수용체를 활성화시키는 활성, 아데닐사이클라제 활성화시키는 활성, 세포내 고리형 아데노신 일인산(cAMP) 수준 향상을 촉진시키는 활성, 세포내 Ca2+ 수준을 양성 조절하는 활성, 인슐린 분비를 자극시키는 활성, 간 글리코겐 저장량을 증가시키는 활성, 위 배출을 지연시키는 활성, 위 활력을 억제시키는 활성, 식욕을 저하시키는 활성, β세포 사멸을 억제시키는 활성, 식후 글루카곤 분비를 억제시키는 활성, 저혈당을 완화시키는 활성 및 체중을 감소시키는 활성으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, GLP-1 수용체와의 결합 능력, cAMP의 발현 수준을 측정함으로써 이를 측정할 수 있다. 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 활성은 인간 GLP-1 활성의 적어도 20%(예를 들어, 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 또는 그 이상)일 수 있다.
SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGG(SEQ ID NO: 2), 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 적어도 2개의 아미노산 돌연변이, 예를 들어 2개, 3개 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 2-4개(예를 들어 2-3개, 3개 또는 2개)의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 상기 적어도 2개의 아미노산 돌연변이는 K26, W31 및 Y19로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에 위치할 수 있다.
본 출원에서, 상기 아미노산 위치 "Xn"이란 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열 중 n번째 위치에 상응하는 잔기 X에서 발생하는 아미노산 치환을 가리키는 것으로, 여기서 n은 양의 정수(GLP-1의 경우, n은 7부터 기산)이고, X는 임의의 아미노산 잔기의 약자이다. 예를 들어, 아미노산 위치 "W31"이 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열의 31번째 위치에 상응하는 위치를 표시한다. SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열에 대하여, 아미노산 잔기 X와 위치 n의 대응 관계는 도 6에 도시된 바와 같다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, K26 및 Y19로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에서의 적어도 2개의 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31 및 K26 아미노산 위치에서의 2개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어 ，상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 2개의 아미노산 돌연변이를 가지며, W31 및 K26 아미노산 위치에 위치할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 4에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31 및 Y19 아미노산 위치에서의 2개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 2개의 아미노산 돌연변이를 가지며, W31 및 Y19 아미노산 위치에 위치할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 12-18 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 K26 및 Y19 아미노산 위치에서의 2개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 2개의 아미노산 돌연변이를 가지며, K26 및 Y19 아미노산 위치에 위치할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 5-11 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, K26 및 Y19 아미노산 위치에서의 3개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 3개의 아미노산 돌연변이를 가지며, W31, K26 및 Y19 아미노산 위치에 위치할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 19-25 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 돌연변이는 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체로 하여금 여전히 인간 GLP-1(예를 들어, 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1 또는 2 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 인간 GLP-1 단백질)의 적어도 일부 활성을 갖도록 한다. 상기 아미노산 돌연변이는 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 융합단백질로 하여금 여전히 인간 GLP-1(예를 들어, 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1 또는 2 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 인간 GLP-1 단백질)의 융합단백질의 적어도 일부 활성을 갖도록 한다. 상기 아미노산 돌연변이는 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체와 Fc 영역의 융합단백질로 하여금 여전히 인간 GLP-1(예를 들어, 아미노산 서열이 SEQ ID NO: 1 또는 2 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 인간 GLP-1 단백질)과 Fc 영역의 융합단백질의 적어도 일부 활성을 갖도록 한다.
본 출원에서, 상기 K26에는 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 상기 아미노산 치환은 K26R일 수 있다.
본 출원에서, 상기 W31에는 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 상기 아미노산 치환은 W31Y, W31A, W31R 또는 W31K일 수 있다. 본 출원에서, 상기 W31에는 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 상기 아미노산 치환은 W31Y, W31K 또는 W31R일 수 있다. 예를 들어, 상기 W31에는 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 상기 아미노산 치환은 W31Y일 수 있다.
본 출원에서, 상기 Y19에는 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 상기 아미노산 치환은 Y19A, Y19L, Y19T, Y19F, Y19I, Y19V 또는 Y19S일 수 있다. 예를 들어, 상기 Y19에는 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 상기 아미노산 치환은 Y19A일 수 있다.
본 출원에서, 아미노산 치환 "XnY"란 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열 중 n번째 위치에 상응하는 잔기 X가 아미노산 잔기 Y에 의해 치환되는 것을 가리키는 것으로, 여기서 n은 양의 정수(GLP-1의 경우, n은 7부터 기산)이고, X 및 Y는 각각 독립적으로 임의의 아미노산 잔기의 약자이며, X와 Y는 다르다. 예를 들어, 아미노산 치환 "W31Y"란 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열 중 31번째 위치에 상응하는 아미노산 잔기 W가 아미노산 잔기 Y에 의해 치환되는 것을 가리킨다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 적어도 2개의 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 상기 아미노산 치환은 1) K26R; 2) W31Y, W31R, W31K 및 W31A로부터 선택되는 임의의 하나; 및 3) Y19A, Y19L, Y19T, Y19F, Y19I, Y19V 및 Y19S로부터 선택되는 임의의 하나;로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 1) K26R; 2) W31Y, W31R, W31K 및 W31A로부터 선택되는 임의의 하나; 및 3) Y19A, Y19L, Y19T, Y19F, Y19I, Y19V 및 Y19S로부터 선택되는 임의의 하나;로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 2개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31 및 K26 아미노산 위치에서의 2개의 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 상기 K26에 있는 아미노산 치환은 K26R일 수 있고, 상기 W31에 있는 아미노산 치환은 W31Y, W31R, W31K 및 W31A일 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31Y 및 K26R의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 W31Y를 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 Y19A를 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 W31Y 및 Y19A를 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 W31Y 및 K26R을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 4 및 19-25 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열의 아미노산 치환은 W31Y 및 K26R일 수 있으며, 예를 들어 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 4에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R, 아미노산 치환 W31Y 및 Y19에 있는 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 19-25 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 아미노산 치환 K26R, 아미노산 치환 W31Y 및 아미노산 치환 Y19A를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 25에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 26에 제시되는 아미노산 서열 HGEGTFTSDVSSX19LEEQAAREFIAX31LVKGGG를 포함할 수 있으며, 여기서, X19=Y, A, L, T, F, I, V 또는 S이고, X31=W, A, R, K 또는 Y이다.
출원 번호가 PCT/CN2021/141606 및 PCT/CN2021/141608인 PCT 국제 특허 출원은 각각 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 및 이의 융합단백질에 관한 것이며, 이의 전체 내용을 참고로 본원에 전체적으로 포함된다.
Fc 영역
본 출원에서, 상기 융합단백질은 면역글로불린 Fc 영역을 포함한다. 본 출원에서, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4와 같은 IgG로부터 유래될 수 있다. 상기 IgG1의 Fc 영역은 SEQ ID NO: 32에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 IgG2의 Fc 영역은 SEQ ID NO: 33에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 IgG3의 Fc 영역은 SEQ ID NO: 34에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 IgG4의 Fc 영역은 SEQ ID NO: 35에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 아미노산 돌연변이가 없는 면역글로불린 Fc 영역(예를 들어, SEQ ID NO: 32-35 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열)과 비교하면, 상기 Fc 영역은 상기 면역글로불린 Fc 영역과 Fc 수용체의 결합 친화력을 선택적으로 향상시킬 수 있는 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역일 수 있고, M252, S254 및/또는 T256 위치에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다(예를 들어, 상기 아미노산 위치는 Kabat의 EU에 따라 코딩됨). 예를 들어, 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역일 수 있고, M252, S254 및 T256 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다(예를 들어, 아미노산 위치는 Kabat의 EU에 따라 코딩됨).
예를 들어, 상기 M252에 있는 아미노산 돌연변이는 M252Y일 수 있다. 예를 들어, 상기 S254T에 있는 아미노산 돌연변이는 S254T일 수 있다. 예를 들어, 상기 T256에 있는 아미노산 돌연변이는 T256E일 수 있다.
본 출원에서, 상기 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역일 수 있으며, 아미노산 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 Fc 영역은 IgG1로부터 유래되는 Fc 영역일 수 있으며, 아미노산 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 Fc 영역은 IgG2로부터 유래되는 Fc 영역일 수 있으며, 아미노산 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 Fc 영역은 IgG3로부터 유래되는 Fc 영역일 수 있으며, 아미노산 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 Fc 영역은 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역일 수 있으며, SEQ ID NO: 36에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
힌지 영역
본 출원에서, 상기 융합단백질은 힌지 영역을 포함할 수 있다. 본 출원에서, 상기 힌지 영역은 IgG로부터 유래될 수 있다.
본 출원에서, 상기 힌지 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래될 수 있다. 본 출원에서, 상기 힌지 영역은 IgG1로부터 유래될 수 있다. 본 출원에서, 상기 힌지 영역은 IgG4로부터 유래될 수 있다.
본 출원에서, 천연적으로 존재하는 IgG1 힌지 영역과 비교하면, 상기 융합단백질의 힌지 영역은, 사슬간 이황화 결합을 제거하기 위해 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 돌연변이는 당업계에 공지된 기술이다.
본 출원에서, 천연적으로 존재하는 IgG 힌지 영역과 비교하면, 상기 융합단백질의 힌지 영역은 N단에 하나 이상의 아미노산을 첨가할 수 있다. 본 출원에서, 천연적으로 존재하는 IgG 힌지 영역과 비교하면, 상기 융합단백질의 힌지 영역은 C단에 하나 이상의 아미노산을 첨가할 수 있다. 본 출원에서, 천연적으로 존재하는 IgG 힌지 영역과 비교하면, 상기 융합단백질의 힌지 영역은 N단에 하나 이상의 아미노산을 감소시킬 수 있다. 본 출원에서, 천연적으로 존재하는 IgG 힌지 영역과 비교하면, 상기 융합단백질의 힌지 영역은 C단에 하나 이상의 아미노산을 감소시킬 수 있다.
본 출원에서, 천연적으로 존재하는 IgG4 힌지 영역과 비교하면, 상기 융합단백질의 힌지 영역은 N단에 Ala와 같은 하나 이상의 아미노산을 첨가할 수 있다. 본 출원에서, 천연적으로 존재하는 IgG4 힌지 영역과 비교하면, 상기 융합단백질의 힌지 영역은, 원하지 않는 단백질 형성을 피하기 위해 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 돌연변이는 당업계에 공지된 기술이다.
본 출원에서, 상기 힌지 영역은 SEQ ID NO:30 또는 31에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
링커
본 출원에서, 상기 융합단백질은 링커를 포함할 수 있다. 상기 링커는 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체와 상기 면역글로불린 Fc 영역을 연결한다. 본 출원에서, 상기 링커는 펩티드 링커일 수 있다. 본 출원에서, 상기 펩티드 링커는 경직하거나 유연할 수 있다. 예시적인 링커는 SEQ ID NO: 27-29 또는 47-70 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 출원에서, 상기 링커는 12-15개 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 본 출원에서, 상기 링커는 15개 아미노산의 길이를 가질 수 있으며, 상기 나열된 아미노산의 길이가 15개 미만인 링커의 경우, Gly와 같은 아미노산을 첨가함으로써 이의 길이가 15개 아미노산에 달하도록 만들 수 있다.
예를 들어, 본 출원에 기재된 링커는 SEQ ID NO: 27-29 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
융합단백질
본 출원에서, 상기 융합단백질은 상기 인간 GLP 폴리펩티드 변이체, 상기 링커, 상기 힌지 영역 및 상기 면역글로불린 Fc 영역을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 융합단백질의 상기 인간 GLP 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 4 또는 25에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG로부터 유래되는 Fc 영역일 수 있다. 예를 들어, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 아미노산 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E를 포함하는 IgG의 Fc 영역일 수 있다.
본 출원에서, 상기 융합단백질의 인간 GLP 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 4 또는 25에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 힌지 영역은 IgG1 또는 IgG4로부터 유래되는 힌지 영역일 수 있으며, 상기 면역 글로불린 Fc 영역은 IgG로부터 유래되는 Fc 영역일 수 있다. 예를 들어, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 아미노산 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E를 포함하는 IgG의 Fc 영역일 수 있다.
본 출원에서, 상기 융합단백질의 상기 인간 GLP 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 4 또는 25에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 링커는 SEQ ID NO: 27-29 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 힌지 영역은 IgG1 또는 IgG4로부터 유래되는 힌지 영역일 수 있고, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG로부터 유래되는 Fc 영역일 수 있다. 예를 들어, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 아미노산 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E를 포함하는 IgG의 Fc 영역일 수 있다.
본 출원에서, 상기 융합단백질은 N단에서 C단으로 순차적으로 상기 인간 GLP 폴리펩티드 변이체, 상기 링커, 상기 힌지 영역 및 상기 면역글로불린 Fc 영역을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 융합단백질의 상기 인간 GLP 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 4에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 링커는 SEQ ID NO: 27-29 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 힌지 영역은 IgG1 또는 IgG4로부터 유래되는 힌지 영역일 수 있고, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역일 수 있다. 예를 들어, 상기 융합단백질은 SEQ ID NO: 37-39 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 융합단백질의 상기 인간 GLP 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 25에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 링커는 SEQ ID NO: 28에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 힌지 영역은 IgG1 또는 IgG4로부터 유래되는 힌지 영역일 수 있고, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역일 수 있으며, 선택적으로 아미노산 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 융합단백질은 SEQ ID NO: 40-42 및 44 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 융합단백질의 상기 인간 GLP 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 4에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 링커는 SEQ ID NO: 28에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 힌지 영역은 IgG1 또는 IgG4으로부터 유래되는 힌지 영역일 수 있고, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역일 수 있으며, 아미노산 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 융합단백질은 SEQ ID NO: 43 및 45 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 융합단백질의 상기 인간 GLP 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 4에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 링커는 SEQ ID NO: 28에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 힌지 영역은 IgG1로부터 유래되는 힌지 영역일 수 있고, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역일 수 있고, 아미노산 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 융합단백질은 SEQ ID NO: 43에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 융합단백질의 상기 인간 GLP 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 25에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 링커는 SEQ ID NO: 28에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 힌지 영역은 IgG1로부터 유래되는 힌지 영역일 수 있고, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역일 수 있고, 아미노산 돌연변이 M252Y, S254T 및 T256E를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 융합단백질은 SEQ ID NO: 44에 제시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
핵산 분자, 벡터, 세포 및 제조방법
다른 한편으로, 본 출원은 또한 본 출원에 기재된 융합단백질을 코딩할 수 있는 하나 이상의 분리된 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 상기 하나 이상의 핵산 분자 중 각각은 완전한 융합단백질을 코딩할 수 있거나 또는 이의 일부를 코딩할 수 있다.
본 출원에 기재된 핵산 분자는 분리 가능한 것이다. 예를 들어, 이하 방법을 통해 생성 또는 합성될 수 있다. (i) 체외에서의 증폭, 예를 들어 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 증폭하여 생성됨, (ii) 클로닝 재조합에 의한 생성, (iii) 예를 들어 효소 분해 및 겔 전기영동 분리에 의한 정제, 또는 (iv) 예를 들어 화학 합성에 의한 합성. 일부 실시양태에서, 상기 분리된 핵산은 재조합 DNA 기술을 통해 제조된 핵산 분자이다. 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, (1989) (Maniatis) 및 T. J. Silhavy, M. L. Bennan 및 L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) 및 by Ausubel, F. M. 등, Current Protocols in Molecular Biology, pub. Greene Publishing Assoc. and Wiley- Interscience(1987)에 기재된 기술들을 포함한다. 요컨대, 유전체 DNA 프래그먼트, cDNA 및 RNA로부터 상기 핵산을 제조할 수 있는 것으로, 모든 이러한 핵산은 세포로부터 직접 추출하거나 또는 여러 가지 증폭 방법(PCR 및 RT-PCR을 포함하나 이에 제한되지 않음)을 통해 재조합하여 생성할 수 있다.
다른 한편으로, 본 출원은 상기 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터를 제공한다. 예를 들어, 상기 벡터는 하나 이상의 상기 핵산 분자를 포함할 수 있다. 이외, 상기 벡터에는 또한 기타 유전자가 포함될 수 있으며, 예를 들어, 적당한 숙주세포 및 적당한 조건 하에서 해당 벡터의 표지 유전자를 선택하도록 허용한다. 이외, 상기 벡터는 또한 코딩 영역이 적당한 숙주에서 정확하게 발현되도록 허용하는 발현 제어 요소를 포함할 수 있다. 이러한 제어 요소는 당업자에게 공지된 것이며, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 인핸서 및 유전자 전사 또는 mRNA 번역을 조절하는 기타 제어 요소를 포함할 수 있다. 본 출원에 기재된 하나 이상의 핵산 분자는 상기 발현 제어 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
상기 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 파지 또는 유전 공학에서 통상적으로 사용되는 기타 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 발현 벡터이다.
다른 한편으로, 본 출원은 본 출원에 기재된 하나 이상의 핵산 분자 및/또는 본 출원에 기재된 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 각종 또는 각 숙주세포는 하나 이상의 본 출원에 기재된 핵산 분자 또는 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 각종 또는 각 숙주세포는 다수 개(예를 들어, 2개 이상) 또는 여러 가지(예를 들어, 2가지 이상)의 본 출원에 기재된 핵산 분자 또는 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 벡터를 상기 세포, 예를 들어 원핵 세포(예를 들어, 박테리아 세포), CHO 세포, NS0 세포, HEK293T 세포 또는 HEK293A 세포, 또는 식물 유래의 세포와 같은 기타 진핵 세포, 진균 세포 또는 효모 세포 등 내에 도입시킬 수 있다. 본 출원에 기재된 벡터는 전기천공법, 리포펙션 등과 같은 당업계에서 공지된 방법에 의해 상기 세포 내에 도입시킬 수 있다.
다른 한편으로, 본 출원은 본 출원에 기재된 융합단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 융합단백질로 하여금 발현하게 만드는 조건 하에서 본 출원에 기재된 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적절한 배지, 적절한 온도 및 배양 시간 등을 사용하는 것을 이루어질 수 있다.
일부 상황에서, 상기 방법은 또한 본 출원에 기재된 융합단백질을 수확(예를 들어, 분리 및/또는 정제)하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 G-아가로스 또는 단백질 A-아가로스를 택하여 친화성 크로마토그래피를 수행할 수 있고, 또한 겔 전기영동 및/또는 고성능 액체 크로마토그래피 등으로 본 출원에 기재된 융합단백질을 정제 및 분리시킬 수 있다.
약학 조성물 및 용도
다른 한편으로, 본 출원은 상기 융합단백질, 상기 핵산 분자, 상기 벡터 또는 상기 세포 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
예를 들어, 상기 약학적으로 허용 가능한 보조제는 완충제, 항산화제, 방부제, 저분자량 폴리펩티드, 단백질, 친수성 중합체, 아미노산, 당, 킬레이트제, 반대이온, 금속 복합물 및/또는 비이온성 계면활성제 등을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 약학 조성물은 경구 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 종양 부위에서의 제자리 투여, 흡입, 직장 투여, 질 투여, 경피 투여 또는 피하 저장고를 통한 투여를 위해 배합될 수 있다.
본 출원에 기재된 약학 조성물은 대사성 질환 또는 병증을 치료할 수 있다. 예를 들어, 상기 대사성 질환 또는 병증은 당뇨병 및 기타 GLP-1 관련 대사성 병증으로부터 선택될 수 있다.
상기 약학 조성물의 투여 빈도 및 투여량은 다수 개 관련 요소에 의해 결정될 수 있는 것으로, 상기 요소는 치료받을 질환의 유형, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중증도 및 활성 성분으로서의 약물 유형을 포함한다. 상기 약학 조성물은 체내 효능 및 농축 지속시간이 양호하므로, 상기 약물의 투여 빈도 및 투여량을 유의하게 줄일 수 있다.
다른 한편으로, 본 출원은 수요가 있는 피시험자의 인슐린 발현을 증가 또는 촉진시키는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은 상기 피시험자에게 유효량의 상기 융합단백질, 상기 분리된 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 세포 및/또는 상기 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
그 어떤한 이론에 의해서도 제한되지 않고, 하기 실시예는 단지 본 출원 발명의 다양한 기술적 방안을 제시하기 위한 것일 뿐, 본 출원 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예
실시예 1 융합단백질의 제조
인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체와 Fc의 융합단백질을 제조하는 것으로, N단에서 C단으로 순차적으로 GLP-1 폴리펩티드 변이체(아미노산 서열이 SEQ ID NO: 4-25 중 임의의 하나에 제시된 바와 같음), 연결 펩티드(아미노산 서열이 SEQ ID NO: 27-29 중 임의의 하나에 제시된 바와 같음), 힌지 영역(아미노산 서열이 SEQ ID NO: 30-31 중 임의의 하나에 제시된 바와 같음) 및 IgG로부터 유래되는 Fc 영역(아미노산 서열이 SEQ ID NO: 32-36 중 임의의 하나에 제시된 바와 같음)을 포함한다. 융합단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 세포에 주입하고, 발현시켜 정제하여 융합단백질을 얻는다. 예시적인 융합단백질의 전체 길이 서열 및 각 부분의 서열은 하기 표 1에 나타난 바와 같다.
| 융합단백질 | 연결 방법 | 전체 길이 서열(SEQ ID NO) | 인간 GLP 폴리펩티드 변이체(SEQ ID NO) | 링커(SEQ ID NO) | 힌지 영역(SEQ ID NO) | Fc 영역(SEQ ID NO) |
| GM-RY-L1H2-Fc4 | 이중 돌연변이 GLP-1(K26R W31Y) + 링커 L1 + 힌지 영역 H2 + IgG4의 Fc 영역 | 37 | 4 | 27 | 31 | 35 |
| GM-RY-L2H2-Fc4 | 이중 돌연변이 GLP-1(K26R W31Y) + 링커 L2 + 힌지 영역 H2 + IgG4의 Fc 영역 | 38 | 4 | 28 | 31 | 35 |
| GM-RY-L3H2-Fc4 | 이중 돌연변이 GLP-1(K26R W31Y) + 링커 L3 + 힌지 영역 H2 + IgG4의 Fc 영역 | 39 | 4 | 29 | 31 | 35 |
| GM-ARY-L2H2-Fc4 | 삼중 돌연변이 GLP-1(Y19A K26R W31Y) + 링커 L2 + 힌지 영역 H2 + IgG4의 Fc 영역 | 40 | 25 | 28 | 31 | 35 |
| GM-ARY-L2H1-Fc4 | 삼중 돌연변이 GLP-1(Y19A K26R W31Y) + 링커 L2 + 힌지 영역 H1 + IgG4의 Fc 영역 | 41 | 25 | 28 | 30 | 35 |
| DULA | 둘라글루타이드 | 3 | - | - | - | - |
| DULA-Fc4m | 둘라글루타이드(YTE 돌연변이된 IgG4 Fc 영역) | 46 | - | - | - | - |
| GM-RY-L2H1-Fc4m | 이중 돌연변이 GLP-1(K26R W31Y) + 링커 L2 + 힌지 영역 H1 + YTE 돌연변이된 IgG4의 Fc 영역 | 43 | 4 | 28 | 30 | 36 |
| GM-ARY-L2H1-Fc4m | 삼중 돌연변이 GLP-1(Y19A K26R W31Y) + 링커 L2 + 힌지 영역 H1 + YTE 돌연변이된 IgG4의 Fc 영역 | 44 | 25 | 28 | 30 | 36 |
| GM-RY-L2H2-Fc4m | 이중 돌연변이 GLP-1(K26R W31Y) + 링커 L2 + 힌지 영역 H2 + YTE 돌연변이된 IgG4의 Fc 영역 | 45 | 4 | 28 | 31 | 36 |
| GM-ARY-L2H2-Fc4m | 삼중 돌연변이 GLP-1(Y19A K26R W31Y) + 링커 L2 + 힌지 영역 H2 + YTE 돌연변이된 IgG4의 Fc 영역 | 42 | 25 | 28 | 31 | 36 |
실시예 2 다양한 링커를 사용한 융합단백질의 약물동태학 검출
본 출원의 융합단백질 GM-RY-L1H2-Fc4, GM-RY-L2H2-Fc4 및 GM-RY-L3H2-Fc4의 체내 약물동태학을 조사한다. 실험은 SPF 동물실에서 진행하고, 동물실 환경 온도는 23±2℃이고, 상대 습도는 40-70%이며, 12시간 동안 명암 교대한다. 실험동물은 자유롭게 음식을 섭취시키고, 실험 전 최소 3일 동안 적응시킨다. 체중이 180-220g인 SPF급 SD 래트를 무작위로 그룹을 나눈다. 각 그룹의 래트에 대응되는 시험용 샘플을 1mg/kg의 용량으로 피하 주사(SC)하였고, 대조군으로는 둘라글루타이드(DULA)를 사용한다. 투여 전, 투여 후 6h, 24h, 48h, 72h, 96h 및 120h에 경정맥으로부터 약 100ul의 혈액을 채취한다. 채취한 혈액을 원심분리 튜브에 넣고 실온에서 30-60분 동안 방치해 둔다. 그 다음, 4℃에서, 2시간 내에 4000rpm으로 10분 동안 원심분리하여, 신속하게 혈청을 분리한다. -80℃에서 보관한다. 샘플에 대해 ELISA 측정을 수행한다. DAS(3.2.8) 소프트웨어를 사용하여 약물동태학 파라미터를 계산한다.
결과는 도 1 및 표 2에 나타난 바와 같이, GM-RY-L1H2-Fc4, GM-RY-L2H2-Fc4 및 GM-RY-L3H2-Fc4의 체내 대사 특성은 대조군인 둘라글루타이드와 크게 다르지 않았으며, 여기서 L2 링커(SEQ ID NO: 28)를 사용한 GM-RY-L2H2-Fc4는 대조군과 비슷한 노출량으로 가장 좋은 반감기 갖는다.
| 파라미터 | AUC(0-t) ug/L*h |
t1/2 h |
Tmax h |
Cmax ug/L |
| DULA 1mg/kg SC | 43954.547 | 13.671 | 6 | 1579.77 |
| GM-RY-L1H2-Fc4 1mg/kg SC | 42673.641 | 16.199 | 6 | 1851.87 |
| GM-RY-L2H2-Fc4 1mg/kg SC | 41231.843 | 32.501 | 6 | 984.447 |
| GM-RY-L3H2-Fc4 1mg/kg SC | 31916.805 | 16.077 | 6 | 1402.199 |
실시예 3 서로 다른 힌지 영역을 사용한 융합단백질의 약물동태학 검출
본 출원의 융합단백질 GM-ARY-L2H2-Fc4 및 GM-ARY-L2H1-Fc4의 체내 약물동태학은 실시예 2의 방법에 따라 검출된다. 샘플에 대해 ELISA 측정을 수행한다. DAS(3.2.8) 소프트웨어를 사용하여 약물동태학 파라미터를 계산한다.
결과는 도 2 및 표 3에 나타난 바와 같이, GM-ARY-L2H2-Fc4 및 GM-ARY-L2H1-Fc4의 체내 반감기는 비슷했으며, 여기서 IgG1의 힌지 영역(SEQ ID NO: 30)을 사용한 GM-ARY-L2H1-Fc4의 노출량이 비교적 더 좋았다.
| 파라미터 | AUC(0-t) ug/L*h |
t1/2 h |
Tmax h |
Cmax ug/L |
| GM-ARY-L2H1-Fc4 1mg/kg SC | 72737.73 | 23.182 | 24 | 1294.342 |
| GM-ARY-L2H2-Fc4 1mg/kg SC | 49740.28 | 23.379 | 24 | 784.77 |
실시예 4 YTE 돌연변이된 융합단백질이 포함되는 Fc 영역을 사용한 약물동태학 검출
본 출원의 융합단백질 GM-RY-L2H1-Fc4m 및 GM-ARY-L2H1-Fc4m의 체내 약물동태학은 게잡이 원숭이를 사용하여 검출된다. 실험의 각 그룹은 두 마리의 게잡이 원숭이를 암컷과 수컷 각각 절반으로 구성되었으며, 각 그룹에 대응하는 시험용 샘플(1mg/kg)을 각각 피하 주사하고, DULA(IgG4의 Fc 영역에 YTE 돌연변이가 없는 둘라글루타이드) 및 DULA-Fc4m(IgG4의 Fc 영역에 YTE 돌연변이가 있는 둘라글루타이드)를 대조군으로 사용한다. 투여 전 및 투여 후 4h, 8h, 24h, 48h, 72h, 120h, 168h, 264h, 336h, 504h, 672h, 840h 및 1008h에 혈액 샘플을 채취한다. 시험용 샘플을 투여한 후 게잡이 원숭이의 혈청에서 시험용 샘플의 농도를 측정하기 위해 혈청을 분리하고 ELISA로 측정한다. DAS(3.2.8) 소프트웨어를 사용하여 약물동태학 파라미터를 계산한다.
결과는 도 3, 도 4, 표 4 및 표 5에 나타난 바와 같이, 여기서 표 4의 데이터는 도 3의 곡선에서 유래되고 표 5의 데이터는 도 4의 곡선에서 유래된다. YTE 돌연변이가 포함된 둘라글루타이드와 비교하면, 본 출원의 GM-RY-L2H1-Fc4m(도 3 및 도 4) 및 GM-ARY-L2H1-Fc4m(도 4)은, 체내 반감기와 노출량이 보다 더욱 좋은 반면, 둘라글루타이드 Fc 영역에서 일어난 YTE 돌연변이의 효과는 비교적 약하며, 돌연변이가 없는 둘라글루타이드와 비교하면, Fc 영역의 YTE 돌연변이는 둘라글루타이드의 체내 반감기와 노출량을 향상시키지 못하였다(도 4).
도 1의 데이터를 종합하면, Fc 영역에 YTE 돌연변이가 없는 본 출원의 융합단백질의 반감기 또는 노출량은 둘라글루타이드와 비슷하나, Fc 영역에서 YTE 돌연변이가 일어난 후의 본 출원의 융합단백질의 반감기 및 노출량은 모두 둘라글루타이드보다 훨씬 더 높았다. 이는 Fc 영역의 YTE 돌연변이가 본 출원의 융합단백질의 약물동태학 특성을 현저히 향상시키며, 융합단백질의 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 돌연변이와 Fc 영역의 YTE 돌연변이가 약물동태학 특성 향상에 시너지 효과가 있음을 설명한다.
| 파라미터 | AUC(0-t) ug/L*h |
t1/2 h |
Tmax h |
Cmax ug/L |
| DULA-Fc4m 1mg/kg SC | 172710.369 | 21.379 | 6 | 5287.753 |
| GM-RY-L2H1-Fc4m 1mg/kg SC | 334876.633 | 53.8925 | 24 | 4152.8175 |
| 파라미터 | AUC(0-t) ug/L*h |
t1/2 h |
Tmax h |
Cmax ug/L |
| DULA 1mg/kg SC | 167169.546 | 29.517 | 8 | 2688.837 |
| DULA-Fc4m 1mg/kg SC | 121353.801 | 28.9625 | 8 | 2956.3575 |
| GM-RY-L2H1-Fc4m 1mg/kg SC | 331986.252 | 82.9165 | 28 | 2867.4045 |
| GM-ARY-L2H1-Fc4m 1mg/kg SC | 379488.618 | 100.2185 | 8 | 3445.402 |
실시예 5 힌지 영역이 서로 다른 Fc 영역의 YTE 돌연변이를 사용한 융합단백질의 약물동태학 검출
본 출원의 Fc 영역의 YTE 돌연변이를 포함하는 융합단백질 GM-ARY-L2H2-Fc4m, GM-RY-L2H2-Fc4m, GM-ARY-L2H1-Fc4m 및 GM-RY-L2H1-Fc4m의 체내 약물동태학은 실시예 4의 방법에 따라 검출된다. 샘플에 대해 ELISA 측정을 수행한다. DAS(3.2.8) 소프트웨어를 사용하여 약물동태학 파라미터를 계산한다.
결과는 도 5 및 표 6에 나타난 바와 같이, 네 가지의 융합단백질의 체내 반감기 또는 노출량이 모두 더 좋으며, 여기서 IgG1의 힌지 영역(SEQ ID NO: 30)을 사용한 융합단백질이 더 좋은 종합 효과를 나타낸다.
| 파라미터 | AUC(0-t) ug/L*h |
t1/2 h |
Tmax h |
Cmax ug/L |
| GM-ARY-L2H1-Fc4m 1mg/kg SC | 407554.621 | 50.352 | 8 | 4716.7835 |
| GM-RY-L2H1-Fc4m 1mg/kg SC | 271584.914 | 60.5895 | 16 | 3338.2635 |
| GM-ARY-L2H2-Fc4m 1mg/kg SC | 182545.608 | 38.795 | 16 | 2575.6805 |
| GM-RY-L2H2-Fc4m 1mg/kg SC | 188560.362 | 87.966 | 8 | 2870.56 |
실시예 6. 루시페라제 방법으로 본 출원 융합단백질의 cAMP/PKA 신호 경로에 대한 활성화 작용 측정
GLP-1 폴리펩티드 변이체의 융합단백질이 GLP-1 수용체에 결합하여 아데닐사이클라제를 활성화시키고, 세포내 고리형 아데노신 일인산(cAMP) 수준을 향상시키는 원리를 이용하여, CREB(cAMP 반응요소 결합 단백질) 보고 유전자에 기반하여 본 출원 융합단백질의 cAMP/PKA 신호경로에 대한 활성화 작용을 측정한다. 인간 GLP-1R 플라스미드 및 CREB에 의해 구동된 루시퍼라제 보고 플라스미드를 이용하여 HER293 세포를 형질감염시킨다. 형질감염 후, HER293-GLP1R-CREB-D4 세포를 소화 및 수집하여, 계수하고, 10%FBS가 함유된 DMEM 배지를 이용하여 세포수를 4x105개 세포/ml로 조정하여, 각 웰당 50μl로 96웰 플레이트에 접종시킨다. 검사대상 샘플은 10%FBS를 함유한 DMEM 배지를 사용하여 1000ng/ml에서 시작하여 9개의 농도로 희석하고, 둘라글루카곤을 양성 대조군으로 사용한다. 상기 96웰 플레이트의 각 웰에 다시 일련 농도의 검사대상 샘플을 50μl씩 첨가하고 37℃에서 몇 시간 동안 인큐베이션한다. 상청액을 폐기하고, 각 웰에 루시페라제 기질을 첨가한다. 실온에서 5분 동안 방치한 후, 50μl를 취하여, 루시페라제 분석 시스템 Bio-GloTM Luciferase Assay System(Promega, G7940)을 사용하여 루시페라제의 활성을 측정하고, 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, SpectraMax M3)로 수치를 판독한다. 형광 강도는 cAMP의 수준을 보여주는데, 이로써 GLP-1 수용체 활성화 정도를 반영하게 된다.
결과는 도 7에 도시된 바와 같이, 본 출원의 융합단백질은 둘라글루타이드와 비슷한 수준의 GLP-1 수용체 활성화 능력이 있다.
실시예 7 다양한 돌연변이 형태를 갖는 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 검출
본 출원의 실시예에서 사용되는 양성 대조군 둘라글루티드(Dulaglutide)는 당업계에 코드 번호 LY-2189265로 알려진 당뇨병 약물로서, 본 출원에서 둘라글루티드는 GLP-1-Fc 또는 DULA 또는 KN042로 지칭된다.
인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 Fc 융합단백질을 제조하기 위해, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 Fc 융합단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 세포로 주입하여, 발현시켜 정제하여 융합단백질을 얻을 수 있다. 융합단백질은 N단에서 C단으로 순차적으로 GLP-1 폴리펩티드 변이체(아미노산 서열이 아래 표에 나타난 바와 같음), 연결 펩티드(G4S)3 및 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역과 힌지 영역을 포함한다. 예시적인 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 서열은 아래 표에 나타난 바와 같다.
| 융합단백질 | 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 | ||
| 명칭 | 아미노산 돌연변이 | SEQ ID NO | |
| GM-WY | GLP-1-WY | W31Y | 71 |
| GM-KRWY | GLP-1-KRWY | W31Y, K26R | 4 |
| GM-KRQN | GLP-1-KRQN | K26R, Q23N | 72 |
| GM-KRQT | GLP-1-KRQT | K26R, Q23T | 73 |
| GM-KRQS | GLP-1-KRQS | K26R, Q23S | 74 |
| GM-KRQE | GLP-1-KRQE | K26R, Q23E | 75 |
| GM-KRYL | GLP-1-KRYL | K26R, Y19L | 5 |
| GM-KRYT | GLP-1-KRYT | K26R, Y19T | 6 |
| GM-KRYF | GLP-1-KRYF | K26R, Y19F | 7 |
| GM-KRYI | GLP-1-KRYI | K26R, Y19I | 8 |
| GM-KRYV | GLP-1-KRYV | K26R, Y19V | 9 |
| GM-KRYS | GLP-1-KRYS | K26R, Y19S | 10 |
| GM-KRYA | GLP-1-KRYA | K26R, Y19A | 11 |
| GM-WYQN | GLP-1-WYQN | W31Y, Q23N | 76 |
| GM-WYQS | GLP-1-WYQS | W31Y, Q23S | 77 |
| GM-WYQT | GLP-1-WYQT | W31Y, Q23T | 78 |
| GM-WYQE | GLP-1-WYQE | W31Y, Q23E | 79 |
| GM-WYYL | GLP-1-WYYL | W31Y, Y19L | 12 |
| GM-WYYT | GLP-1-WYYT | W31Y, Y19T | 13 |
| GM-WYYF | GLP-1-WYYF | W31Y, Y19F | 14 |
| GM-WYYI | GLP-1-WYYI | W31Y, Y19I | 15 |
| GM-WYYV | GLP-1-WYYV | W31Y, Y19V | 16 |
| GM-WYYS | GLP-1-WYYS | W31Y, Y19S | 17 |
| GM-WYYA | GLP-1-WYYA | W31Y, Y19A | 18 |
| GM-WYFL | GLP-1-WYFL | W31Y, F28L | 80 |
| GM-KRWYQN | GLP-1-KRWYQN | W31Y, K26R, Q23N | 81 |
| GM-KRWYQT | GLP-1-KRWYQT | W31Y, K26R, Q23T | 82 |
| GM-KRWYQS | GLP-1-KRWYQS | W31Y, K26R, Q23S | 83 |
| GM-KRWYQE | GLP-1-KRWYQE | W31Y, K26R, Q23E | 84 |
| GM-KRWYYL | GLP-1-KRWYYL | W31Y, K26R, Y19L | 20 |
| GM-KRWYYT | GLP-1-KRWYYT | W31Y, K26R, Y19T | 21 |
| GM-KRWYYI | GLP-1-KRWYYI | W31Y, K26R, Y19I | 22 |
| GM-KRWYYS | GLP-1-KRWYYS | W31Y, K26R, Y19S | 24 |
| GM-KRWYYA | GLP-1-KRWYYA | W31Y, K26R, Y19A | 25 |
(1) 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 친화력 검출
ELISA를 사용하여 실시예 1의 융합단백질과 GLP-1 수용체의 결합 친화력을 측정한다. GLP-1 수용체와 마우스 Fc를 발현하는 융합단백질을 GLP1R-muFc(SEQ ID NO: 3)라고 칭하고, GLP1R-muFc를 5μg/ml로 희석시켜, 96웰 플레이트에 플레이팅시키고, 실온에서 30분 동안 고정시킨다. PBS로 1회 세척 후 1% BSA로 37℃에서 30분 동안 밀폐하고, 0.05% PBST20으로 3회 세척한다. 각 웰에 50μl, 10μg/ml의 4배 농도 구배로 희석한 검사대상 샘플을 첨가하고, KN042를 양성 대조군으로 한다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBST로 5회 세척한다. 각 웰에 50μl의 1%BSA가 함유된 0.05% PBST20으로 2000배 희석된 마우스 단클론 HP6023 항 인간 IgG4Fc-HRP(abcam, ab99817)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBST로 5회 세척한다. 각 웰에 50μl TMB를 첨가하여 3분 동안 발색하고, 50μl/웰 1M H2SO4를 첨가하여 반응을 종료하고, 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, SpectraMax M3)를 사용하여 OD값을 측정한다. KN042를 양성 대조군으로 한다.
결과는 도 8에 도시된 바와 같다. 이중 돌연변이를 포함하는 융합단백질의 일부는 GLP-1 수용체에 대해 우수한 결합 활성을 나타낸다.
(2) cAMP/PKA 신호 경로에 대한 융합단백질의 활성화 작용에 대한 루시퍼라제 방법에 의한 검출
본 출원의 실시예 6에서 cAMP/PKA 신호 경로에 대한 융합단백질의 활성화 작용을 검출하는 루시퍼라제 방법을 참조하고, 그 결과는 도 9에 도시된 바와 같다.
결과는 본 출원에 의해 청구된 융합단백질은 모두 GLP-1 수용체를 활성화함으로써 cAMP/PKA 신호 경로를 활성화할 수 있음을 나타낸다.
(3) 융합단백질의 약물동태학 검출
본 출원 실시예 2에서 융합단백질의 약물동태학 검출 방법을 참조하여, 그 결과는 도 10에 나타난 바와 같다. 도 10A는 본 출원의 융합단백질 GM-KRWY의 반감기가 16.199h인 것으로 둘라글루타이드보다 길고, 또한 약물 노출량은 둘라글루타이드보다 높으며, 혈장 농도가 비스함을 도시하였다. 도 10B는 본 출원의 융합단백질 GM-KRWYYL, GM-KRWYYA 및 GM-KRWYYI의 반감기가 약 13h 내지 16.5h인 것으로 둘라글루타이드보다 길고, 또한 약물 노출량 및 혈장 농도가 둘라글루타이드보다 높음을 도시하였다. 도 10C는 본 출원의 융합단백질 GM-KRWYQN, GM-KRWYQE 및 GM-KRWYYA의 반감기가 약 22h 내지 25h인 것으로 둘라글루타이드보다 길고, 또한 약물 노출량 및 혈장 농도가 둘라글루타이드보다 높음을 도시하였다.
(4) 융합단백질에 대한 경구 당부하 검출
GLP-1-Fc 융합단백질의 체내 혈당감소 활성을 고찰한다. 마우스를 하룻밤 동안 금식시키고, 실험 전 혈당과 체중을 측정한 후 무작위로 그룹을 나눈다. 각 그룹의 마우스에 대응되는 시험용 샘플을 복강내 주사하고, 둘라글루타이드를 대조군으로 사용한다. 투여 후 0.5h, 각 마우스에 1.5g/kg의 포도당을 경구 투여한다. 포도당 부하 전, 부하 후 10분, 20분, 30분, 60분 및 120분에 마우스의 꼬리 끝 혈당 수치를 휴대용 로슈 혈당 측정기(Roche, Accu-chek)로 측정한다. 마우스 꼬리 끝을 약 1mm 절제하여, 꼬리 뿌리부터 꼬리 끝으로 향하여 정맥을 가압하면서 혈액을 채취하여 혈당 수치를 측정한다. 결과는 도 11에 도시된 바와 같다.
결과는 대조군과 비교하면, 본 출원의 융합단백질 GM-KRWY, GM-KRWYYA 및 GM-KRWYQE는 동일한 수준의 체내 혈당감소 활성을 갖음을 나타낸다.
전술한 상세한 설명은 설명 및 예시의 방식으로 제공되며, 첨부된 청구범위의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 본 출원에 열거된 실시양태에 대한 다양한 변화는 당업자에게 자명할 것이며 첨부된 청구범위 및 이의 동등한 방식의 범위 내 보유된다.
Claims (60)
- 융합단백질, 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하며;
여기서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 적어도 2개 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 적어도 2개의 아미노산 돌연변이는 W31, K26 및 Y19로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 위치에 위치하는, 융합단백질. - 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 C단에 위치하는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG로부터 유래되는 Fc 영역인, 융합단백질.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역인, 융합단백질.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4로부터 유래되는 Fc 영역인, 융합단백질.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 SEQ ID NO: 32-35 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 아미노산 돌연변이가 없는 면역글로불린 Fc 영역과 비교하면, 상기 아미노산 돌연변이는 상기 면역글로불린 Fc 영역과 Fc 수용체의 결합 친화력을 선택적으로 향상시키는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 EU에 따라 코딩된 M252, S254 및 T256 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는, 융합단백질.
- 제8항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 M252Y, S254T 및/또는 T256E로 이루어진 그룹의 아미노산 돌연변이를 포함하는, 융합단백질.
- 제9항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 아미노산 돌연변이는 M252Y, S254T 및 T256E인, 융합단백질.
- 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 SEQ ID NO: 36에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 영역을 포함하며, 상기 힌지 영역은 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체와 상기 면역글로불린 Fc 영역 사이에 위치하는, 융합단백질.
- 제12항에 있어서, 상기 힌지 영역은 IgG로부터 유래되는, 융합단백질.
- 제12항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 IgG1 또는 IgG4로부터 유래되는, 융합단백질.
- 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 SEQ ID NO: 30-31 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 융합단백질.
- 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 힌지 영역은 IgG1로부터 유래되는, 융합단백질.
- 제16항에 있어서, 상기 힌지 영역은 SEQ ID NO: 30에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 이는 또한 링커를 포함하며, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체와 상기 힌지 영역 사이에 위치하는, 융합단백질.
- 제18항에 있어서, 상기 링커는 펩티드 링커인, 융합단백질.
- 제18항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 5-20개 아미노산의 길이를 갖는, 융합단백질.
- 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 15개 아미노산의 길이를 갖는, 융합단백질.
- 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 SEQ ID NO: 27-29 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 융합단백질.
- 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 SEQ ID NO: 28에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 인간 GLP-1의 적어도 일부 활성을 갖는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31 및 K26 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함하는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31 및 Y19 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함하는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 K26 및 Y19 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함하는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열은 W31, K26 및 Y19 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함하는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 상기 W31에서 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 W31Y, W31R, W31K 또는 W31A인, 융합단백질.
- 제29항에 있어서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 상기 W31에서 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 W31Y인, 융합단백질.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 상기 Y19에서 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 Y19A, Y19L, Y19T, Y19F, Y19I, Y19V 및 Y19S로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 임의의 하나의 아미노산 치환인, 융합단백질.
- 제31항에 있어서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 상기 Y19에서 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 Y19A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 임의의 하나의 아미노산 치환인, 융합단백질.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 상기 K26에서 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 K26R인, 융합단백질.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 26에 제시되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 4-25 중 임의의 하나에 제시되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열에 포함된 아미노산 돌연변이는 W31Y, K26R 및 Y19A인, 융합단백질.
- 제36항에 있어서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO: 25에 제시되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 2에 제시되는 아미노산 서열과 비교하면, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체의 아미노산 서열에 포함된 아미노산 돌연변이는 W31Y 및 K26R인, 융합단백질.
- 제38항에 있어서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체는 SEQ ID NO:4에 제시되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 및 상기 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는, 융합단백질.
- 제12항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체 및 상기 힌지 영역을 포함하는, 융합단백질.
- 제12항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체, 상기 면역글로불린 Fc 영역 및 상기 힌지 영역을 포함하는, 융합단백질.
- 제18항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 이는 N단에서 C단으로 순차적으로 상기 인간 GLP-1 폴리펩티드 변이체, 상기 링커, 상기 힌지 영역 및 상기 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 37-45 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 43-44 중 임의의 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 융합단백질.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질을 코딩하는, 분리된 핵산 분자.
- 제46항에 따른 분리된 핵산 분자를 포함하는, 벡터.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질, 제46항에 따른 분리된 핵산 분자, 또는 제47항에 따른 벡터를 포함하거나 발현하는, 세포.
- 제1항 내지 제45항에 따른 융합단백질, 제46항에 따른 분리된 핵산 분자, 제47항에 따른 벡터 및/또는 제48항에 따른 세포 및 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학 조성물.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질을 포함하는, 면역접합체.
- 대사성 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서, 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질, 제46항에 따른 분리된 핵산 분자, 제47항에 따른 벡터, 제48항에 따른 세포, 제49항에 따른 약학 조성물 및/또는 제50항에 따른 면역접합체의 용도.
- 제51항에 있어서, 상기 대사성 질환 또는 병증은 GLP-1 관련 대사성 병증을 포함하는, 용도.
- 제51항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대사성 질환 또는 병증은 당뇨병을 포함하는, 용도.
- 수요가 있는 피시험자에게 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질, 제46항에 따른 분리된 핵산 분자, 제47항에 따른 벡터, 제48항에 따른 세포, 제49항에 따른 약학 조성물 및/또는 제50항에 따른 면역접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 대사 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하는, 방법.
- 제54항에 있어서, 상기 대사성 질환 또는 병증은 GLP-1 관련 대사성 병증을 포함하는, 방법.
- 제54항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대사성 질환 또는 병증은 당뇨병을 포함하는, 방법.
- 대사성 질환 또는 병증을 예방 및/또는 치료하는 데 사용되는 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질, 제46항에 따른 분리된 핵산 분자, 제47항에 따른 벡터, 제48항에 따른 세포, 제49항에 따른 약학 조성물 및/또는 제50항에 따른 면역접합체.
- 제57항에 있어서, 상기 대사성 질환 또는 병증은 GLP-1 관련 대사 병증을 포함하는, 융합단백질, 분리된 핵산 분자, 벡터, 세포 및/또는 약학 조성물.
- 제57항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대사성 질환 또는 병증은 당뇨병을 포함하는, 융합단백질, 분리된 핵산 분자, 벡터, 세포 및/또는 약학 조성물.
- 수요가 있는 피시험자에게 유효량의 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질, 제46항에 따른 분리된 핵산 분자, 제47항에 따른 벡터, 제48항에 따른 세포, 제49항에 따른 약학 조성물 및/또는 제50항에 따른 면역접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 피시험자의 인슐린 발현을 증가 또는 촉진시키는 방법.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110764902.2 | 2021-07-06 | ||
| CN202110764902 | 2021-07-06 | ||
| CN202210721402.5 | 2022-06-24 | ||
| CN202210721402 | 2022-06-24 | ||
| PCT/CN2022/103777 WO2023280133A1 (zh) | 2021-07-06 | 2022-07-05 | 融合蛋白及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240029769A true KR20240029769A (ko) | 2024-03-06 |
Family
ID=84801272
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020247003118A Pending KR20240029769A (ko) | 2021-07-06 | 2022-07-05 | 융합단백질 및 이의 응용 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4368636A1 (ko) |
| JP (1) | JP2024524530A (ko) |
| KR (1) | KR20240029769A (ko) |
| CN (1) | CN117616037A (ko) |
| AU (1) | AU2022308120A1 (ko) |
| CA (1) | CA3224575A1 (ko) |
| TW (1) | TW202317607A (ko) |
| WO (1) | WO2023280133A1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114685644A (zh) * | 2020-12-29 | 2022-07-01 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 一种人glp-1多肽变体及其应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2004251145C1 (en) | 2003-06-12 | 2011-04-14 | Eli Lilly And Company | GLP-1 analog fusion proteins |
| AU2008275180A1 (en) | 2007-07-10 | 2009-01-15 | Eli Lilly And Company | GLP-1-Fc fusion protein formulation |
| CN104327187B (zh) * | 2014-10-11 | 2018-06-08 | 上海兴迪金生物技术有限公司 | 一种重组人GLP-1-Fc融合蛋白 |
| CN104293834B (zh) * | 2014-10-11 | 2018-03-23 | 上海兴迪金生物技术有限公司 | GLP‑1或其类似物与抗体Fc片段融合蛋白的制备方法 |
| CN111087475B (zh) * | 2019-12-25 | 2022-07-08 | 东莞市东阳光生物药研发有限公司 | Fgf21融合蛋白及抑制其降解的方法 |
| CN111072783B (zh) * | 2019-12-27 | 2021-09-28 | 万新医药科技(苏州)有限公司 | 一种采用大肠杆菌表达串联序列制备glp-1或其类似物多肽的方法 |
-
2022
- 2022-07-05 CA CA3224575A patent/CA3224575A1/en active Pending
- 2022-07-05 CN CN202280048550.3A patent/CN117616037A/zh active Pending
- 2022-07-05 WO PCT/CN2022/103777 patent/WO2023280133A1/zh active Application Filing
- 2022-07-05 EP EP22836884.1A patent/EP4368636A1/en active Pending
- 2022-07-05 JP JP2024500121A patent/JP2024524530A/ja active Pending
- 2022-07-05 AU AU2022308120A patent/AU2022308120A1/en active Pending
- 2022-07-05 TW TW111125165A patent/TW202317607A/zh unknown
- 2022-07-05 KR KR1020247003118A patent/KR20240029769A/ko active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2022308120A1 (en) | 2024-02-08 |
| WO2023280133A9 (zh) | 2023-02-02 |
| JP2024524530A (ja) | 2024-07-05 |
| CN117616037A (zh) | 2024-02-27 |
| TW202317607A (zh) | 2023-05-01 |
| CA3224575A1 (en) | 2023-01-12 |
| WO2023280133A1 (zh) | 2023-01-12 |
| EP4368636A1 (en) | 2024-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3596130B1 (en) | Dual-target fusion proteins comprising the fc portion of an immunoglobulin | |
| KR102670157B1 (ko) | 이중 작용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물 | |
| KR101993714B1 (ko) | 대사 장애를 치료하는데 이용하기 위한 조성물과 방법 | |
| JP6618854B2 (ja) | 作用持続期間が増大し、免疫原性が減少した操作されたポリペプチド | |
| CN103403019B (zh) | 具有增强的作用持续时间的工程化多肽 | |
| JP7303629B2 (ja) | 長時間作用型ｆｇｆ２１融合タンパク質およびそれを含む医薬組成物 | |
| CN106559984A (zh) | 用于治疗糖尿病的包含长效胰岛素类似物缀合物和长效促胰岛素肽缀合物的组合物 | |
| KR102692516B1 (ko) | 융합 단백질을 포함하는 간염증, 간섬유화 및 간경화 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
| US20210253662A1 (en) | Long-Acting Recombinant GLP1-Fc-CD47 Protein and Preparation and Use Thereof | |
| CN110172103B (zh) | GLP-1类似物-Fc融合蛋白及其制备方法和用途 | |
| CN113105561B (zh) | 一种双靶点融合蛋白的制备方法和应用 | |
| KR20240029769A (ko) | 융합단백질 및 이의 응용 | |
| WO2022143515A1 (zh) | 一种人glp-1多肽变体及其应用 | |
| TW202346323A (zh) | 具有改善的生物穩定性的ｇｌｐ—１及升糖素雙重激動肽 | |
| CN118076373A (zh) | 用于联合疗法的包括生长分化因子-15变体和胰高血糖素样肽-1受体激动剂的组合物 | |
| US20240076345A1 (en) | Human glp-1 polypeptide variant and use thereof | |
| WO2024141054A1 (zh) | 包含融合蛋白的药物组合物及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0105 | International application |
Patent event date: 20240126 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
|
| PG1501 | Laying open of application |