CN102659813A

CN102659813A - 2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈多晶型体、其制备方法及其药理用途

Info

Publication number: CN102659813A
Application number: CN201210164740XA
Authority: CN
Inventors: 柳红; 李佳; 王江; 李静雅; 李建; 周圣斌; 苏明波; 蒋华良; 罗小民; 陈凯先
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2012-05-23
Filing date: 2012-05-23
Publication date: 2012-09-12
Anticipated expiration: 2032-05-23
Also published as: CN102659813B

Abstract

本发明公开了一种2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈多晶型体、其制备方法及其药理用途。所述化合物的多晶型体与现有技术相比，具有DPP4抑制活性强、体内降糖活性强、药代动力学特性佳的优点，特别适合用于2型糖尿病的治疗。

Description

2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈多晶型体、其制备方法及其药理用途

技术领域

本发明涉及药物化合物的晶体，具体来说，本发明涉及2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈多晶型体、其制备方法、晶体组合物、药物组合物及用途。

背景技术

糖尿病是一种常见的代谢性疾病。它的特征是在禁食状态或者在进行口服糖耐量试验下表现出异常高的血浆血糖浓度和高血糖症。世界卫生组织根据糖尿病的临床形式分为1型和2型，而大多数糖尿病病人为2型糖尿病（T2DM）。2型糖尿病又称非胰岛素依赖性糖尿病，具有很高的血管并发症，如冠状动脉性疾病、中风、高血压、肾病、周围血管性疾病、神经性疾病和视网膜病。这种代谢性疾病已经成为公共卫生问题。根据世界卫生组织调查，全世界有将近1.94亿糖尿病患者，到2030年将会提高到3.66亿。促进胰岛β-细胞分泌胰岛素是治疗T2DM的主要手段。但是，除了能起到治疗作用之外，还会引起一定的副作用，如：低血糖、增加体重、心血管的病态反应和β-细胞的死亡等。

研究表明，糖化血红蛋白A1c（HbA1c）每降低1%，T2DM患者的并发症就会降低35%。因此，如何减少并发症和不良的副作用，已是治疗2型糖尿病的主要方向。经临床验证的治疗糖尿病的靶标有过氧化合物酶增殖体活化受体(PPAR)α/γ、胰高血糖素样肽酶-1(GLP-1)和二肽基肽酶IV(Dipeptidyl peptidase IV，DPP4)等。而DPP4抑制剂已经成为治疗2型糖尿病的一个新选择，无论是单独给药还是联合用药，DPP4抑制剂都是至今为止比较安全有效的药物。

二肽基肽酶IV（DPP4；又叫T-细胞抗原CD26），是一种以二聚体形式存在的高特异性丝氨酸蛋白酶。它包含两种状态，一种是跨膜蛋白酶，含有766个氨基酸，广泛分布在肾脏、肠绒状壁、细胞膜、肝细胞、血管内皮、T 细胞、B细胞和自杀性细胞。另一种是以溶解状态存在于血浆中。DPP4最重要的酶作用是水解肽链N端含丙氨酸或脯氨酸的多肽，如水解GLP-1。如果抑制DPP4的活性，就会间接地提高体内的GLP-1的含量，从而引起体内的一系列的生理作用，起到治疗2型糖尿病的目的。

目前，临床上应用最多的药物是与GLP-1有关的抗2型糖尿病药，比如：（a）DPP4耐受的GLP-1同类物；（b）小分子GLP-1受体激动剂；（c）DPP4抑制剂。DPP4抑制剂作为一种新的口服抗糖尿病药，能够阻止肠降血糖素激素的快速降解，提高餐后GLP-1的水平，毒副作用小，效果好，近来研究表明，无论是单独治疗或者是和其它抗糖尿病药联合用药，DPP4抑制剂能够降低糖化血红蛋白A1c水平。并且，发生低血糖的风险性很小，已经受到越来越多的制药企业的青睐。

DPP4抑制剂的研究已经取得了较大的突破，目前上市的药物有默克公司的西他列汀(Sitagliptin)，诺华公司的维格列汀(Vildagliptin)和百时美施贵宝公司的沙格列汀(Saxagliptin)等等。由于丝氨酸蛋白酶还有其它家族，因此DPP4抑制剂的设计，首先应考虑它的选择性问题，避免引起其他毒副作用。所以说DPP4抑制剂的研究仍是一项很大的挑战。

2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈(式I)为新型DPP4抑制剂，是一种新型的抗糖尿病活性分子。该化合物的DPP4抑制活性达到了纳摩尔级，与上市药物西他列汀(Sitagliptin)相当，对DPP4家族其它酶无抑制活性，其DPP4选择性优于上市药物西他列汀(Sitagliptin)，从分子水平保证了其安全性。在药效学研究方面，进行了单次给药在ICR小鼠上的急性降糖作用，其降糖作用优于上市药物维格列汀(Vildagliptin)；同时还进行了在雌性BKS小鼠模型上的药效评价以及雄性BKS小鼠模型上的药效评价，实验结果表明，该化合物的体内降糖作用优于上市药物维格列汀(Vildagliptin)。药物动力学实验研究表明，该化合物具有良好的体内药代动力学特性，半衰期优于上市药物阿格列汀(Alogliptin)。安全性实验表明该化合物安全性良好，其中大鼠急性毒性实验表明，1g/kg给药组未见动物死亡；大鼠亚急性毒性实验表明，大鼠经口给予300mg/kg组无明显的毒性反应。综合体外药效学评价、体内药理学评价、药代动力学研究、以及安全性评价等研究结果，该化合物体内降糖作用优于目前临床使用的DPP4抑制剂，因此，该化合物有望开发成为新的2型糖尿病治疗药物。

多晶型现象是指元素或化合物以不同的晶型形成具有不同物理化学性质的固体状态的现象。不同的多晶型体在结构和性质方面有所不同。各种物理性质，如溶解度、密度、稳定性、熔点等都随晶型不同而变化。药物固体通常形成分子晶体，很容易得到多晶型的变体。同时，在药物研究领域，多晶型还包括了有机溶剂化物、水合物等多组分晶体形式。这些不同晶体形式的不同的物理化学性能或可加工性能有时直接影响到药物的安全、有效性能。因此晶型研究和控制成为药物研发过程中的重要研究内容。通过选择具有不同溶解度和固有的溶出速率的多晶型就可以有利地影响药物的实际血液水平。

发明内容

本发明的一方面提供了式I所示化合物的A晶型

所述A晶型使用Cu-K_α辐射的XRPD（X-射线粉末衍射）光谱如图1所示，用晶面距d值表示在约处有衍射峰，典型地在约

处有衍射峰，进一步典型地在约

处有衍射峰，更进一步典型地在约9.28

处有衍生峰。

所述A晶型的IR（红外吸收）光谱如图2所示，约在3431、2953、2222、1681、1550、785cm^-1处有吸收峰。

所述A晶型的DSC（差示扫描量热测定）图谱如图3所示，其中吸热转变温度的起始值在约154.32℃。

本发明的另一方面提供了式I所示化合物的B晶型，所述B晶型使用Cu-K_α辐射的XRPD（X-射线粉末衍射）光谱如图6所示，用晶面距d值表示在约

处有衍射峰，典型地在约

处有衍射峰，进一步典型地在约

处有衍射峰，更进一步典型地在约

处有衍生峰。

所述B晶型的IR（红外吸收）光谱如图7所示，约在2939、2864、1664、1552、1518、1373、1350、1230、787、771、663cm^-1处有吸收峰。

所述B晶型的DSC（差示扫描量热测定）图谱如图8所示，其中吸热转变温度的起始值在约147.57℃。

本发明的另一方面提供了A晶型组合物，其中上述的A晶型占组合物重量的60%以上，较好是90%以上，更好是95%以上，最好是99%以上。在所述A晶型组合物中除A晶型外还可含有少量的其它晶型和无定形2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈。

本发明的另一方面提供了B晶型组合物，其中上述的B晶型占组合物重量的60%以上，较好是90%以上，更好是95%以上，最好是99%以上。在所述B晶型组合物中除B晶型外还可含有少量的其它晶型和无定形2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈。

本发明的另一方面提供了药物组合物，其中包括治疗有效量的上述A晶型或B晶型，或者上述A晶型组合物或B晶型组合物以及药学上可接受的赋形剂。其中，所述赋形剂包括常规的填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂等，所述填充剂选自淀粉、乳糖、微晶纤维素、糊精、甘露醇、氧化镁、硫酸钙及其混合物，所述崩解剂选自羧甲基纤维素及其盐、交联羧甲基纤维素及其盐、交联聚维酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素及其混合物；所述粘合剂选自聚维酮、羟丙基甲基纤维素、淀粉浆及其混合物；所述润滑剂选自硬脂酸镁、硬脂酸钙及其混合物。

本发明的另一方面提供了预防或治疗II型糖尿病和/或其并发症的方法，其包括向有需要的患者给予治疗有效量的上述A晶型或B晶型，上述A晶型组合物或B晶型组合物。

本发明的另一方面提供了上述A晶型或B晶型，上述A晶型组合物或B晶型组合物在制备用于预防或治疗II型糖尿病及其并发症的药物中的用途。

上述II型糖尿病并发症包括冠状动脉性疾病、中风、高血压、肾病、周围血管性疾病、神经性疾病和视网膜病等。

本发明的2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈A晶型可以按照如下的方法制备得到：

方法一：

（1）将2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈溶于选自酯类溶剂和醇类溶剂中的一种溶剂中；

（2）搅拌下加入选自醚类和烷烃类溶剂中的一种溶剂；

（3）析晶；

（4）步骤（3）所得固体在20-80℃、0-10KPa条件下真空干燥30-100个小时。

进一步，本发明所述的酯类溶剂选自乙酸甲酯、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯、乙酸丙酯或其混合物，更优选为乙酸乙酯。

进一步，本发明所述的醇类溶剂选自乙醇、甲醇、正丁醇、异丙醇、正丙醇或其混合物。更优选为乙醇。

本发明的2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈B晶型可以按照如下的方法制备得到：

方法二：

除了步骤（1）中所用溶剂为酮类溶剂以外，以与方法一相同的方法得到2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈B晶型。

所述的酮类溶剂选自丙酮、丁酮、甲基异丁基酮、甲基丁基酮或其混合物，优选为丙酮。

进一步，本发明方法步骤（2）所述的醚类溶剂选自石油醚、叔丁基甲基醚、乙醚、异丙醚、二乙醚或其混合物，优选为石油醚。

进一步，本发明方法步骤（2）所述的烷烃类溶剂选自正庚烷、正己烷、正戊烷或其混合物，更优选为正庚烷。

进一步，所述步骤（3）具体采用如下方法进行析晶：控制析晶温度在0-50℃，静置或搅拌结晶直至结晶物完全析出。优选控制析晶温度在0-20℃。

进一步，所述步骤（3）具体采用如下方法进行析晶：在30-80℃下减压或常压下蒸干溶剂析晶。优选在35-50℃下减压或常压下蒸干溶剂析晶。

进一步，所述步骤（4）在下列条件下进行干燥得2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈A晶型：在25-40℃、0-10KPa条件下真空干燥60-80个小时。

附图说明

图1为本发明的实施例1的晶体（A晶型）的X-衍射粉末衍射光谱图。

图2为本发明的实施例1的晶体（A晶型）的红外光谱图。

图3为本发明的实施例1的晶体（A晶型）的差热扫描分析（DSC）图。

图4为本发明的实施例1的晶体（A晶型）的热失重分析（TGA）图。

图5为本发明的实施例2的晶体（A晶型）的X-衍射粉末衍射光谱图。

图6为本发明的实施例5的晶体（B晶型）的X-衍射粉末衍射光谱图。

图7为本发明的实施例5的晶体（B晶型）的红外光谱图。

图8为本发明的实施例5的晶体（B晶型）的差热扫描分析（DSC）图。

图9为本发明的实施例5的晶体（B晶型）的热失重分析（TGA）图。

图10为本发明的实施例6的无定形的X-衍射粉末衍射光谱图。

图11为本发明的实施例6的无定形的红外光谱图。

图12为本发明的实施例6的无定形的热失重分析（TGA）图。

图13为本发明的实施例6的无定形的差热扫描分析（DSC）图。

图14为多晶型的SD大鼠血浆中DPP4活性实验。

图15为多晶型对正常ICR小鼠的口服糖耐量的影响。

具体实施方式

需要说明的是，在XRPD中，由晶体化合物得到的衍射谱图特定的晶型往往是特征性的，其中谱带（尤其是在低角度）的相对强度可能会因为结晶条件、粒径和其它测试条件的差异而产生的优势取向效果而变化。因此，衍射峰的相对强度对所针对的晶体并非是特征性的，判断是否与已知的晶型相同时，更应该注意的是峰的位置而不是它们的相对强度。在XRPD谱图中通常用2θ角或晶面距d表示峰位置，由于2θ角与入射X射线的波长有关，因此用晶面距d表示更具有代表性。两者之间具有简单的换算关系：d=λ/2sinθ，其中d代表晶面距，λ代表入射X射线的波长（对于Cu-K_α，

），θ为衍射角。对于同种化合物的同种晶型，其XRPD谱图在整体上具有相似性，表征峰位置的d值误差一般在±2%之内，大部分误差不超过±1%；相对强度误差可较大，但变化趋势一致。另外，判断晶型是否一样时应注意保持整体观念，因为并不是一条衍射线代表一个物相，而是一套特定的“d-I/I₁”数据才代表某一物相。还应指出的是，在混合物的鉴定中，由于含量下降等因素会造成部分衍射线的缺失，此时，无需依赖高纯试样中观察到的全部谱带，甚至一条谱带也可能对给定的晶体是特征性的。

DSC测定当晶体由于其晶体结构发生变化或晶体熔融而吸收或释放热时的转变温度。对于同种化合物的同种晶型，在连续的分析中，热转变温度和熔点误差典型地在约±5℃之内，通常在约±3℃之内。DSC提供了一种辨别不同晶型的辅助方法。不同的晶体形态可根据其不同的转变温度特征而加以识别。需要指出的是对于混合物而言，其DSC峰或熔点可能会在更大的范围内变动。此外，由于在物质熔化的过程中伴有分解，因此熔化温度与升温速率密切相关。

IR测定分子中对应于光而振动的基团相关的特定化学键引起的红外吸收。由于不同晶型分子共价键的电环境不一样，共价键强度也可能会有变化，共价键强度的改变必然会导致不同晶型的IR光谱的不同。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

实施例

2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈参考文献:European Journal of Medicinal Chemistry 46(2011)71-76制备。¹HNMR(CDCl₃):δ7.71(d,J=5.2HZ,1H),7.62(d,J=8HZ,1H),7.45(t,J=8HZ,1H),7.31(t,J=8HZ,1H),7.19(d,J=5.2HZ,1H),7.03(d,J=8HZ,1H),5.51(s,2H),3.24(m,1H),3.01(m,2H),2.80(m,1H),2.67(m,1H),1.91(m,1H),1.72(m,1H),1.60(m,1H),1.25(m,1H);LC-MS m/z 366.1[M+H]⁺。按此合成方法制备得到的是化合物2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈的无定形粉末。

实施例1：2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈的A晶型的制备

将200mg的2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈溶于1mL乙酸乙酯中，加入3mL石油醚，室温搅拌下析晶，至不再有固体析出，过滤，将所得固体物料置于真空干燥箱中，于25℃、5KPa条件下真空干燥70个小时，得到2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈A晶体100mg。

实施例2：2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈的A晶型的制备

将200mg的2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈溶于1mL乙醇中，加入12mL石油醚，室温搅拌下析晶，至不再有固体析出，过滤，将所得固体物料置于真空干燥箱中，于25℃、5KPa条件下真空干燥70个小时，得到2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈A晶体110mg。

实施例3：2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈的A晶型的制备

将200mg的2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈溶于1mL乙酸乙酯中，加入12mL正庚烷，室温搅拌下析晶，至不再有固体析出，过滤，将所得固体物料置于真空干燥箱中，于25℃、5KPa条件下真空干燥70个小时，得到2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈A晶体100mg。

实施例4：2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈的A晶型的制备

将200mg的2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈溶于1mL乙酸乙酯中，加入8mL正庚烷，混合均匀后静置24小时析晶，过滤，将所得固体物料置于真空干燥箱中，于25℃、5KPa条件下真空干燥70个小时，得到2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈A晶体110mg。

实施例5：2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈的B晶型的制备

将200mg的2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈溶于1mL丙酮中，加入15mL石油醚，混合均匀后静置24小时析晶，过滤，将所得固体物料置于真空干燥箱中，于25℃、5KPa条件下真空干燥70个小时，得到2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈B晶体90mg。

实施例6：2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈的无定形物的制备

将200mg的2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈溶于二氯甲烷5mL中，完全溶解后于39℃下减压蒸除溶剂，置于真空干燥箱中，于25℃、5KPa条件下真空干燥70个小时，得到2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈无定形物200mg。

实施例7：晶体的测试

样品：实施例1的晶体（A晶型）

X-射线粉末衍射测试：仪器型号：岛津XRD-6000；光源：Cu-K_α40kV40mA；石墨单色器；发散狭缝（DS）：1°；扫描方式：2θ/θ，连续扫描；扫描范围：3°~40°，扫描速度4°/min，结果见图1。

红外吸收光谱测试；采用美国NICOLET公司670FI-IR光谱仪，KBr压片法，扫描范围400~4000cm^-1，结果见图2。

DSC测试：仪器：Mettler-Toledo ST；测定条件如下：使用氧化铝坩埚，在空气吹扫下以20℃/min的升温速率，从30℃扫描到400℃，结果见图3。

热失重分析（TGA）测试：采用NETZSCH TG 209F1，测定条件如下：使用氧化铝坩埚，在氮气吹扫下以10℃/min的升温速率，从25℃扫描到400℃，结果见图4。

实施例8：晶体的测试

样品：实施例2的晶体（A晶型）

X-射线粉末衍射测试：仪器型号：岛津XRD-6000；光源：Cu-K_α40kV40mA；石墨单色器；发散狭缝（DS）：1°；扫描方式：2θ/θ，连续扫描；扫描范围：3°~40°，扫描速度4°/min，结果见图5。

实施例9：晶体的测试

样品：实施例5的晶体（B晶型）

X-射线粉末衍射测试：仪器型号：岛津XRD-6000；光源：Cu-K_α40kV40mA；石墨单色器；发散狭缝（DS）：1°；扫描方式：2θ/θ，连续扫描；扫描范围：3°～40°，扫描速度4°/min，结果见图6。

红外吸收光谱测试；采用美国NICOLET公司670FI-IR光谱仪，KBr压片法，扫描范围400~4000cm^-1，结果见图7。

DSC测试：仪器：Mettler-Toledo ST；测定条件如下：使用氧化铝坩埚，在空气吹扫下以20℃/min的升温速率，从30℃扫描到400℃，结果见图8。

热失重分析（TGA）测试：采用NETZSCH TG 209F1，测定条件如下：使用氧化铝坩埚，在氮气吹扫下以10℃/min的升温速率，从25℃扫描到400℃，结果见图9。

实施例10：无定形物的测试

样品：实施例6的无定形物

X-射线粉末衍射测试：仪器型号：岛津XRD-6000；光源：Cu-K_α40kV 40mA；石墨单色器；发散狭缝（DS）：1°；扫描方式：2θ/θ，连续扫描；扫描范围：3°～40°，扫描速度4°/min，结果见图10。

红外吸收光谱测试；采用美国NICOLET公司670FI-IR光谱仪，KBr压片法，扫描范围400~4000cm^-1，结果见图11。

热失重分析（TGA）测试：采用NETZSCH TG 209F1，测定条件如下：使用氧化铝坩埚，在氮气吹扫下以10℃/min的升温速率，从25℃扫描到400℃，结果见图12。

DSC测试：仪器：Mettler-Toledo ST；测定条件如下：使用氧化铝坩埚，在空气吹扫下以20℃/min的升温速率，从30℃扫描到400℃，结果见图13。

实施例11：体外活性实验

筛选方法：二肽基肽酶IV活性筛选(DPP4 activity assay)

仪器：酶标仪，Envision（PerkinElmer,USA）

材料：人源DPP4（二肽基肽酶IV），本实验室利用杆状病毒表达系统Bac-to-Bac（购自GIBCO公司）按照常规实验技术表达并纯化获得的蛋白酶DPP4胞外片断（aa29-766）。底物：Ala-Pro-AMC由吉尔生化（上海）公司合成。

过程：DPP4可特异性水解底物Ala-Pro-AMC生成产物AMC，AMC经355nm的紫外光激发产生460nm的发射光，动态测量单位时间内460nm波长处荧光值线性变化，计算得到DPP4活性。实验采用西他列汀（CAS:486460-32-6，根据现有技术按照常规实验技术合成，参考文献：Journal of Medicinal Chemistry 48(2005)141-151.）作为对照化合物。

样品处理：样品用DMSO溶解，低温保存，DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内。

初筛选择单浓度条件下，例如20μg/ml，对样品的活性进行测试。对于在一定条件下表现出活性的样品，例如抑制率%（Inhibition）大于50，测试活性剂量依赖关系，即IC₅₀/EC₅₀值，通过样品活性对样品浓度进行非线性拟和得到，计算所用软件为Graphpad Prism 4，拟合所使用的模型为sigmoidaldose-response(varible slope)，对于大多数抑制剂筛选模型，将拟合曲线底部和顶部设定为0和100。一般情况下，每个样品在测试中均设置复孔(n≥2)，在结果中以标准偏差(Standard Deviation,SD)或者标准误差(Standard Error,SE)表示。

实验结果：

化合物活性结果见表1，显示本发明化合物有很好的DPP4抑制活性和选择性。

表1.多晶型的DPP4抑制活性和选择性

^aN.I.:无抑制作用

实施例12：体内抑制DPP4活性的研究

动物：SD大鼠（8-10周龄，性别：雄，体重250g-300g，购自上海斯莱克实验动物中心）。

步骤：SD大鼠饥饿过夜，口服给予受试化合物A晶型(上述制备实施例1制备，3mg/kg)、B晶型(上述制备实施例5制备，3mg/kg)、无定形(上述制备实施例6制备，3mg/kg)、阳性药阿格列汀对照组(3mg/kg，CAS：850649-62-6根据现有技术按照常规实验技术合成，参考文献：Journal of Medicinal Chemistry 50(2007)2297-2300.)、阳性药LAF237对照组(15mg/kg，维格列汀，CAS：274901-16-5根据现有技术按照常规实验技术合成参考文献：Journal of Medicinal Chemistry 46(2003)2774-2789.)；以溶剂组为空白对照，分别于口服给药前、给药后30、60、120和240分钟从大鼠眼眶丛静脉取血，加入经抗凝剂处理的EPPENDORF管，离心后取血浆测定DPP4活性。

结果：A晶型、B晶型、无定形、阿格列汀（CAS：850649-62-6根据现有技术按照常规实验技术合成，参考文献：Journal of Medicinal Chemistry 50(2007)2297-2300.）和LAF237（维格列汀，CAS：274901-16-5根据现有技术按照常规实验技术合成参考文献：Journal of Medicinal Chemistry 46(2003)2774-2789.）经小鼠口服后吸收进入血浆内均可显著抑制正常SD大鼠体内DPP4酶活性，并于60分钟达到抑制最佳效果，随后DPP4抑制趋势有所缓解（图14）。在0-240min之间，B晶型优于A晶型和无定形，但是B晶型对血浆内DPP4的抑制效果略低于阳性对照药物阿格列汀和LAF237组。

实施例13：体内活性实验

单次给药在ICR小鼠上的急性降糖作用

动物：ICR小鼠（8－10周龄，雄性，体重25g－30g，购自上海斯莱克实验动物中心）

步骤：

1、实验前两天记录动物摄食情况，计算每只动物每天摄食量；

2、动物饥饿过夜（给每天食量的1/3，约2g）；

3、第二天测血糖，根据血糖将动物随机分为4组，每组8只。分别为溶剂对照组（0.5%甲基纤维素MC）：A晶型(上述制备实施例1制备，3mg/kg)、B晶型(上述制备实施例5制备，3mg/kg)、无定形(上述制备实施例6制备，3mg/kg)、阳性药阿格列汀对照组(3mg/kg，CAS：850649-62-6根据现有技术按照常规实验技术合成，参考文献：Journal of Medicinal Chemistry 50(2007)2297-2300.)、阳性药LAF237对照组(15mg/kg，维格列汀，CAS：274901-16-5根据现有技术按照常规实验技术合成，参考文献：Journal of Medicinal Chemistry 46(2003)2774-2789.)；

4、口服给药（1只/min），4小时后测血糖，口服给葡萄糖（2.5g/kg），测15min、30min、60min、90min、120min时的血糖值。

结果：B晶型优于A晶型和无定形；其中B晶型、阿格列汀和维格列汀均能显著改善ICR小鼠的口服葡萄糖耐量。B晶型3mg/kg的作用与阿格列汀3mg/kg和LAF237 15mg/kg相当，B晶型、阿格列汀和LAF237均不会导致低血糖（图15）。

实施例14：药代动力学试验

动物：健康大鼠12只，雄性，体重150-200g，

随机分成2组，每组6只。分别灌胃和静脉注射给予A晶型，给药体积为10mL/kg，药物以DMSO/吐温80/生理盐水（5:5:90，v/v/v）配制。试验前禁食12h，自由饮水。给药后2h统一进食。

经大鼠眼球后静脉丛取血0.3mL，置肝素化试管中，11000rpm离心5min，分离血浆，于20℃冰箱中冷冻。

结果：

A晶型：大鼠灌胃给予20mg/kg A晶型后，血浆浓度达峰时间T_max为0.25h，达峰浓度C_max为212.14ng/ml；药时曲线下面积AUC_0-t为278.211 ng·h/ml；末端消除半衰期t_1/2为2.47h。静脉注射给予10mg/kg A晶型后，AUC_0-t为271.17ng·h/ml；经剂量标准化后，大鼠灌胃给予20mg/kg A晶型后的绝对生物利用度为51.3%。

B晶型：大鼠灌胃给予20mg/kg B晶型后，血浆浓度达峰时间T_max为0.25h，达峰浓度C_max为556.95ng/ml；药时曲线下面积AUC_0-t为962.51ng·h/ml；末端消除半衰期t_1/2为4.38h。静脉注射给予10mg/kg B晶型后，AUC_0-t为906.51ng·h/ml；经剂量标准化后，大鼠灌胃给予20mg/kg B晶型后的绝对生物利用度为53.09%。

两种晶型中，B晶型药代动力学试验结果优于A晶型；B晶型半衰期为4.38小时，生物利用度为53.09%；A晶型半衰期为2.47小时，生物利用度为51.30%；B晶型的AUC_0-t大于A晶型的AUC_0-t。

从以上实验结果可以看出，化合物I的多晶型与现有技术相比，具有DPP4抑制活性强、体内降糖活性强、药代动力学特性佳的优点：(1)B晶型的血浆DPP IV抑制活性优于A晶型和无定形，与上市药物阿格列汀和维格列汀(LAF-237)降糖活性相当；(2)B晶型的体内降糖活性优于A晶型和无定形，与上市药物阿格列汀和维格列汀(LAF-237)降糖活性相当；(3)B晶型的半衰期长于A晶型和无定形，生物利用度也同时优于A晶型和无定形。特别适合用于2型糖尿病的治疗。

Claims

1.一种2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈晶体，其为以下晶型中的一种：

A晶型，所述A晶型使用Cu-K_α辐射的X-射线粉末衍射方法，用晶面距d值表示在约

处有衍射峰；

B晶型，所述B晶型使用Cu-K_α辐射的X-射线粉末衍射方法，用晶面距d值表示在约

处有衍射峰。

2.根据权利要求1所述的2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈晶体，其特征在于：

所述A晶型使用Cu-K_α辐射的X-射线粉末衍射方法，用晶面距d值表示在约

处有衍射峰；

所述B晶型使用Cu-K_α辐射的X-射线粉末衍射方法，用晶面距d值表示在约

处有衍射峰。

3.根据权利要求1或2所述的2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈晶体，其特征在于：

所述A晶型具有基本上如图1所示的粉末X-射线衍射图；

所述B晶型具有基本上如图6所示的粉末X-射线衍射图。

4.根据权利要求1或2所述的2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈晶体，其特征在于：

所述A晶型具有基本上分别如图2和3所示的红外光谱和DSC图谱；

所述B晶型具有基本上分别如图7和8所示的红外光谱和DSC图谱。

5.一种2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈晶体组合物，其为A晶型组合物或B晶型组合物，

在所述A晶型组合物中，根据权利要求1-4中任一项中所述的A晶型占组合物重量的60%以上；

在所述B晶型组合物中，根据权利要求1-4中任一项中所述的B晶型占组合物重量的60%以上。

6.权利要求1-4中任一项所述的2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈晶体的制备方法，其中：

所述A晶型按照如下的方法制备：

方法一：

（2）搅拌下加入选自醚类和烷烃类溶剂中的一种溶剂；

（3）析晶；

（4）步骤（3）所得固体在20-80℃、0-10KPa条件下真空干燥30-100个小时；

所述B晶型按照如下的方法制备：

方法二：

A.将2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈溶于酮类溶剂中；

B.搅拌下加入选自醚类和烷烃类溶剂中的一种溶剂；

C.析晶；

D.步骤C所得固体在20-80℃、0-10KPa条件下真空干燥30-100个小时。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

方法一步骤（1）中所述的酯类溶剂为乙酸甲酯、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、乙酸异丁酯或乙酸丙酯；和/或

方法一步骤（1）中所述的醇类溶剂为乙醇、甲醇、正丁醇、异丙醇或正丙醇，优选为乙醇；和/或

方法二步骤A中所述的酮类溶剂为丙酮、丁酮、甲基异丁基酮或甲基丁基酮；和/或

方法一步骤（2）和方法二步骤B中所述的醚类溶剂为石油醚、叔丁基甲基醚、乙醚、异丙醚或二乙醚；和/或

方法一步骤（2）和方法二步骤B中所述的烷烃类溶剂为正庚烷、正己烷或正戊烷；和/或

方法一步骤（3）和方法二步骤C的析晶条件为：析晶温度在0-50℃；和/或

方法一步骤（4）在下列条件下进行：在25-40℃、0-10KPa条件下真空干燥60-80个小时。

8.一种药物组合物，其包含药物有效量的权利要求1-4中任一项所述的2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈晶体以及药学上可接受的赋形剂。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述赋形剂包括常规的填充剂、崩解剂、粘合剂和/或润滑剂，所述填充剂选自淀粉、乳糖、微晶纤维素、糊精、甘露醇、氧化镁、硫酸钙及其混合物，所述崩解剂选自羧甲基纤维素及其盐、交联羧甲基纤维素及其盐、交联聚维酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素及其混合物；所述粘合剂选自聚维酮、羟丙基甲基纤维素、淀粉浆及其混合物；所述润滑剂选自硬脂酸镁、硬脂酸钙及其混合物。

10.权利要求1-4中任一项所述的2-((2-(3-氨基哌啶-1)-4-氧噻吩[3,2-d]嘧啶-3(4H)-甲基)苯甲腈晶体在制备用于预防或治疗II型糖尿病及其并发症的药物中的用途。