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CN102600214B - 苦丁茶冬青叶的提取方法、总皂苷及其用途 - Google Patents

苦丁茶冬青叶的提取方法、总皂苷及其用途 Download PDF

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CN102600214B CN201110026026.XA CN201110026026A CN102600214B CN 102600214 B CN102600214 B CN 102600214B CN 201110026026 A CN201110026026 A CN 201110026026A CN 102600214 B CN102600214 B CN 102600214B
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Abstract

本发明提供一种苦丁茶冬青叶的提取方法和用该方法提取的苦丁茶冬青叶总皂苷及其用途。所述提取方法包括如下步骤：(1)用50～70％的乙醇水溶液回流提取苦丁茶冬青叶；(2)将提取液滤过并除去其中的乙醇；(3)将步骤(2)得到的溶液上大孔树脂柱进行吸附，然后依次用水、pH值9～11的10～30％碱性乙醇水溶液、10～30％乙醇水溶液和50～70％乙醇水溶液洗脱该树脂柱；(4)将用50～70％乙醇水溶液洗脱得到的溶液浓缩、干燥即得。制得的总皂苷可以用制备用于降低胆固醇、降低血脂和抗粥样动脉硬化的药物。

Description

苦丁茶冬青叶的提取方法、总皂苷及其用途
技术领域
本发明涉及一种苦丁茶冬青叶的提取方法和由该方法提取的苦丁茶冬青叶总皂苷及其用途。具体地，本发明涉及一种提取苦丁茶冬青叶的总皂苷部位的方法，用该方法提取的总皂苷可用于降低胆固醇、降低血脂、抗粥样动脉硬化。
背景技术
高血脂包括高胆固醇和高甘油三酯，前者的危害性远远高于后者。对于高血脂而言，药物性降脂疗法是治疗高脂血症的最有效措施。目前，降低甘油三酯的有效药物已经很多，但降低胆固醇的有效药物还主要为他汀类。该类药物主要是对抗高胆固醇血症所致的动脉硬化，其作用机理为抑制肝脏胆固醇合成。但是长期服用他汀类药物对肝脏和肌肉有明显的毒性作用，同时导致转氨酶增高，少数服用者出现横纹肌溶解症和急性肾衰竭，尽管经过了几代药物结构的修饰，仍未解决其毒副作用问题。
苦丁茶为传统的民间饮品，作为减肥、降血脂、降血压、清热解毒等功用的保健茶已有近千年的饮用历史。市场上的苦丁茶品种繁多，据调查已有22种植物的叶可作为苦丁茶使用，但具体那一种苦丁茶具有较好的降血脂、降血压等功效则不得而知，导致消费者花费了大量的金钱，但降血脂效果甚微，甚至没有效果。
发明内容
近年来，本发明的发明人经过系统的比较研究，发现只有来源于冬青属植物的苦丁茶冬青(Ilex kudingcha C.J.Tseng)的叶具有非常明显的降血脂、抗动脉粥样硬化作用，其有效成分为皂苷类成分，同时，该植物所含的皂苷类成分的苷元也与其它来源的苦丁茶明显不同。通过对活性成分和药理作用进行系统的研究，发明人发现苦丁茶冬青叶的皂苷类成分具有明显的降低胆固醇、抗动脉粥样硬化作用，其作用强度与他汀类药物相当，但其机理与他汀类药物完全不同。此外，该类皂苷还有降低甘油三酯、抗氧化、肾保护、改善血液流变学等作用。作用机理研究表明，苦丁茶冬青皂苷降血脂机理为抑制肠道及肝脏酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT)的活性，从而抑制胆固醇肠道吸收。但是，按照常规中药材提取方法提取得到的苦丁茶冬青叶提取物中异绿原酸的含量大大高于苦丁茶皂苷的含量。而经发明人研究发现，异绿原酸具有升高血脂的作用。
因此，本发明的一个目的在于，提供一种苦丁茶冬青叶的提取方法，该提取方法能够将苦丁茶冬青叶总皂苷部位与总异绿原酸部位分离，并分别得到苦丁茶冬青叶皂苷部位含量较高的提取物和总异绿原酸部位含量较高的提取物；本发明的另一个目的在于，提供由本发明的方法提取的苦丁茶冬青叶总皂苷，其总皂苷部位含量可以达到80％以上，能够降低血脂和抗粥样动脉硬化，同时对肝脏和肾脏具有保护作用；本发明的再一个目的在于，提供上述苦丁茶冬青叶总皂苷部位在制备用于降低胆固醇、降低血脂、抗粥样动脉硬化的药物中的应用。
针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种苦丁茶冬青叶的提取方法，该方法可以包括如下步骤：(1)用50～70％的乙醇水溶液回流提取苦丁茶冬青叶；(2)将提取液滤过并除去其中的乙醇；(3)将步骤(2)得到的溶液上大孔树脂柱进行吸附，然后依次用水、pH值9～11的10～30％碱性乙醇水溶液、10～30％乙醇水溶液和50～70％乙醇水溶液洗脱该树脂柱；(4)收集用50～70％乙醇水溶液洗脱得到的溶液，浓缩、干燥即得。
根据本发明提供的提取方法，其中，所述步骤(1)中乙醇的浓度可以优选为55～65％，最优选为60％；步骤(3)中乙醇的浓度可以优选为55～65％，最优选为60％。在本文中，所述乙醇水溶液的浓度是指乙醇在乙醇水溶液中的体积百分比浓度。
根据本发明提供的提取方法，其中，所述步骤(1)的回流提取的操作方法为本领域技术人员所公知，该操作中乙醇水溶液的用量可以根据原料的量来确定，例如乙醇水溶液与原料的重量比可以为2～20∶1，优选为5～15∶1；提取的次数可以为1～8次，优选为2～4次；每次回流提取的时间可以为0.5～5小时，优选为0.5～2小时，各次回流提取的时间可以相同也可以不同，各次回流所使用的乙醇的浓度可以相同也可以不同，并且各次回流所使用的乙醇的量可以相同也可以不同。例如，在本发明的一种优选的实施方式中，可以先使用原料重量10倍的60％乙醇回流1小时，将提取液滤过后再使用原料重量8倍的60％乙醇回流1小时，将提取液滤过后再使用原料重量8倍的60％乙醇回流1小时，然后将三次回流提取分离出的滤液合并。
根据本发明提供的提取方法，其中，所述步骤(2)中除去乙醇的方法和步骤(4)中浓缩的方法为本领域技术人员所公知，例如，均可以为减压蒸馏。步骤(4)中干燥的方法优选为真空干燥。为了节约乙醇的用量，本发明的方法还可以包括将步骤(2)分离出的乙醇和/或步骤(4)分离出的乙醇回收，并再次用于步骤(1)的回流提取。
根据本发明提供的提取方法，其中，所述步骤(3)中使用的大孔树脂柱是本领域常用的树脂柱，就本发明而言，优选为苯乙烯型的大孔吸附树脂，如D101、HPD100、HPD400A、AB-8和NKA等型号的大孔树脂柱。所述大孔树脂柱的径高比可以为1∶3～10，优选为1∶4～7，最优选为1∶6；树脂与苦丁茶冬青叶的重量比可以为5～15∶1，优选为6～10∶1，最优选为7∶1。
优选情况下，为了得到效价更高的苦丁茶冬青叶总皂苷部位，所述步骤(3)的洗脱过程可以为：先用4～10柱体积水淋洗至无糖反应；再用5～10柱体积pH值9～11的10～30％碱性乙醇水溶液淋洗；然后用2～5体积10～30％乙醇水溶液淋洗；最后用3～6柱体积50～70％乙醇水溶液洗脱该树脂柱。例如，在本发明的一种优选的实施方式中，步骤(3)为：将步骤(2)得到的溶液上HPD400A大孔树脂柱进行吸附(树脂柱径高比为1∶4，树脂与药材的重量比为7∶1)，反复上样3次，静止吸附30分钟，吸附后先用水淋洗树脂柱至无糖，再用8倍柱体积25％的碱性乙醇(pH＝10)淋洗树脂柱，然后用3倍柱体积25％的中性乙醇淋洗树脂柱至中性，最后用4倍柱体积60％的乙醇洗脱该树脂柱，将60％乙醇洗脱液收集蒸干即得到苦丁茶冬青叶总皂苷部位。
根据本发明提供的提取方法，其中，所述步骤(3)中的碱性乙醇水溶液的pH值可以最优选为10。
根据本发明提供的提取方法，其中，该方法还可以包括步骤(5)将用pH值9～11的10～30％碱性乙醇水溶液和用10～30％乙醇水溶液洗脱得到的溶液合并、调节pH值2～3、浓缩、干燥，得到总异绿原酸。
本发明还提供了使用上述方法提取的苦丁茶冬青叶总皂苷，其总皂苷部位含量可以达到80％以上，能够降低血脂和抗粥样动脉硬化，同时对肝脏和肾脏具有保护作用。
本发明还提供了使用上述方法提取的苦丁茶冬青叶总皂苷在制备用于降低胆固醇、降低血脂和抗粥样动脉硬化的药物中的应用。该苦丁茶冬青叶总皂苷既可以单独使用，也可以与他汀类药物联合使用，以提高药效并改善他汀类药物的毒副作用。
本发明提供的苦丁茶冬青叶总皂苷具有明显的降低胆固醇、抗动脉粥样硬化作用，其作用强度与他汀类药物相当，但其机理与他汀类药物完全不同。此外，该提取物还有降低甘油三酯、抗氧化、肾保护、改善血液流变学等作用。作用机理研究表明，苦丁茶冬青皂苷降血脂机理为抑制肠道及肝脏酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT)的活性，从而抑制胆固醇肠道吸收。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例1制得的样品A1的高效液相色谱图；
图2为对比例1制得的样品C1的高效液相色谱图；
图3为对比例2制得的样品C2的高效液相色谱图；
图4为对比例3制得的样品C3的高效液相色谱图；
图5显示苦丁茶冬青总皂苷对ApoE-/-小鼠血浆总胆固醇水平的影响；
图6显示苦丁茶冬青总皂苷对ApoE-/-小鼠血浆MDA水平的影响；
图7显示苦丁茶冬青总皂苷对动脉粥样硬化的影响；
图8显示苦丁茶冬青总皂苷对粪便中总胆固醇含量的影响；
图9显示苦丁茶冬青总皂苷对Caco-2细胞表达ACAT2mRNA的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。需要说明的是，实施例中出现的各种百分比浓度的乙醇，均是指相应体积百分比浓度的乙醇水溶液。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的苦丁茶冬青叶的提取方法。
提取：称取苦丁茶冬青叶药材0.5Kg，分别用5L和4L 60％的乙醇回流提取并过滤两次，回流时间分别为0.5小时和1小时，将滤液合并；
除乙醇：将提取得到的滤液减压蒸馏至无醇味，并将乙醇回收，浓缩液的相对密度为1.06～1.08(室温)；
吸附：将得到的溶液上HPD400A大孔树脂柱吸附，树脂柱的填充量为5Kg，径高比为1∶4，反复上样3次，静止吸附30分钟；
洗杂：先用4柱体积的去离子水淋洗树脂柱至无糖；再用8柱体积的20％碱性乙醇(NaOH，pH＝10)淋洗；然后用3柱体积的20％乙醇淋洗至中性；
洗脱：用6柱体积60％乙醇将树脂上吸附的提取物洗脱；
浓缩、干燥：将洗脱液减压蒸馏回收乙醇，然后进行真空干燥，并将干燥后得到的固体粉碎过100目筛，得到65.35克苦丁茶冬青叶提取物，记作A1，出膏率为13.07％。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的苦丁茶冬青叶的提取方法。
提取：称取苦丁茶冬青叶药材0.5Kg，先后用4L体积百分比为65％的乙醇、3L 60％的乙醇及3L 50％的乙醇回流提取并过滤三次，回流时间分别为2小时、1小时和0.5小时，将滤液合并；
除乙醇：将提取得到的滤液减压蒸馏至无醇味，并将乙醇回收，浓缩液的相对密度为1.06～1.08(室温)；
吸附：将得到的溶液上AB-8大孔树脂柱吸附，树脂柱的填充量为3.5Kg，径高比为1∶8；
洗杂：先用8柱体积的去离子水淋洗树脂柱至无糖；再用10柱体积的30％碱性乙醇(NaOH，pH＝10.5)淋洗；然后用4柱体积的30％乙醇淋洗至中性；
洗脱：用3柱体积65体积％乙醇将树脂上吸附的提取物洗脱；
浓缩、干燥：将洗脱液减压蒸馏，然后进行真空干燥，并将干燥后得到的固体粉碎100目筛，得到50.31克苦丁茶冬青叶提取物，记作A2，出膏率为10.06％。
对比例1
本对比例用于说明洗杂过程仅用水淋洗的苦丁茶冬青叶的提取方法。
按照与实施例1相同的方法进行提取、除乙醇和吸附过程；
洗杂：用4柱体积的去离子水淋洗树脂柱至无糖；
洗脱：用4柱体积60％乙醇将树脂上吸附的提取物洗脱；
浓缩、干燥：将洗脱液减压蒸馏，然后进行真空干燥，并将干燥后得到的固体粉碎过100目筛，得到150克苦丁茶冬青叶提取物，记作C1，出膏率为30.00％。
对比例2
本对比例用于说明洗杂过程仅用水和乙醇淋洗的苦丁茶冬青叶的提取方法。
按照与实施例1相同的方法进行提取、除乙醇和吸附过程；
洗杂：用4柱体积的去离子水淋洗树脂柱至无糖；再用5柱体积的10％乙醇淋洗；
洗脱：用4柱体积60％乙醇将树脂上吸附的提取物洗脱；
浓缩、干燥：将洗脱液减压蒸馏，然后进行真空干燥，并将干燥后得到的固体粉碎过100目筛，得到110.23克苦丁茶冬青叶提取物，记作C2，出膏率为22.05％。
对比例3
本对比例用于说明洗杂过程仅用水和乙醇淋洗的苦丁茶冬青叶的提取方法。
按照与实施例1相同的方法进行提取、除乙醇和吸附过程；
洗杂：用4柱体积的去离子水淋洗树脂柱至无糖；再用11柱体积的20％乙醇淋洗；
洗脱：用4柱体积60％乙醇将树脂上吸附的提取物洗脱；
浓缩、干燥：将洗脱液减压蒸馏，然后进行真空干燥，并将干燥后得到的固体粉碎过100目筛，得到102.8克苦丁茶冬青叶提取物，记作C3，出膏率为20.56％。
成分测定
一、高效液相色谱检测(HPLC)
色谱柱：Kromasil 100-5-C 18(4.6×250mm)，流速：0.8ml/min；检测波长：226nm；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.1％磷酸溶液，梯度洗脱，洗脱条件如表1所示：
表1
时间/min 乙腈/ml
0～12 15～23
12～20 23～30
20～40 30～40
40～50 40～95
图1为实施例1制得的样品A1的色谱图，图2为对比例1制得的样品C1的色谱图，图3为对比例2制得的样品C2的色谱图，图4为对比例3制得的样品C3的色谱图。在图1-4中，谱峰Kc、Ka和Kd分别表示三种主要的苦丁茶冬青叶皂苷成分(KDC-C、KDC-A和KDC-D)的谱峰；谱峰Ia、Ib和Ic分别表示三种异绿原酸成分(异B、异A和异C)的谱峰。
表2列出了实施例1、2制得的样品A1和A2以及对比例1、2和3制得的样品C1、C2和C3的HPLC检测结果。
表2
通过图1-4中的结果和表2中的数据对比可以看出，采用水或低浓度乙醇不能去除异绿原酸类成分，而采用碱性的低浓度醇洗则能够达到去除异绿原酸类成分，从而获得高纯度的苦丁茶总皂苷提取物。
二、紫外吸收测定总皂苷
分别精密称取所得提取物(3批)约10mg，甲醇定容至25ml。精密量取0.8ml置于10ml的具塞玻璃管中，80℃水浴蒸干，得到3批样品。以苦丁茶皂苷A为对照品(0.535mg/ml)，分别量取0.1ml、0.2ml、0.4ml置于10ml的具塞玻璃管中，80℃水浴蒸干。
称量0.1g香草醛置于10ml具塞玻璃管，加入2ml冰醋酸，溶解后加入8ml高氯酸，摇匀，得到金黄色显色剂。
分别向上述蒸干的样品及对照品的玻璃管中加入1ml上述显色剂，在60℃下水浴加热15min后，立即冷却，加入5ml冰醋酸，摇匀后，在538nm下测量紫外吸收值。
表3列出了实施例1、2制得的样品A1和A2以及对比例1、2和3制得的样品C1、C2和C3的总皂苷含量测定结果。
表3
样品 总皂苷含量/％
A1 88.24
A2 86.02
C1 53.11
C2 65.03
C3 68.02
通过表3中的数据对比可以看出，A1和A2的总皂苷的含量明显高于C1、C2和C3中的含量，说明通过去除其它杂质能够明显提高总皂苷的含量。但是同时也发现UV法测定含量还是存在着不准确的地方，如C2、C3虽然测出来皂苷的含量较高，但是通过HPLC检测，发现其仍存在大量异绿原酸类成分，这是因为使用冰醋酸-香草醛显色法，很多类似糖苷类化合物都会显色，缺乏单一性，所以使测定结果不够准确。
药效试验
进行如下试验检测实施例1制得的苦丁茶冬青叶提取物的疗效。
ApoE-/-小鼠，按体重随机分为4组。
(1)阴性对照组(CG)：正常饮食7周，同时每日灌胃给予生理盐水。
(2)高脂对照组(HG)：单纯喂食0.2％高胆固醇饲料7周，同时每日灌胃给予生理盐水。
(3)阿托伐他汀治疗组(AG)：喂食高胆固醇饲料一周后开始灌胃给予阿托伐他汀(50mg/kg/d)治疗，同时继续给与高胆固醇饮食，每天灌胃一次，疗程为6周。
(4)苦丁茶冬青总皂苷剂量组(SG)：疗程同上，苦丁茶冬青总皂苷给药剂量为300mg/kg/d。
一、苦丁茶冬青总皂苷对血浆总胆固醇(TC)水平的影响
图5显示了苦丁茶冬青总皂苷对ApoE-/-小鼠血浆总胆固醇(TC)水平的影响。ApoE-/-小鼠经过一周高胆固醇饲料喂食，血浆总胆固醇从300～400mg/dL升高到约800mg/dL，形成极高胆固醇血症后开始灌胃给药。结果显示，与高脂对照组相比，所有给药组都能降低小鼠的血浆TC水平。苦丁茶冬青总皂苷和阿托伐他汀组在给药一周后血浆TC水平降低30％～35％，二者药效基本相同，无显著性差异。药效持续六周并保持稳定。
二、苦丁茶冬青总皂苷对血浆MDA的影响
图6显示了苦丁茶冬青总皂苷对ApoE-/-小鼠血浆MDA水平的影响，随高脂饮食时间的延长，给药第六周时高脂对照组血浆MDA水平升高约为高脂饮食前的5倍。和高脂对照小鼠相比，阿托伐他汀组和皂苷中、组从给药第二周起，能明显抑制血浆MDA水平的升高，并都持续到给药结束。从给药第四周起，阿托伐他汀组MDA水平开始上升，在给药第六周时达到16.5nmol/L，比给药前升高约1.5倍。而皂苷组从给药开始到实验结束，血浆MDA水平几乎没有升高；皂苷组与阿托伐他汀组相比，从给药第五周能更有效的抑制血浆MDA水平的升高并具有显著性差异。结果显示，阿托伐他汀和苦丁茶冬青皂苷均能抑制血浆脂质氧化。
三、苦丁茶冬青总皂苷对动脉粥样硬化的影响
图7显示了苦丁茶冬青总皂苷对ApoE-/-小鼠主动脉流出道动脉粥样面积影响的实验结果，高脂对照组(HG)与阴性控制组(CG)相比p＜0.05，说明造模成功，而苦丁茶冬青总皂苷(SG)和阿托伐他汀(AG)组与HG组均存在极显著差异(P＜0.01)，说明这两组都能显著抑制主动脉流出道动脉粥样硬化斑块的形成，抑制率达到约40％。
四、苦丁茶冬青总皂苷对粪便中总胆固醇含量的影响
为了研究苦丁茶冬青总皂苷降血浆胆固醇的可能机制，对ApoE-/-小鼠粪便中总胆固醇的含量进行了测定，以检测药物对小鼠胆固醇吸收的影响，结果如图8所示，与阴性控制组(CG)相比#p＜0.05，与高脂对照组(CG)相比*p＜0.05。结果表明，小鼠经高胆固醇食物诱导后，胆固醇的排泄量增加了75％，与对照组小鼠差异显著。皂苷组小鼠粪便胆固醇含量比高脂组增加约40％，且差异显著。
五、苦丁茶冬青总皂苷对Caco-2细胞表达ACAT2mRNA的影响
在之前的研究中发现，苦丁茶冬青总皂苷能增加胆固醇的排泄量，减少小肠内TC和CE含量。因此对相关基因的mRNA表达水平进行了检测。结果发现，ACAT2的mRNA水平受到了苦丁茶冬青总皂苷的影响，其中ACAT2的结果见图9。图中TS表示苦丁茶总皂苷，Ator表示阿托伐他汀，与阴性控制组(CG)相比#p＜0.05。从结果可以看出，10μg/mL和100μg/mL的总皂苷能抑制表达ACAT2mRNA的50％，与阴性对照组相比差异显著。而苦丁茶冬青总皂苷对其它筛选基因表达没有影响。本研究结果证明：苦丁茶冬青皂苷降血脂机理可能为抑制肠道及肝脏酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT)的活性，从而抑制胆固醇肠道的吸收。
通过以上药效检测结果可以看出，本发明提供的苦丁茶冬青叶提取物具有明显的降低胆固醇、降低血脂、抗动脉粥样硬化作用，其作用强度与他汀类药物相当。

Claims (14)

1.一种苦丁茶冬青叶的提取方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)用50～70％的乙醇水溶液回流提取苦丁茶冬青叶；(2)将提取液滤过并除去其中的乙醇；(3)将步骤(2)得到的溶液上大孔树脂柱进行吸附，然后依次用水、pH值9～11的10～30％碱性乙醇水溶液、10～30％乙醇水溶液和50～70％乙醇水溶液洗脱该树脂柱；(4)收集用50～70％乙醇水溶液洗脱得到的溶液，浓缩、干燥即得苦丁茶冬青叶总皂苷；(5)将用pH值9～11的10～30％碱性乙醇水溶液和用10～30％乙醇水溶液洗脱得到的溶液合并、调节pH值2～3、浓缩、干燥，得到总异绿原酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)中乙醇的浓度为55～65％；步骤(3)中乙醇的浓度为55～65％。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述步骤(1)中乙醇的浓度为60％。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述步骤(3)中乙醇的浓度为60％。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述步骤(1)中提取1～8次，每次0.5～5小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤(1)中提取2～4次。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤(1)中每次提取0.5～2小时。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述步骤(2)中除去乙醇的方法为减压蒸馏，所述步骤(4)中浓缩的方法为减压蒸馏；干燥的方法为真空干燥。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述步骤(3)中的大孔树脂柱的径高比为1:3～10；树脂与苦丁茶冬青叶的重量比为5～15:1。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述步骤(3)中的大孔树脂柱的径高比为1:4～7。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述步骤(3)中的大孔树脂柱的径高比为1:6。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，所述步骤(3)中树脂与苦丁茶冬青叶的重量比为6～10:1。
13.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述步骤(3)中的碱性乙醇水溶液的pH值为10。
14.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该方法还包括将步骤(2)分离出的乙醇和/或步骤(4)分离出的乙醇回收，并再次用于步骤(1)的回流提取。
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