CN102590526B

CN102590526B - β2-微球蛋白检测试剂盒

Info

Publication number: CN102590526B
Application number: CN201210011220.5A
Authority: CN
Inventors: 邹炳德; 邹继华; 方亮
Original assignee: NINGBO MEIKANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Meikang biological Polytron Technologies Inc
Priority date: 2012-01-13
Filing date: 2012-01-13
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2032-01-13
Also published as: CN102590526A

Abstract

本发明提供了一种β2-微球蛋白检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2，试剂R1包括缓冲液、防腐剂、稳定剂、电解质、表面活性剂，其余为纯化水，试剂R2包括用β2-微球蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒、缓冲液、防腐剂、稳定剂，其余为纯化水。β2-微球蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒采用定向偶联的方法，制备步骤包括：聚苯乙烯胶乳颗粒的激活；β2-微球蛋白抗体的氧化；β2-微球蛋白抗体与聚苯乙烯胶乳颗粒的偶联。该试剂盒灵敏度高、特异性好、准确性好、抗干扰能力强、生产成本低。

Description

β2-微球蛋白检测试剂盒

技术领域

本发明属于医学免疫学领域，涉及一种免疫检测试剂，进一步地，本发明涉及一种β2-微球蛋白检测试剂盒。

背景技术

β2-微球蛋白是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，分子质量为11.8KD，它是细胞表面人类淋巴细胞抗原(HLA)的β链(轻链)部分(为一条单链多肽)，广泛存在于血浆、尿液、脑脊液、唾液以及初乳中，含量很低。正常人β2-微球蛋白的合成率及从细胞膜上的释放量相当恒定，β2-微球蛋白可以从肾小球自由滤过，99.9％在近端肾小管吸收，因此测定血液β2-微球蛋白可以作为反映肾小球滤过率的指标。

目前常用的测定β2-微球蛋白的方法有免疫扩散法、免疫电泳法、放射免疫分析法、酶联免疫法、胶乳增强免疫透射比浊法。其中应用最多的就是胶乳增强免疫透射比浊法，其基本原理是：将抗体包被在胶乳颗粒上，与相应抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。目前将β2-微球蛋白抗体包被到胶乳颗粒上的常用方法是物理吸附法，该方法稳定性较差，抗体容易从胶乳颗粒上脱落下来；而且容易受类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，IgM、IgG型RF或者嗜异性抗体可以与包被在胶乳上的抗体的Fc段直接结合，从而导致检测结果假阳性或假性升高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述背景技术的不足，提供一种灵敏度高、特异性好、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的β2-微球蛋白检测试剂盒。

本发明所采用的技术方案为：

一种β2-微球蛋白检测试剂盒，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2，所述试剂R1包括缓冲液、防腐剂、稳定剂、电解质、表面活性剂，其余为纯化水；所述试剂R2包括用β2-微球蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒、缓冲液、防腐剂、稳定剂，其余为纯化水。

本发明上述试剂盒中试剂R1与试剂R2的体积比为4∶1。

本发明试剂1和试剂2中的缓冲液包括但不限于PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液、氯化铵缓冲液以及其他具有相似性质的缓冲液中的一种或几种。试剂R1所用的缓冲液与试剂R2所用的缓冲液只要为上面的缓冲液中的一种任意搭配均可。

本发明试剂1和试剂2中的防腐剂包括但不限于山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin 300以及其他具有相似性质的防腐剂中的一种或几种。

本发明试剂1和试剂2中的稳定剂包括但不限于聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA以及其他具有相似性质的稳定剂中的一种或者几种。

本发明试剂1中的电解质包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化钙以及其他具有相似性质的电解质中的一种或几种。

本发明试剂1中的表面活性剂包括但不限于TWEEN系列表面活性剂、SPAN系列表面活性剂、TRITON系列表面活性剂以及其他具有相似性质的表面活性剂中的一种或几种。

本发明所述的聚苯乙烯胶乳颗粒(该聚苯乙烯胶乳颗粒为市售常规产品)，其平均粒径在0.01～1.5μm之间，粒径小于0.01μm时，胶乳颗粒聚集产生的光密度变化太小，结果很难达到试验敏感度要求，在制备试剂的时候，需要花费过多的离心时间，延长了试剂生产的时间，增加了试剂成本且不利于重复性。而粒径大于1.5μm的胶乳颗粒在测量高浓度检测物时，其聚集产生的光密度变化超过了检测限，结果很难获得对应于分析物浓度的光密度变化，而且颗粒太大会加速自聚集，导致分散性降低。胶乳颗粒粒径随着试验方法和设备的改变而改变，因此所选择的颗粒粒径最好是介于0.05～0.5μm之间。

本发明所述抗体包括但不限于多克隆抗体(羊、兔、鸡)及单克隆抗体。

本发明β2-微球蛋白检测试剂盒除包括试剂1与试剂2之外，还包括β2-微球蛋白校准品；进一步的，所述的β2-微球蛋白校准品中β2-微球蛋白含量为0～18mg/L。

本发明所述的试剂R2是用β2-微球蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，置于适当的缓冲液中组成，该试剂R2制备步骤包括：

(1)聚苯乙烯胶乳颗粒的激活：在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDAC)，混合反应后加入己二酸二酰肼，继续混合反应，得到激活的聚苯乙烯胶乳颗粒；

(2)β2-微球蛋白抗体的氧化：用高碘酸钠将β2-微球蛋白抗体非结合活性区域Fc端羟基氧化成醛基；

(3)β2-微球蛋白抗体与聚苯乙烯胶乳颗粒的偶联：将步骤(1)激活的聚苯乙烯胶乳颗粒和步骤(2)氧化的β2-微球蛋白抗体混合反应，待反应结束后，再加入葡萄糖封闭聚苯乙烯胶乳微球上未反应的基团，得到偶联β2-微球蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳微球。

本发明上述制备方法各个步骤中物料配比为：

步骤(1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺∶聚苯乙烯胶乳颗粒＝0.2～1∶100(重量比)；己二酸二酰肼∶聚苯乙烯胶乳颗粒＝20～50∶100(重量比)；

步骤(2)中高碘酸钠∶β2-微球蛋白抗体＝1∶2(重量比)；

步骤(3)中抗体∶激活的聚苯乙烯胶乳颗粒＝10～20∶100(重量比)，葡萄糖∶激活的聚苯乙烯胶乳颗粒＝25～50∶100。

本发明所用检测β2-微球蛋白的方法为胶乳增强免疫透射比浊法，其原理是包被了抗原或抗体的胶乳微粒，与标本中相应抗体或抗原发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波长下，通过测定聚集物形成所产生的浊度，即可测出标本中被检物的含量。在本发明中，血清中的β2-微球蛋白与结合在聚苯乙烯胶乳颗粒表面的抗人β2-微球蛋白抗体结合，产生抗原抗体反应，使聚苯乙烯胶乳颗粒形成聚集；在546nm，700nm波长处测定吸光度，对照标准曲线可求出β2-微球蛋白的含量。

本发明的优点：

1.本发明通过改进胶乳颗粒包被方法，使该试剂盒灵敏度高、特异性好、准确性高、抗干扰能力强、生产成本低。

2.本发明试剂盒中的试剂R2制备是一种抗原抗体反应试验方法，特别之处在于，本发明采用定向偶联法将β2-微球蛋白抗体包被到聚苯乙烯胶乳颗粒上；本发明将β2-微球蛋白抗体的非结合活性区域的Fc端定向偶联到聚苯乙烯胶乳颗粒上，不会发生类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰所导致的检测结果假阳性或假性升高，该方法定向偶联的β2-微球蛋白抗体偶联到聚苯乙烯胶乳颗粒上后，其抗原结合位点指向流动相，抗体偶联部位为Fc片段，因此不会发生抗体结合力损失的情况，保持了抗体的活力，大大减少了抗体的用量，降低了生产成本。

3.本发明试剂盒中的R2制备采用定向化学偶联法，得到的致敏胶乳颗粒稳定性较好，抗体不会从胶乳颗粒上脱落，而且由于化学偶联过程中，Fc段发生了结构上的改变，因此不会受到类风湿性因子(RF)和嗜异性抗体的干扰，大大提升了检测结果的准确性和可信性。

具体实施方式

下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。

实施例1β2-微球蛋白检测试剂盒的制备

本发明的试剂盒涉及试剂的主要原材料如下：

1.β2-微球蛋白抗体：采用间接ELISA法测定效价为1∶100000。

2.胶乳：本发明仅示例性的采用直径为200～300nm带羧基基团的聚苯乙烯胶乳颗粒进行实验。

本实施例的主要试剂的配制如下：

试剂R1：含1.0％PEG6000(聚乙二醇6000)，0.09％叠氮钠，0.2％BSA，0.8％NaCl，0.3％吐温20的0.2M氯化铵缓冲液。该试剂为无色透明溶液。

试剂R2：0.1M Tris缓冲液中含0.2％β2-微球蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒、1％BSA，0.2％NaN₃。该试剂为乳白色溶液。具体步骤如下：

1.取1ml(100mg/ml)胶乳，用0.1M(mol/L)，pH5.0的MES溶液(2-吗啉乙磺酸缓冲液)洗涤3次，分散；

2.加入0.05ml用0.1M，pH5.0的MES溶液新鲜配制的EDAC(10mg/ml)混合完全，室温混和1小时；

3.加入0.5ml用0.1M，pH5.0的MES溶液新鲜配制的己二酸二酰肼(100mg/ml)，4℃反应过夜；

4.用0.1M，pH5.0的MES溶液洗涤2次，0.1M，pH7.5的磷酸盐溶液洗涤1次，分散备用；

5.取1.5ml抗体(10mg/ml)溶液，加入0.5ml用0.1M，pH7.5的磷酸盐溶液配制的高碘酸钠溶液(10mg/ml)，室温混合15min，

6.将步骤5中氧化好的抗体加入到步骤4中已激活的胶乳溶液中，4℃反应过夜；

7.加入0.32ml 10％BSA(小牛血清白蛋白)溶液，4℃混合4h；

8.加入0.4ml 10％葡萄糖溶液，4℃混合过夜；

9.用0.1M，pH7.5Tris溶液洗涤3次，加入0.1M，pH7.5Tris溶液(含1％BSA，0.2％NaN₃的Tris缓冲液)至胶乳终浓度为0.2％。

β2-微球蛋白校准品：在0.9％生理盐水中加入不同含量的β2-微球蛋白蛋白，除菌过滤，所述的β2-微球蛋白校准品中β2-微球蛋白含量控制在0～18mg/L之间，这些校准品均为无色透明液体。

实施例2β2-微球蛋白的测定

检测工具：日立7060型自动分析仪。

分析方法：两点终点法；主波长：546nm，副波长：700nm：样品量：3.0ul；试剂R1：240ul；试剂R2：60ul；校准方式：样条函数Spline；反应方向：上升；测定温度：37℃；样品与试剂R1混匀后，于第30秒读取吸光度A₁；于5分钟时加入试剂R2，于5分钟时读取吸光度A₂。反应吸光度的计算为A₂与A₁的校准差值。

计算方法：多点定标，以样条函数作为计算模式，根据吸光度与参考血清的值作剂量/响应曲线，样品含量可根据其吸光度值在剂量/响应曲线上算出。

参考范围：1.0～3.0mg/L

实施例3β2-微球蛋白检测试剂盒各项性能指标测试

1.灵敏度试验

测定6种不同β2-微球蛋白含量的样品，每个样品测10次，通过计算均值和SD值(标准差值)，从表1可见，本发明检测试剂盒的灵敏度为0.08mg/L。

表1

β2-MG(mg/L)	测定次数	均值	2.6SD	M+2.6SD	M-2.6SD
						0	10	0.02	0.031	0.05	-0.02
0.04	10	0.05	0.044	0.10	0.01
						0.08	10	0.10	0.031	0.13	0.07
0.12	10	0.15	0.058	0.21	0.10
						0.16	10	0.19	0.044	0.23	0.14
0.20	10	0.22	0.032	0.25	0.19

2.高值线性测定

测定10个不同β2-微球蛋白含量的样品，每个样品测2次，从表2可见，本发明检测试剂盒的最高检测范围可达到18mg/L，判定依据r²≥0.990。

表2

	β2-MG理论值(mg/L)	β2-MG实际值(mg/L)
			1	0	0.03
2	2	2.08
			3	4	3.91
4	6	5.89
			5	8	8.15
6	10	10.09
			7	12	11.85
8	14	14.22
			9	16	16.29

10

18

18.30

3.精密度试验

使用2个不同β2-微球蛋白含量的人血清样品，测定本发明检测试剂盒的批内精密度。使用3个批号试剂盒分别测定1个人血清样品20次，计算本发明检测试剂盒的批间相对极差。结果表明，本发明检测试剂盒的批内精密度为1.36％和1.62％(见表3)，而批间相对极差为4.03％(见表4)。

表3

	样品1	样品2
			测定次数	20	20
平均值(mg/L)	1.430	11.318
			最小值(mg/L)	1.400	10.840
最大值(mg/L)	1.460	11.560
			标准差(SD)	0.0194	0.1840
变异系数(CV％)	1.36	1.62

表4

4.干扰试验

在同一份人血清样品中分别加入不同含量的干扰物质后进行测定。加入干扰物质后的测定值除以加入干扰物质前的测定值即为影响率，试验结果表明游离胆红素，结合胆红素，血红蛋白以及乳糜微粒的浓度分别在200mg/dl，200mg/dl，5000mg/dl以及21000FTU以下时，它们对测定结果的干扰均在2％以下(见表5)。

表5

5.稳定性试验

在2-8℃贮存条件下，分别在0月、4月、8月、12月和14月对同一血清样本进行测定，每个样本测5次，取均值(结果见表6)。结果表明，4月、8月、12月和14月与0月相比，测得值差异很小，说明本发明的检测试剂盒在2-8℃贮存条件下可稳定一年。

表6

项目	0月	4月	8月	12月	14月
						试剂空白吸光度A₀	0.7871	0.7780	0.7809	0.7951	0.7885
样本测得值	2.463	2.49	2.505	2.52	2.523
						批内CV(％)	1.30	1.32	1.25	1.42	1.57

从上述实施例可知本发明的β2-微球蛋白检测试剂盒具有灵敏度高、特异性好、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的优点。

Claims

1.一种β2-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于：包括试剂R1、试剂R2，所述试剂R1包括缓冲液、防腐剂、稳定剂、电解质、表面活性剂，其余为纯化水；所述试剂R2包括用β2-微球蛋白抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒、缓冲液、防腐剂、稳定剂，其余为纯化水；所述试剂R2的制备步骤包括：

（1）聚苯乙烯胶乳颗粒的激活：在带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，混合反应后加入已二酸二酰肼，继续混合反应，得到激活的聚苯乙烯胶乳颗粒；

（2）β2-微球蛋白抗体的氧化：用高碘酸钠将β2-微球蛋白抗体非结合活性区域Fc端羟基氧化成醛基；

（3）β2-微球蛋白抗体与聚苯乙烯胶乳颗粒的偶联：将步骤（1）激活的聚苯乙烯胶乳颗粒和步骤（2）氧化的β2-微球蛋白抗体混合反应，待反应结束后，再加入葡萄糖封闭聚苯乙烯胶乳颗粒上未反应的基团，得到偶联β2-微球蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳颗粒；

所述步骤（1）中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺:聚苯乙烯胶乳颗粒=0.2～1:100；已二酸二酰肼:聚苯乙烯胶乳颗粒=20～50:100；步骤（2）中高碘酸钠:β2-微球蛋白抗体=1:2；步骤（3）中β2-微球蛋白抗体:激活的聚苯乙烯胶乳颗粒=10～20:100，葡萄糖:激活的聚苯乙烯胶乳颗粒=25～50:100，所述比例均为重量比。

2.根据权利要求1所述的β2-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1与试剂R2的体积比为4︰1。

3.根据权利要求1所述的β2-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1和试剂R2中的缓冲液为PBS缓沖液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、氯化铵缓冲液中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的β2-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0.01～1.5μm。

5.根据权利要求4所述的β2-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为0.05～0.5μm。

6.根据权利要求1所述的β2-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述的β2-微球蛋白抗体为羊抗人多克隆抗体或兔抗人多克隆抗体或鼠抗人单克隆抗体。

7.根据权利要求1所述的β2-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于：还包括β2-微球蛋白校准品。

8.根据权利要求7所述的β2-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述β2-微球蛋白校准品中β2-微球蛋白的含量为0～18mg/L。