CN102628867B - 双抗体胶乳增强视黄醇结合蛋白检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种双抗体胶乳增强视黄醇结合蛋白检测试剂盒，更具体而言，本发明公开了一种检测视黄醇结合蛋白的双抗包被胶乳增强免疫透射比浊试剂盒，其包括试剂1和试剂2以及校准品，其中配对的单克隆抗体A、B分别包被到胶乳颗粒上，包被的抗体与待测RBP结合，多个结合物聚集到一起，形成可以检测到的浊度变化。本发明的检测试剂盒具有灵敏度高的特点，能够检测尿液样本和血清样本，能够作为营养指标检测血清中的RBP，同时通过检测尿液中的RBP，灵敏的反应肾近曲小管损伤的程度。
Description
技术领域
本发明涉及一种双抗体胶乳增强视黄醇结合蛋白检测试剂盒，更具体而言，本发明公开了一种检测视黄醇结合蛋白的双抗包被胶乳增强免疫透射比浊试剂盒，其包括试剂1和试剂2以及校准品。
背景技术
视黄醇结合蛋白(retinolbindingprotein，RBP)由一条多肽链及小部分碳水化合物组成，不含中性糖和氨基已糖，由182个氨基酸构成；分子量为21KD；等电点pH4.4-4.8，半衰期3-12h。
RBP家族分成5类，包括分泌性RBP、细胞内RBP、视黄酸的核受体、视觉组织特异性的细胞外RBP和视觉组织特异性的细胞内RBP。
RBP广泛分布于正常人体液中，具有从肝细胞中转运视黄醇至周围组织的功能。血液中RBP主要以视黄醇、前白蛋白结合的复合物形式存在，当复合物中的视黄醇与靶细胞结合后，RBP便与前白蛋白分离，自肾小球滤出，由近端肾小管上皮细胞吸收、降解。所以当肾小管重吸收功能出现障碍时，尿液中RBP含量升高。有文章表明通过与尿微量白蛋白、尿素、肌酐等指标比较，尿液中RBP是反映肾近曲小管损伤的敏感指标，能够先其他项目出现异常。尿液中RBP的正常值范围是不超过0.7mg/L，要求检测试剂盒具有良好的灵敏度。
RBP主要在肝细胞中合成，作为视黄醇的载体蛋白，在肝内与视黄醇1∶1结合，体内90％的RBP与视黄醇结合形成holo-RBP，释放入血后与前白蛋白以1∶1结合形成三维复合物，共同转运视黄醇至周围组织靶细胞。只有holo-RBP才可入血，在蛋白质营养不良时，肝的蛋白质合成不足，并引起RBP不足，视黄醇不能进入血液，视黄醇对RBP的分泌起调节作用，两者呈正相关性。与前白蛋白一起参与维生素A的转运，血清RBP和血清维生素A含量有高度相关性，认为RBP可以作为反映维生素A缺乏的敏感指标。分析营养性疾病患者的血浆蛋白变化发现血浆RBP的变化早于白蛋白和转铁蛋白，并与氮平衡的相关性高于白蛋白和转铁蛋白，表明血清RBP水平是反映营养性疾病疗效的灵敏、特异性指标。血液中RBP的正常值范围是男36-72mg/L、女22-53mg/L，要求检测试剂盒有较宽的线性范围。
目前检测RBP的方法有单向免疫扩散RID、酶联免疫吸附EIA、免疫比浊等。单向免疫扩散主要是手工操作，试验重复性较差，检测的准确度不高，临床已经不再采用其为定量检测方法。酶联免疫吸附法的检测限较差，并且费时。目前临床进行大量样本检测常采用的方法是免疫比浊法。
目前可以应用到临床进行大量标本检测的方法有免疫比浊即免疫透射比浊和免疫散射比浊。免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂(聚乙二醇等)的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着样本中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出样本中抗原的含量。但是当抗原量很低时，抗原抗体结合物较少，不易形成浊度，所以灵敏度较低。于是在免疫比浊的基础上发展了胶乳增强免疫比浊，其基本原理是：将抗体吸附在大小合适、均匀一致的胶乳颗粒上，当抗体和抗原结合后，易于发生凝集，由于交联了胶乳颗粒使透过光减少，胶乳颗粒起到放大信号的作用，由此可以增大灵敏度。
虽然市场上有多种免疫透射比浊方法的试剂盒，但是由于灵敏度不足，均存在的缺点是同一试剂不能同时血清样本和尿液样本中的RBP，几乎所有试剂盒均是用于血清样本RBP的检测。因此有需要研制一种能检测尿液样本和血清样本中的RBP的试剂盒。
发明内容
因此，本发明的技术目的是提供一种能检测尿液样本和血清样本中的RBP试剂盒。
因此，本发明的第一方面涉及一种检测视黄醇结合蛋白的双抗包被胶乳增强免疫透射比浊试剂盒，其包括试剂1和试剂2以及校准品，其中试剂1是含有具有促进凝聚作用的多聚物的缓冲液，试剂2是含有胶乳-抗体交联物的缓冲液，校准品是血清基质或者尿液基质的至少5个不同浓度的校准液，其特征在于所述试剂2中的抗体是配对的单克隆抗体A和B，单克隆抗体A起到捕获作用，单克隆抗体B起到检测功能，优选地，单克隆抗体A、B选自鼠抗人、鸡抗人、山羊抗人抗体，优选地，选自鼠抗人抗体。
优选地，试剂1中的多聚物选自PEG6000、PEG8000、PEG20000、TWEEN20和TWEEN80，浓度范围为0.5-10％。
优选地，试剂1、试剂2中的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、Tris、MOPS，试剂1的pH范围是6.0-9.0；试剂2的pH范围是5.5-8.5。
优选地，试剂2中单克隆抗体A用量为0.1-0.5mg/ml，单克隆抗体B用量为0.1-0.5mg/ml，优选地，两个单克隆抗体A和B分别与胶乳颗粒进行包被，然后混合均匀，单克隆抗体A和B是兔抗人单克隆抗体或羊抗人单克隆抗体，优选地，单克隆抗体A和B是鼠抗人单克隆抗体。
优选地，制备试剂2的交联方法是化学交联或物理吸附，优选地，化学交联中胶乳是羧基修饰的聚苯乙烯颗粒；物理吸附中胶乳是普通聚苯乙烯颗粒。
优选地，胶乳颗粒的粒径范围为50-200nm，优选地，与两个单抗分别进行包被的胶乳颗粒的粒径相同或不同，优选地，包被时胶乳颗粒的浓度范围为0.1-0.5％。当分别包被的胶乳颗粒粒径不同时，优选地，单抗A包被的胶乳颗粒粒径范围50-150nm，单抗B包被的胶乳颗粒粒径范围50-200nm。
优选地，试剂1、试剂2中均添加防腐剂，优选地，叠氮钠和PC300，优选地，用量在0.01-0.3％。
优选地，试剂1中添加浓度为10-100mmol/L的EDTA。
优选地，用于检测血清的校准品为血清基质，浓度分别为130mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L、12.5mg/L、0mg/L，或类似比例的含量；用于检测尿液的校准品为尿液基质，浓度分别为4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L、0mg/L，或类似比例的含量。
优选地，血清基质校准品和尿液基质校准品均含有0.01-0.1％的叠氮钠、0.01-0.2％的制菌霉素。
最优选地，所述的检测视黄醇结合蛋白的双抗包被胶乳增强免疫透射比浊试剂盒选自如下组合的试剂盒：
试剂盒1：
试剂1组分：
缓冲液MOPS0.15mol/LpH＝6.5，
PEG600010％，
NaN30.1％，
EDTA100mmol/L，
试剂2组分：
缓冲液MOPS0.15mol/LpH＝8.5，
单克隆抗体A0.45mg/ml，其为鼠抗人抗体，抗抗原人尿提取视黄醇结合蛋白，效价大于1∶5000，
胶乳颗粒A，104nm，0.35％，用于包被单克隆抗体A，
单克隆抗体B0.5mg/ml，其为鼠抗人抗体，抗抗原人尿提取视黄醇结合蛋白，效价大于1∶1000，
胶乳颗粒B，77nm，0.5％，用于包被单克隆抗体B，
校准品A：血清校准品，浓度分别为130、100、50、25、12.5、0mg/L，
校准品B：尿液校准品，浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0mg/L，
试剂盒2：
试剂1组分：
缓冲液Tris0.05mol/LpH＝9，
PEG60000.56％，
NaN30.1％，
EDTA10mmol/L，
试剂2组分：
缓冲液Tris0.15mol/LpH＝8.0，
单克隆抗体A0.15mg/ml，其为鼠抗人抗体，抗抗原人尿提取视黄醇结合蛋白，效价大于1∶5000，
胶乳颗粒A，159nm，0.15％，用于包被单克隆抗体A，
单克隆抗体B0.12mg/ml，其为鼠抗人抗体，抗抗原人尿提取视黄醇结合蛋白，效价大于1∶1000，
胶乳颗粒B，195nm，0.11％，用于包被单克隆抗体B，
校准品A：血清校准品，浓度分别为130、100、50、25、12.5、0mg/L，
校准品B：尿液校准品，浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0mg/L。
换言之，本发明中采用配对的单克隆抗体A、B分别包被到胶乳颗粒上，包被到胶乳上的抗体与待测RBP结合，多个结合物聚集到一起，形成可以检测到的浊度变化。通过检测6个或更多个校准品，绘制校准曲线。检测样本时，通过反应吸光度值计算待测样本中RBP的浓度。
本试剂盒由于采用两个单抗和胶乳增强，与RBP形成的结合物比采用单一抗体或者未采用胶乳形成的结合物体积要大，所以具有较高的灵敏度，能够准确的检测尿液中的RBP含量，灵敏的反映肾小管的重吸收功能。同时通过调整抗体用量，本试剂盒能具有较宽的线性范围，用于检测血清中RBP含量，反映营养状况。
本发明采用多点定标，克服了反应吸光度与浓度不是正比例的问题，能够保证检测结果的准确度。
本发明采用双抗体包被胶乳颗粒的思路来源于酶标夹心法ELISA，采用配对的两个单克隆抗体(配对的意思是指单克隆抗体分别与抗原发生反应，确定结合的位点，确保两个单克隆抗体与抗原反应的结合位点不一样，这样两个单克隆抗体可以同时使用；作为捕获抗体的单克隆抗体要求亲和性非常好，检测抗体要求应用到免疫反应中信号高)，单克隆抗体A作为捕获抗体，单克隆抗体B作为检测抗体，当形成两个单克隆抗体、抗原以及其包被的胶乳三部分组成结合物时灵敏度会有更大的改善，同时不影响线性。
本发明采用免疫透射比浊法，市场上有多种免疫透射比浊方法的试剂盒，但是由于灵敏度不足，均存在的缺点是同一试剂不能同时血清样本和尿液样本，几乎所有试剂盒均是用于血清样本的检测，本发明由于采用两个包被到胶乳颗粒上的单克隆抗体提高了检测的灵敏度，所以克服了该缺点。虽然现有技术中(“一种双抗体复合的视黄醇结合蛋白检测试剂盒”，申请号：20100159837.2，公开号：101833009A。)也有涉及用两种抗体来检测视黄醇结合蛋白的试剂盒，但相关文献并未表明两种抗体间存在“配对”的作用，该文献的方法也不是采用胶乳增强的方法。同时，该文献中的双抗体是一个单抗和一个多抗，采用多抗容易造成交叉反应，所以本发明中采用两个单抗有助于避免交叉反应，提高灵敏度。虽然二者反应原理均是免疫反应，但是本发明采用胶乳增强，灵敏度要高。同时，直接将该文献中使用的双抗应用到胶乳增强的免疫透射比浊法时效果也远远没有本发明试剂盒的效果好。同时，该文献没有阐明样本的类型，但是从相关性样本的量值推断应该是血清，因为尿样中的RBP正常含量小于0.7mg/L，所以检测样本的范围本发明要宽；对比文献并未对灵敏度进行详细证明，而本发明的突出优势是灵敏度好。
附图说明：
图1：本发明视黄醇结合蛋白试剂盒的线性回归曲线。
图2：本发明视黄醇结合蛋白试剂盒与国外试剂盒检测尿液测定结果的相关图。
图3：本发明视黄醇结合蛋白试剂盒与国外试剂盒检测血清测定结果的相关图。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
实施例
实施例1：RBP试剂盒1组成
试剂1组分：
缓冲液MOPS0.15mol/LpH＝6.5，
PEG600010％，
NaN30.1％，
EDTA100mmol/L，
试剂2组分：
缓冲液MOPS0.15mol/LpH＝8.5，
单克隆抗体A0.45mg/ml(来源：鼠抗人、抗原：人尿提取视黄醇结合蛋白、效价：大于1∶5000)，
胶乳颗粒A(单克隆抗体A包被使用)104nm0.35％(厂家：JSR羧基量：0.238meq/g、浓度：5％)，
单克隆抗体B0.5mg/ml(来源：鼠抗人、抗原：人尿提取视黄醇结合蛋白、效价：大于1∶1000)，
胶乳颗粒B(单克隆抗体B包被使用)77nm0.5％(厂家：JSR、羧基量：0.274meq/g、浓度：5％)，
校准品：血清校准品，浓度分别为130、100、50、25、12.5、0mg/L，
校准品：尿液校准品，浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0mg/L。
实施例2：本申请试剂盒1的灵敏度性能评价
仪器：奥林巴斯AU400
表1：参数：
尿液校准品4、2、1、0.5、0.25、0mg/L，
对照试剂：
国外某知名品牌A：
其主要组成成分：
试剂R1：GOOD’S缓冲液，
试剂R2：胶乳包被的兔抗人RBP抗体IgG，
检测原理：
胶乳颗粒包被多抗RBP抗体与样本中的RBP抗原结合，形成免疫复合物，在570nm检测其浊度变化，其变化程度与样本中的RBP含量成正比。
尿液校准品5、2.5、1.25、0.625、0.31、0mg/L，
灵敏度评价方法：
将RBP纯品配制的样本进行稀释，使某一浓度接近灵敏度限制，重复10次检测水空白和不同浓度的样本，记录原始数据和反应吸光度，如下表进行计算。
灵敏度检测数据：
(1)实施例1试剂盒1灵敏度性能评价，结果见表2-4。
表2：试剂盒1灵敏度测值1
表3：试剂盒1测量时的吸光度
表4：试剂盒1灵敏度统计评价
(2)对照试剂盒灵敏度评价，结果见表5-7。
表5：对照试剂盒灵敏度测值
表6：对照试剂盒测量时的吸光度
表7：对照试剂盒灵敏度统计评价
评价标准：(A-3sd)大于3SDS0的最低浓度为该检测项目的灵敏度。
结论：本发明的检测尿液RBP的检测试剂盒的灵敏度是0.09mg/L，对照试剂盒的灵敏度为0.2mg/L，本发明试剂盒的灵敏度远远高于对照试剂盒的灵敏度。
实施例3：本申请试剂盒1的线性性能评价
仪器：奥林巴斯400
表8：参数：
血清校准品：浓度分别为130、100、50、25、12.5、0mg/L，
线性评价方法：
将血清样本按照1/10的梯度进行稀释，分别为1/40、1/20、1/10、2/10、3/10、4/10、5/10、6/10、7/10、8/10、9/10、1，每个浓度重复检测3次。以稀释比例为X轴，以测值为Y轴作图，结果见图1。
表9：线性检测数据：
对数据进行线性回归作图，结果见附图1评价标准：检测与理论值比较偏差应在±10％，即可接受。
结论：样本浓度大于130mg/L后检测会出现前带；本发明试剂盒的线性在7-135mg/L。
实施例4本申请试剂盒1的相关性---尿样检测
试剂、校准品、参数均与实施例2中一样；对照试剂为上述国外知名厂家A；样本为尿液。
表10：检测数据：
对所获得的数据进行相关性作图，结果见图2。
结论：对照试剂检测0.15mg/L以下的样本时有时会出现负值；自配试剂与进口试剂的相关系数大于0.99，具有良好的相关性。
实施例5：本申请试剂盒1的相关性---血清样本
试剂、校准品、参数均与实施例4中一样；对照试剂为某国外知名厂家B；样本为血清。
国外某知名品牌B：
主要组成成分：
试剂R1：缓冲液，
试剂R2：胶乳包被的羊抗人抗体，
校准品：150、50、20、10、0mg/L，
表11：检测数据
对所获得的数据进行相关性作图，结果见图3。
结论：自配试剂与进口试剂的相关系数大于0.99，具有良好的相关性。
实施例6：本申请RBP试剂盒2的组分及其测试结果
R1组分：
缓冲液Tris0.05mol/LpH＝9，
PEG60000.56％，
NaN30.1％，
EDTA10mmol/L，
R2组分：
缓冲液Tris0.15mol/LpH＝8.0，
单克隆抗体A0.15mg/ml(来源：鼠抗人、抗原：人尿提取视黄醇结合蛋白、效价：大于1∶5000)，
胶乳颗粒A(单克隆抗体A包被使用)159nm0.15％(厂家：JSR羧基量：0.203meq/g、浓度：5％)，
单克隆抗体B0.12mg/ml(来源：鼠抗人、抗原：人尿提取视黄醇结合蛋白、效价：大于1∶1000)，
胶乳颗粒B(单克隆抗体B包被使用)195nm0.11％(厂家：JSR羧基量：0.128meq/g、浓度：5％)，
校准品：血清校准品，浓度分别为130、100、50、25、12.5、0mg/L，
校准品：尿液校准品，浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0mg/L，
将试剂盒2按照上述实施例2-5的方法进行检测，结果表明其在灵敏度、线性、相关性性能方面与试剂盒1均类似。
Claims (2)
1.一种检测视黄醇结合蛋白的双抗包被胶乳增强免疫透射比浊试剂盒，其包含：
试剂1，组分：
试剂2，组分：
MOPS缓冲液0.15mol/LpH＝8.5，
包被有单克隆抗体A的胶乳颗粒A，粒径为104nm，浓度为0.35％，其中单克隆抗体A的浓度为0.45mg/ml，其为抗-人尿提取的视黄醇结合蛋白的鼠抗人抗体，且效价大于1∶5000，包被有单克隆抗体B的胶乳颗粒B，粒径为77nm，浓度为0.5％，其中单克隆抗体B的浓度为0.5mg/ml，其为抗-人尿提取的视黄醇结合蛋白的鼠抗人抗体，且效价大于1∶1000；
校准品A：
血清校准品，浓度分别为130、100、50、25、12.5、0mg/L；
校准品B：
尿液校准品，浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0mg/L；
其中，单克隆抗体A和单克隆抗体B与抗原的结合位点不同，胶乳颗粒是羧基修饰的聚苯乙烯颗粒。
2.根据权利要求1所述的检测视黄醇结合蛋白的双抗包被胶乳增强免疫透射比浊试剂盒，其中血清基质校准品和尿液基质校准品含有0.01-0.1％的叠氮钠、0.01-0.2％的制菌霉素。
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Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102788881A (zh) * | 2012-08-16 | 2012-11-21 | 北京恩济和生物科技有限公司 | 一种前白蛋白检测试剂盒及其制备方法 |
| CN102841210A (zh) * | 2012-08-30 | 2012-12-26 | 谢兵 | 一种视黄醇检测试剂盒及其制备方法 |
| CN103323596B (zh) * | 2012-10-31 | 2015-06-03 | 武汉生之源生物科技有限公司 | 髓过氧化物酶含量检测试剂盒及其制备方法 |
| CN102944679A (zh) * | 2012-11-15 | 2013-02-27 | 北京康美天鸿生物科技有限公司 | 一种胶乳比浊法进行视黄醇结合蛋白检测的试剂盒 |
| CN103134934B (zh) * | 2013-02-27 | 2014-11-12 | 宁波美康生物科技股份有限公司 | 可以同时检测尿液和血清样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒 |
| CN103525769B (zh) * | 2013-10-10 | 2015-11-18 | 菲鹏生物股份有限公司 | 可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及应用 |
| CN104215770A (zh) * | 2014-08-14 | 2014-12-17 | 上海睿康生物科技有限公司 | 一种基于双粒子的视黄醇结合蛋白检测试剂盒 |
| CN104614528A (zh) * | 2014-12-18 | 2015-05-13 | 江苏昊申医学科技有限公司 | 一种线性范围更宽的视黄醇结合蛋白测定试剂盒 |
| CN106814191A (zh) * | 2015-11-30 | 2017-06-09 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种视黄醇结合蛋白免疫比浊法检测试剂盒 |
| CN106932589A (zh) * | 2015-12-30 | 2017-07-07 | 上海复星长征医学科学有限公司 | 测定人体血清视黄醇结合蛋白含量的试剂盒及其制备方法 |
| CN105911285A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-08-31 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定类风湿因子的试剂盒 |
| CN106093423A (zh) * | 2016-05-31 | 2016-11-09 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定视黄醇结合蛋白的试剂盒及其制备方法 |
| CN106124774B (zh) * | 2016-06-17 | 2018-05-25 | 上海执诚生物科技有限公司 | 基于胶乳免疫比浊法的补体c4试剂盒及其制备方法 |
| CN107490696A (zh) * | 2017-08-10 | 2017-12-19 | 迈克生物股份有限公司 | 一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒及检测方法 |
| CN108508201A (zh) * | 2018-03-27 | 2018-09-07 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 一种癌胚抗原胶乳增强免疫比浊试剂盒 |
| CN108627652B (zh) * | 2018-05-31 | 2019-05-03 | 宁波海壹生物科技有限公司 | 一种基于单粒径并可同时检测血清和尿液样本中视黄醇结合蛋白的试剂盒 |
| CN108761089B (zh) * | 2018-06-29 | 2025-04-04 | 迈克生物股份有限公司 | 用于检测β2-微球蛋白的试剂的制备方法 |
| CN109358199A (zh) * | 2018-10-18 | 2019-02-19 | 郑州标源生物科技有限公司 | 一种视黄醇结合蛋白质控品的制备方法 |
| CN111721938B (zh) * | 2019-03-29 | 2022-11-25 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 糖链抗原125胶乳免疫比浊试剂盒 |
| CN111721946A (zh) * | 2019-03-29 | 2020-09-29 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 糖类抗原19-9免疫比浊试剂盒 |
| CN110007091A (zh) * | 2019-04-02 | 2019-07-12 | 杭州博谱医药科技有限公司 | 一种脂联素检测试剂盒及其制备方法 |
| CN110865192A (zh) * | 2019-11-21 | 2020-03-06 | 安徽大千生物工程有限公司 | 一种基于胶乳增强免疫比浊法测定gp73的试剂盒及其制备使用方法 |
| CN110806487A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-02-18 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 一种用于人肝素结合蛋白检测的试剂盒及其制备方法 |
| CN112763724A (zh) * | 2020-12-26 | 2021-05-07 | 北京安图生物工程有限公司 | 同时测定血清和尿液中视黄醇结合蛋白含量的试剂组合及试剂盒 |
| CN112730848B (zh) * | 2020-12-29 | 2022-03-22 | 中生北控生物科技股份有限公司 | 一种检测视黄醇结合蛋白的试剂盒及方法 |
| CN113092790B (zh) * | 2021-04-02 | 2023-12-15 | 三诺生物传感股份有限公司 | 一种降钙素原的检测试剂盒及其制备方法 |
| CN114047338B (zh) * | 2021-11-10 | 2024-03-12 | 上海捷门生物技术有限公司 | 一种尿液转铁蛋白检测试剂盒及其检测方法 |
| CN116359489B (zh) * | 2022-11-30 | 2025-02-14 | 广州杰博生物科技有限公司 | 一种免疫检测试剂盒及其制备方法和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101356438A (zh) * | 2005-11-24 | 2009-01-28 | 根田股份有限公司 | 评估人半胱氨酸蛋白酶抑制剂c的浊度测定法免疫测定 |
| CN101680891A (zh) * | 2007-11-21 | 2010-03-24 | 爱科来株式会社 | 测定试剂、使用其的免疫比浊法和待测物分析用具 |
| CN102175871A (zh) * | 2010-12-30 | 2011-09-07 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 双胶乳法测定血清或尿液中游离轻链的液体双试剂试剂盒 |
| CN202066863U (zh) * | 2010-10-29 | 2011-12-07 | 厦门大学附属中山医院 | 检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4241301B2 (ja) * | 2003-09-30 | 2009-03-18 | 和光純薬工業株式会社 | 免疫学的測定用試薬 |
| JP4331073B2 (ja) * | 2004-08-31 | 2009-09-16 | デンカ生研株式会社 | 抗原の測定方法及びそのための試薬 |
| JP2007163319A (ja) * | 2005-12-14 | 2007-06-28 | Sanyo Chem Ind Ltd | 免疫測定法及び免疫測定用試薬キット |
| EP2042870A1 (en) * | 2007-09-28 | 2009-04-01 | Fujifilm Corporation | Method of high sensitive immunoassay |
-
2011
- 2011-12-30 CN CN201110454990.2A patent/CN102628867B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101356438A (zh) * | 2005-11-24 | 2009-01-28 | 根田股份有限公司 | 评估人半胱氨酸蛋白酶抑制剂c的浊度测定法免疫测定 |
| CN101680891A (zh) * | 2007-11-21 | 2010-03-24 | 爱科来株式会社 | 测定试剂、使用其的免疫比浊法和待测物分析用具 |
| CN202066863U (zh) * | 2010-10-29 | 2011-12-07 | 厦门大学附属中山医院 | 检测脂联素的颗粒增强免疫透射比浊试剂盒 |
| CN102175871A (zh) * | 2010-12-30 | 2011-09-07 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 双胶乳法测定血清或尿液中游离轻链的液体双试剂试剂盒 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Continous-flow system for automation of latex immunoassay by particle counting.;Alfred M.Bernard等;《Clin Chem》;19831231;第29卷;第1007页右侧栏"试剂"部分 * |
| Development of a new microparticle-enhanced turbidimetric assay for C-reactive protein with superior features in analytical sensitivity and dynamic range.;Shinichi Eda等;《J Clin Lab Anal》;19981231;第12卷;第137页右侧栏最后一段－第138页右侧栏第1段，第139页左侧栏第3段，第143右侧栏第1段 * |
| Development of a rapid latex enhanced turbidimetric assay for retinol binding protein in urine.;H Thakkar等;《Ann Clin Biochem》;19911231;第28卷;第407页右侧栏－第408页右侧栏第3行 * |
| Latex immunoassay of retinol-binding protein.;Alfred M.Bernard等;《Clin Chem》;19821231;第28卷;第1167页右侧栏－第1168页左侧栏"试剂"部分 * |
Also Published As
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