CN102550542B - 用于脂肪干细胞的无血清冻存液及脂肪干细胞库的建立 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于脂肪干细胞的无血清冻存液及脂肪干细胞库的建立。本发明的无血清冻存液包括无血清培养基、二甲基亚砜(DMSO)和血清替代组分。本发明解决了脂肪干细胞冻存质量不稳定以及血清中的有害因子对细胞影响的缺陷，用本发明无血清冻存液保存的脂肪干细胞具有成活率高、贴壁生长好、纯度高、分化能力强的优点。

Description

用于脂肪干细胞的无血清冻存液及脂肪干细胞库的建立

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及用于脂肪干细胞的无血清冻存液及脂肪干细胞库的建立。本发明冻存液克服了传统血清冻存液的缺陷，且经济有效，用本发明的冻存液建立的脂肪干细胞库，脂肪干细胞保存完好，具有很强的分化能力。

背景技术

干细胞(stem cells，SC)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。胚胎、婴儿或成人都具有持久或终身自我更新能力的干细胞，具有产生特异的细胞类型、形成人体组织和器官的潜能。根据发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞虽然能分化为多种不同的组织，但在细胞分化调节和伦理上局限性限制了其临床应用。间充质干细胞是目前备受关注的一类具有多向分化潜能的成体干细胞，间充质干细胞可在体外培养扩增，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞以及肌肉细胞等多种组织细胞

骨髓干细胞、脐带干细胞和脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)近年来研究较多。骨髓干细胞由于不易取材、扩增较慢、对于体弱和老年患者不适用以及伦理等问题，给临床应用带来不便。脐带间充质干细胞与骨髓干细胞相比来源较广泛，免疫原性低，几乎无免疫排斥反应。脂肪干细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，它与骨髓干细胞、脐带干细胞相比有很多优点，研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，生长均匀、对机体损伤小等优点，而且其来源广泛、体内储备量大、适宜自体移植、安全性能高，脂肪干细胞库的建立逐渐成为近年来新的研究热点之一。

由于人脂肪间充质干细胞分离培养周期较长，原代细胞铺满的时间约2周以上，达到一定的数量需要3周左右。人脂肪间充质干细胞体外长期培养传代容易发生自发分化，失去其多向分化的潜能。所以为保证实验的连续性，必须随时提供大量的实验或组织工程用的种子细胞。因此建立一种行之有效的冻存方法是必要的，通过检测人脂肪间充质干细胞在冻存复苏后的细胞周期，细胞表型和成脂的多向分化潜能来鉴定冻存方法的可靠性。

目前冻存多采用血清进行冻存，血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，其优势主要体现在：

(1)含有丰富的细胞生长所必须的营养成份，充分支持细胞生长；

(2)血清中的大量蛋白对细胞起到一定的保护作用；

(3)为细胞的体外培养提供了细胞增殖所必需的生长因子和微量元素；

(4)为贴壁依赖细胞提供贴壁因子。

然而冻存液中使用动物血清也存在多种缺点，主要包括：

(1)血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应(如精胺、亚精胺)形成有细胞毒性作用的聚精胺；补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡；

(2)动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致；

(3)取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性；

(4)血清成本高，每500ml血清价格可高达3000-4000元；

(5)血清的活体采集对动物有一定损害。

目前还没有严格意义上的适用于脂肪干细胞和脂肪干细胞建库的无血清冻存液，因此本领域迫切需要开发新颖有效的且适合脂肪干细胞的无血清冻存液。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效的可用于脂肪干细胞的无血清冻存液及其应用，避免含有血清的冻存液在临床使用中可能存在的风险。

本发明的另一目的是提供一种新型高效的脂肪干细胞库及其建立方法。

在本发明的第一方面，提供了一种无血清冻存液，所述冻存液包括以下组分：无血清培养基、二甲基亚砜(DMSO)和血清替代组分Knockout^TM SerumReplacement(KSR)，且所述冻存液不含血清。

在另一优选例中，所述无血清冻存液按体积计，无血清培养基的含量为a，a选自5％-15％(v/v)，DMSO含量为b，b选自8％-20％(v/v)，KSR含量为c，c选自70％-85％(v/v)，且a+b+c≤100％。

在另一优选例中，按体积计，a选自8-12％(v/v)，b选自10-14％(v/v)，c选自75-80％(v/v)。

在另一优选例中，按体积计，a为10％(v/v)，b为12％(v/v)，c为78％(v/v)。

在另一优选例中，所述无血清培养基选自：DEME培养基、UltraMEM培养基。

在另一优选例中，所述无血清培养基的为市售DEME培养基，并包含适量胰岛素、转铁蛋白、青霉素和链霉素。

在本发明的第二方面，提供了一种本发明第一方面所述无血清冻存液的用途，它被用于长期保存脂肪干细胞和/或建立脂肪干细胞库。

在本发明的第三方面，提供了一种脂肪干细胞混合物，所述混合物包括以下组分：

脂肪干细胞，和

本发明第一方面所述的无血清冻存液。

在本发明的第四方面，提供了一种脂肪干细胞库，所述脂肪干细胞库含有本发明第三方面所述的脂肪干细胞混合物。

在另一优选例中，所述脂肪干细胞和无血清冻存液的混合物用程序梯度降温后，液氮保存。

在另一优选例中，所述细胞库中的复苏后的脂肪干细胞具有诱导成脂的能力。

在另一优选例中，所述细胞库中的复苏后的脂肪干细胞的存活率≥90％。

在另一优选例中，所述细胞库中的复苏后的脂肪干细胞的存活率≥95％。

在本发明的第五方面，提供了一种本发明第四方面所述脂肪干细胞库的用途，它被用于长期保存脂肪干细胞。

在本发明的第六方面，提供了一种脂肪干细胞库的建立方法，包括步骤：

(i)对获得的含脂肪干细胞的脂肪组织材料进行洗涤，获得去除了血细胞的脂肪组织；

(ii)对步骤(i)得到的脂肪组织进行消化，得到经消化的脂肪组织混合物；

(iii)对上一步骤获得的经消化的脂肪组织混合物进行过滤，去除未消化的组织块，获得含脂肪干细胞的滤液；

(iv)对上一步骤获得的滤液进行离心，弃去上层的脂肪，得到的沉淀为脂肪干细胞；

(v)对步骤(iv)得到的脂肪干细胞进行接种传代，得到脂肪间充质干细胞；

(vi)消化上一步骤的脂肪间充质干细胞，得到分散的脂肪干细胞；

(vii)用本发明第一方面所述的无血清冻存液与步骤(vi)得到的脂肪干细胞混合，低温保存，得到脂肪干细胞库。

在另一优选例中，步骤(ii)所述的消化为胶原酶消化，较佳地胶原酶I消化。

在另一优选例中，步骤(vi)所述的消化为胰蛋白酶消化。

在另一优选例中，步骤(vii)包括用所述的无血清冻存液与步骤(vi)得到的脂肪干细胞混合，得到脂肪干细胞混合物，降温后液氮保存所述混合物，得到脂肪干细胞库

在另一优选例中，步骤(vii)中使用程序降温法梯度降温，较佳地降温速率为-1至-2℃/min。

在另一优选例中，步骤(vii)中当温度到达-25℃以下时，降温速率调至-5至-10℃/min。

在另一优选例中，步骤(vii)中当温度达到-100℃时，将脂肪干细胞直接保存于液氮中。

在本发明的第七方面，提供了一种自体移植组合物，所述自体移植组合物包括：

有效量的用本发明第一方面无血清冻存液保存后复苏的脂肪干细胞，或来源于本发明第四方面所述的脂肪干细胞库保存后复苏的脂肪干细胞，和

至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了普通有血清冻存液处理的脂肪干细胞和本发明的无血清冻存液处理的脂肪干细胞的复苏结果。

图1A为普通有血清冻存液处理组的细胞复苏结果。

图1B为本发明无血清冻存液处理组的细胞复苏结果。

图2显示用流式细胞仪检测用本发明(配方见实施例3)的无血清液冻存的脂肪间充质干细胞复苏后表面标志抗原蛋白的鉴定结果，表明该脂肪干细胞的纯度很高。

图2A显示复苏后的脂肪干细胞含有CD34的比例为0％。

图2B显示复苏后的脂肪干细胞含有CD45的比例为0％。

图2C显示复苏后的脂肪干细胞含有CD29的比例为98.9％。

图2D显示复苏后的脂肪干细胞含有CD73的比例为93.5％。

图2E显示复苏后的脂肪干细胞含有CD90的比例为96.3％。

图2F显示复苏后的脂肪干细胞含有CD 105的比例为73.3％。

图3显示用本发明的无血清液冻存液(配方见实施例3)冻存的脂肪干细胞复苏后成脂肪诱导结果。

图3A为复苏后的脂肪干细胞在成脂诱导培养基中的诱导结果，表明用本发明(配方见实施例3)的无血清液冻存液处理的脂肪干细胞在复苏后具有很强的成脂能力。

图3B显示复苏后的脂肪干细胞在普通培养基中生长，不具有成脂能力。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，虽然多数血清替代品不适合在冻存液中替代血清，但是用KSR配制的特定无血清冻存液居然能够获得优于含血清冻存液的冻存效果，从而首次建立了一种新颖的用于脂肪干细胞长期保存的无血清冻存液。本发明的冻存液克服了传统血清冻存液的缺陷，用本发明的冻存液建立脂肪干细胞库，脂肪干细胞保存完好，具有很强的分化能力，在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“以上”和“以下”包括本数，例如“95％以上“指≥95％，“0.2％以下”指≤0.2％。

术语“不含血清”或“基本上不含血清”可互换使用，指血清组分的含量≤0.1％，较佳地≤0.01％，更佳地≤0.005％(如0％)，按冻存液的总重量计。

脂肪干细胞(ADSCs)

如本文所用，术语“脂肪干细胞”指分离自脂肪组织的干细胞，具体地，脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。在本发明中，脂肪组织或脂肪原料没有特别限制，可以是来源于动物或人的任何部位的脂肪组织，优选人的脂肪组织。较佳地，脂肪组织可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的组织。ADSCs能够在体外稳定增殖且衰亡率低，它取材容易、体内储备量大、适宜大规模培养、对机体损伤小、来源广泛、适宜自体移植。

无血清培养基

如本文所用，术语“无血清培养基”指可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的基本上不含血清的培养基。适用于非本发明的无血清培养基没有特别限制，可以是任何适用于培养或保存干细胞(尤其是脂肪干细胞)的无血清培养基。

一般，无血清培养基的基本成分包括(但不局限于)：

无机盐：无机盐可以调节细胞渗透压、调节酶的活性以及溶液酸碱度，一般包括：CaCl₂、KCl、MgSO₄、NaCl、NaHCO₃、NaH₂PO₄等。

氨基酸：氨基酸是细胞合成蛋白质的必须原料，一般包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、组氨酸、酪氨酸。精氨酸和半胱氨酸等。

维生素：维生素是维持细胞牺牲的一种生物活性物质，形成辅基或辅酶。脂溶性维生素一般包括：VA、VD、VE和VK等，水溶性维生素一般包括叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素和硫胺素等。

碳水化合物：碳水化合物是细胞的能量来源，也是和蛋白质和核酸的组分，葡萄糖是最主要的碳水化合物组分。

微量元素：微量元素具有促进细胞生长，活化酶蛋白功能的重要组分，硒是最常见的微量元素。

生长因子及激素：不同的细胞可以添加不同的生长因子和激素，如胰岛素等。

促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，促贴壁物质一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。

无血清培养基还可以包括抗生素，常用抗生素包括但不局限于青霉素、链霉素，其终浓度一般为20-100mg/ml，较佳地50mg/ml。

本领域技术人员可以通过常用方法配制无血清培养基，也可以购买市售的各种无血清培养基，其中包括(但并不限于)：DEME无血清培养基、UltraMEM无血清培养基等。

二甲基亚砜(DMSO)

二甲基亚砜是一种含硫有机化合物，常温下为无色无臭的透明液体，具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。在细胞培养中，DMSO可以作为渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。

无血清冻存液

本发明提供了一种有效的可用于脂肪干细胞的无血清冻存液，包括组分：

无血清培养基、二甲基亚砜(DMSO)和血清替代组分Knockout^TM SerumReplacement(KSR)，且所述冻存液不含血清。

通常，按体积计，无血清培养基的含量为5％-15％，DMSO含量为8％-20％，KSR含量为70％-85％。在另一优选例中，按体积计，无血清培养基含量为8-12％，DMSO含量为10-14％，KSR含量为75-80％，更佳地，无血清培养基含量为10％，DMSO含量为12％，KSR含量为78％。

细胞冻存

细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。如果在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，严重时引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞，贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞冻存中最重要的部分是细胞冻存液。传统的细胞冻存液含有动物血清，主要为胎牛血清和/或小牛血清。血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种极其复杂的混合物，其一部分组成成份尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件的不同而不同。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、无机物等。

本发明采用含有无血清培养基和血清替代品的冻存液进行细胞冻存，既排除了动物细胞血清带来的缺陷，又能保证细胞冻存和复苏的效果。

细胞冻存时可采用常规的设备和方法进行。在优选例中，可采用程序降温法，降温盒材质通常为聚碳酸脂、高密度聚乙烯和泡沫，并需要异丙醇和机械冷冻装置。冷却速率可调，并且可以重复进行，从而满足了细胞冻存和复原的需要。一种典型的降温程序为：降温速率-1至-2℃/min；当温度到达-25℃以下时，可调至-5至-10℃/min；当温度达到-100℃时，可以迅速浸入液氮中。细胞在液氮中可以长期保存达数十年或更久。

细胞库

如本发明所用，“细胞库”一词指经一定程序降温后、长期保存在特定冻存液中的一类细胞群。细胞库中的细胞可以来源于人；也可以来源于(非人)哺乳动物，如大鼠、小鼠、猴、猫、羊等；也可以来源于禽类，如鸡。细胞可以来源于不同的器官和组织，如：口腔、肾、肝脏、淋巴、肌肉、卵巢等。细胞库中的细胞保存时间可以长达数十年或更久。

细胞复苏

如本发明所用，“细胞复苏”一词是指休眠的细胞重新活化的过程。一般采用本领域技术人员所熟知的程序即快速复苏法，将冷冻管迅速由液氮转入到温水浴中，较佳地37℃-40℃，不定时搅拌加速解冻；细胞完全解冻后，对冷冻管进行消毒；将解冻后清洗细胞并重悬，转移到细胞培养瓶，CO₂孵箱中培养；检查细胞存活率及活力。

细胞贴壁

如本发明所用，“细胞贴壁”一词是指正常细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子，可以在该表面上生长，繁殖。当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态，即成纤维样细胞性或上皮样细胞。贴壁生长有接触抑制的现象，在动物细胞培养中，要用胰蛋白酶处理，使贴壁细胞脱落。而肿瘤细胞就没有这些特性，可以悬浮培养。

干细胞抗原检测

用本发明方法冻存的脂肪干细胞在复苏后具有很高的纯度，可通过细胞表面抗原的检测加以验证。

脂肪干细胞具有多种特异性抗原和受体，主要有CD3、CD13、D29、CD34、CD45、CD49e、CD59、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC等。

CD34抗原是一种高度糖基化I型跨膜蛋白，它选择性的表达于人类造血干细胞(HSC)，祖细胞(PC)和血管内皮细胞(EC)表面，带有CD34的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≤0.2％，更佳地，≤0.2％。

CD45存在于所有造血细胞的表面，包括造血干细胞和破骨细胞。带有CD45的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≤0.1％。

CD29、CD73、CD90、CD105等主要存在于脂肪间充质干细胞表面。

带有CD29的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≥95％，更佳地≥97％，最佳地≥98％。

带有CD73的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≥80％，更佳地≥90％，最佳地≥93％。

带有CD90的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≥80％，更佳地≥90％，最佳地≥95％。

带有CD 105的脂肪干细胞在总干细胞的比例优选为≥70％，更佳地≥72％，最佳地≥75％。

本领域内技术人员可以使用通用的方法检测脂肪干细胞的纯度和分化程度，如流式细胞仪法。检测时，加入不同的与有针对性的特异抗体，抗体可以是完整的单克隆或多克隆抗体，也可以是具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。加入抗体与细胞表面的抗原结合一定时间，用流式细胞仪对细胞进行自动分析和分选。

成脂诱导及检测

由于脂肪干细胞具有多向分化能力，在一定的条件下对脂肪干细胞进行分化诱导，能够得到特定功能的已分化的细胞。

本领域内技术人员可以使用通用的方法对脂肪干细胞进行成脂诱导。一种优选的诱导方法是向培养液中加入地塞米松，含地塞米松诱导培养基主要有3种：1.地塞米松加1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(IBMX)，2.地塞米松加胰岛素，3.地塞米松加茚甲新(indomethacin)、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤及胰岛素。诱导培养基中最重要的是地塞米松，低浓度的地塞米松是无血清或低血清培养间充质干细胞的必需成分之一，能够促进间充质干细胞的体外快速增殖；较高浓度的地塞米松则可以诱导间充质干细胞向脂肪细胞分化。

本领域内技术人员可以使用通用的方法和染料(如Oil Red、苏丹红5B和溶剂红27等)对脂肪干细胞诱导成脂进行检测。一种优选的染料是Oil Red(O)，即油红O。油红O的结构为1-2，5-二甲基-4-(2，5-二甲基苯偶氮)苯偶氮-2萘酚，是一种红色粉末，油溶性偶氮染料，易溶于苯、乙醇和丙酮。成脂肪诱导的过程中，细胞在胞浆中不断有油滴的累积，并不断的增加变大，最后整个细胞的胞浆中都是油滴。油红O作为生物染色剂，易与油脂结合，但与细胞本身的结构着色力差。在显微镜下可以清楚地进行成脂染色观察。

自体移植组合物和施用方式

本发明还提供了一种自体移植组合物，可用于抗衰老等多种用途。自体移植组合物包括有效量的、经本发明无血清冻存液保存后并复苏的脂肪干细胞，在一个优选例中还可以包括至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，对于含脂肪干细胞的组合物，优选形式为液态剂型

配制好的自体移植组合物可以通过常规途径进行给药或施用，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

使用本发明的自体移植组合物时，是将安全有效量的脂肪干细胞施用于人，其中该安全有效量通常为10⁵-10⁸细胞/人/次，更佳地为10⁶-10⁷细胞/人/次。当然，具体剂量还应考虑施用途径、施用对象的健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的无血清冻存液的主要优点包括：

(1)成分清晰，不含对细胞有害的成分；

(2)质量稳定，无批次间的营养成分含量的浮动现象；

(3)冻存后细胞复苏好，成活率高；

(4)冻存后细胞抗原特征保持稳定，纯度高；

(5)保存的脂肪干细胞复苏后具有很强的分化能力。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

分离脂肪干细胞

1.试剂和耗材

无菌长柄手术镊

无菌滤网

50ml离心管

培养瓶

DMEM(购于Hyclone公司)无血清培养基

0.125％胰蛋白酶-0.01％EDTA溶液

0.1％胶原酶I配制方法(现配现用)：称取0.1g胶原酶I粉末溶解于100ml未加任何因子的培养基中，用之前37℃预热。

2.分离脂肪干细胞

2.1.洗涤脂肪组织(除去血细胞)：向含有脂肪的离心管中加入等量的生理盐水，拧紧盖子，晃动3min以充分洗涤脂肪组织，接着静止3-5min，使不同相分离，吸去下层水相；重复以上操作三次，直到下层液较为清澈。

2.2.胶原酶消化：吸弃生理盐水后，加预热的与脂肪等体积的含0.1％胶原酶I的DMEM，置恒温振荡器中，37℃，200rpm，消化1h，每隔15min晃动离心管5-10秒(使脂肪与胶原酶I充分接触)；

2.3.收集沉淀：消化完毕，2000rpm离心10min，弃去上层消化后的脂肪，收集两管的底层沉淀至一个新离心管，加DMEM至50ml，1000rpm离心8min洗涤一次；

2.4.过滤并计数：加DMEM至50ml，混匀，100μm滤器过滤去除为消化的组织块，加DMEM至50ml，吸取1ml计数细胞量及活力。

实施例2

脂肪干细胞的培养

1.接种：将实施例1中分离的脂肪干细胞1000rpm离心8min，洗涤一次，根据计数细胞的量调整接种密度接种至T75培养瓶(接种密度：一般每个T75培养瓶中接种12ml抽脂脂肪量，即50ml抽脂脂肪分离得到的细胞接种到4个T75培养瓶)，置37℃、5％CO₂培养。

2.传代：细胞接种后约1-2天贴壁，3天左右出现少量贴壁间充质干细胞，培养5-7天贴壁细胞呈集落时，用0.125％胰蛋白酶-0.01％EDTA溶液消化传代，每个T75培养瓶加入2ml消化液，消化时间为1.5-2.5min，收集并计数细胞，按5×10³/cm²(即根据原代贴壁情况1∶1-2的比例)传代，传代后细胞生长变快，一般三天即可再次传代，根据细胞生长情况，按照1∶2-3的比例传代，一般情况下，P2代脂肪间充质干细胞的数目多于2×10⁷。

实施例3

细胞冻存

1.试剂和耗材

2ml冻存管

5ml移液管

10ml移液管

50ml离心管

3ml塑料吸管

40μm细胞过滤器

Nalgene程序降温盒(市售货号5100-0001c)

0.25％胰酶-EDTA

DMSO

无血清培养基(购于ScienCell公司，货号7511)：该市售的无血清培养基属于DMEM培养基，并含适量胰岛素、转铁蛋白、青霉素和链霉素。

血清替代品：Knockout^TM Serum Replacement(KSR)，(购于Invitrogen，货号10828028)

无血清冻存液：按体积计，10％的无血清培养基+12％DMSO+78％血清替代品KSR

普通冻存液：按体积计，10％的胎牛血清+10％DMSO+80％DMEM

2.冻存

2.1观察需冻存的细胞形态，当细胞融合度达85％-90％后，消化细胞。

2.2消化后向每个培养容器中加入无血清培养基适量(2-3ml/75cm²)，反复吹打容器底或摇动容器至细胞大部分脱落，移入50ml离心管中，原培养容器中加入4-5ml PBS冲洗容器壁，洗涤液合并加入离心管中，210g离心10min。

2.3细胞洗涤：将离心管中上清液弃去，向每个离心管中加入2-4ml PBS，用5ml移液管轻轻吹打均匀，合并15-20个离心管中的细胞悬液至一个离心管中，210g离心10min，进行洗涤。

2.4向细胞悬液中沿管壁缓缓加入与管内已加入无血清细胞冻存液，轻轻吹打混匀。(冻存密度范围：0.5-2×10⁷/ml)，另一组加入普通含血清细胞冻存液，每组5个样本。

2.5将需冻存的细胞置于装有异丙醇的程序降温盒中，使用前注意异丙醇的量及异丙醇的使用次数，按规定及时添加及更换异丙醇。于-80℃冰箱过夜，该降温盒保持-1℃/min的降温速率，次日移入液氮罐，即为构建的脂肪干细胞库。

实施例4

细胞复苏

1.试剂和耗材：

5ml移液管

10ml移液管

3ml塑料吸管

50ml离心管

4℃预冷的PBS溶液

75％乙醇

2.复苏

2.1恒温水浴箱的温度调节至40℃；从液氮中取出细胞冻存管，立即投入40℃温水中轻轻晃动，直至冻存液完全融解；

2.2用75％乙醇擦拭冻存管盖子，火焰烧灼冻存管盖子；打开冻存管盖子，将管中细胞悬液转移至50ml离心管中(注意动作轻柔)，再往冻存管中加入1ml 4℃预冷PBS，吹打洗涤，尽量将管内残留细胞一并移入50ml离心管中，轻轻吹打混匀；

2.3重复上述操作，将2-3个冻存管内细胞悬液及其洗涤液合并入1个50ml离心管内，往离心管中缓缓加入4℃预冷PBS(加入比例：10-15ml/每冻存管)，210g离心8min，弃上清液；可合并2-3个离心管内细胞至1个50ml离心管中，缓缓加入4℃预冷PBS，定容至45ml(或按比例定容：15-20ml/每离心管)，轻轻吹打混匀，取样10μl进行计数，并计算细胞活率，210g离心10min，沉淀即为得到的复苏后细胞群。

实施例5

测定复苏的脂肪干细胞存活率

用实施例3配制的无血清冻存液冻存第三代脂肪干细胞，一个月后进行细胞复苏，分成五组，制成1×10⁵/mL浓度的单细胞悬液，取9滴移入EP管内，每管加1滴浓度为0.4％的苔盼蓝溶液，2min内用血球计数板进行细胞计数，并计算存活率。对照组为普通冻存液冻存后复苏的细胞经上述相同的处理。

试验结果如表1所示。

表1复苏后存活率

组别	普通含血清冻存液	本发明的无血清冻存液
			1	89.0％	95.5％
2	90.5％	93.5％
			3	91.0％	94.5％
4	93.5％	95.5％
			5	96％	95.0％
平均值	92％	94.8％

由表1结果可以看出，用本发明的无血清冻存液冻存的细胞复苏后存活效率平均值为94.8％，而普通含血清冻存液冻存的细胞复苏后存活效率平均值为92％，本发明的无血清冻存液效果较好。

实施例6

本发明无血清冻存液冻存时间的测定

为了检测用本发明无血清冻存液(配方见实施例3)制备的细胞库的冻存效率，本发明人将冻存一个月、三月个、六个月的脂肪干细胞进行复苏，每组五个，用实施例4的方法染色后计数，结果见表2。

表2

组别	冻存1个月复苏	冻存3个月复苏	冻存6个月复苏
				1	94.5％	95.5％	91.0％
2	93.5％	93.0％	96.5％
				3	95.0％	92.5％	95.0％
4	94.5％	94.5％	93.5％
				5	95.0％	96.5％	95.5％
平均值	94.5％	94.4％	94.3％

结果：细胞冻存1个月，3个月，6个月的细胞存活率平均值分别为：94.5％、94.4％、94.3％，细胞复苏状态良好，细胞库性能稳定。

实施例7

细胞贴壁率测定

分别将本发明的无血清冻存液(配方见实施例3)处理的和对照冻存液处理的复苏的细胞按照每孔5×10⁴个细胞量接种于24孔培养板内，每组细胞接种3孔，培养1天，观察细胞贴壁情况。

结果见图1。图1A为本发明的无血清冻存液处理组复苏后贴壁结果，图1B为对照组复苏后贴壁结果，结果表明，用本发明无血清冻存液冻存后复苏后的细胞，细胞活率较高，贴壁效果良好。

实施例8

干细胞表面标志的鉴定

将本发明冻存液(配方见实施例3)处理的细胞和对照组的细胞分别复苏后，将干细胞离心、重悬；计数细胞，然后将细胞浓度调整为l×10⁸/L，离心5min，弃上清，用4℃的冷D-Hanks冲洗重悬细胞，再次将细胞悬液以800r/min，离心5min，之后弃去上清。然后用D-Hanks将细胞重悬至1mL，加入抗体5-10μl，避光，冰上放置30min。D-Hanks冲洗，离心弃上清，重复该冲洗过程2-3次，确保将未结合抗体除净最后，加入约200至300μL的D-Hanks制成悬液，用流式细胞仪检测。加入的抗体分别为：人抗CD34、CD45、CD29、CD73、CD90和CD 105。

结果见图2，图2A为CD34单克隆抗体流式细胞仪测定图谱，CD34的含量为0％；图2B为CD45单克隆抗体流式细胞仪测定图谱，CD45的含量为0％；图2C为CD29单克隆抗体流式细胞仪测定图谱，CD29的含量为98.9％；图2D为CD73单克隆抗体流式细胞仪测定图谱，CD73的含量为93.5％；图2E为CD90单克隆抗体流式细胞仪测定图谱，CD90的含量为96.3％；图2F为CD 105单克隆抗体流式细胞仪测定图谱，CD 105的含量为73.3％。

干细胞表明抗原分析结果见表3。

表3

表面抗原

CD34

CD45

CD29

CD73

CD90

CD105

结果

0％

0％

98.9％

93.5％

96.3％

73.3％

结论：对本发明的无血清冻存液冻存处理的脂肪干细胞复苏后，进行细胞表面抗原标记分析表明，所述干细胞的纯度非常高，基本上都是脂肪间充质干细胞。例如98.9％具有CD29表面抗原(一种公认的脂肪干细胞特异性抗原)，而没有CD34抗原(一种典型的造血干细胞表面抗原)，也没有细胞(0％)具有CD45抗原(一种已知位于白细胞表面的典型抗原)。

实施例9

脂肪干细胞的成脂诱导及检测

本发明冻存液制备人脂肪干细胞细胞库(实施例3)，复苏后，将干细胞以2×10⁵细胞/孔接种于6孔培养板。以正常培养基培养干细胞作为阴性对照组。

培养及诱导方法：向基础培养基(DMEM+10％胎牛血清)中加入终浓度分别为1μmol/L的地塞米松、10μmol/L的胰岛素、200μmol/L的吲哚美辛和0.5mmol/L的异丁基甲基黄嘌呤，配制成脂诱导培养基，每周换2次液，直到进行成脂染色观察为止，以上对照组均做平行实验(n＝3)。

油红O染色方法：

染色：小心轻缓倒去培养液，用D-hanks轻缓漂洗，加10％中性甲醛固定细胞膜30mi n。加入0.5％油红0(六孔板加1.5ml)，染色10min-1h左右。

脱色，75％酒精/60％异丙醇漂洗，除去多余的染料；复染，淡苏木染色1min，PBS漂洗；甘油明胶封片，显微镜观察

每组样本随机选取5-10个视野进行拍照观察以考察共培养方法的成脂诱导分化效果。脂肪呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色。

结果表明，在成脂诱导剂的作用下，用本发明的无血清冻存液处理的脂肪干细胞在复苏后仍然具有分化为脂肪细胞的能力(图3)，图3A中可以看到成脂分化后的细胞内出现大量密集在一起的小脂滴(红色)，图3B为阴性对照，为未经诱导分化的干细胞。

实施例10

不同种类无血清培养基(血清替代品)冻存细胞效果比较

为了验证本发明无血清冻存液的效果，本发明人选用另一种无血清冻存液(血清替代品)：市售的HyClone公司的FetalClone III(SH30109.01)作为对比。

本发明冻存液：10％的无血清培养养基+12％DMSO+78％KSR(按体积计)

对照组冻存液：10％的无血清培养养基+12％DMSO+78％FetalClone III(按体积计)

取第三代的冻存一个月的细胞，复苏后按照实施例5的方法进行活细胞计数。

结果见表4。

表4

测试结果意外地显示：未使用任何血清的本发明无血清冻存液处理细胞的复苏效果最好，优于对照组的其他无血清冻存液和含血清的冻存液。

这表明，虽然多数血清替代品不适合在冻存液中替代血清，但是本发明的含KSR的无血清冻存液能够获得优于含血清冻存液的冻存效果，因此本发明的无血清冻存液非常适用于脂肪干细胞的冻存。

实施例11

不同配比的无血清冻存液冻存细胞效果比较

在本实施例中，测试了4种不同配比的本发明无血清冻存液，配方见表5。

按照实施例3的方法分别制备细胞库，冻存3个月以后，按照实施例4方法将库内的脂肪干细胞复苏，用实施例5所述方法测定细胞存活率。

表5

组别	配方(按体积计)
		1	7％的无血清培养基+8％DMSO+85％KSR
2	10％的无血清培养基+12％DMSO+78％KSR
		3	15％的无血清培养基+15％DMSO+70％KSR
4	5％的无血清培养基+15％DMSO+80％KSR

结果表明，用4种不同配比的本发明无血清冻存液制备的细胞库，复苏后的脂肪干细胞存活率都很高(约为93-95％)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种无血清冻存液，其特征在于，包括以下组分：无血清培养基、二甲基亚砜即DMSO和血清替代组分Knockout^TM Serum Replacement即KSR，且所述冻存液不含血清；且

按体积计，无血清培养基的含量为a，a选自5%-15%(v/v)，DMSO含量为b，b选自8%-20%(v/v)，KSR含量为c，c选自70%-85%(v/v)，且a+b+c≤100%。

2.如权利要求1所述的无血清冻存液，其特征在于，a选自8%-12%(v/v)，b选自10%-14%(v/v)，和/或c选自75%-80%(v/v)。

3.权利要求1所述无血清冻存液的用途，其特征在于，它被用于长期保存脂肪干细胞和/或建立脂肪干细胞库。

4.一种脂肪干细胞混合物，其特征在于，所述混合物包括以下组分：

脂肪干细胞，和

权利要求1所述的无血清冻存液。

5.一种脂肪干细胞库，其特征在于，所述细胞库含有权利要求4所述的脂肪干细胞混合物。

6.如权利要求5所述的细胞库，其特征在于，所述脂肪干细胞和无血清冻存液的混合物用程序梯度降温后，液氮保存。

7.如权利要求5所述的细胞库，其特征在于，所述细胞库中的复苏后的脂肪干细胞具有诱导成脂的能力。

8.如权利要求5所述的细胞库，其特征在于，所述细胞库中的复苏后的脂肪干细胞的存活率≥90%。

9.权利要求5所述脂肪干细胞库的用途，其特征在于，它被用于长期保存脂肪干细胞。

10.一种脂肪干细胞库的建立方法，其特征在于，包括步骤：

(i)对获得的含脂肪干细胞的脂肪组织材料进行洗涤，从而获得去除了血细胞的组织混合物；

(ii)对步骤(i)得到的组织混合物进行消化，得到经消化的组织混合物；

(iii)对上一步骤获得的经消化的组织混合物进行过滤，去除未消化的组织块，获得含脂肪干细胞的滤液；

(iv)对上一步骤获得的滤液进行离心，弃去上层的脂肪，得到的沉淀为脂肪干细胞；

(v)对步骤(iv)得到的脂肪干细胞进行接种传代，得到脂肪间充质干细胞；

(vi)消化上一步骤的脂肪间充质干细胞，得到分散的脂肪干细胞；

(vii)用权利要求1所述的无血清冻存液低温保存步骤(vi)得到的脂肪干细胞，得到脂肪干细胞库。

Images