KR102749801B1 - 트레할로스를 포함하는 포유동물 세포 보존용 액 - Google Patents
트레할로스를 포함하는 포유동물 세포 보존용 액 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 포유동물 세포를 액체 내에서 보존했을 때에 발생하는 세포 생존율 저하나, 포유동물 줄기세포를 액체 내에서 보존했을 때에 발생하는 자기 복제능 저하를 효과적으로 억제할 수 있으면서도, 포유동물 세포를, 포유동물의 생체 내에 투여했을 때, 포유동물의 생태에 악영향을 미칠 가능성이 낮은 포유동물 세포 보존용 액 등을 제공하는 것을 과제로 하고, 그 해결 수단으로서는, 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염, 및, pH 조정제로서의 탄산수소나트륨 등의 탄산수소염을 포함하면서도, pH가 6.5∼8.5인 포유동물 세포 보존용 액을 이용하여 포유동물 세포를 보존한다.
Description
본 발명은, 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염(이하, 이들을 총칭하여 '트레할로스류'라고 하는 경우가 있음)을 포함하면서도, 수소이온 지수(pH)가 6.5∼8.5인 포유동물 세포 보존용 액(保存用液, 이하, '본건 포유동물 세포 보존용 액'이라고 하는 경우가 있음)이나, 본건 포유동물 세포 보존용 액을 이용하여 포유동물 세포를 보존하는 방법 등에 관한 것이다
최근, 줄기세포 연구의 급속한 발전에 따라 재생 의료에 대한 기운이 높아졌으며, 그 지식이나 이해는, 연구자뿐만 아니라, 일반적으로도 널리 보급되어 왔다. 줄기세포를 이용한 재생 의료는, 줄기세포가 갖는 자기 복제능과 다분화능이나, 줄기세포가 분비하는 인자를 이용하여, 다양한 질환으로 손상된 세포나 조직의 기능을 회복시키는 것을 목적으로 한 의료이다. 백혈병이나 재생불량성 빈혈 등의 혈액 난치병 환자에게 골수 이식을 하면, 조혈계 줄기세포가 환자 체내에 생착되어, 거의 일생에 걸쳐 조혈능의 유지가 가능하게 된다. 또한, 최근에는 많은 연구자가 조혈 줄기세포 이외의 줄기세포를 이용한 임상 응용을 목표로, 중추 신경, 말초 신경, 골수, 소장 등에서의 줄기세포를 동정하여, 외상성 질환이나 조직 변성 질환에 대한 조직 줄기세포의 이식 치료가 실천되기 시작되었다(비특허 문헌 1∼3). 다른 한편으로, 암 면역세포 요법은, 암을 공격하는 기능을 갖는 면역세포를 체외로 꺼내어, 그 기능을 강화한 후, 다시 체내에 되돌리는 최첨단 세포 의료이며, 수지상세포 백신 요법, 알파·베타 T 세포 요법(αβT 세포 요법), 감마·델타 T 세포 요법(γδT 세포 요법), CTL 요법, 내추럴 킬러 세포 요법(NK 세포 요법) 등의 T 세포를 이용한 요법이 실천되고 있다.
이식 치료에 이용하는 줄기세포나 T 세포를 장기 보존하는 경우, 액체 내에서의 보존에서는 세포 생존율을 양호하게 유지할 수 없다. 예를 들면, 인간 골수 줄기세포를 생리 식염수 내에 냉장 보존(4℃)하면, 세포 생존율이 48시간 후에는 40% 이하까지 저하되고, 72시간 후에는 20% 이하까지 저하된다는 것이 보고되어 있다(비특허 문헌 4). 이로 인해, 이식용 줄기세포나 이식용 T 세포를 장기 보존하는 경우, 동결 보존하는 것이 일반적이다. 그러나, 동결 보존액 내에는, 통상적으로 DMSO, 글리세롤 등의 동결 보존제가 첨가되어 있기 때문에, 동결 보존한 줄기세포나 T 세포를 해동한 후, 이식 치료를 수행하기 전에 동결 보존제를 제거할 필요가 있어, 번거로운 것이 문제시되었다. 또한, 동결 보존액에 동결 보존제를 첨가해도 동결시의 물의 결정화에 의한 세포 골격의 데미지가 크고, 동결 융해 후의 세포 생존율이 저하되는 것도 문제시되었다. 이로 인해, 간편성이 우수하면서도, 세포 생존율의 저하를 억제할 수 있는 세포 보존액의 개발이 급선무로 여겨졌다.
본 발명자들은, 트레할로스에는, 포유동물 세포를 액체 내에서 보존했을 때에 발생하는 세포 생존율 저하를 억제하는 작용이 있다는 것을 보고하고 있다(특허 문헌 1 및 2). 그러나, 이들 액의 pH를 조정했을 때, 세포 생존율 저하를 억제하는 효과가 한층 더 높아진다는 것이나, 포유동물 줄기세포의 자기 복제능 저하를 억제하는 효과가 있다는 것에 대해서는 알려져 있지 않았다.
비특허 문헌 1: Gage, F. H. Science 287:1433-1438(2000)
비특허 문헌 2: Morrison, S. J. et al., Cell 96:737-749(1999)
비특허 문헌 3: Batle, E. et al., Cell 111:251-263(2002)
비특허 문헌 4: Lane, T.A. et al., Transfusion 49:1471-1481(2009)
본 발명의 과제는, 포유동물 세포를 액체 내에서 보존했을 때에 발생하는 세포 생존율 저하나, 포유동물 줄기세포를 액체 내에서 보존했을 때에 발생하는 자기 복제능 저하를 효과적으로 억제할 수 있으면서도, 포유동물 세포를, 포유동물의 생체 내에 투여했을 때, 포유동물의 생태에 악영향을 미칠 가능성이 낮은 포유동물 세포 보존용 액 등을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 지속하고 있다. 그 과정에서, 트레할로스류와, pH 조정제로서의 탄산수소염을 포함하면서도, pH가 6.5∼8.5인 액 내에, 포유동물 세포를 보존하면, 당해액이 pH의 완충 작용을 갖지 않는 경우라도, 세포사가 효과적으로 억제되어, 생세포 비율을 높일 수 있다는 것을 알아냈다. 또한, 당해액 내에 포유동물 줄기세포를 보존하면, 당해액이 pH의 완충 작용을 갖지 않는 경우라도, 포유동물 줄기세포의 자기 복제능 저하가 효과적으로 억제된다는 것도 확인했다. 본 발명은, 이러한 지견을 바탕으로 완성하기에 이른 것이다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
〔1〕 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염, 및, pH 조정제로서의 탄산수소염을 포함하면서도, pH가 6.5∼8.5인 포유동물 세포 보존용 액.
〔2〕 탄산수소염이 탄산수소나트륨인, 상기 〔1〕 에 기재된 보존용 액.
〔3〕 다당류 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 더 포함하는, 상기 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 보존용 액.
〔4〕 등장액인, 상기 〔1〕 내지 〔3〕 중 어느 한 항에 기재된 보존용 액.
〔5〕 등장액이 젖산 링거액인, 상기 〔4〕 에 기재된 보존용 액.
〔6〕 다당류가 덱스트란인, 상기 〔3〕 내지 〔5〕 중 어느 한 항에 기재된 보존용 액.
〔7〕 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염의 농도가 2.0∼6.0(w/v)%인, 상기 〔1〕 내지 〔6〕 중 어느 한 항에 기재된 보존용 액.
〔8〕 덱스트란 혹은 그 유도체 또는 이들의 염의 농도가 4.0∼7.0(w/v)%인, 상기 〔6〕 또는 〔7〕 에 기재된 보존용 액.
〔9〕 포유동물 세포를 0∼40℃로 보존하기 위한, 상기 〔1〕 내지 〔8〕 중 어느 한 항에 기재된 보존용 액.
〔10〕 포유동물 세포를 6시간∼14일간 보존하기 위한, 상기 〔1〕 내지 〔9〕 중 어느 한 항에 기재된 보존용 액.
〔11〕 포유동물 세포의 생존율 저하를 억제하기 위해 이용되는, 상기 〔1〕 내지 〔10〕 중 어느 한 항에 기재된 보존용 액.
〔12〕 포유동물 세포의 자기 복제능 저하를 억제하기 위해 이용되는, 상기 〔1〕 내지 〔11〕 중 어느 한 항에 기재된 보존용 액.
〔13〕 포유동물 세포의 이식에 이용되는, 상기 〔1〕 내지 〔12〕 중 어느 한 항에 기재된 보존용 액.
〔14〕 포유동물 세포가 포유동물 줄기세포인, 상기 〔1〕 내지 〔13〕 중 어느 한 항에 기재된 보존용 액.
〔15〕 포유동물 줄기세포가 포유동물 중간엽 줄기세포인, 상기 〔14〕 에 기재된 보존용 액.
〔16〕 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염, 및, pH 조정제로서의 탄산수소염을 포함하는, 상기 〔1〕 내지 〔15〕 중 어느 한 항에 기재된 보존용 액을 조제하기 위한 분말 제제.
〔17〕 탄산수소염이 탄산수소나트륨인, 상기 [16] 에 기재된 분말 제제.
〔18〕 트레할로스 혹은 그 유도체 또는 이들의 염, 및, pH 조정제로서의 탄산수소염을 포함하면서도, pH가 6.5∼8.5인 보존용 액 내에서, 포유동물 세포를 보존하는 공정을 포함하는, 포유동물 세포의 보존 방법.
〔19〕 탄산수소염이 탄산수소나트륨인, 상기 〔18〕 에 기재된 보존 방법.
〔20〕 보존용 액이 다당류 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 더 포함하는, 상기 〔18〕 또는 〔19〕 에 기재된 보존 방법.
〔21〕 보존용 액이 등장액인, 상기 〔18〕 내지 〔20〕 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법.
〔22〕 등장액이 젖산 링거액인, 상기 〔21〕 에 기재된 보존 방법.
〔23〕 다당류가 덱스트란인, 상기 〔20〕 내지 〔22〕 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법.
〔24〕 보존용 액 내에서 포유동물 세포를 6시간∼14일간 보존하는 것을 특징으로 하는 상기 〔18〕 내지 〔23〕 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법.
또한, 본 발명의 실시의 다른 형태로서, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액을, 포유동물 세포의 이식을 필요로 하는 대상(예를 들면, 외상성 질환 환자, 조직 변성 질환 환자, 암 환자)에게 투여하는 공정을 포함하는, 포유동물 세포의 이식 방법; 이나, 트레할로스류를 포함하는 액(바람직하게는 등장액)에, 포유동물 세포를 가하거나, 혹은, 포유동물 세포를 포함하는 액(바람직하게는 등장액)에, 트레할로스류를 가하고, 더욱이, 당해액의 pH를 6.5∼8.5로 조정함으로써, 본건 포유동물 세포 보존용 액을 조제하는 공정과, 조제한 본건 포유동물 세포 보존용 액 내에서, 포유동물 세포를 보존하는 공정과, 보존한 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액을, 포유동물 세포의 이식을 필요로 하는 대상(예를 들면, 외상성 질환 환자, 조직 변성 질환 환자, 암 환자)에게 투여하는 공정을 포함하는, 포유동물 세포의 이식 방법; 이나, 본건 포유동물 세포 보존용 액의 제조에서의, 트레할로스류의 사용이나, 액체 내의 포유동물 세포의 생존율 저하를 억제하기 위한, 트레할로스류의 사용; 이나, 포유동물 세포 이식 치료를 필요로 하는 질환(예를 들면, 외상성 질환, 조직 변성 질환, 암)의 치료에서의 사용을 위한, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액; 이나, 트레할로스류를 포함하는 액(바람직하게는 등장액)에, 포유동물 세포를 가하거나, 혹은, 포유동물 세포를 포함하는 액(바람직하게는 등장액)에, 트레할로스류를 가하고, 더욱이, 당해액의 pH를 6.5∼8.5로 조정함으로써, 본건 포유동물 세포 보존용 액을 조제하는 공정을 포함하는, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액의 조제 방법; 이나, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액; 을 들 수 있다. 아울러, 상기 이식 방법의, 포유동물 세포를 보존하는 공정은, 통상적으로, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액을, 당해 보존용 액이 액체 상태로 존재하는 온도 조건하에서 보존하는 것으로서, 당해 보존용 액이 고체 상태로 보존하는 공정(예를 들면, 동결 보존하는 공정, 동결 건조 보존하는 공정 등의 포유동물 세포를 휴면 상태로 보존하는 공정)을 포함하지 않는다.
본 발명에 의하면, 트레할로스류를 액체 내에 가하고, 더욱이, 당해액의 pH를 6.5∼8.5로 조정함으로써, 포유동물 세포를 액체 내에서 보존했을 때에 발생하는 세포 생존율 저하나, 포유동물 줄기세포를 액체 내에서 보존했을 때에 발생하는 자기 복제능 저하를 효과적으로 억제할 수 있다. 더욱이, 트레할로스류는, 포유동물의 생체 내에 투여했을 경우에, 포유동물의 생태에 악영향을 미칠 가능성이 낮은 이당류라는 점에서, 포유동물 세포를 본건 포유동물 세포 보존용 액 내에서 보존한 후, 새로운 이식용 액으로 치환하지 않고, 그대로 포유동물의 생체 내에 투여할 수 있다.
도 1은 실시예 1∼3 및 비교예 1∼3에 있어서, 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포(hAD-MSC; Human Adipose tissue-derived Mesenchymal Stem Cell)를, 각 보존 기간 동안(1일, 2일간, 4일간, 7일간, 및 14일간) 트레할로스 함유 보존액 CSP-01 내에서 보존했을 때의 세포 생존율(도 1A) 및 생세포 회수율(도 1B)을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 실시예 6∼10 및 비교예 6에 있어서, hAD-MSC를, 각 보존 기간 동안(24시간, 48시간, 96시간, 및 168시간) 트레할로스 함유 보존액 CSP-01 내에서 보존했을 때의 세포 생존율(도 2A) 및 생세포 회수율(도 2B)을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 11∼14 및 비교예 6 및 7에 있어서, hAD-MSC를, 각 보존 기간 동안(24시간, 48시간, 96시간, 및 168시간) 트레할로스 함유 보존액 CSP-01 내에서 보존했을 때의 세포 생존율(도 3A) 및 생세포 회수율(도 3B)을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(hBM-MSC; Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell)를, 트레할로스 함유 보존액 CSP-01(pH 5.6 미조정), CSP-01(pH 7.3 NaOH) 및 CSP-01(7.2 NaHCO3) 내에서, 5℃에서 3일간 보존했을 때의 세포 생존율을 측정한 결과를 보존 전(pre)의 측정 결과와 합쳐서 나타낸 도면이다.
도 2는 실시예 6∼10 및 비교예 6에 있어서, hAD-MSC를, 각 보존 기간 동안(24시간, 48시간, 96시간, 및 168시간) 트레할로스 함유 보존액 CSP-01 내에서 보존했을 때의 세포 생존율(도 2A) 및 생세포 회수율(도 2B)을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 11∼14 및 비교예 6 및 7에 있어서, hAD-MSC를, 각 보존 기간 동안(24시간, 48시간, 96시간, 및 168시간) 트레할로스 함유 보존액 CSP-01 내에서 보존했을 때의 세포 생존율(도 3A) 및 생세포 회수율(도 3B)을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(hBM-MSC; Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell)를, 트레할로스 함유 보존액 CSP-01(pH 5.6 미조정), CSP-01(pH 7.3 NaOH) 및 CSP-01(7.2 NaHCO3) 내에서, 5℃에서 3일간 보존했을 때의 세포 생존율을 측정한 결과를 보존 전(pre)의 측정 결과와 합쳐서 나타낸 도면이다.
본 발명의 포유동물 세포 보존용 액은, '포유동물 세포를 보존하기 위해'라는 용도로 특정된, 트레할로스류를 포함하면서도, pH가 6.5∼8.5인 액(즉, 본건 포유동물 세포 보존용 액)이다. 아울러, 특허 문헌 2에 있어서, 포유동물 세포의 보존에 이용한 트레할로스를 포함하는 젖산 링거액이나, 트레할로스 및 덱스트란을 포함하는 젖산 링거액은, 각각, 후술하는 본 실시예의 CSP-01액(비교예 3, 4) 및 CSP-11액(비교예 5, 7)에 상당하는 pH가 6.5 미만인 액으로서, 본건 포유동물 세포 보존용 액과는 상이하다.
본건 포유동물 세포 보존용 액에서의 pH로서는, 6.5∼8.5의 범위 내이면 되고, 예를 들면, 6.5∼8.4; 6.5∼8.3; 6.5∼8.2; 6.5∼8.1; 6.5∼8.0; 6.5∼7.9; 6.5∼7.8; 6.5∼7.7; 6.5∼7.6; 6.5∼7.5; 6.5∼7.4; 6.5∼7.3; 6.5∼7.2; 6.5∼7.1; 6.5∼7.0; 6.5∼6.9; 6.5∼6.8; 6.6∼8.5; 6.7∼8.5; 6.8∼8.5; 6.9∼8.5; 7.0∼8.5; 7.1∼8.5; 7.2∼8.5; 7.3∼8.5; 7.4∼8.5; 7.5∼8.5; 7.6∼8.5; 7.7∼8.5; 7.8∼8.5; 7.9∼8.5; 8.0∼8.5; 8.1∼8.5; 8.2∼8.5; 6.6∼8.4; 6.6∼8.3; 6.6∼8.2; 6.6∼8.1; 6.6∼8.0; 6.6∼7.9; 6.6∼7.8; 6.6∼7.7; 6.6∼7.6; 6.6∼7.5; 6.6∼7.4; 6.6∼7.3; 6.6∼7.2; 6.6∼7.1; 6.6∼7.0; 6.6∼6.9; 6.7∼8.4; 6.7∼8.3; 6.7∼8.2; 6.7∼8.1; 6.7∼8.0; 6.7∼7.9; 6.7∼7.8; 6.7∼7.7; 6.7∼7.6; 6.7∼7.5; 6.7∼7.4; 6.7∼7.3; 6.7∼7.2; 6.7∼7.1; 6.7∼7.0; 6.8∼8.4; 6.8∼8.3; 6.8∼8.2; 6.8∼8.1; 6.8∼8.0; 6.8∼7.9; 6.8∼7.8; 6.8∼7.7; 6.8∼7.6; 6.8∼7.5; 6.8∼7.4; 6.8∼7.3; 6.8∼7.2; 6.8∼7.1; 6.9∼8.4; 6.9∼8.3; 6.9∼8.2; 6.9∼8.1; 6.9∼8.0; 6.9∼7.9; 6.9∼7.8; 6.9∼7.7; 6.9∼7.6; 6.9∼7.5; 6.9∼7.4; 6.9∼7.3; 6.9∼7.2; 7.0∼8.4; 7.0∼8.3; 7.0∼8.2; 7.0∼8.1; 7.0∼8.0; 7.0∼7.9; 7.0∼7.8; 7.0∼7.7; 7.0∼7.6; 7.0∼7.5; 7.0∼7.4; 7.0∼7.3; 7.1∼8.4; 7.1∼8.3; 7.1∼8.2; 7.1∼8.1; 7.1∼8.0; 7.1∼7.9; 7.1∼7.8; 7.1∼7.7; 7.1∼7.6; 7.1∼7.5; 7.1∼7.4; 7.2∼8.4; 7.2∼8.3; 7.2∼8.2; 7.2∼8.1; 7.2∼8.0; 7.2∼7.9; 7.2∼7.8; 7.2∼7.7; 7.2∼7.6; 7.2∼7.5; 7.3∼8.4; 7.3∼8.3; 7.3∼8.2; 7.3∼8.1; 7.3∼8.0; 7.3∼7.9; 7.3∼7.8; 7.3∼7.7; 7.3∼7.6; 7.4∼8.4; 7.4∼8.3; 7.4∼8.2; 7.4∼8.1; 7.4∼8.0; 7.4∼7.9; 7.4∼7.8; 7.4∼7.7; 7.5∼8.4; 7.5∼8.3; 7.5∼8.2; 7.5∼ 8.1; 7.5∼8.0; 7.5∼7.9; 7.5∼7.8; 7.6∼8.4; 7.6∼8.3; 7.6∼8.2; 7.6∼8.1; 7.6 ∼8.0; 7.6∼7.9; 7.7∼8.4; 7.7∼8.3; 7.7∼8.2; 7.7∼8.1; 7.7∼8.0; 7.8∼8.4; 7.8∼8.3; 7.8∼8.2; 7.8∼8.1; 7.9∼8.4; 7.9∼8.3; 7.9∼8.2; 8.0∼8.4; 8.0∼8.3; 8.1∼8.3; 등을 들 수 있다.
본건 포유동물 세포 보존용 액으로서는, 포유동물 세포의 보존이 가능한 액(예를 들면, 등장액, 저장액, 고장액)이면 되고, 등장액을 바람직하게 예시할 수 있다. 본 명세서에 있어서 '등장액'이란, 체액이나 세포액의 삼투압과 거의 동일한 삼투압을 갖는 액을 의미하고, 구체적으로는, 250∼380mOsm/L 범위 내의 삼투압을 갖는 액을 의미한다. 또한, 본 명세서에 있어서 '저장액'이란, 체액이나 세포액의 삼투압보다도 낮은 삼투압을 갖는 액을 의미하고, 구체적으로는, 250mOsm/L 미만의 삼투압을 갖는 액을 의미한다. 이러한 저장액으로서는, 세포가 파열되지 않을 정도의 저장액(구체적으로는, 100∼250mOsm/L 미만의 범위 내의 삼투압을 갖는 액)이 바람직하다. 또한, 본 명세서에 있어서 '고장액'이란, 체액이나 세포액의 삼투압보다도 높은 삼투압을 갖는 액을 의미하고, 구체적으로는, 삼투압이 380mOsm/L 초과(바람직하게는 380mOsm/L 초과∼1000mOsm/L의 범위 내)인 것을 의미한다.
상기 등장액으로서는, 체액이나 세포액의 삼투압과 거의 동일해지도록 나트륨이온, 칼륨이온, 칼슘이온 등에 의해 염 농도나 당 농도 등을 조정한 등장액이면 특별히 제한되지 않으며, 구체적으로는 생리 식염수나, 완충 효과가 있는 생리 식염수(예를 들면, PBS, 트리스 완충 생리 식염수 [Tris Buffered Saline; TBS], HEPES 완충 생리 식염수), 링거액, 젖산 링거액, 아세트산 링거액, 중탄산 링거액, 5% 글루코스 수용액, 동물세포 배양용 기초 배지(예를 들면, DMEM, EMEM, RPMI-1640, α-MEM, F-12, F-10, M-199), 등장제(예를 들면, 포도당, D-소르비톨, D-만니톨, 락토스, 염화나트륨) 등을 들 수 있고, 이들 중에서도 젖산 링거액이 바람직하다. 등장액은, 시판 중인 것일 수도 있고, 스스로 조제한 것일 수도 있다. 시판 중인 것으로서는, 오오츠카 생식주(Otsuka Normal Saline, 오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤(Otsuka Phamaceutical Factory, Inc.) 제품)(생리식염액), 링거액 '오오츠카'(오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)(링거액), 락텍(Lactec, 등록 상표)주(注)(오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)(젖산 링거액), 빈(Veen, 등록 상표) F 수액(후소약쿠힌코교 가부시키가이샤(Fuso Pharmaceutical Indurties, Ltd.) 제품)(아세트산 링거액), 오오츠카 당액(糖液) 5%(오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품) (5% 글루코스 수용액), 비카네이트(BICANATE, 등록 상표) 수액(오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)(중탄산 링거액)을 들 수 있다.
본건 포유동물 세포 보존용 액은, 트레할로스류를 포함하는 액, 또는 분체인 트레할로스류 함유물을 첨가한 액에, pH 조정제로서의 탄산수소염을 첨가함으로써, pH가 6.5∼8.5가 되도록 조정하여 얻을 수 있다. 상기 탄산수소염으로서는, 탄산수소암모늄, 탄산수소칼륨, 탄산수소나트륨, 탄산수소칼슘 등을 들 수 있으며, 탄산수소나트륨이 바람직하다. 또한, 상기 탄산수소염으로 pH를 조정한 본건 포유동물 세포 보존용 액은, pH의 완충 작용을 갖지 않을 수도 있다.
상기 트레할로스류에서의 트레할로스로서는, 2개의 α-글루코스가 1,1-글리코시드 결합한 이당류인 α,α-트레할로스 이외에, α-글루코스와 β-글루코스가 1,1-글리코시드 결합한 이당류인 α,β-트레할로스나, 2개의 β-글루코스가 1,1-글리코시드 결합한 이당류인 β,β-트레할로스를 들 수 있으나, 이들 중에서도 α,α-트레할로스가 바람직하다. 이들 트레할로스는, 화학 합성, 미생물에 의한 생산, 효소에 의한 생산 등의 어떠한 공지의 방법에 의해서도 제조할 수 있으나, 시판품을 이용할 수도 있다. 예를 들면, α,α-트레할로스(가부시키가이샤 하야시바라(HAYASHIBARA Co., Ltd.) 제품) 또는 후지필름 와코준야쿠 가부시키가이샤(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) 제품) 등의 시판품을 들 수 있다.
상기 트레할로스류에서의 트레할로스 유도체로서는, 이당류인 트레할로스에 하나 또는 복수의 당 단위가 결합한 글리코실 트레할로스류이면 특별히 제한되지 않으며, 글리코실 트레할로스류에는, 글루코실 트레할로스, 말토실 트레할로스, 말토트리오실 트레할로스 등이 포함된다.
상기 트레할로스류에서의 트레할로스나 그 유도체의 염으로서는, 예를 들면, 염산염, 브롬화 수소산염, 요오드화 수소산염, 인산염, 질산염, 황산염, 아세트산염, 프로피온산염, 톨루엔술폰산염, 숙신산염, 옥살산염, 젖산염, 주석산염, 글리콜산염, 메탄술폰산염, 부티르산염, 길초산염, 시트르산염, 푸마르산염, 말레인산염, 말산염 등의 산 부가염이나, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 등의 금속염이나, 암모늄염, 알킬암모늄염 등을 들 수 있다. 아울러, 이들의 염은 사용 시에 용액으로서 이용되며, 그 작용은, 트레할로스의 경우와 동등 효과인 것이 바람직하다. 이들의 염류는, 수화물 또는 용매화물을 형성하고 있을 수도 있고, 또한 어느 하나를 단독으로 또는 2종 이상을 적절히 조합하여 이용할 수 있다.
본건 포유동물 세포 보존용 액 내의 트레할로스류의 농도로서는, 트레할로스류에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과가 발휘되는 농도이면 되고, 예를 들면, 트레할로스 환산으로 0.1(w/v)% 이상, 바람직하게는 0.3(w/v)% 이상, 보다 바람직하게는 0.6(w/v)% 이상, 더욱 바람직하게는 1.0(w/v)% 이상, 가장 바람직하게는 2.0(w/v)% 이상이다. 또한, 세포에의 악영향을 회피한다는 관점에서, 예를 들면, 트레할로스 환산으로 40(w/v)% 이하, 바람직하게는 20(w/v)% 이하, 보다 바람직하게는 15(w/v)% 이하, 더욱 바람직하게는 10%(w/v)% 이하, 가장 바람직하게는 6.0(w/v)% 이하이다. 따라서, 본건 포유동물 세포 보존용 액 내의 트레할로스류의 농도로서는, 예를 들면, 트레할로스 환산으로 0.1∼40(w/v)%의 범위 내, 바람직하게는 0.3∼20(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.6∼15(w/v)%, 더욱 바람직하게는 1.0∼10%(w/v)%, 가장 바람직하게는 2.0∼6.0(w/v)%이다.
본건 포유동물 세포 보존용 액은, 포유동물 세포를, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액이 액체 상태로 존재하는 온도 조건하에서 임의 기간 동안 보존하기 위해 이용하는 것이다. 본건 포유동물 세포 보존용 액은, 포유동물 세포를 액체 내에서 보존했을 때에 발생하는 세포 생존율 저하나, 포유동물 줄기세포를 액체 내에서 보존했을 때에 발생하는 자기 복제능 저하를 효과적으로 억제하는 작용을 가지면서도, 포유동물의 생체 내에 투여했을 경우에, 포유동물의 생태에 악영향을 미칠 가능성이 낮은 액이다. 이로 인해, 본건 포유동물 세포 보존용 액은, 더욱이, '포유동물 세포의 생존율 저하를 억제하기 위해'라는 용도; '포유동물 세포의 자기 복제능 저하를 억제하기 위해'라는 용도; 및/또는 '포유동물 세포를 이식하기 위해'라는 용도; 로 특정된 것이 바람직하다.
본건 포유동물 세포 보존용 액은, 트레할로스류를 단독으로 포함하는 액일 수도 있고, 트레할로스류로부터 선택되는 2종류 이상을 포함하는 액이나, 트레할로스류 이외에, 임의 성분을 더 포함하는 액일 수도 있다.
본 명세서에 있어서 '임의 성분'으로는, 예를 들면, 등장제(예를 들면, 글루코스, 소르비톨, 만니톨, 락토스, 염화나트륨), 킬레이트제(예를 들면, EDTA, EGTA, 시트르산, 살리실레이트), 용해보조제, 보존제, 산화방지제, 아미노산(예를 들면, 프롤린, 글루타민), 폴리머(예를 들면, 폴리에테르), 인지질(예를 들면, 리소포스파티드산[LPA; Lysophosphatidic acid]), 탄산수소염 이외의 pH 조정제(예를 들면, 수산화물, 아세트산염, 탄산염 등의 알칼리; 시트르산, 숙신산, 아세트산, 젖산, 빙초산, 염산 등의 산)를 들 수 있다. 본 명세서에 있어서 '임의 성분'이란, 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있는 성분을 의미한다.
또한, 본 발명에는, 트레할로스류를 포함하는, 본건 포유동물 세포 보존용 액을 조제하기 위한 분말 제제가 포함된다. 당해 분말 제제에는 상기한 임의 성분을 포함하고 있을 수도 있다.
본건 포유동물 세포 보존용 액으로서는, 트레할로스류만으로도, 포유동물 세포의 생존율 저하 억제 효과를 발휘하기 때문에, 트레할로스류 이외에, 포유동물 세포의 생존율 저하 억제 작용을 갖는 성분(예를 들면, 아카보즈, 스타키오스, 덱스트란, 히드록시에틸 전분[Hydroxyethyl starch; HES] 등의 다당류 혹은 그 유도체 또는 이들의 염; 글루코스 등의 단당류 혹은 그 유도체 또는 이들의 염)을 포함하지 않을 수도 있으나, 포유동물 세포의 생존율 저하 억제 효과를 한층 더 높이기 위해, 상기 성분, 구체적으로는, 다당류 혹은 그 유도체 또는 이들의 염을 더 포함하는 것이 바람직하며, 후술하는 본 실시예에 있어서 그 효과가 실증되어 있기 때문에, 덱스트란 혹은 그 유도체 또는 이들의 염(이하, 이들을 총칭하여 '덱스트란류'라고 하는 경우가 있음)을 더 포함하는 것을 바람직하게 예시할 수 있다.
상기 덱스트란류에서의 덱스트란으로서는, D-글루코스로 이루어지는 다당(C6H10O5)n으로서, α1→6 결합을 주쇄로 하는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 덱스트란의 중량평균 분자량(Mw)으로서는, 예를 들면, 덱스트란 40(Mw=40000), 덱스트란 70(Mw=70000) 등을 들 수 있다. 이들 덱스트란은, 화학 합성, 미생물에 의한 생산, 효소에 의한 생산 등의 어떠한 공지의 방법으로도 제조할 수 있으나, 시판품을 이용할 수도 있다. 예를 들면, 덱스트란 40(도쿄카세이코교 가부시키가이샤(Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) 제품), 덱스트란 70(도쿄카세이코교 가부시키가이샤) 제품), 저분자 덱스트란 L주(10[w/v]% 덱스트란 함유 젖산 링거액)(오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품) 등의 시판품을 들 수 있다.
상기 덱스트란류에서의 덱스트란 유도체로서는, 덱스트란 황산, 카르복실화 덱스트란, 디에틸아미노에틸(DEAE)-덱스트란 등이 포함된다.
상기 덱스트란류에서의 덱스트란이나 그 유도체의 염으로서는, 예를 들면, 염산염, 브롬화 수소산염, 요오드화 수소산염, 인산염, 질산염, 황산염, 아세트산염, 프로피온산염, 톨루엔술폰산염, 숙신산염, 옥살산염, 젖산염, 주석산염, 글리콜산염, 메탄술폰산염, 부티르산염, 길초산염, 시트르산염, 푸마르산염, 말레인산염, 말산염 등의 산 부가염이나, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염 등의 금속염이나, 암모늄염, 알킬암모늄염 등을 들 수 있다. 아울러, 이들의 염은 사용 시에 용액으로서 이용되며, 그 작용은, 덱스트란의 경우와 동등 효과인 것이 바람직하다. 이들의 염류는, 수화물 또는 용매화물을 형성하고 있을 수도 있고, 또한 어느 하나를 단독으로 또는 2종 이상을 적절히 조합하여 이용할 수 있다.
본건 포유동물 세포 보존용 액 내의 덱스트란류의 농도로서는, 덱스트란류에 의한 세포 생존율 저하 억제 효과가 발휘되는 농도이면 되고, 예를 들면, 덱스트란 환산으로 0.1(w/v)% 이상, 바람직하게는 0.3(w/v)% 이상, 보다 바람직하게는 0.6(w/v)% 이상, 보다 바람직하게는 1.0(w/v)% 이상, 더욱 바람직하게는 2.0(w/v)% 이상, 가장 바람직하게는 4.0(w/v)% 이상이다. 또한, 세포에의 악영향을 회피한다는 관점에서, 예를 들면, 덱스트란 환산으로 50(w/v)% 이하, 바람직하게는 20(w/v)% 이하, 보다 바람직하게는 15(w/v)% 이하, 보다 바람직하게는 12%(w/v)% 이하, 더욱 바람직하게는 9.0%(w/v)% 이하, 가장 바람직하게는 7.0(w/v)% 이하이다. 따라서, 본건 포유동물 세포 보존용 액 내의 덱스트란류의 농도로서는, 예를 들면, 덱스트란 환산으로 0.1∼50(w/v)%의 범위 내, 바람직하게는 0.3∼20(w/v)%, 보다 바람직하게는 0.6∼15(w/v)%, 보다 바람직하게는 1.0∼12%(w/v)%, 더욱 바람직하게는 2.0∼9.0%(w/v)%, 가장 바람직하게는 4.0∼7.0(w/v)%이다.
본건 포유동물 세포 보존용 액으로서는, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액을 그대로 이식에 이용하는 경우, 포유동물 세포 이식에 적합한 액이 바람직하며, 이러한 포유동물 세포 이식에 적합한 액은, 포유동물 세포 이식에 적합하지 않는 물질, 예를 들면, 생체 유래 성분(예를 들면, 혈청 또는 혈청 유래 성분[예를 들면, 알부민]); 이나, 포유동물 세포를 동결 보존 또는 동결 건조 보존했을 때의 포유동물 세포의 생존율 저하를 억제하는 작용을 갖는 성분, 예를 들면, 디메틸 설폭시드[Dimethyl sulfoxide; DMSO], 글리세린, 에틸렌글리콜, 트리메틸렌글리콜, 디메틸아세트아미드, 폴리에틸렌글리콜[PEG], 폴리비닐피롤리돈, 혈청 또는 혈청 유래 성분(예를 들면, 알부민) 등의 동결 보호제 또는 동결 건조 보호제; 를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
본 발명의 포유동물 세포의 보존 방법은, 트레할로스류를 포함하면서도, pH가 6.5∼8.5인 액 내에서, 포유동물 세포를 임의 기간 동안 보존하는 공정을 포함하는 것(이하, '본건 보존 방법'이라고 하는 경우가 있음)이다. 본건 보존 방법은, 통상적으로, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액을, 당해 보존용 액이 액체 상태로 존재하는 온도 조건하에서 보존하는 것으로서, 당해 보존용 액이 고체 상태로 존재하는 온도 조건하에서 보존하는 공정(예를 들면, 동결 보존 하는 공정, 동결 건조 보존하는 공정 등의 포유동물 세포를 휴면 상태로 보존하는 공정)을 포함하지 않는다. 또한, 본건 포유동물 세포 보존용 액 내의 포유동물 세포의 밀도는, 예를 들면, 103∼1010개/mL의 범위 내이다.
본건 보존 방법으로서는, 트레할로스류를 포함하는 액, 또는 분체인 트레할로스류 함유물을 첨가한 액에, 상기 pH 조정제로서의 탄산수소염을 더 첨가함으로써, pH가 6.5∼8.5가 되도록 조정하여, 본건 포유동물 세포 보존용 액을 조제하는 공정; 이나, 본건 포유동물 세포 보존용 액 내에서 포유동물 세포를 보존하기 전에, 트레할로스류를 포함하는 액(바람직하게는 등장액)에, 포유동물 세포를 가하거나, 혹은, 포유동물 세포를 포함하는 액(바람직하게는 등장액)에, 트레할로스류를 가함으로써, 트레할로스류를 포함하는 액을 조제하는 공정; 을 포함하는 것일 수도 있다.
본 발명에 있어서, 포유동물 세포를 보존하는 임의 기간으로서는, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액을 액체 상태로 보존했을 때, 당해 보존용 액 내의 포유동물 세포의 세포 생존율 저하를 억제하여, 생세포 비율을 높일 수 있는 기간이 바람직하며, 예를 들면, 6시간 이상, 12시간 이상, 1일(24시간) 이상, 1.5일(36시간) 이상, 2일(48시간) 이상, 3일(72시간) 이상, 4일(96시간) 이상, 7일(168시간) 이상이고, 또한, 포유동물 세포의 보존 기간이 지나치게 길면 세포 생존에 악영향을 미칠 가능성이 있기 때문에, 세포 생존율에의 악영향을 회피한다는 관점에서, 예를 들면, 21일 이하, 16일 이하, 14일 이하, 10일 이하, 7일 이하, 4일 이하이다. 따라서, 상기 보존 기간으로는, 예를 들면, 6시간∼21일; 12시간∼21일; 1∼21일; 1.5∼21일; 2∼21일; 3∼21일; 4∼21일; 7∼21일; 6시간∼16일; 6시간∼14일; 6시간∼10일; 6시간∼7일; 6시간∼4일; 12시간∼16일; 12시간∼14일; 12시간∼10일; 12시간∼7일; 12시간∼4일; 1∼16일; 1∼14일; 1∼10일; 1∼7일; 1∼4일; 1.5∼16일; 1.5∼14일; 1.5∼10일; 1.5∼7일; 1.5∼4일; 2∼16일; 2∼14일; 2∼10일; 2∼7일; 2∼4일; 3∼16일; 3∼14일; 3∼10일; 3∼7일; 3∼4일; 4∼16일; 4∼14일; 4∼10일; 4∼7일; 7∼16일; 7∼14일; 7∼10일; 등을 들 수 있으며, 후술하는 본 실시예에 있어서 그 효과가 입증되어 있기 때문에, 6시간∼14일을 바람직하게 예시할 수 있다. 본건 포유동물 세포 보존용 액 내에 보존한 포유동물 세포에 대해, 세포사가 억제되었다는 것은, 트리판 블루(Trypan Blue) 염색법, TUNEL법, Nexin법, FLICA법 등의 세포사를 검출할 수 있는 공지의 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, '포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액이 액체 상태로 존재하는 온도'로서는, 포유동물 세포를 포함하는 본건 포유동물 세포 보존용 액이, 동결되지 않고 액체 상태로 존재하면서도, 당해 보존용 액 내의 포유동물 세포가 생육 가능한 온도이면 되고, 통상적으로 0∼40℃의 범위 내, 바람직하게는 0∼30℃(실온)의 범위 내이다.
본 발명에 있어서, 포유동물 세포로서는, 예를 들면, 포유동물 세포 이식 치료를 필요로 하는 질환(암; I형 당뇨병; 간 질환 등의 장기 질환; 등)에 대한 재생 의료에 있어서, 혈관 경유로 투여되는 포유동물 세포, 구체적으로는, 줄기세포; 췌도세포(pancreatic islet cell); 간세포; 수지상세포; 등을 예시할 수 있으며, 바람직하게는 줄기세포나 간세포이다. 이들 세포는, 공지의 일반적인 방법으로 단리할 수 있다. 예를 들면, 각종 세포 표면 마커에 대한 항체를 이용한 형광 활성화 셀 소터(FACS)나, 형광 물질이나 비오틴, 아비딘 등의 표지 물질로 표지한 상기 세포 표면 마커에 대한 항체와, 이러한 표지 물질에 대한 항체와 MACS 비드(자성 비드)와의 컨쥬게이트 항체를 이용한 자동 자기 세포 분리 장치(autoMACS)에 의해 실시할 수 있다. 상기 형광 물질로서는, 알로피코시아닌(APC), 피코에리트린(PE), FITC(fluorescein isothiocyanate), Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, PE-Texas Red, PE-Cy5, PE-Cy7 등을 들 수 있다.
또한, 상기 '줄기세포'란, 자기 복제능 및 분화·증식능을 갖는 미숙한 세포를 의미한다. 줄기세포에는, 분화 능력에 따라, 다능성 줄기세포(pluripotent stem cell), 복능성 줄기세포(multipotent stem cell), 단능성 줄기세포(unipotent stem cell) 등의 아집단이 포함된다. 다능성 줄기세포란, 그 자체로는 개체가 될 수 없지만, 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 복능성 줄기세포란, 모든 종류는 아니지만, 복수 종류의 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 단능성 줄기세포란, 특정 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다.
상기 다능성 줄기세포로서는, 배아 줄기세포(Embryonic stem cell; ES 세포), EG 세포(Embryonic germ cell), 유도 만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cell; iPS 세포) 등을 들 수 있다. ES 세포는, 내부세포 덩어리를 피더세포상 또는 LIF를 포함하는 배지 내에서 배양함으로써 제조할 수 있다. 배아 줄기세포(ES 세포)의 제조 방법은, 예를 들면, WO96/22362, WO02/101057, US 5,843,780, US 6,200,806, US 6,280,718 등에 기재되어 있다. EG 세포는, 원시 생식세포를 mSCF, LIF 및 bFGF를 포함하는 배지 내에서 배양함으로써 제조할 수 있다(Ce11, 70:841-847, 1992). iPS 세포는, 체세포(예를 들면, 섬유아세포, 피부세포 등)에 Oct3/4, Sox2 및 Klf4(필요에 따라, 또한 c-Myc 또는 n-Myc) 등의 리프로그래밍 인자를 도입함으로써 제조할 수 있다(Ce11, 126: p. 663-676, 2006; Nature, 448: p. 313-317, 2007; Nat Biotechno1, 26; p, 101-106, 2008; Cel1 131: p. 861-872, 2007; Science, 318: p. 1917-1920, 2007; Ce11 Stem Cells 1: p. 55-70, 2007; Nat Biotechnol, 25: p. 1177-1181, 2007; Nature, 448: p. 318-324, 2007; Cell Stem Cells 2: p. 10-12, 2008; Nature 451: p. 141-146, 2008; Science, 318: p. 1917-1920, 2007). 체세포의 핵을 핵 이식함으로써 제작된 초기 배를 배양함으로써 수립한 줄기세포도, 다능성 줄기세포로서 또한 바람직하다(Nature, 385, 810(1997); Science, 280, 1256(1998); Nature Biotechnology, 17, 456(1999); Nature, 394, 369(1998); Nature Genetics, 22, 127(1999); Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 96, 14984(1999), Rideout III 외(Nature Genetics, 24, 109(2000)).
상기 복능성 줄기세포로서는, 지방세포, 골세포, 연골세포, 지방세포 등의 세포로 분화 가능한 중간엽 줄기세포, 뉴런, 성상교세포(astrocyte), 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte) 등의 세포로 분화 가능한 신경계 줄기세포, 골수 줄기세포, 생식 줄기세포 등의 신체 줄기세포 등을 들 수 있다. 복능성 줄기세포는, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이다. 중간엽 줄기세포란, 골아세포, 연골아세포 및 지방아세포의 전부 또는 몇 가지로 분화가 가능한 줄기세포를 의미한다. 복능성 줄기세포는, 자체 공지의 방법에 의해, 생체로부터 단리할 수 있다. 예를 들면, 중간엽 줄기세포는, 포유동물의 골수, 지방조직, 말초혈, 제대혈 등으로부터 공지의 일반적인 방법으로 채취할 수 있다. 예를 들면, 골수 천자 후의 조혈 줄기세포 등의 배양, 계대에 의해 인간 중간엽 줄기세포를 단리할 수 있다(Journal of Autoimmunity, 30(2008) 163-171). 복능성 줄기세포는, 상기 다능성 줄기세포를 적절한 유도 조건하에서 배양함으로써 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, 포유동물로서는, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니피그 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제목(有蹄目), 개, 고양이 등의 고양이목, 인간, 원숭이, 붉은털 원숭이, 게잡이 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등을 예시할 수 있으며, 그 중에서도, 마우스, 돼지, 인간을 바람직하게 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 포유동물 세포로서는, 부착성('접착성'이라고도 함) 세포를 예시할 수 있다. 본 명세서 내에서, '부착성' 세포란, 앵커리지에 접착함으로써 생존, 증식, 물질의 생산을 수행할 수 있는 앵커리지 의존성 세포를 의미한다. 부착성 줄기세포로서는, 예를 들면, 다능성 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 신경계 줄기세포, 골수 줄기세포, 생식 줄기세포 등을 들 수 있으며, 중간엽 줄기세포를 바람직하게 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 포유동물 세포(집단)는, 생체 내로부터 분리된 것일 수도 있고, 인 비트로에서 계대 배양된 것일 수도 있으나, 단리 또는 정제되어 있는 것이 바람직하다. 본 명세서 내에서, '단리 또는 정제'란, 목적으로 하는 성분 이외의 성분을 제거하는 조작이 실시되어 있는 것을 의미한다. 단리 또는 정제된 포유동물 세포의 순도(전체 세포수에 대한, 포유동물 줄기세포수 등의 목적으로 하는 세포의 비율)는, 통상적으로 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상(예를 들면, 100%)이다.
본건 포유동물 세포 보존용 액 내에 보존하는 포유동물 세포(집단)는, 단일세포(single cell) 상태일 수도 있다. 본 명세서에 있어서, '단일세포 상태'란, 다른 세포와 모여서 덩어리를 형성하고 있지 않은 것(즉, 응집되어 있지 않은 상태)을 의미한다. 단일세포 상태의 포유동물 세포는, 인 비트로에서 배양한 포유동물 세포를 트립신/EDTA 등으로 효소 처리함으로써 조제할 수 있다. 포유동물 세포 내에 포함되는 단일세포 상태의 포유동물 세포의 비율은, 예를 들면, 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상(예를 들면, 100%)이다. 단일세포 상태의 세포의 비율은, 포유동물 세포를 PBS 내에 분산시키고, 이것을 현미경 아래에서 관찰하여, 무작위로 선택된 복수개(예를 들면, 1000개)의 세포에 대해 응집 유무를 조사함으로써 결정할 수 있다.
본건 포유동물 세포 보존용 액 내에 보존하는 포유동물 세포(집단)는, 부유(浮遊)되어 있을 수도 있다. 본 명세서에 있어서, '부유'란, 포유동물 세포가, 보존용 액을 수용한 용기 내벽에 접촉하지 않고, 액 내에 유지되어 있는 것을 말한다.
본건 포유동물 세포 보존용 액 내에 보존한 포유동물 세포가, 응집 또는 침전되어 있는 경우, 이식 전에 피펫팅이나 탭핑 등의 당해 기술분야에서의 주지의 방법에 의해 포유동물 세포를 현탁하는 것이 바람직하다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위가 이들 예시에 한정되는 것은 아니다. 아울러, 이하의 실시예에 있어서, 3(w/v)% 트레할로스 및 5(w/v)% 덱스트란 40을 포함하는 젖산 링거액을, 편의상 'CSP-01액'이라고 하는 경우가 있으며, 또한, 3(w/v)% 트레할로스를 포함하는 젖산 링거액을, 편의상 'CSP-11액'이라고 하는 경우가 있다.
I 바람직한 pH의 검토
1. 재료 및 방법
[포유동물 세포]
이하의 실험 1∼4에는, 이하의 표 1에 기재된 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포(hAD-MSC)를 이용했다.
| 도너 연령, 성별, 유래 | 38세, 여성, 지방 |
| 도너수 | 1 |
| 로트 번호 | 0000421627 |
| 입하시의 계대 횟수 | 1회 |
| 보존 방법 | 액체 질소 내에서 보존 |
| 공급원 | Lonza Walkersville사 |
| 대리점 | Lonza Japan 사 |
[CSP-01액]
CSP-01액은, α,α-트레할로스(가부시키가이샤 하야시바라 제품 또는 후지필름 와코준야쿠 가부시키가이샤 제품)와, 저분자 덱스트란 L주(10[w/v]% 덱스트란 함유 젖산 링거액)(오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)를, 트레할로스 및 덱스트란의 마지막 농도가 각각 3(w/v)% 및 5(w/v)%가 되도록 젖산 링거액(락텍 수액; 오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)에 첨가하여 조제했다(특허 문헌 2 참조).
[CSP-11액]
CSP-11액은, α,α-트레할로스(가부시키가이샤 하야시바라 제품 또는 후지필름 와코준야쿠 가부시키가이샤 제품)를, 트레할로스의 마지막 농도가 3(w/v)%가 되도록 젖산 링거액(락텍 수액; 오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)에 첨가하여 조제했다(특허 문헌 2 참조). CSP-01액 및 CSP-11액의 조성을 이하의 표 2에 나타낸다.
| CSP-01액 | CSP-11액 | |
| 덱스트란40(w/v)% | 5 | - |
| 트레할로스(w/v)% | 3 | 3 |
| 염화나트륨(w/v)% | 0.6 | 0.6 |
| 염화칼슘(w/v)% | 0.02 | 0.02 |
| 염화칼륨(w/v)% | 0.03 | 0.03 |
| L-젖산나트륨(w/v)% | 0.31 | 0.31 |
[hAD-MSC의 배양]
hAD-MSC는 정법에 따라 배양했다. 즉, hAD-MSC를, 인간 지방 유래 줄기세포 첨가 인자 세트(Lonza Walkersville사 제품, PT-4503)를 포함하는 ADSC-BM(Adipose Derived Stem Cell Basal Medium)(Lonza Walkersville사 제품, PT-3273)(이하, 단지 '배양액'이라고 함)을 첨가한 75cm2 플라스크에 넣고, CO2 인큐베이터(37℃ 조건하) 내에서 계대 배양했다. 또한, 배양액의 교환은 3일마다 수행했다.
[hAD-MSC 함유액의 조제]
hAD-MSC 함유액을, 이하의 〔1〕 내지 〔10〕 의 순서에 따라 조제했다.
〔1〕 퍼스널 인큐베이터를 37±2℃로 가온해 두었다.
〔2〕 hAD-MSC를 배양하고 있는 75cm2 플라스크를, CO2 인큐베이터로부터 꺼냈다.
〔3〕 도립 현미경 아래에서 세포 상태를 관찰하여, 약 80% 컨플루언트한 것을 사용했다.
〔4〕 배양액을 흡인하고, PBS(-)를 각 75cm2 플라스크에 8mL씩 첨가했다.
〔5〕 PBS(-)를 흡인 후, 트립신/EDTA(CC-5012, Lonza Walkersville사 제품)를 플라스크에 4mL씩 첨가하고, 퍼스널 인큐베이터에서 37±2℃ 조건하에서 5분간 인큐베이팅했다.
〔6〕 세포가 90% 정도 박리될 때까지 도립 현미경 아래에서 관찰하면서 천천히 흔들었다.
〔7〕 트립신 반응을 정지시키기 위해, 트립신 중화액(TNS; CC-5002, Lonza Walkersville사 제품)을 8mL씩 가하여, 피펫팅에 의해 세포를 박리하고, 50mL의 코니칼 튜브에 옮겼다.
〔8〕 원심 처리(210×g, 5분간, 20℃) 후, 상청을 제거하고, 일정량(각 75cm2 플라스크당 1.5mL)의 PBS(-)를 첨가하여, 세포를 현탁했다.
〔9〕 세포 현탁액으로부터 일부(20μL) 분취하여, 20μL의 트리판 블루 염색액(Gibco사 제품)과 혼합하고, 원셀 카운터(세포 계수반; 바이오메디컬 사이언스사 제품)를 이용하여 전체 세포수(생세포수 및 사세포수)를 계측했다. 아울러, 세포수는, 원셀 카운터에서의 9개 부분의 에리어 중, 4 모퉁이의 에리어 내에 있는 세포를 계측하고, 이후의 계측도 마찬가지로 수행했다.
〔10〕 전체 세포수가 5.0×105세포/mL가 되도록 PBS(-)를 첨가하고, 빙냉(氷冷)하여, 포유동물 세포 함유액을 조제했다.
[세포 생존율 및 생세포 회수율의 측정]
피검액 내에 포유동물 세포를 보존했을 때의 세포 생존율 및 생세포 회수율을, 이하의 〔1〕 내지 〔4〕 의 순서에 따라 측정했다.
〔1〕 조제한 포유동물 세포 함유액을, 핀피펫(Finnpipette, 100-1000μL)을 이용하여, 15mL 클래리파인드 폴리프로필렌 코니칼 튜브에 1mL씩 분주하고, 원심 처리(210×g, 5분간, 25℃) 후, 빙냉했다.
〔2〕 상청을 제거하고, 핀피펫(100-1000μL)을 이용하여, 1mL의 각 피검액에 세포를 현탁한 후, 그 일부(20μL)를, 미리 트리판 블루 염색액(Gibco사 제품) 20μL를 첨가한 1.5mL 마이크로 튜브에 분취했다. 트리판 블루 염색액과 혼화한 세포 현탁액을, 원셀 카운터에 분취하고, 광학 현미경(ECLIPSE TS100, Nikon사 제품)을 이용하여 전체 세포수 및 트리판 블루 양성 세포(사세포)수를 계측함으로써, 보존 시작 직후의 세포 생존율을 산출했다.
〔3〕 나머지 세포 현탁액은, 약용 냉장 쇼케이스(5℃로 설정)에서 각 보존 기간까지 정치 보존했다.
〔4〕 각 보존 기간이 경과한 시점에서, 팁 끝을, 세포를 포함하는 액이 들어간 튜브 바닥으로부터 목시(目視)로 5mm 정도인 위치까지 삽입하고, 부드럽게 교반(500μL의 액량으로의 피펫팅을 5회)함으로써 세포가 현탁된 상태에서, 그 일부(20μL)를 1.5mL 마이크로 튜브에 채취하여, 트리판 블루 염색액(Gibco사 제품) 20μL와 혼화한 후, 원셀 카운터에 분취하고, 광학 현미경(ECLIPSE TS100, Nikon사 제품)을 이용하여 전체 세포수 및 트리판 블루 양성 세포(사세포)수를 계측함으로써, 각 보존 기간에서의 세포 생존율 및 생세포 회수율을 산출했다. 아울러, 세포 생존율은, 식 '(전체 생세포수/전체 세포수)×100=([전체 세포수-사세포수]/전체 세포수)×100=세포 생존율(%)'을 이용하여 산출하였으며, 또한, 생세포 회수율은, 식 '(각 보존 기간 동안의 전체 생세포수/보존 시작 직후의 전체 생세포수)×100=([각 보존 기간 동안의 전체 세포수-각 보존 기간 동안의 사세포수]/[보존 시작 직후의 전체 세포수-보존 시작 직후의 사세포수])×100=생세포 회수율(%)'을 이용하여 산출했다.
[CFU 어세이]
피검액 내에 포유동물 중간엽 줄기세포를 보존했을 때의 콜로니 형성능을, 이하의 〔1〕 내지 〔4〕 의 순서에 따라 측정했다.
〔1〕 조제한 포유동물 세포 함유액을, 핀피펫(100-1000μL)을 이용하여, 15mL 클래리파인드 폴리프로필렌 코니칼 튜브에 1mL씩 분취하고, 원심 처리(210×g, 5분간, 25℃) 후, 빙냉했다.
〔2〕 상청을 제거하고, 핀피펫(100-1000μL)을 이용하여, 1mL의 각 피검액에 세포를 현탁한 후, 그 일부(20μL)를, 60mm 디쉬(면적이 21cm2)에, 15세포/cm2가 되도록 파종하고, 약 8일후에 형성된 콜로니수를 측정하였으며, 보존 시작 직후의 콜로니 형성 단위(CFU), 즉, 파종한 세포수에 대한 콜로니수의 비율을 산출했다.
〔3〕 나머지 세포 현탁액은, 약용 냉장 쇼케이스(5℃로 설정)에서 각 보존 기간까지 정치 보존했다.
〔4〕 각 보존 기간이 경과한 시점에서, 팁 끝을, 세포를 포함하는 액이 들어간 튜브 바닥으로부터 목시로 5mm 정도인 위치까지 삽입하고, 부드럽게 교반(500μL의 액량으로의 피펫팅을 5회)함으로써 세포가 현탁된 상태에서, 60mm 디쉬(면적이 21cm2)에, 15세포/cm2가 되도록 파종하고, 약 8일 후에 형성된 콜로니수를 측정하여, 보존 시작 직후의 CFU를 산출했다.
2. 결과
[실험 1]
hAD-MSC를, 이하의 표 3에 나타낸 6종류의 피검액 내에 각 보존 기간 동안(1일, 2일간, 4일간, 7일간, 및 14일간) 보존했을 때의 세포 생존율(표 4 및 도 1A 참조) 및 생세포 회수율(표 5 및 도 1B 참조)을, 상기 [세포 생존율 및 생세포 회수율의 측정] 항목에 기재된 방법에 따라 측정했다.
| 피검액 | pH 조정제(첨가량[g/L]) | |
| 비교예 1 | 젖산 링거 | - |
| 비교예 2 | CSP-01액(pH 5.65) | 염산(0.0350) |
| 비교예 3 | CSP-01액(pH 6.15) | - |
| 실시예 1 | CSP-01액(pH 6.60) | 탄산수소나트륨(0.0125) |
| 실시예 2 | CSP-01액(pH 6.95) | 탄산수소나트륨(0.0250) |
| 실시예 3 | CSP-01액(pH 7.29) | 탄산수소나트륨(0.0350) |
그 결과, 비교예 1(젖산 링거) 및 비교예 2(CSP-01액[pH 5.65])에 있어서는, 세포 보존 시작 후 2일째의 세포 생존율이, 모두다 약 65%까지 저하되었으며, 4일째에는, 모두다 30% 이하까지 저하되었다(표 4 및 도 1A 참조). 한편, 실시예 1∼3(CSP-01액[pH 6.60∼7.29])에 있어서는, 세포 보존 시작 후 2일째의 세포 생존율이, 모두다 96%를 초과하였으며, 4일째에는, 모두다 70%를 초과하였다(표 4 및 도 1A 참조). 또한, 세포 보존 시작 후 4일째 이후의 세포 생존율을, 실시예 1∼3 사이에서 비교하면, 실시예 1(CSP-01액[pH 6.60])보다 실시예 2(CSP-01액[pH 6.95]) 쪽이 높고, 또한, 실시예 2(CSP-01액[pH 6.95])보다 실시예 3(CSP-01액[pH 7.29]) 쪽이 높았다(표 4 및 도 1A 참조). 또한, 생세포 회수율에 대해서도 마찬가지 경향이 인정되었다(표 5 및 도 1B 참조).
이 결과는, CSP-01액, 즉, 트레할로스 및 덱스트란을 포함하는 젖산 링거액의 pH를 약 6.6 이상(바람직하게는 약 7.29 전후)로 조정하고, 당해액 내에 포유동물 세포를 보존하면, 트레할로스 및 덱스트란이 포함되지 않은 젖산 링거액이나, 트레할로스 및 덱스트란을 포함하면서도, pH가 6.15 이하인 젖산 링거액에 포유동물 세포를 보존했을 경우와 비교해서, 세포사가 효과적으로 억제되어, 생세포 비율을 높일 수 있다는 것을 나타내고 있다.
| 보존 시작 직후 | 보존 기간 | |||||
| 1일 | 2일 | 4일 | 7일 | 14일 | ||
| 비교예 1 | 98.8±1.3 | 89.3±2.0 | 65.7±5.6 | 22.7±15.9 | 10.1±3.2 | 2.0±2.1 |
| 비교예 2 | 99.6±0.6 | 93.5±2.0 | 66.4±7.6 | 25.1±9.0 | 23.5±3.7 | 10.4±4.3 |
| 비교예 3 | 99.2±0.7 | 98.6±0.5 | 96.7±1.8 | 67.8±8.9 | 43.7±4.1 | 18.7±6.8 |
| 실시예 1 | 99.3±1.3 | 99.6±0.6 | 97.8±1.7 | 73.9±4.0 | 59.1±3.6 | 21.8±5.5 |
| 실시예 2 | 99.2±0.7 | 99.2±0.7 | 97.4±0.5 | 86.8±0.3 | 61.9±2.7 | 37.8±14.0 |
| 실시예 3 | 99.2±0.7 | 97.9±2.2 | 96.2±2.5 | 92.5±1.4 | 66.3±0.3 | 39.3±4.7 |
표 안의 수치는, 세포 생존율(평균치±표준편차[SD]; n=3)을 나타낸다.
| 보존 시작 직후 | 보존 기간 | |||||
| 1일 | 2일 | 4일 | 7일 | 14일 | ||
| 비교예 1 | 100±0.0 | 95.8±4.8 | 68.7±12.2 | 25.9±17.3 | 9.6±1.9 | 1.60±1.8 |
| 비교예 2 | 100±0.0 | 95.8±7.2 | 74.2±13.3 | 27.0±9.9 | 24.0±3.5 | 12.6±6.2 |
| 비교예 3 | 100±0.0 | 110±11.9 | 105±17.9 | 74.2±12.7 | 48.0±6.8 | 22.4±10.0 |
| 실시예 1 | 100±0.0 | 106±6.6 | 99.6±4.6 | 79.4±7.6 | 64.5±6.4 | 23.7±6.6 |
| 실시예 2 | 100±0.0 | 105±10.8 | 105±4.3 | 102±6.0 | 67.1±7.3 | 41.8±14.3 |
| 실시예 3 | 100±0.0 | 110±16.2 | 107±7.3 | 107±19.1 | 81.5±2.6 | 42.8±9.6 |
표 안의 수치는, 생세포 회수율(평균치±표준편차[SD]; n=3)을 나타낸다.
[실험 2]
hAD-MSC를, 이하의 표 6에 나타낸 4종류의 피검액 내에 각 보존 기간 동안(6시간, 24시간, 48시간, 및 96시간) 보존했을 때의 세포 생존율(표 7 참조) 및 생세포 회수율(표 8 참조)을, 상기 [세포 생존율 및 생세포 회수율의 측정] 항목에 기재된 방법에 따라 측정했다.
| 피검액 | pH 조정제(첨가량[g/L]) | |
| 실시예 4 | CSP-01액(pH 7.29) | 탄산수소나트륨(0.0350) |
| 비교예 4 | CSP-01액(pH 6.16) | - |
| 실시예 5 | CSP-11액(pH 7.04) | 탄산수소나트륨(0.0150) |
| 비교예 5 | CSP-11액(pH 6.35) | - |
그 결과, 비교예 4(CSP-01액[pH 6.16])에 있어서는, 세포 보존 시작 후 48시간(2일)째의 세포 생존율이, 약 50%까지 저하되었으며, 96시간(4일)째에는, 37%까지 저하되었다(표 7 참조). 한편, 실시예 4(CSP-01액[pH 7.29])에 있어서는, 세포 보존 시작 후 48시간(2일)째의 세포 생존율이, 90%를 초과하였으며, 96시간(4일)째에는, 70%를 초과하였다(표 7 참조). 또한, 생세포 회수율에 대해서도 마찬가지 경향이 인정되었다(표 8 참조).
또한, 비교예 5(CSP-11액[pH 6.35])에 있어서는, 세포 보존 시작 후 48시간(2일)째의 세포 생존율이, 약 45%까지 저하되었으며, 96시간(4일)째에는, 약 15%까지 저하되었다(표 7 참조). 한편, 실시예 5(CSP-11액[pH 7.04])에 있어서는, 세포 보존 시작 후 48시간(2일)째의 세포 생존율이, 75%를 초과하였으며, 96시간(4일)째에는, 45%를 초과하였다(표 7 참조). 또한, 생세포 회수율에 대해서도 마찬가지 경향이 인정되었다(표 8 참조).
이들 결과는, 상기 [실험 1]의 결과를 지지하는 동시에, CSP-11액, 즉, (덱스트란이 포함되어 있지 않은)트레할로스를 포함하는 젖산 링거액에 대해서도 마찬가지로, pH를 약 7.04 이상으로 조정하고, 당해액 내에 포유동물 세포를 보존하면, 트레할로스를 포함하면서도, pH가 6.35 이하인 젖산 링거액에 포유동물 세포를 보존했을 경우와 비교해서, 세포사가 효과적으로 억제되어, 생세포 비율을 높일 수 있다는 것을 나타내고 있다.
| 보존 시작 직후 | 보존 기간 | ||||
| 6시간 | 24시간 | 48시간 | 96시간 | ||
| 실시예 4 | 98.4±2.0 | 98.6±1.2 | 97.6±2.4* | 92.3±4.1*** | 72.5±3.4*** |
| 비교예 4 | 98.6±1.8 | 98.9±1.5 | 92.3±2.8 | 49.7±5.6 | 37.0±7.4 |
| 실시예 5 | 98.2±3.1 | 98.3±0.8 | 94.9±2.4 | 76.0±12.9* | 45.6±8.6*** |
| 비교예 5 | 98.7±1.0 | 97.5±1.2 | 88.5±8.4 | 45.1±14.8 | 15.8±4.1 |
표 안의 수치는, 세포 생존율(평균치±표준편차[SD]; n=4)을 나타낸다. 실시예 4에서의 '*' 및 '***'은, 동일한 보존 기간의 비교예 4와의 사이에서, 각각 통계학적으로 유의차(p<0.05 및 p<0.001)가 있다는 것을 나타낸다. 또한, 실시예 5에서의 '*' 및 '***'은, 동일한 보존 기간의 비교예 5와의 사이에서, 각각 통계학적으로 유의차(p<0.05 및 p<0.001)가 있다는 것을 나타낸다.
| 보존 시작 직후 | 보존 기간 | ||||
| 6시간 | 24시간 | 48시간 | 96시간 | ||
| 실시예 4 | 100±0.0 | 95.1±7.3 | 102±4.3* | 104±7.7*** | 83.5±5.3*** |
| 비교예 4 | 100±0.0 | 89.5±4.7 | 91.9±4.9 | 52.2±6.9 | 40.7±8.9 |
| 실시예 5 | 100±0.0 | 97.3±7.0 | 93.4±3.5 | 76.2±8.1* | 46.6±8.1*** |
| 비교예 5 | 100±0.0 | 103±8.8 | 96.2±12.0 | 50.7±16.9 | 17.3±4.7 |
표 안의 수치는, 생세포 회수율(평균치±표준편차[SD]; n=4)을 나타낸다. 실시예 4에서의 '*’ 및 '***’은, 동일한 보존 기간의 비교예 4와의 사이에서, 각각 통계학적으로 유의차(p<0.05 및 p<0.001)가 있다는 것을 나타낸다. 또한, 실시예 5에서의 '*’ 및 '***’은, 동일한 보존 기간의 비교예 5와의 사이에서, 각각 통계학적으로 유의차(p<0.05 및 p<0.001)가 있다는 것을 나타낸다.
[실험 3]
hAD-MSC를, 이하의 표 9에 나타낸 11종류의 피검액 내에 각 보존 기간 동안(24시간, 48시간, 96시간, 및 168시간) 보존했을 때의 세포 생존율(표 10 및 12 참조) 및 생세포 회수율(표 11 및 13 참조)을, 상기 [세포 생존율 및 생세포 회수율의 측정] 항목에 기재된 방법에 따라 측정했다.
| 피검액 | pH 조정제(첨가량[g/L]) | |
| 비교예 6 | 젖산 링거 | - |
| 실시예 6 | CSP-01액(pH 6.69) | 탄산수소나트륨(0.0125) |
| 실시예 7 | CSP-01액(pH 7.03) | 탄산수소나트륨(0.0250) |
| 실시예 8 | CSP-01액(pH 7.35) | 탄산수소나트륨(0.0350) |
| 실시예 9 | CSP-01액(pH 7.68) | 탄산수소나트륨(0.100) |
| 실시예 10 | CSP-01액(pH 8.02) | 탄산수소나트륨(0.300) |
| 비교예 7 | CSP-11액(pH 6.44) | - |
| 실시예 11 | CSP-11액(pH 7.04) | 탄산수소나트륨(0.0100) |
| 실시예 12 | CSP-11액(pH 7.16) | 탄산수소나트륨(0.0150) |
| 실시예 13 | CSP-11액(pH 7.69) | 탄산수소나트륨(0.0500) |
| 실시예 14 | CSP-11액(pH 8.00) | 탄산수소나트륨(0.100) |
그 결과, 실시예 6∼10(CSP-01액[pH 6.69∼8.02])은, 비교예 6(젖산 링거)과 비교해서, 어떠한 보존 기간에서도 세포 생존율 및 생세포 회수율이 높았으며, 특히 실시예 8(CSP-01액[pH 7.35]) 및 실시예 9(CSP-01액[pH 7.68])의 세포 생존율 및 생세포 회수율이 가장 높은 경향을 나타냈다(표 10 및 11 및 도 2 참조).
이 결과는, 상기 [실험 1] 및 [실험 2]의 결과를 지지하는 동시에, CSP-01액, 즉, 트레할로스 및 덱스트란을 포함하는 젖산 링거액의 pH를 6.69 이상으로 조정하고, 당해액 내에 포유동물 세포를 보존하면, 젖산 링거액에 포유동물 세포를 보존했을 경우와 비교해서, 세포사가 효과적으로 억제되어, 생세포 비율을 높일 수 있다는 것을 나타내고 있다.
또한, 실시예 11∼14(CSP-11액[pH 7.04∼8.00])는, 비교예 6(젖산 링거)이나 비교예 7(CSP-11액[pH 6.44])과 비교해서, 어떠한 보존 기간에서도 세포 생존율 및 생세포 회수율이 높았으며, 특히 실시예 12∼14(CSP-11액[pH 7.16∼8.00])의 세포 생존율 및 생세포 회수율이 가장 높은 경향을 나타냈다(표 12 및 13 및 도 3 참조).
이 결과는, 상기 [실험 2]의 결과를 지지하는 동시에, CSP-11액, 즉, (덱스트란이 포함되어 있지 않은)트레할로스를 포함하는 젖산 링거액의 pH를 7.04 이상으로 조정하고, 당해액 내에 포유동물 세포를 보존하면, 트레할로스가 포함되어 있지 않은 젖산 링거액이나, 트레할로스를 포함하면서도, pH가 6.44 이하인 젖산 링거액에 포유동물 세포를 보존했을 경우와 비교해서, 세포사가 효과적으로 억제되어, 생세포 비율을 높일 수 있다는 것을 나타내고 있다.
| 보존 시작 직후 | 보존 기간 | ||||
| 24시간 | 48시간 | 96시간 | 168시간 | ||
| 비교예 6 | 98.0±0.1 | 83.9±3.9 | 63.5±8.4 | 35.9±7.0 | 13.3±9.3 |
| 실시예 6 | 98.5±0.8 | 89.5±3.5 | 79.0±2.3 | 59.4±3.6 | 44.0±6.3 |
| 실시예 7 | 97.4±0.7 | 93.7±1.7 | 81.6±3.5 | 64.1±1.1 | 52.3±6.7 |
| 실시예 8 | 99.0±0.1 | 97.3±0.5 | 90.6±1.9 | 83.8±1.9 | 56.9±5.0 |
| 실시예 9 | 98.2±0.6 | 94.2±2.6 | 89.2±4.8 | 79.9±3.1 | 60.9±8.1 |
| 실시예 10 | 98.3±0.5 | 89.8±5.5 | 83.3±7.9 | 77.7±5.9 | 51.4±8.2 |
표 안의 수치는, 세포 생존율(평균치±표준편차[SD]; n=3)을 나타낸다.
| 보존 시작 직후 | 보존 기간 | ||||
| 24시간 | 48시간 | 96시간 | 168시간 | ||
| 비교예 6 | 100±0.0 | 79.4±12.0 | 57.6±8.8 | 34.7±6.3 | 7.0±5.9 |
| 실시예 6 | 100±0.0 | 101±10.5 | 82.7±11.8 | 57.8±13.6 | 48.6±9.6 |
| 실시예 7 | 100±0.0 | 105±11.4 | 99.8±19.9 | 72.4±3.5 | 59.7±6.7 |
| 실시예 8 | 100±0.0 | 100±16.1 | 93.1±15.3 | 88.6±4.9 | 59.2±4.5 |
| 실시예 9 | 100±0.0 | 103±9.8 | 89.2±7.5 | 88.9±6.5 | 58.1±11.1 |
| 실시예 10 | 100±0.0 | 88.1±8.9 | 75.3±5.8 | 79.0±16.1 | 41.2±6.7 |
표 안의 수치는, 생세포 회수율(평균치±표준편차[SD]; n=3)을 나타낸다.
| 보존 시작 직후 | 보존 기간 | ||||
| 24시간 | 48시간 | 96시간 | 168시간 | ||
| 비교예 6 | 97.6±0.5 | 85.9±4.2 | 55.8±6.6 | 33.8±1.8 | 9.3±5.3 |
| 비교예 7 | 98.3±0.6 | 86.3±1.7 | 62.6±5.6 | 41.5±6.4 | 16.4±2.5 |
| 실시예 11 | 98.6±1.5 | 93.1±3.3 | 69.8±5.0 | 44.2±8.3 | 27.5±4.3 |
| 실시예 12 | 97.7±1.2 | 93.3±0.3 | 76.3±3.8 | 47.5±11.7 | 37.0±2.9 |
| 실시예 13 | 97.8±1.1 | 89.4±3.2 | 80.4±3.4 | 66.0±5.9 | 29.7±4.1 |
| 실시예 14 | 98.6±1.6 | 92.1±3.7 | 80.6±8.7 | 58.0±5.5 | 45.3±0.8 |
표 안의 수치는, 세포 생존율(평균치±표준편차[SD]; n=3)을 나타낸다.
| 보존 시작 직후 | 보존 기간 | ||||
| 24시간 | 48시간 | 96시간 | 168시간 | ||
| 비교예 6 | 100±0.0 | 82.4±12.9 | 53.8±12.4 | 32.5±4.2 | 6.9±5.1 |
| 비교예 7 | 100±0.0 | 92.9±13.9 | 65.4±14.2 | 36.9±6.2 | 12.2±2.3 |
| 실시예 11 | 100±0.0 | 98.6±13.2 | 82.3±17.4 | 46.3±11.5 | 24.8±2.2 |
| 실시예 12 | 100±0.0 | 89.1±13.3 | 74.2±5.8 | 43.5±12.8 | 30.1±8.4 |
| 실시예 13 | 100±0.0 | 89.1±7.2 | 82.7±11.0 | 63.3±4.6 | 23.5±6.6 |
| 실시예 14 | 100±0.0 | 82.8±2.6 | 80.0±13.0 | 51.3±9.0 | 32.0±6.4 |
표 안의 수치는, 생세포 회수율(평균치±표준편차[SD]; n=3)을 나타낸다.
[실험 4]
hAD-MSC를, 이하의 표 14에 나타낸 4종류의 피검액 내에 각 보존 기간 동안(6시간, 24시간, 및 48시간) 보존했을 때의 콜로니 형성능(표 15 참조)을, 상기 [CFU 어세이] 항목에 기재된 방법에 따라 측정했다.
| 피검액 | pH 조정제(첨가량[g/L]) | |
| 실시예 15 | CSP-01액(pH 7.29) | 탄산수소나트륨(0.0350) |
| 비교예 8 | CSP-01액(pH 6.16) | - |
| 실시예 16 | CSP-11액(pH 7.04) | 탄산수소나트륨(0.0150) |
| 비교예 9 | CSP-11액(pH 6.35) | - |
그 결과, 비교예 8(CSP-01액[pH 6.16])에 있어서는, hAD-MSC의 콜로니 형성능이, 보존 기간이 길어짐에 따라 저하되는 반면, 실시예 15(CSP-01액[pH 7.29])에 있어서는, 이러한 콜로니 형성능의 저하가 억제되었다(표 15 참조).
이 결과는, CSP-01액, 즉, 트레할로스 및 덱스트란을 포함하는 젖산 링거액의 pH를 7.29 전후로 조정하고, 당해액 내에 포유동물 중간엽 줄기세포를 보존하면, 트레할로스 및 덱스트란을 포함하면서도, pH가 6.16 전후인 젖산 링거액에 포유동물 중간엽 줄기세포를 보존했을 경우와 비교해서, 콜로니 형성능의 저하를 억제할 수 있다는 것을 나타내고 있다.
또한, 비교예 9(CSP-11액[pH 6.35])에 있어서는, hAD-MSC의 콜로니 형성능이, 보존 기간이 길어짐에 따라 저하되는 반면, 실시예 16(CSP-11액[pH 7.04])에 있어서는, 이러한 콜로니 형성능의 저하가 억제되었다(표 15 참조).
이 결과는, CSP-11액, 즉, (덱스트란이 포함되어 있지 않은)트레할로스를 포함하는 젖산 링거액의 pH를 7.04 전후로 조정하고, 당해액 내에 포유동물 줄기세포를 보존하면, 트레할로스를 포함하면서도, pH가 6.35 전후인 젖산 링거액에 포유동물 줄기세포를 보존했을 경우와 비교해서, 콜로니 형성능(즉, 자기 복제능)의 저하를 억제할 수 있다는 것을 나타내고 있다.
| 보존 시작 직후 | 보존 기간 | |||
| 6시간 | 24시간 | 48시간 | ||
| 실시예 15 | 21.3±1.9 | 21.9±3.2 | 22.0±2.7** | 15.2±3.6*** |
| 비교예 8 | 21.3±1.9 | 20.8±1.4 | 14.9±2.5 | 1.70±1.4 |
| 실시예 16 | 21.6±2.5 | 21.0±2.0 | 16.3±5.4 | 10.0±7.1* |
| 비교예 9 | 21.6±2.5 | 22.7±1.6 | 14.5±3.4 | 1.10±0.8 |
표 안의 수치는, 파종한 세포수에 대한 콜로니수의 비율(평균치±표준편차[SD]; n=4)을 나타낸다. 실시예 15에서의 '**’ 및 '***’은, 동일한 보존 기간의 비교예 8과의 사이에서, 각각 통계학적으로 유의차(p<0.01 및 p<0.001)가 있다는 것을 나타낸다. 또한, 실시예 16에서의 '*’은, 동일한 보존 기간의 비교예 9와의 사이에서, 통계학적으로 유의차(p<0.05)가 있다는 것을 나타낸다.
II pH 조정제의 검토
1. 재료 및 방법
[포유동물 세포]
이하의 실험에는, 이하의 표 16에 기재된 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(hBM-MSC)를 이용했다.
| 도너 연령, 성별, 유래 | 31세, 남성, 골수 |
| 도너수 | 1 |
| 로트 번호 | 0000527428 |
| 입하시의 계대 횟수 | 2회 |
| 보존 방법 | 액체 질소 내에서 보존 |
| 공급원 | Lonza Walkersville사 |
| 대리점 | 카타야마화학공업주식회사 |
[시험액의 조제]
삭제
CSP-01액은, 실시예 1과 마찬가지로, α,α-트레할로스(가부시키가이샤 하야시바라 제품 또는 후지필름 와코준야쿠 가부시키가이샤 제품)와, 저분자 덱스트란 L주(10[w/v]% 덱스트란 함유 젖산 링거액)(오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)를, 트레할로스 및 덱스트란의 마지막 농도가 각각 3(w/v)% 및 5(w/v)%가 되도록 젖산 링거액(락텍 수액; 오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)에 첨가하여, CSP-01액(5.6 미조정)을 얻었다. 0.5mol/L의 수산화나트륨 용액을, pH가 7.300이 되도록 첨가하여, CSP-01액(7.3 NaOH)을 얻었다. pH 조정제로서 탄산수소나트륨 용액을 첨가하여, CSP-01액(7.2 NaHCO3)을 조제했다. CSP-01액(7.2 NaHCO3)의 pH는 7.158이었다. 아울러, 각 피검액에서의 pH는, 실온(21.2∼24.0℃)에서 측정했을 때의 값이다.
[hBM-MSC를 포함하는 젖산 링거액의 조제]
hBM-MSC를 포함하는 젖산 링거액은, 이하의 순서 〔1〕 내지 〔8〕 에 따라 조제했다.
〔1〕 4×105개의 hBM-MSC를, 75cm2 플라스크에 가하고, 인간 중간엽 줄기세포 전용 배지 키트(Lonza사 제품)(이하, 'MSC 배지'라고 함) 존재하에서 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양을 수행했다. 현미경 아래에서 세포 상태를 관찰하였으며, 약 80% 정도 컨플루언트가 될 때까지 배양했다.
〔2〕 MSC 배지를 제거하고, 10mL의 PBS(-)로 hBM-MSC를 린스했다.
〔3〕 PBS(-)를 제거하고, 4mL의 트립신-EDTA(CC-3232, Lonza사 제품)를 가하고, 실온에서 5분간 정치했다.
〔4〕 hBM-MSC가 90% 정도 박리될 때까지 현미경 아래에서 관찰하면서 천천히 흔들었다.
〔5〕 5mL의 MSC 배지를 가하고, 트립신 반응을 정지시키고, 피펫팅에 의해 hBM-MSC를 회수하여, 50mL 원심 튜브에 옮겼다.
〔6〕 600×g, 5분간, 실온에서 원심 분리를 수행했다.
〔7〕 상청(MSC 배지)을 제거하고, 9mL의 젖산 링거액을 가하여, 침전(hBM-MSC)을 현탁했다.
〔8〕 세포수를 계측하고, 5×105cells/mL가 되도록 젖산 링거액으로 조정하여, hBM-MSC를 포함하는 젖산 링거액을 조제했다.
[각종 피검용 등장액 내에서의 hBM-MSC의 보존 방법]
각종 피검용 등장액 내에서의 hBM-MSC의 보존은, 이하의 순서 〔1〕 내지 〔2〕 에 따라 수행했다.
〔1〕 조제한 hBM-MSC를 포함하는 젖산 링거액을, 각 튜브에 0.5mL씩 분주하고, 원심 분리(600×g, 5분간)를 수행했다.
〔2〕 상청(젖산 링거액)을 제거하고, 침전(hBM-MSC)을, 0.5mL의 각종 피검용 등장액으로 현탁하고, 5℃에서 3일간 보존했다.
[트리판 블루 염색법에 의한 hBM-MSC의 세포 생존율의 해석]
트리판 블루 염색법에 의한 hBM-MSC의 세포 생존율의 해석은, 이하의 순서 〔1〕 내지 〔2〕 에 따라 수행했다.
〔1〕 5℃에서 3일간 보존 후의 hBM-MSC를 포함하는 각종 피검용 등장액 각각으로부터, 20μL를 채취하여, 튜브에 옮긴 후, 트리판 블루 염색액(Gibco사 제품) 20μL를 혼합했다. 아울러, 비교 대조로서, 각종 피검용 등장액에 현탁하기 전(5℃에서 보존 전)의 hBM-MSC를 포함하는 젖산 링거액 각각으로부터, 20μL를 채취하여, 튜브에 옮긴 후, 트리판 블루 염색액 20μL를 혼합했다.
〔2〕 현미경 아래에서 원셀 카운터(바이오메디컬 사이언스사 제품)를 이용하여 전체 세포수와 트리판 블루 양성 세포(사세포)수를 측정하였으며, 전체 세포수에 대한 트리판 블루 음성 세포의 비율, 즉, 세포 생존율을 산출했다. 세포 생존율(%)을 이하의 식 1을 이용하여 산출했다.
[식1]
세포 생존율(%)=(전체 세포수-사세포수)/전체 세포수×100
2. 결과
[실험]
hBM-MSC를, 이하의 표 17에 나타낸 3종류의 피검 내에 5℃에서 3일간 보존했을 때의 세포 생존율(도 4 참조)을, 상기 [세포 생존율의 측정] 항목에 기재된 방법에 따라 측정했다. 결과를 표 18 및 도 4에 나타낸다.
| 피군(n=4) | pH(실측값) | 온도(℃) |
| CSP-01(5.6 미조정) | 5.599 | 23.7 |
| CSP-01(7.3 NaOH) | 7.300 | 24.0 |
| CSP-01(7.2 NaHCO3) | 7.158 | 21.2 |
| 피검액 | 세포 생존율 (평균값±SD) | |
| 보존 전 | 3일간 보존 후 | |
| CSP-01(5.6 미조정) | 98.5±0.4 | 79.8±7.6 |
| CSP-01(7.3 NaOH) | 62.7±4.3 | |
| CSP-01(7.2 NaHCO3) | 87.9±1.7 | |
결과, hBM-MSC를, 5℃에서 3일간 보존하면, CSP-01(5.6 미조정)에 보존했을 경우와 비교해서, CSP-01(7.3 NaOH)에 보존했을 경우에는 세포 생존율이 유의미하게 저하되었다. 그러나, CSP-01(7.2 NaHCO3)에 보존하면 CSP-01(5.6 미조정) 및 CSP-01(7.3 NaOH)에 보존했을 경우와 비교해서, 세포 생존율이 높은 경향을 나타냈다.
삭제
이들 결과는, CSP-01의 pH를 7.2∼7.3으로 조정했을 때, pH 조정제에 의해 세포 생존율에 영향을 준다는 것을 나타내며, 수산화나트륨보다도 탄산수소나트륨을 이용한 쪽이, 세포 생존율을 높게 유지할 수 있다는 것을 나타내고 있다.
본 발명에 의하면, 트레할로스류를 액체 내에 가함으로써, 포유동물 세포를 액체 내에서 보존했을 때에 발생하는 세포 생존율 저하나, 포유동물 줄기세포를 액체 내에서 보존했을 때에 발생하는 자기 복제능 저하를 효과적으로 억제할 수 있다. 더욱이, 트레할로스류는, 포유동물의 생체 내에 투여했을 경우에, 포유동물의 생태에 악영향을 미칠 가능성이 낮은 이당류라는 점에서, 포유동물 세포를 본건 포유동물 세포 보존용 액 내에서 보존한 후, 새로운 이식용 액으로 치환하지 않고, 그대로 포유동물의 생체 내에 투여할 수 있다.
Claims (24)
- 트레할로스 또는 그 염, 및, pH 조정제로서의 탄산수소염을 포함하면서도, pH가 6.5~8.5인, 포유동물 세포 보존용 액(保存用液).
- 제1항에 있어서,
탄산수소염이 탄산수소나트륨인 보존용 액.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
다당류 또는 그 염을 더 포함하는 보존용 액.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
등장액인 보존용 액.
- 제4항에 있어서,
등장액이 젖산 링거액인 보존용 액.
- 제3항에 있어서,
다당류가 덱스트란인 보존용 액.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
트레할로스 또는 그 염의 농도가 2.0~6.0(w/v)%인 보존용 액.
- 제6항에 있어서,
덱스트란 또는 그 염의 농도가 4.0~7.0(w/v)%인 보존용 액.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
포유동물 세포를 0~40℃에서 보존하기 위한 보존용 액.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
포유동물 세포를 6시간~14일간 보존하기 위한 보존용 액.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
포유동물 세포의 생존율 저하를 억제하기 위해 이용되는 보존용 액.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
포유동물 세포의 자기 복제능 저하를 억제하기 위해 이용되는 보존용 액.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
포유동물 세포의 이식에 이용되는 보존용 액.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
포유동물 세포가 포유동물 줄기세포인 보존용 액.
- 제14항에 있어서,
포유동물 줄기세포가 포유동물 중간엽 줄기세포인 보존용 액.
- 트레할로스 또는 그 염, 및, pH 조정제로서의 탄산수소염을 포함하는, 제1항 또는 제2항의 보존용 액을 조제하기 위한 분말 제제.
- 제16항에 있어서,
탄산수소염이 탄산수소나트륨인 분말 제제.
- 트레할로스 또는 그 염, 및, pH 조정제로서의 탄산수소염을 포함하면서도, pH가 6.5~8.5인 보존용 액 내에서, 포유동물 세포를 보존하는 공정을 포함하는, 포유동물 세포의 보존 방법.
- 제18항에 있어서,
탄산수소염이 탄산수소나트륨인 보존 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서,
보존용 액이 다당류 또는 그 염을 더 포함하는 보존 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서,
보존용 액이 등장액인 보존 방법.
- 제21항에 있어서,
등장액이 젖산 링거액인 보존 방법.
- 제20항에 있어서,
다당류가 덱스트란인 보존 방법.
- 제18항 또는 제19항에 있어서,
보존용 액 내에서 포유동물 세포를 6시간~14일간 보존하는 보존 방법.
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