CN102532269A - γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列及其TCR受体转染细胞与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM、含有该序列的TCR以及TCR受体转染细胞。GTM氨基酸残基序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示。实验证明，GTM肽可以与肿瘤细胞、肿瘤组织以及Vδ1T细胞配体MICA蛋白特异性结合。通过Lentivirus表达系统建立了在J.RT3-T3.5表面表达含有人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的TCR的J.RT3-T3.5细胞平台，在细胞水平上模拟了γδ1TIL及其识别杀伤肿瘤的机制，表明转染细胞TCRγ4δ1对肿瘤细胞的杀伤活性明显增高，且这种杀伤作用是TCR依赖性的。本发明将在恶性肿瘤治疗药物的开发及其过继治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列及其TCR受体转染细胞与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域中的多肽及其编码基因与应用，特别是涉及人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM及其TCR受体转染细胞与在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。 

背景技术

机体的免疫系统在进化过程中产生了四种主要的抗原识别机制，分为巨噬细胞和树突状细胞(DC)的模式识别、αβT细胞和B细胞的特异性识别、NK细胞针对内部自我异常改变的识别和γδT细胞对抗原的识别(Morita CTHH，HHMariuzza RAHH，HHBrenner MBHH.Antigen recognition by human gamma delta T cells：pattern recognition by the adaptive immune system.HHSpringer Semin Immunopathol.HH2000；22(3)：191-217；Zocchi MRHH，HHPoggi AHH.Role of gammadelta T lymphocytes in tumor defense.HHFront Biosci.HH 2004 Sep 1；9：2588-604；Hochstenbach FHH，HHBrenner MBHH.Newly identified gamma delta and beta delta T-cell receptors.HHJ Clin Immunol.HH 1990 Jan；10(1)：1-18.)。目前，前三种抗原识别机制已基本研究清楚。巨噬细胞和树突状细胞(DC)是通过模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)如TLR(toll-like receptor)识别种属间标志分子如病原相关分子(pathogen associated molecular pattern，PAMPs)，依据两个最保守分子之间的相互识别对侵入宿主的病原微生物进行清除，其特点是简单快速(Takeda KHH，HHKaisho THH，HHAkira SHH.Toll-like receptors.HHAnnu Rev Immunol.HH2003；21：335-76.Epub 2001 Dec 19.)。αβT细胞和B细胞为主的抗原识别以精细而准确的识别方式为特征，它们依据其抗原受体库的高度多样性和多信号协同作用能精细的区分一个抗原和其它数量众多的外来抗原(抗原表位)细微的差别。NK细胞能够直接识别和杀伤一些肿瘤细胞而无需抗原预先作用。NK细胞的活性被其活化受体(杀伤细胞活化受体，KAR)或抑制受体(杀伤细胞抑制受体，KIR)与靶细胞上的某些配体或MHC-I类分子的相互作用所控制，其识别特点是通过带有保守序列的受体对不变的配体进行识别，针对内部自我异常改变(Allison TJ，Winter CC，Fournie JJ，Bonneville M，Garboczi DN：Structure of a human gammadelta T-cell antigen receptor.Nature 2001，411：820-824；Kabelitz D，Wesch D，Hinz T：gamma delta T cells，their T cell receptor usage and role in human diseases.Springer Semin Immunopathol 1999，21：55-75.)。但作为天然免疫及获得性免疫之间桥梁的γδT细胞具体的识别机制目前还不清楚。 

人γδT细胞占人外周血CD3⁺T细胞的2-5％，但是在小肠或皮肤等局部组织中为主要的T细胞亚群。γδT细胞根据δ链V基因的不同，主要分为两个亚型，外周血主要是γ9δ2T(Vδ2)细胞亚型，而上皮组织中以δ1型(Vδ1)为主，同时配有不同的γ链(Hayday AC.γδT cells：a right time and a right place for a conserved third way of protection.Annu Rev Immunol 2000；18：975-1026.)。活化的γδT细胞具有很强的细胞毒效应细胞活性，并能产生各种细胞因子(通常包括TNF-α和IFN-γ)。然而，由于对抗原的MHCI非限制性识别的特点，γδT可能识别与αβT细胞不同的抗原配体，这使γδT细胞处于机体防御和免疫监视的第一线(Hayday AC.γδT cells：a right time and a right place for a conserved third way of protection.Annu Rev Immunol 2000；18：975-1026.Girardi M，Oppenheim DE，Steele CR，et al.Regulation of cutaneous mal ignancy by gy T cells.Science 2001；294：605-9.)。 

人γδT细胞识别肿瘤表面表达的抗原。Vδ1识别MICA/B和ULBP家族。从结直肠癌患者肿瘤浸润性T淋巴细胞(TIL)中分离出来的Vδ1γδT细胞不仅能裂解来自自体的，也能裂解各种同种异体上皮肿瘤细胞(Maeurer MJ，Martin D，Walter W，et al.Human intestinal Vy1+T lymphocytes recognize tumor cells of epithelial origin.J Exp Med 1996；183：1681-96.)。在热应激或者氧化压力条件下，可以诱导MICA/B和ULBP1-3在许多上皮肿瘤细胞以及一些淋巴瘤细胞表面以各种水平表达。表达MICA/B和ULBP1-3的肿瘤及淋巴瘤细胞能够被Vδ1T细胞所识别并杀伤，且这种杀伤是通过MICA直接识别γδTCR(γδT细胞受体)来实现的(Wu J.，Groh V.，Spies T.T cell antigen receptor engagement and specificity in the recognition of stress-inducible MIC by human epithelial γδ T cells.J.Immumol2002；169：1236-1240.Zhao J，Huang J，Chen H，Cui L，He W.Vδ1 T cell receptor binds specifically to MHC I chain related A：molecular and biochemical evidences.Biochem Biophys Res Commun 2006；339：232-40.)。Vδ2T细胞识别磷酸类非肽抗原和F1-ATPase。这类抗原通常是来自类异戊二烯(isoprenoid)生物合成途径的产物。其中对γδT刺激活性最强的是羟甲异戊烯二磷酸酯((E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate，HMBPP)。 

TCR(人T细胞受体)由δ链和与其匹配的γ链组成，其抗原结合部位是由六个抗原决定簇(CDR)形成的，这六个CDR在识别抗原时作用是不同的，其中CDR3区在抗原识别时，占有主导地位。鉴于TCRδ CDR3区(CDR3δ)与抗体重链的CDR3区在结构和功能上的相似性，因此，研究人员提出了CDR3δ的一级结构是决定TCRγδ识别抗原特异性关键部位的学术假说。根据卵巢上皮癌(OEC)组织浸润的γδT细胞(γδTIL)TCR的一个CDR3δ的基因序列(OT3)，人工合成了OT3肽，并通过体外一系列OT3肽与靶细胞、靶组织或来源于靶细胞的蛋白的结合实验，验证OT3肽的结合特异性；同时，在用OT3序列替代抗体重链CDR3区序列构建的OT3移植抗体(OT3Ab)进行的相应实验中得到进一步验证。证明CDR3δ确实在TCRγδ抗原识别特异性上起关键作用。通过亲和层析的方法利用OT3肽作为探针在人卵巢癌SKOV3细胞总蛋白中寻找到与之结合的分子hMSH2配体(TCRγδ所识别的新型配体)。通过RT-PCR、Western Blot、流式细胞术、免疫组化等方法证实hMSH2在肿瘤细胞及组织中表达；而且，体外实验证实hMSH2蛋白能特异性与Vδ2T细胞结合，并刺激其活化增殖，分泌γ干扰素，促进Vδ2T细胞对靶细胞的杀伤活性。 

上述结果是来自γ9δ2T细胞对肿瘤识别的研究。而另一类上皮来源的Vδ1T细胞与肿瘤的识别特性、CDR3区序列特征、识别的肿瘤抗原以及识别肿瘤抗原的分子机制还未见报道。Vδ1与Vδ2T细胞在序列和结构、分布、识别抗原配体、功能等方都有很大区别，因此，γδ2TCR结构CDR3序列不能代表其它类型TCR的其它CDR3序列与肿瘤的识别机制。 

发明内容

本发明提供了一个人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(tumor-infiltrating γδT cell，γδTIL)中δ1链互补决定域3(CDR3δ1)的优势序列GTM。 

本发明所提供的人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列，命名为GTM，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1； 

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有抗原识别作用的蛋白质。 

序列表中的SEQ ID NO：1由15个氨基酸残基组成。 

含有上述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的TCR受体的δ1链蛋白也属于本发明的保护范围。 

具体来讲，含有上述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的TCR受体的δ1链，命名为TRD1G，是下述氨基酸残基序列 之一： 

1)序列表中的SEQ ID NO：2； 

2)将序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有抗原识别作用的蛋白质。 

序列表中的SEQ ID NO：2由286个氨基酸残基组成，自氨基端第111-125位氨基酸残基为GTM序列。 

与上述含有上述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的TCR受体的δ1链TRD1G相匹配的γ4链，命名为TRG4G，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：3； 

2)将序列表中SEQ ID NO：3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有抗原识别作用的蛋白质。 

序列表中的SEQ ID NO：3由324个氨基酸残基组成。 

一种胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)的TCR，其δ1链的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示(TRD1G)，其γ4链的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示(TRG4G)。 

编码上述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的基因(GTM)，是下述核苷酸序列之一： 

1)序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列； 

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列； 

3)与序列表中SEQ ID NO：4限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有抗原识别作用的核苷酸序列； 

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液在65℃下洗膜。 

序列表中的SEQ ID NO：4由45个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-45位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质。 

编码含有上述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的TCR受体的δ1链蛋白的基因也属于本发明的保护范围。 

具体来讲，编码含有上述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的TCR受体的δ1链TRD1G的基因(TRD1G)，是下述核 苷酸序列之一： 

1)序列表中SEQ ID NO：5的DNA序列； 

2)编码序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列； 

3)与序列表中SEQ ID NO：5限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有抗原识别作用的核苷酸序列； 

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液在65℃下洗膜。 

序列表中的SEQ ID NO：5由858个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-858位碱基，自5’端第331-375位碱基为GTM编码序列，编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列的蛋白质。 

编码含有上述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的TCR受体的δ1链TRD1G相匹配的γ4链TRG4G的基因(TRG4G)，是下述核苷酸序列之一： 

1)序列表中SEQ ID NO：6的DNA序列； 

2)编码序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列； 

3)与序列表中SEQ ID NO：6限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有抗原识别作用的核苷酸序列； 

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液在65℃下洗膜。 

序列表中的SEQ ID NO：6由972个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-972位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：3的氨基酸残基序列的蛋白质。 

编码所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)的TCR的基因，其δ1链编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示(TRD1G)，其γ4链编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示(TRG4G)。 

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。 

扩增本发明基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。 

所述转基因细胞系为转基因J.RT3-T3.5细胞，这是一种人Jurkat白血病细胞系的衍生体，它不能产生有功能的TCR受体，但可用于转染其它外源的TCR以研究其抗 原特异性；可按照常规方法将编码所述胃癌组织来源肿瘤浸润性淋巴细胞(γδTIL)细胞的TCR的基因转染J.RT3-T3.5细胞，如通过含有编码所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)的TCR基因的重组真核表达载体将编码所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)的TCR基因导入J.RT3-T3.5细胞。 

用于构建含有编码所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)的TCR基因的重组真核表达载体的出发载体可为pRSV-rev、pLentilox 3.7、pMDLg、pRRE、pWPXL或pLVX-DsRed等慢病毒表达载体，优选为pWPXL；以pWPXL为出发载体，构建的携带所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)的TCR的δ1链编码基因(TRD1G)的重组真核表达载体为pWPXL-δ1，构建的携带所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)的TCR的γ4链编码基因(TRG4G)的重组真核表达载体为pWPXL-γ4。 

所述携带有编码所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)的TCR基因的重组真核表达载体可通过脂质体介导法、电转、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或慢病毒等常规的生物学方法转化J.RT3-T3.5细胞。 

所述转染有编码所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)的TCR基因的J.RT3-T3.5细胞为TCRγ4δ1转染细胞。 

所述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM，含有上述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的TCR受体的δ1链蛋白，δ1链为TRD1G、γ4链为TRG4G的胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)的TCR以及编码所述多肽、蛋白的基因可用于制备杀灭肿瘤细胞的药物或制剂，因而本发明为进一步开发一种抗肿瘤药物提供了依据。 

本发明所指的抗肿瘤药物，它的活性成分为上述具有抗肿瘤作用的人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM，或含有上述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的TCR受体的δ1链蛋白，或δ1链为TRD1G、γ4链为TRG4G的胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)的TCR或编码所述多肽、蛋白的基因。 

编码所述多肽、蛋白的基因可存在于J.RT3-T3.5细胞中，其中转染有编码所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)的TCR的基因的J.RT3-T3.5细胞为TCRγ4δ1。 

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促 进剂、表面活性剂和吸附载体等。 

本发明的药物可以制成注射液或冻干粉剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。 

上述蛋白药物和基因药物的用量可采用药学领域中蛋白药物和基因药物的常规剂量，并可根据实际情况调整。一般情况下，本发明的TCRγ4δ1细胞在注射剂量为1.0×10⁵-2.0×10⁵个/kg体重时，能够延缓肿瘤的生长。 

本发明提供了人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM、含有该序列的TCR以及TCR受体转染细胞。实验证明，GTM肽可以与肿瘤细胞、肿瘤组织以及Vδ1T细胞配体MICA蛋白特异性结合。通过Lentivirus表达系统建立了在J.RT3-T3.5表面表达含有人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的TCR的J.RT3-T3.5细胞平台，在细胞水平上模拟了γδ1TIL及其识别杀伤肿瘤的机制(其中一条途径为：TCR识别肿瘤抗原，进而释放细胞因子TNFα来杀伤肿瘤细胞)，结果表明转染细胞TCRγ4δ1对肿瘤细胞的杀伤活性明显增高，且这种杀伤作用是TCR依赖性的。本发明将在恶性肿瘤治疗药物的开发及其过继治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。 

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 

附图说明

图1为4例胃癌来源TIL中γδTIL的比例 

图2为一例胃癌来源γδTIL(W2-γδTIL)中δ链的亚型分析 

图3为PCR扩增W2-γδTIL的δ的V区全长序列的琼脂糖凝胶电泳检测结果 

图4为W2-γδTIL(A)和S2-γδTIL(B)对不同肿瘤细胞的杀伤效应 

图5为流式细胞术检测W2-γδTIL的表型 

图6为GTM肽与不同肿瘤细胞、肿瘤组织及配体蛋白MICA的结合实验结果 

图7为PCR扩增的δ1链全长基因和γ4链全长基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果 

图8为TCRγ4δ1转染细胞表面γδTCR表达情况的流式细胞术检测结果(pWPXL转染细胞为对照) 

图9为TCRγ4δ1转染细胞对Daudi细胞的杀伤作用 

图10为流式细胞术检测TCRγ4δ1转染细胞(pWPXL转染细胞为对照)分别与anti-γδTCR(A)和MICA蛋白(B)孵育后TNFα的表达情况 

具体实施方式

本发明优化了体外扩增培养肿瘤浸润性γδT细胞(γδTIL)的条件，成功从4 例胃癌来源的肿瘤组织中培养出Vδ1表型的γδTIL。体外对肿瘤细胞具有杀伤活性。 

本发明对体外扩增培养的肿瘤γδ1TIL的CDR3δ1序列进行分析，结果发现：每例γδ1TIL的CDR3δ1序列具有相对优势特征；其中4例胃癌来源γδ1TIL中3例的CDR3区优势序列相同且共有优势序列较其它序列短。选取3例胃癌来源γδTIL共有的CDR3δ1区优势序列GTM作为后续结构研究的基础。 

人工合成GTM肽，利用流式细胞术、激光共聚焦扫描显微镜技术、ELISA、SPR、免疫组化方法在γδ1T-CDR3肽水平证明GTM肽能与肿瘤细胞或组织区特异性结合。亲和层析方法证实在肿瘤细胞总蛋白中缺失存在与GTM肽特异性结合的蛋白，即肿瘤抗原配体。 

成功从一例胃癌来源的γδTIL中扩增出完整的γ4链和δ1链全长，并通过Lentivirus表达系统建立了在J.RT3-T3.5细胞表面稳定表达完整TCRγ4δ1的平台，以期在细胞水平上模拟γδ1TIL进而研究其识别肿瘤的分子机制。转染细胞能够杀伤肿瘤细胞且这种杀伤作用是TCR依赖性的，给功能基因组和未来基因治疗应用带来了广阔的可能性。 

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 

实施例1、人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(tumor-infiltrating γδT cell，γδTIL)中δ1链互补决定域3(CDR3δ1)的优势序列GTM的获得 

一、上皮来源肿瘤中γδTIL细胞的培养及鉴定 

1、γδTIL细胞的培养 

用anti-pan-TCRγδ mAb(购自Beckman Coulter)包被24孔板，5μg/孔，37℃孵育2h。将无菌手术采集的胃癌、肾癌等实体瘤标本(上皮来源)在RPMI-1640培养基(含青霉素200μg/mL、链霉素100μg/mL、庆大霉素100μg/mL)中浸洗2次，10min/次；去除坏死组织、周围血管及正常组织；将洗好的组织剪碎，用RPMI-1640培养基(含青霉素200μg/mL、链霉素100μg/mL)洗2次，10min/次，然后重悬于RPMI-1640完全培养基中。将重悬的组织碎块上板，添加IL-2(白细胞介素-2，购自北京瑞得合通药业有限公司，200U/mL)；37℃、5％CO₂培养两周，每3天换液一次。 

2、流式细胞仪检测培养TIL细胞的TCR表型： 

收集细胞，1000rpm离心5min，调每管细胞数至1×10⁶个。加1mL PBS洗液轻轻吹打，重悬细胞，1000rpm离心5min，洗2次。加抗体 (FITC-anti-TCRγδ/PE-anti-TCRαβ或者FITC-anti-Vδ1、PE-anti-Vδ1、FITC-anti-Vδ3，购自Beckman Coulter或Pierce)及同型对照(FITC-mouse IgG/PE-mouse IgG，购自Beckman Coulter或Pierce)，不加抗体管作阴性对照，4℃避光孵育30min。加1mL PBS洗液洗涤细胞，3000rpm离心5min，洗3次。每管细胞加入4℃预冷的PBS固定液0.5mL，轻轻吹打，悬起细胞，400目滤网过滤，4℃避光保存待测。 

部分检测结果如图1(横坐标表示TCRγδ，纵坐标表示TCRαβ；W2表示一例胃癌组织来源γδTIL(命名为W2)，W3表示一例胃癌组织来源γδTIL(命名为W3)，W4表示一例胃癌组织来源γδTIL(命名为W4)，W5表示一例胃癌组织来源γδTIL(命名为W5)和图2(横坐标表示Vδ1或Vδ2或Vδ3，纵坐标表示细胞数)所示，共成功培养多例不同肿瘤组织来源的γδTIL，流式细胞术检测上皮来源肿瘤中γδTIL细胞多数为δ1型。符合文献(Bennett WTHH，HHPandolfi FHH，HHGrove BHHH，HHHawes GEHH，HHBoyle LAHH，HHKradin RLHH，HHKurnick JTHH.Dominant rearrangements among human tumor infiltrating lymphocytes.Analysis of T cells derived from 32 patients with melanoma，lung，and renal cell carcinoma.HHCancer.HH 1992 May 1；69(9)：2379-84.)报导的上皮来源的γδTIL细胞主要为Vδ1型，而外周血来源的γδTIL细胞主要为Vδ2型。 

二、γδ1TIL CDR3δ1区序列分析 

1、细胞总RNA的提取 

收集培养的不同来源(来源于胃癌、肾癌等实体瘤组织)的γδTIL细胞，PBS洗一次；按每5×10⁶cells/mL的比例加入Trizol试剂，反复吹打使细胞完全裂解，室温孵育5min；移入经DEPC处理的EP管中，加入1/5体积的氯仿，剧烈振荡15sec，室温静置3min；4℃、10,000rpm离心15min，小心吸取上层水相至一个新管中；加入1/2体积的异丙醇，冰浴10min；4℃、12,000rpm离心10min，弃上清，加入1mL 75％乙醇清洗沉淀，洗两次。4℃、12,000rpm离心10min，吸弃上清，室温干燥沉淀。用DEPC水溶解沉淀，立即用于逆转录或-80℃保存备用。 

2、逆转录合成cDNA第一链 

用购自Promega的MMLV逆转录试剂盒，以步骤1提取的细胞总RNA为模板，反转录合成其cDNA第一链，方法为：取RNA样品2μg和Oligo(dT)₁₅(500μg/ml)1μl，补加DEPC水至13μl，70℃ 10min；取出后马上置于冰浴中，依次加入5×Buffer5μl、dNTP(10mmol/L)5μl、RNA酶抑制剂1μl、MMLV逆转录酶1μl，补加DEPC水至25μl，42℃，60min进行逆转录反应；70℃ 15min灭活酶活性。 

3、PCR扩增TCRδ基因 

本步骤所使用的引物由擎科生物技术有限公司合成，引物浓度均为10pmol/μl，使用内参引物P-UP、P-DN以及γδTIL δ链V区(简称Vδ)全长测序引物Vδ1、Vδ2、Vδ3、Cδ。其中Vδ为5′端特异性引物，与3′端引物Cδ配对使用，可扩增出CDR3基因片段，引物序列如表1所示： 

表1引物序列 

引物名称	引物序列
		Vδ1	5’-GCCCAGAAGGTTACTCAAGCCCAG-3’；
Vδ2	5’-GCCATTGAGTTGGTGCCTGAACAC-3’；
		Vδ3	5’-TGTGACAAAGTAACCCAGAGTTCCCC-3’；
Cδ(reverse)	5’-AAACGGATGGTTTGGTATGAGGC-3’；
		P-UP(β-actin-UP)	5’-TACCACTGGCATCGTGATGGACTC-3’；
P-DN(β-actin-DN)	5’-TCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3’。

以步骤2反转录合成的cDNA第一链为模板，在上述引物(引物对Vδ1和Cδ扩增Vδ1基因、引物对Vδ2和Cδ扩增Vδ2基因、引物对Vδ3和Cδ扩增Vδ3基因)的引导下PCR扩增γδTILδ链V区序列，PCR反应体系如下： 

cDNA                                1μl， 

引物                                各1μl， 

10×PCR反应缓冲液                   5μl， 

MgClRR₂RR(25mM)                     3μl， 

dNTP(2.5mM)                         4μl， 

Taq plusDNA聚合酶(1u/μl)           1μl， 

dd HRR₂RRO                          34μl， 

总体积                              50μl； 

PCR参数为：94℃预变性5min，94℃ 30sec，58℃退火45sec，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃再延伸10min。反应结束后取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3(DNA分子量Marker为DL-2000，泳道P表示内参β-actin，泳道1表示Vδ1/Cδ扩增产物，泳道2表示Vδ2/Cδ扩增产物，泳道3表示Vδ3/Cδ 扩增产物)所示，经在引物对Vδ1和Cδ的引导下扩增获得了367bp的Vδ1的DNA片段，引物对Vδ2和Cδ、Vδ3和Cδ未扩增到目的基因，与预期结果相符。 

4、γδTIL的δ1基因克隆 

(1)目的DNA片段的回收：用DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收步骤3扩增的目的片段； 

(2)连接反应：将回收的目的片段连接入pGEM-T Easy载体(购自Promega)中，反应体系如下： 

上述反应物充分混匀并离心使其沉于管底后，22℃连接2h。 

(3)重组质粒的转化 

取E.coli DH5α感受态细胞50μl，加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min；42℃热休克90sec，迅速插入冰中，冰浴5min；加入200μl LB培养基，37℃、200rpm振荡培养1h；此时可将LB平板(含50μg/mL Amp)涂布IPTG(40μg/mL)和X-gal(24μg/mL)，以进行蓝白斑筛选。涂板后37℃培养过夜至菌落直径为1～2mm。挑取白色菌落作为阳性克隆接种于5mL LB培养基中，37℃培养过夜。 

5、阳性克隆序列分析 

送阳性克隆菌液至诺赛生物技术公司测序，测序引物使用T载体的通用引物。DNAMAN软件分析序列结果。结果如表2所示，每例γδ1TIL的CDR3δ1序列具有相对优势特征；其中4例(W2、W3、W4、W5)胃癌来源γδ1TIL中3例的CDR3δ1优势序列相同，命名为GTM序列(CA FLPHA DKLIFGKG，即序列表中SEQ ID NO：1)，而且该共有优势序列较其它序列短。 

表24例胃癌来源γδ1TIL中CDR3δ1序列及其频率小结 

实施例2、γδ1TIL的对肿瘤的杀伤功能及表型分析 

1、γδTIL对肿瘤细胞的杀伤功能 

使用cytotox 96 non-radioactive cytotoxicity assay reagents kit(Promega，USA)并参照试剂盒说明书进行杀伤试验。以W2-γδTIL(来源于胃癌组织)和S2-γδTIL(来源于肾癌组织)为效应细胞，分别检测其对不同肿瘤细胞-胃腺癌细胞BGC-823(来源于人胃癌)、肾癌细胞G401(来源于人肾癌)和结肠癌细胞HT-29(来源于人结肠癌)的杀伤效率。靶细胞1×10⁴/孔加入96孔板，使效靶比分别为2.5∶1、5∶1、10∶1。结果如图4所示(图A为胃癌来源的W2-γδTIL对肿瘤细胞的杀伤率，图B为肾癌来源的S2-γδTIL对肿瘤细胞的杀伤率)，这两例γδTIL对3种肿瘤细胞均具有一定的杀伤效应，且杀伤具有来源特异性，即胃癌来源的W2-γδTIL对胃癌细胞系BGC-823杀伤效率最高，而肾癌来源的S2-γδTIL对肾癌细胞系G401杀伤效率最高。 

2、W2-γδTIL的表型分析 

流式细胞染色步骤同实施例1。检测W2-γδTIL的细胞表面分子表达情况(NKG2D、CD4、CD8、CD80、CD86、CD56、CD69)。 

结果如图5所示(横坐标表示TCRγδ，纵坐标表示各种表面分子)，W2-γδTIL的表型分析显示W2-γδTIL表面NKG2D、CD8、CD86、CD56、CD69均高表达，而CD4、CD80无表达，表明主要为杀伤表型。 

实施例3、人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列-CDR3δ1(GTM)肽与肿瘤细胞、肿瘤组织以及Vδ1配体蛋白MICA的结合 

1、GTM肽的合成及生物素化 

采用化学合成法合成序列表中SEQ ID NO：1所示的人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列-CDR3δ1(GTM)肽，合成时直接在末端标记一个生物素分子，以肽CH3(WPHNWWPHFKVK)为对照。 

2、流式细胞术检测GTM肽与不同肿瘤细胞的结合特性 

将生长状态良好的BGC-823、G401、肺腺癌细胞GLC-82(来源于人肺腺癌)、HT-29、人卵巢癌细胞SKOV3(来源于人卵巢癌)消化收集，离心后用PBS调至浓度为1×10⁶cells/mL的细胞悬液，各自取0.5mL于每一EP管中，洗涤细胞，加入生物素化的GTM肽或对照肽CH340μg/管；空白对照管和二抗对照管只加PBS洗液；4℃孵育30min，洗涤三次。加入FITC-Streptavidin(购自eBioscience)5μl，空白对照管只加PBS洗液，4℃避光孵育30min，洗涤三次，每管细胞中加入4℃预冷的PBS固定液0.5mL，轻轻吹打，悬起细胞，将细胞悬液过滤至新EP管中，4℃避光保存，流式细胞仪检测。 

流式细胞术检测结果如图6A所示，与对照相比，GTM肽与不同肿瘤细胞均有不同程度结合，结合率较高。 

3、激光共聚焦扫描显微镜检测GTM肽与不同肿瘤细胞的结合 

处理盖玻片：酸(重铬酸钾120g：浓硫酸200mL：蒸馏水1000mL)中浸泡48h，洗净，于95％乙醇中浸泡，晾干，于多聚赖氨酸(浓度0.1mg/mL)中浸泡1h，晾干，高温消毒。铺细胞：取无菌24孔板，每孔放一片消毒后并干燥的盖玻片。将生长状态良好的BGC-823、G401、GLC-82、HT-29、SKOV3细胞调至浓度为1×10⁵cells/mL的细胞悬液，每孔1mL，37℃静置过夜。洗涤细胞：每孔加1mL PBS缓冲液，3min×4次，整个操作过程中动作轻柔，避免触及玻片上已生长的细胞。固定细胞：每孔加入0.5mL 4％多聚甲醛，室温静置20min；吸弃固定液，洗涤细胞1次。封闭细胞：每孔加入0.5mL含10％山羊血清的PBS封闭液，没过盖玻片，室温孵育45min；吸弃封闭液。完全吸净孔中液体，玻片保持湿润，每孔加入0.25mL肽(PBS封闭液配，10μg/mL)，室温孵育45min。吸弃一抗，洗涤细胞。然后每孔加入0.25ml FITC-Streptavidin(1∶500稀释)，室温避光孵育45min；吸弃二抗，洗涤细胞3次。碧云天kit中Hochest染核1min。洗涤细胞。碧云天kit中封片剂封片，激光共聚焦扫描显微镜检测。 

激光共聚焦扫描显微镜检测结果如图6B所示，与对照相比，GTM肽与不同肿瘤细 胞均有不同程度结合，结合率较高。 

4、利用BIA技术检测GTM肽与MICA的结合 

(1)Vδ1配体蛋白MICA包被CM5芯片 

首先对固定反应缓冲液(10mM乙酸(acetate)，购自GE)的pH值及包被蛋白的浓度进行优化筛选，选取最大响应值对应的pH值(pH5.0)的乙酸缓冲液作为实验用固相化的缓冲体系。将MICA蛋白(本组表达纯化)包被CM5芯片(购自GE)的浓度定为8000RU。 

(2)摸索洗脱条件，该洗脱条件(20mM甘氨酸-HCl)下可以将GTM肽及其突变肽完全洗下又不会使包被在芯片上的蛋白被洗下，即回到基线。 

(3)根据Rmax值选择结合蛋白的最高浓度，梯度稀释样品。 

(4)按照Biacore3000的说明书利用自动程序进行亲和力测定。每个循环分为平衡基线-结合-解离-再生-回复基线，完成后可进行下一循环，每个浓度至少作2个循环。 

(5)BIACORE 3000 Evaluation软件进行数据分析。 

Biacore检测结果如图6C所示，与对照相比，GTM肽可与肿瘤抗原配体-Vδ1配体蛋白MICA结合。 

5、免疫组织化学法检测GTM肽与各种癌组织的结合 

如图6D所示，组织切片为胃癌(G)、肾癌(R)、肺癌(L)、结肠癌(C)和卵巢癌(O)组织的石蜡切片。烤片：60℃ 2h。石蜡切片常规脱蜡至水(二甲苯-乙醇-水)。枸橼酸修复，暴露抗原，93℃ 10min，ddH₂O洗涤两次。3％ H₂O₂处理10min以清除内源性过氧化物酶的活性。水化，PBS冲洗，3min/次，共3次。封闭，10％正常羊血清(PBS稀释)，37℃孵育10min。向玻片上滴加GTM肽或CH3肽(终浓度为50μg/mL)，使其恰好覆盖细胞，37℃孵育1h。另设抗体稀释液作为对照。PBS冲洗，3min/次，共3次。滴加HRP-Streptavidin(辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，购自Pierce，1∶100稀释)，室温孵育30min。PBS冲洗，3min/次，共3次。滴加DAB显色液，适时用自来水冲洗终止反应。苏木素复染，常规脱水到二甲苯(水-乙醇-二甲苯)。明胶封片，照相。 

免疫组化检测结果如图6D所示，与对照相比，GTM肽与不同肿瘤组织(胃癌、肾癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌)均有不同程度结合。 

实施例4、转染有编码所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)的TCR的基因的J.RT3-T3.5γδT淋巴细胞TCRγ4δ1的获得 

一、分别携带全长δ1(TRD1G，含GTM)、γ4(TRG4G)基因的重组慢病毒表达载体的构建 

将含有上述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的TCR受体的δ1链命名为TRD1G，将与TRD1G相匹配的γ4链命名为TRG4G，构建分别携带全长δ1(TRD1G，含GTM)、γ4(TRG4G)基因的重组慢病毒表达载体，具体方法包括以下步骤： 

1、细胞总RNA的提取 

用Trizol试剂提取胃癌来源的γδTIL(W2)的RNA，方法同实施例1。 

2、逆转录合成cDNA第一链 

方法同实施例1。 

3、PCR扩增TCRδ1和γ4全长基因 

δ1链基因全长扩增引物为TRδ1-UP-BamHI和TRδ-DN-MluI，γ4链基因全长扩增引物为TRγ4-UP-PmeI和TRγ-DN-MluI，引物序列如表3所示。 

表3引物序列 

名称	引物序列
		TRδ1-UP-BamHI	5’-CGCGGATCCGCCACCATGCTGTTCTCCAGC CTGCTG-3’
TRδ-DN-MluI	5’-CGACGCGTTCATTACAAGAAAAATAACTTGGCAGTC-3’
		TRγ4-UP-PmeI	5’-GGGTTTAAACGCCACCATGCAGTGGGCCCT AGCGG-3’
TRγ-DN-MluI	5’-CGACGCGTTCATCATGATTTCTCTCCATTGCAGCAG-3’。

以步骤2逆转录合成cDNA第一链为模板，在TRδ1-UP-BamHI和TRδ-DN-MluI的引导下PCR扩增δ1链全长基因，在TRγ4-UP-PmeI和TRγ-DN-MluI的引导下PCR扩增γ4链全长基因，扩增所用DNA聚合酶为Phusion DNA聚合酶(FINNZYMES)，PCR反应体系如下： 

PCR参数为：98℃预变性30sec，98℃ 10sec，98℃退火30sec，54℃延伸50sec， 30个循环，最后72℃再延伸5min。反应结束后，取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图7(DNA分子量Marker为DL-2000，δ1链全长基因(A)和γ4链全长基因(B))所示，经扩增获得了858bp的δ1DNA片段和972bp的γ4DNA片段，与预期结果相符。 

4、TRD1G和TRG4G与载体的连接 

(1)载体pWPXL和PCR产物的单酶切反应 

载体pWPXL(购自Clontech)和TRD1G基因PCR扩增产物分别用BamHI和MluI进行双酶切，载体pWPXL和TRG4G基因PCR扩增产物分别用PmeI和MluI进行双酶切，酶切反应体系如下： 

37℃酶切2小时，用DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收酶切片段。 

(2)连接反应 

将酶切片段连接入经同样酶酶切的载体pWPXL中，连接反应体系如下： 

上述反应物充分混匀并离心使其沉于管底后，4℃连接过夜，得到重组质粒，分别命名为pWPXL-δ1和pWPXL-γ4。 

5、重组质粒的转化及鉴定 

(1)重组质粒的转化 

方法同实施例1。 

(2)重组质粒的酶切鉴定 

方法同实施例1，pWPXL-δ1经BamHI和MluI酶酶切获得了858bp的DNA片段，pWPXL-γ4经PmeI和MluI酶酶切获得了972bp的DNA片段，与预期结果相符。 

(3)DNA片段的序列分析 

将经酶切鉴定含有目的DNA插入片段的阳性克隆进行序列测定，由诺赛生物技术 公司完成。用DNAMAN软件分析测序结果。结果获得了插入序列及位置均正确的分别携带含有人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的TCR受体的δ1链基因TRD1G的重组慢病毒载体pWPXL-δ1以及携带与δ1链匹配的γ4链基因TRG4G的重组慢病毒载体pWPXL-γ4，其中TRD1G具有序列表中SEQ ID NO：5的核苷酸序列，由858个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-858位碱基，自5’端第331-375位碱基为GTM编码序列，编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列的蛋白质；TRG4G具有序列表中SEQ ID NO：6的核苷酸序列，由972个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-972位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：3的氨基酸残基序列的蛋白质。取测序正确的菌液加入10％甘油作为菌种，于-70℃保存备用。 

二、转染有编码所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)的TCR基因的J.RT3-T3.5细胞(TCRγ4δ1转染细胞)的获得 

1、J.RT3-T3.5细胞的转染 

用Qiagen质粒小提试剂盒(购自Qiagen)提取pWPXL(阴性对照)、pWPXL-δ1、pWPXL-γ4质粒、psPAX2质粒(包装质粒，购自Clontech)、pMD2.G质粒(包膜质粒，购自Clontech)，OD260/OD280检测提取质粒的浓度和纯度。转染前一天(D0)将生长状态良好的293T细胞(购自ATCC)铺板(6cm平板铺2×10⁶个细胞)。转染前1h换成新鲜培养基(无抗生素)(D1)。用 

I Reduced Serum Medium(购自Invitrogen)分别稀释质粒，轻轻混匀。临用前轻轻混合Lipofectamine^TM 2000(购自Invitrogen)，用 I Reduced Serum Medium稀释。室温孵育5min。然后将稀释后的质粒与稀释后的Lipofectamine^TM 2000混合。轻轻混匀，室温孵育20min，溶液变浑浊。将其加入含细胞和培养基的孔板中，混匀。37℃孵育24h。转染后第二天(D2)更换培养基，第三天(D3)收病毒上清。将pWPXL-δ1、psPAX2和pMD2.G转染的病毒上清和pWPXL-γ4、psPAX2和pMD2.G转染的病毒上清同时加入J.RT3-T3.5细胞(购自ATCC)中(polybrene 8μg/mL，中文名称1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)，将转染细胞命名为pWPXL-δ1/pWPXL-γ4转染细胞。以pWPXL转染的病毒上清作为阴性对照，命名为pWPXL转染细胞。感染后48h更换新鲜培养基，再孵育48h后检测表达情况。 

2、全长γ4和δ1链转染细胞表面γδTCR表达情况的流式细胞术检测 

流式细胞术检测转染细胞表面γδTCR的表达：收集转染δ1和γ4后的J.RT3-T3.5细胞，用PE-γδAb抗体(购自Beckman Coulter)进行细胞表面染色，步骤同实施例1。流式细胞术检测结果如图8所示，与阴性对照(pWPXL转染细胞) 相比，在δ1和γ4转染细胞(pWPXL-δ1/pWPXL-γ4转染细胞)中检测到γδTCR表达，将转染有编码所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)的TCR基因的J.RT3-T3.5细胞命名为TCRγ4δ1转染细胞。 

3、流式细胞术富集高表达目的基因的转染细胞 

流式细胞术富集高表达目的基因的转染细胞，步骤同实施例1，只是全过程都要无菌操作，所用试剂均需无菌。分选后细胞表面γδTCR的表达情况如图8(GFP表示绿色荧光蛋白，即连接在δ1基因3’端的标签蛋白)所示，经流式分选后，TCRγ4δ1阳性细胞纯度达90％以上，可以进行后续功能实验。 

实施例5、TCRγ4δ1转染细胞的功能鉴定 

1、TCRγ4δ1转染细胞对肿瘤细胞的杀伤活性测定 

使用cytotox 96 non-radioactive cytotoxicity assay reagents kit(Promega，USA)进行肿瘤细胞杀伤试验。效应细胞为TCRγ4δ1转染细胞，靶细胞为人B淋巴瘤细胞Daudi(购自ATCC)，加入96孔板中，靶细胞3×10⁴/孔。效应细胞与抗γδTCR抗体、同型对照IgG1抗体4℃孵育1h后进行杀伤，效靶比分别为1.25∶1，2.5∶1，5∶1。同时还用相同方法检测了pWPXL和TCRγ4δ1转染细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。 

结果如图9所示，与阴性对照(pWPXL转染细胞)相比，TCRγ4δ1转染细胞对Daudi细胞的杀伤效率提高，且这种杀伤作用是TCRγδ依赖性的。 

2、TCRγ4δ1转染细胞的细胞因子测定 

转染后，1×10⁶个TCRγ4δ1转染细胞(pWPXL转染细胞为对照)分别与anti-TCRγδ(浓度5μg/mL，购自Beckman Coulter)或MICA蛋白(浓度5μg/mL)37℃孵育18h。孵育最后6h加入BrefeldinA(中文名称布雷非德菌素A，BioLegend)，1ug/mL。使用Fixation/Permeabilization Wash Buffer(BioLegend)胞内染色检测转染细胞TNF-a的生成。4℃避光保持待测。 

结果如图10所示(横坐标为TNFα胞内表达情况，纵坐标为细胞数；图A表示转染细胞与anti-TCRγδ抗体孵育后胞内TNFα表达情况，图B表示转染细胞与MICA蛋白孵育后胞内TNFα表达情况)，与阴性对照(pWPXL转染细胞)相比，与anti-TCRγδ或MICA蛋白孵育后，TCRγ4δ1转染细胞内TNFα表达提高。 

综上所述，J.RT3-T3.5细胞表达TCRγδ后对肿瘤细胞的杀伤作用增强，且这种增强是TCRγδ依赖性的，本发明的TCRγ4δ1转染细胞可作为活性成分制备成抗肿瘤药物。 

Claims (15)

1.人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有抗原识别作用的蛋白质。

2.含有权利要求1所述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列的TCR受体的δ1链蛋白。

3.根据权利要求2所述的TCR受体的δ1链蛋白，其特征在于：所述蛋白是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：2；

2)将序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有抗原识别作用的蛋白质。

4.与权利要求3所述含有上述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的TCR受体的δ1链相匹配的γ4链，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：3；

2)将序列表中SEQ ID NO：3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有抗原识别作用的蛋白质。

5.一种胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞(γδTIL)的TCR，其δ1链的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，其γ4链的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

6.编码权利要求1所述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：4的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：4限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有抗原识别作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：4限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

7.编码权利要求2所述含有上述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的TCR受体的δ1链蛋白的基因。

8.编码权利要求3所述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列的TCR受体的δ1链蛋白的基因，其特征在于：所述基因是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：5的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：5限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有抗原识别作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：5限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

9.编码权利要求4所述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列GTM的TCR受体的δ1链TRD1G相匹配的γ4链的基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：6的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：6限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有抗原识别作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：6限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

10.编码权利要求5所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞的TCR的基因，其δ1链编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，其γ4链编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。

11.含有权利要求6-10任一项所述基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌。

12.根据权利要求11所述的转基因细胞系，其特征在于：所述转基因细胞系为转基因J.RT3-T3.5细胞；可按照常规方法将编码所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞的TCR基因转染J.RT3-T3.5细胞，如通过含有编码所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞的TCR基因的重组真核表达载体将编码所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞的TCR基因导入J.RT3-T3.5细胞。

13.根据权利要求12所述的转基因细胞系，其特征在于：用于构建含有编码所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞的TCR基因的重组真核表达载体的出发载体为pRSV-rev、pLentilox 3.7、pMDLg、pRRE、pWPXL或pLVX-DsRed等慢病毒表达载体，优选为pWPXL；以pWPXL为出发载体，构建的携带所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞的TCR的δ1链编码基因的重组真核表达载体为pWPXL-δ1，构建的携带所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞的TCR的γ4链编码基因的重组真核表达载体为pWPXL-γ4。

14.根据权利要求13所述的转基因细胞系，其特征在于：所述转染有编码所述胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞的TCR基因的J.RT3-T3.5细胞为TCRγ4δ1转染细胞。

15.权利要求1所述的人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列，权利要求2或3所述的含有上述人胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞中δ1链互补决定域3的优势序列的TCR受体的δ1链蛋白，或者权利要求5所述的胃癌组织来源肿瘤浸润性γδT淋巴细胞的TCR在制备杀灭肿瘤细胞的药物或制剂中的应用，所述肿瘤细胞与人B淋巴瘤细胞Daudi相关。

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