CN108864276A - 靶向ny-eso-1的t细胞受体联合表达pd1抗体可变区及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向NY‑ESO‑1的T细胞受体联合表达抗PD1的抗体。由NY‑ESO‑1 TCRα链、P2A、NY‑ESO‑1 TCRβ链、T2A、人IL2信号肽、抗人PD1单克隆抗体的重链和轻链可变区(aPD1scFv)结构串联构成。该T细胞受体用于修饰人的T淋巴细胞，修饰后的T细胞(TCR‑T细胞)能用于表达HLA‑A2+NY‑ESO‑1阳性肿瘤的治疗。本发明制备的NY‑ESO‑1‑aPD1 TCR‑T细胞对特异性肿瘤细胞(U266、T2‑NY‑ESO‑1)都具强烈的功能，CD107a表达和IFNγ分泌较高，效靶比是5:1的情况下对U266杀伤效率达到85％。本发明制备的NY‑ESO‑1‑aPD1 TCR‑T带有分泌PD1抗体功能，可封闭PD1‑PDL1位点，使TCR‑T免受免疫微环境的抑制作用。

Description

靶向NY-ESO-1的T细胞受体联合表达PD1抗体可变区及其用途

技术领域

本发明属于T细胞受体领域，具体涉及靶向NY-ESO-1的T细胞受体并联合表达PD1抗体可变区及其用途。

背景技术

近年来人们在筛选肿瘤特异性抗原方面取得了很大进展，发现了大量肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原。1991年比利时的Boon教授和他的同事们首先发现的肿瘤睾丸(cancer-testis antigen，CT)抗原，CT是目前鉴定出来的肿瘤特异性抗原中数目最多的一类，它们具有以下共同特征：一般在正常组织中不表达；在肝癌、恶性黑色素瘤、肺癌等多种肿瘤中有不同强度的表达；编码基因位于X染色体上。由于上述特点，CT抗原被认为是肿瘤特异性的共享抗原。

CT抗原包括黑色素瘤抗原(MAGE)家族、SSX基因家族、LAGE、GAGE、CTp11和NY-ESO-l等，NY-ESO-1是由Chen Y.T.等使用重组cDNA文库血清学分析技术从食管癌cDNA表达文库中筛出来的一种肿瘤共享抗原。NY-ESO-1基因家族至少拥有3个成员，他们分别是NY-ESO-1、LAGE-1和ESO3，基因均定位于Xq28。NY-ESO-1基因转录的mRNA最长747bp，表达的蛋白质相对分子质量为18KD，由180个氨基酸组成，其C端存在一疏水性氨基酸尾，在NY-ESO-1蛋白上有潜在的跨膜区域。采用RT-PCR和免疫组织化学法检测NY-ESO-l mRNA及其蛋白的表达情况，研究者对NY-ESO-1在各个系统的肿瘤的表达进行了研究，结果表明NY-ESO-1在各肿瘤表达频率不一，在神经母细胞瘤、滑膜肉瘤、恶性黑素瘤、卵巢癌等肿瘤组织中表达较高，在结直肠癌、肝癌、尿路上皮癌、多发性骨髓瘤、肺癌中也有不同程度的表达，但在一些类型的肿瘤如直肠癌、肾癌、白血病及淋巴瘤组织中NY-ESO-1的表达较低，甚至不表达。NY-ESO-1在正常组织中也有表达，主要表达于睾丸和卵巢，低表达于子宫，但是由于血睾屏障的存在，正常组织遭受的免疫毒性能得到有效控制。NY-ESO-l的表达特征，展现了良好的临床应用前景，成为了国内外学者的研究重点。近年来，NY-ESO-l是过继性免疫治疗的重要靶点。

由于难以从大多数肿瘤患者体内获得对肿瘤抗原有高亲和力和特异性的肿瘤反应性T细胞。研究者逐渐尝试通过基因工程的方法，将可识别肿瘤抗原的特异性TCR基因导入患者T细胞，从而获得特异性TCR基因转染T细胞。即通过对患者无能T细胞抗原特异性的再定向(redirect)，获得肿瘤反应性T细胞。从根本上说，TCR是T细胞识别抗原的分子基础。就占外周血T淋巴细胞总数的80％以上的α⁺β⁺T细胞而言。其TCR分子由α、β双链构成，TCRα链和β链都在蛋白结构上均由可变区(V区)和恒定区(C区)两部分组成，其中V区是识别抗原肽/MHC复合物(pMHC)的关键部位。TCRα链和β链的V区各含有三个与免疫球蛋白的V区结构类似的高变区，也称互补决定区(Complementarity Determining Region，CDR)，一般用CDRl、CDR2和CDR3表示。另外，TCRVβ链还含有第四个高变区CDR4。通过基因重排等机制形成的具有极高多样性的TCR决定了T细胞识别抗原的多样性，使成熟T细胞表达的TCRαβ双链组成了一个能与成千万种抗原(理论上可达到10¹⁴级)结合的抗原识别受体库(repertoire)

随着TCR多样性及TCR识别抗原肽/MHC复合物机制等相关理论知识的不断丰富，结合分子生物学及基因工程技术的深入发展。肿瘤过继性细胞治疗逐渐明确了一条全新思路-TCR基因工程化T细胞(TCR gene engineered T cell)。即首先筛选和克隆肿瘤特异性TCR基因，随后以之转染T细胞赋予其抗原特异性，从而获得基因工程化抗原特异性T细胞，最终将TCR基因转染T细胞回输患者体内，重建针对抗原阳性肿瘤的T细胞免疫反应。近年来，许多学者分离出肿瘤相关抗原特异性TCR基因，然后通过慢病毒、逆转录病毒或者其他非病毒载体将其转导入T细胞并表达，在短期内获得大量具有特异性识别抗原能力的T细胞，并进行了一系列临床前或临床试验，取得了一些可喜的成果。

以αβTCR基因转染T细胞赋予抗原特异性的研究最初起源于转基因小鼠模型。随后多个研究小组成功的使αβTCR双链成功转染表达于人白血病细胞系Jurkat。1999年，第一例通过TCR基因转染赋予人外周血T细胞抗原特异性，使其靶向识别肿瘤抗原的实验由Clay等人完成。他们首先鉴定并克隆化来自HLA-A2型黑色素瘤患者的肿瘤反应性T细胞。再鉴定并克隆了可识别MART-1(表达于大多数人黑色素瘤细胞的肿瘤特异性抗原)m9-27肽的TCR基因，在克隆获得TCR基因的cDNA编码序列后，利用逆转录病毒载体，将特异性TCR基因转染来源于HLA-A2型健康人外周血T细胞的CD8+T细胞。特异性TCR基因转染T细胞可在体外有效裂解MART-1阳性黑色素瘤细胞系。从而证明了利用外源TCR基因改造T细胞赋予其肿瘤抗原识别能力的可行性。此后，研究者又成功的获得了针对MDM2、LMP2等肿瘤抗原的TCR基因，并以之成功转染T细胞，使TCR基因转染T细胞治疗成为肿瘤免疫治疗的全新策略。2006年，Rosenberg等在《SCINECE》发表了在第一例在黑色素瘤病人中进行的TCR基因转染T细胞治疗的1期临床实验结果。该研究通过逆转录病毒载体将MART-1抗原特异的TCR基因转入患者外周血淋巴细胞，再将淋巴细胞回输病人体内。结果表明在17例病人中有2例出现了明显的肿瘤消退。

Robbins研究小组将NY-ESO-1抗原特异性TCR基因修饰的T细胞回输给6名滑膜细胞肉瘤患者和11名恶性黑素瘤患者，结果4名滑膜细胞肉瘤患者和5名恶性黑素瘤患者取得了明显的治疗效果，包括2名完全缓解的患者，而且无一例发生明显的不良反应。尽管TCR基因修饰的T细胞展现了良好的临床疗效，但是也有研究者发现，某些患者的肿瘤仍能逃脱免疫治疗的杀伤。Klippel等发现，接受过继NY-ESO-1特异性T细胞疗法后又复发的恶性黑素瘤患者可能与其体内细胞MHC丢失有关，从而形成了免疫逃逸。此外，目前提高TCR亲和力和减少TCRαβ链错配率是TCR基因治疗亟需解决的问题，TCR错配或亲和力过高等原因导致的自身免疫性疾病也不可忽视。同样，T细胞的肿瘤微环境和TCR的安全性问题也值得关注。此外，调节性T细胞、髓系来源的抑制性细胞以及一些细胞因子都会对输入的基因修饰T细胞产生影响，从而影响T细胞的杀伤功能。以上研究结果提示，TCR基因转染T细胞治疗已经迈出临床应用的步伐。

PD1(programmed death 1)最初是在凋亡的T细胞杂交瘤中得到的，由于其和细胞凋亡相关而被命名为程序性死亡1受体。PD1受体表达于T细胞表面和初级B细胞表面，在这些细胞的分化和凋亡中发挥作用。PD1有两个配体，分别是PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，属于B7家族蛋白(Blood.2009.114(8):p.1537-44.)。PD-L1蛋白广泛表达于抗原提呈细胞、活化T、B细胞、巨噬细胞、胎盘滋养层、心肌内皮和胸腺皮质上皮细胞。PD-L1与T细胞上的受体PD1相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用。正常情况下，机体遇到外来病原体或抗原侵犯时，抗原提呈细胞捕获抗原，对抗原进行加工使之成为T细胞可以识别的抗原表位，与MHC分子结合并呈现与细胞外侧供T细胞识别。T细胞通过TCR与抗原提呈细胞的MHC分子结合，另外共刺激信号CD28受体与初始T细胞表面的B7-1(CD80)或B7-2(CD86)结合，T细胞接到正向调控信号，初始T细胞活化为效应T细胞，启动免疫应答。当有持续抗原刺激时，为避免应答过度，活化T细胞表面表达PD1，与抗原提呈细胞表面的PD-L1结合，向T细胞传递负向调控信号，T细胞增殖减少或凋亡。研究发现，在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达，肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上PD-L1的表达，表达的PD-L1和T细胞表面的PD1结合抑制T细胞抗肿瘤活性，从而使肿瘤细胞逃避机体免疫系统的监视和清除，有利于肿瘤的发生和生长。

虽然复方组合前景广阔，但目前的抗肿瘤药治疗窗口普遍较窄，联合用药的效果仍难以预测，严重制约了PD1作用的发挥。宾夕法尼亚大学Edmund Moon教授和他所带领的团队针对这一联合应用策略开展了一系列研究。在NY-ESO-1为抗原靶点的TCR-T细胞杀伤肿瘤细胞实验时，加入抗PD1抗体，可显著改善T细胞功能减退的现象；相应地，在小鼠皮下移植瘤模型中，TCR-T细胞的肿瘤清除能力有限，而在同时给予PD1抗体处理后，则能达到完全消除肿瘤的目的(Clin Cancer Res.2016.22(2):p.436-47.)。

我们专利是以NY-ESO-l的TCRα链和TCRβ链作为TCR的结构，同时也表达了抗人PD1的片段。本专利对靶向TCR进行了修饰，引入了抗人PD1的片段，使TCR-T细胞和阻断PD1/PD-L1信号联合应用策略对肿瘤免疫抑制微环境得到了很好的改善。同时也为今后的临床实验奠定了基础。

发明内容

本发明第一方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：

(1)含有依次连接的NY-ESO-1TCRα链的编码序列、P2A的编码序列、NY-ESO-1TCRβ链的编码序列、T2A的编码序列、人IL2信号肽的编码序列、抗人PD1单克隆抗体的重链和轻链可变区(aPD1scFv)的编码序列串联构成多核苷酸序列；和

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。

在一个或多个实施方案中，在所述NY-ESO-1TCRα的编码序列编码序列如SEQ IDNO:2第1-822位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述P2A的编码序列如SEQ IDNO:2第823-903位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述NY-ESO-1TCRβ链的编码序列如SEQ ID NO:2第904-1830位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人T2A的编码序列如SEQ ID NO:2第1831-1905位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人IL2信号肽的编码序列如SEQ ID NO:2第1906-1965位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人PD1单克隆抗体的重链编码序列如SEQ ID NO:2第1966-2304位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人PD1单克隆抗体的轻链编码序列如SEQ ID NO:2第2350-2670位核苷酸序列所示。

本发明第二方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：

(1)含有依次连接的NY-ESO-1TCRα链的编码序列、P2A的编码序列、NY-ESO-1TCRβ链的编码序列、T2A的编码序列、人IL2信号肽的编码序列、抗人PD1单克隆抗体的重链和轻链可变区(aPD1scFv)的编码序列串联而成编码序列；和

(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白；

在一个或多个实施方案中，在所述NY-ESO-1TCRα的编码序列编码序列如SEQ IDNO:1第1-274位氨基酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述P2A的编码序列如SEQ IDNO:1第275-301位氨基酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述NY-ESO-1TCRβ链的编码序列如SEQ ID NO:1第302-610位氨基酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人T2A的编码序列如SEQ ID NO:1第611-635位氨基酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人IL2信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1第636-655位氨基酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人PD1单克隆抗体的重链编码序列如SEQ ID NO:1第656-768位氨基酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人PD1单克隆抗体的轻链编码序列如SEQ ID NO:1第784-890位氨基酸序列所示。

本发明第三方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为载体。在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。

本发明第四方面提供一种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有本文所述的核酸构建物，优选含有所述载体，更优选含有所述逆转录病毒载体。

本发明第五方面提供一种基因修饰的T细胞，所述细胞含有本文所述的多核苷酸序列，或含有本文所述的核酸构建物，或感染了本文所述的逆转录病毒。

本发明第六方面提供一种含本文所述的基因修饰的T细胞的药物组合物。

本发明第七方面提供本文所述的多核苷酸序列、融合蛋白、核酸构建物或逆转录病毒在制备活化的T细胞中的应用。

本发明第八方面提供本文所述的多核苷酸序列、融合蛋白、核酸构建物、逆转录病毒、或基因修饰的T细胞或其药物组合物在制备治疗NY-ESO-1介导的疾病的药物中的用途。在一个或多个实施方案中，优选地，所述NY-ESO-1介导的疾病包括神经母细胞瘤、滑膜肉瘤、恶性黑素瘤、卵巢癌；

更优选地，所述NY-ESO-1介导的疾病包括神经母细胞瘤、滑膜肉瘤、恶性黑素瘤、卵巢癌、结直肠癌、肝癌、尿路上皮癌、多发性骨髓瘤、肺癌。

附图说明

图1为RV-NY-ESO-1TCR-aPD1(NY-ESO-1-aPD1TCR-T)逆转录病毒表达载体示意图。

图2为RV-NY-ESO-1TCR-aPD1(NY-ESO-1-aPD1TCR-T)逆转录病毒表达质粒的部分测序结果峰值图。

图3为流式细胞仪显示逆转录病毒感染T细胞72小时NY-ESO-1TCR-T和NY-ESO-1-aPD1TCR-T的TCR表达效率。

图4 293T-PD1过表达细胞与NY-ESO-1TCR-aPD1病毒孵育30min后染anti-HumanFab结果。

图5为制备5天的NY-ESO-1-aPD1TCR-T细胞与靶细胞共培养5小时CD107a表达检测。

图6为制备5天的NY-ESO-1-aPD1TCR-T细胞与靶细胞共培养5小时IFNγ的分泌检测。

图7为制备5天的NY-ESO-1TCR-T和NY-ESO-1-aPD1TCR-T细胞与靶细胞共培养16小时后对肿瘤细胞的杀伤作用。

图8为制备5天的NY-ESO-1TCR-T和NY-ESO-1-aPD1TCR-T与靶细胞共培养24小时和48小时后TCR-T表面PD1表达。

具体实施方式

本发明提供一种靶向NY-ESO-1的T细胞受体(TCR)。该TCR含有依次连接的NY-ESO-1TCRα链、P2A、NY-ESO-1TCRβ链、T2A、人IL2、抗人PD1单克隆抗体的重链和轻链可变区(aPD1scFv)片段。

应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的融合蛋白(即所述TCR)的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。

本发明也包括SEQ ID NO:1第1-601位氨基酸序列所示的TCR、SEQ ID NO:1第275-601位氨基酸序列所示的TCR的突变体。这些突变体包括：与该TCR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该TCR的生物学活性(如活化T细胞)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。

突变体还包括：在SEQ ID NO:1第1-601位所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:1第275-601位所示的氨基酸序列的氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该TCR的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。

本发明包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。

本文所述的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的多核苷酸序列可以多种方式被操作以保证所述融合蛋白(TCR)的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。通常通过可操作地连接本发明的多核苷酸序列至启动子，并将构建体并入表达载体，实现本发明多核苷酸序列的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。

本发明的多核苷酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，可被克隆入质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。进一步地，载体是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。

通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO 01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估TCR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。

将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用病毒载体，特别是逆转录病毒载体，这已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。

因此，在某些实施方案中，本发明还提供用于活化T细胞的逆转录病毒，该病毒含有本文所述的逆转录病毒载体以及相应的包装基因，如gag、pol和vsvg。

适用于本发明的T细胞可以是各种来源的各种类型的T细胞。例如，T细胞可来源于恶性肿瘤患者的PBMC。

在某些实施方案中，获得T细胞后，可先用适量的(例如30～80ng/ml，如50ng/ml)的CD3抗体刺激活化，然后在含有适量的(例如30～80IU/ml，如50IU/ml)的IL2培养基进行培养备用。

因此，在某些实施方案中，本发明提供一种基因修饰的T细胞，该基因修饰的T细胞含有本文所述的多核苷酸序列，或含有本文所述的逆转录病毒载体，或感染了本文所述的逆转录病毒。

本发明的TCR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量，并形成特异性记忆T细胞。不希望被任何具体的理论所束缚，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，本发明的TCR-T细胞可体内分化成中心记忆样状态。

由TCR-T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，TCR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中TCR-T细胞诱导对CAR中的抗原结合部分特异性的免疫应答。

因此，可采用本发明的TCR、其编码序列、核酸构建物、表达载体、病毒以及TCR-T细胞治疗的疾病优选为NY-ESO-1介导的疾病。

本发明的TCR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的TCR-T细胞，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。

在本发明的一些实施方案中，本发明的TCR-T细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合本领域周知的治疗NY-ESO-1介导的疾病的放疗或化疗制剂进行治疗。

本文中，“抗肿瘤效应”指一种生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌相关的各种生理症状的改善表示。

“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，指可引起免疫应答的活有机体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。

本发明从NCBI GenBank数据库中搜索序列信息，全基因合成T细胞受体NY-ESO-1TCR-aPD1的基因片段，插入到逆转录病毒载体RV。重组质粒在293T细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达该T细胞受体。在本发明的一个实施方案中，实现T细胞受体基因修饰的T淋巴细胞的转化方法是基于逆转录病毒转化方法。该方法具有转化效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因T淋巴细胞表面，转化的核酸通过转录、翻译表达在其上。本发明所获得的表达NY-ESO-1TCR的逆转录病毒通过Retronectin法制备TCR-T细胞，制备3天后的TCR-T细胞用流式检测感染效率，制备5天后TCR-T细胞在体外与NY-ESO-1阳性的肿瘤细胞共培养5小时检测CD107a表达和IFNγ的分泌，制备5天后TCR-T细胞在体外与肿瘤细胞共培养16小时法检测TCR-T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤作用(细胞毒性)。因此本发明所述NY-ESO-1-aPD1TCR-T可在HLA-A2+NY-ESO-1阳性肿瘤治疗中得到应用。

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

实施例1：NY-ESO-1TCR-aPD1基因序列的确定

从NCBI网站数据库搜索到NY-ESO-1TCRα、NY-ESO-1TCRβ、抗PD1抗体重链和轻链可变区基因序列信息，这些序列在网站http://sg.idtdna.com/CodonOpt上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。

各氨基酸和基因序列信息见SEQENCE LISTING(SEQUNCE ID NO.1-2)。

将上述序列全基因合成，在首尾引入不同酶切位点，形成完整的NY-ESO-1TCR-aPD1基因序列信息。

实施例2：包含NY-ESO-1TCR-aPD1核酸序列的病毒载体的构建

将实施例1中制备的CAR分子的核苷酸序列经NotI(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切、经T4连接酶(NEB)连接插入逆转录病毒RV载体的NotI-EcoRI位点，转化到感受态E.coli(DH5α)，将重组质粒送上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的NY-ESO-1TCR-aPD1序列比对来验证序列是否正确。测序引物为：

正义序列:AGCATCGTTCTGTGTTGTCTC(SEQUNCE ID NO.3)

反义序列:TGTTTGTCTTGTGGCAATACAC(SEQUNCE ID NO.4)

经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，纯化质粒的质粒磷酸钙法转染293T细胞进行逆转录病毒包装实验。

本实施例所构建得到的质粒图谱如图1所示。图2显示该逆转录病毒表达质粒的部分测序结果峰值图。

实施例3：逆转录病毒包装

1.第1天293T细胞应是小于20代，不过分长满的。以0.6×10⁶cells/ml铺板，10cm皿添加10ml的DMEM培养基，充分混匀细胞，37度培养过夜；

2.第2天293T细胞融合度达到90％左右进行转染(通常是铺板14-18h左右)；准备质粒复合物，各种质粒的量为RV-NY-ESO-1TCR-aPD1(MSCV)为12.5ug，Gag-pol为10ug，VSVg为6.25ug，CaCl₂ 250ul，H₂O为1ml总体积为1.25ml；在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的HBS，边加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到293T皿中，37度培养4h，去除培养基，PBS洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基；

3.第4天：转染48h后收集上清并用0.45um滤器过滤后分装保存于-80度，继续添加预热的新鲜DMEM培养基。

实施例4：逆转录病毒感染人的T细胞

1.用Ficcol分离液(天津灏洋)分离获得较纯的CD3+T细胞，用含5％AB血清X-VIVO(LONZA)培养基调整细胞密度为1×10⁶/mL。将细胞以1ml/孔接种到预先用抗人50ng/mlCD3抗体(北京同立海元)和50ng/ml CD28抗体(北京同立海元)，再加入100IU/ml的白细胞介素2(北京双鹭)，刺激培养48小时后病毒感染。

2.T细胞活化培养后隔天，PBS稀释至终浓度为15μg/ml的Retronectin(Takara)包被non-tissue treated培养板，24孔板每孔250μl。避光，4℃过夜备用。

3.T细胞活化培养两天后，取出2块包被好的24孔板，吸弃包被液，加入含2％BSA的HBSS室温封闭30min。封闭液体积为每孔500μl，吸弃封闭液，用含2.5％HEPES的HBSS洗板两次。

4.病毒液加入孔内，每孔加2ml病毒液，32℃，2000g，离心2h。

5.弃去上清液，24孔板每孔加入活化后的T细胞1×10⁶个，体积1ml，培养基为T细胞培养基中添加IL-2 200IU/ml。30℃，1000g，离心10min。

6.离心完毕后，将培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养。

7.感染后24h，将细胞悬液吸出，1200rpm，4℃，离心7min。

8.细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含IL-2 100IU/ml的T细胞培养液，使T细胞的密度维持在5×10⁵/ml左右，使细胞扩增。

实施例5：流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞表面TCR的表达

分别离心收集感染后72小时的TCR-T细胞和NT细胞(对照组)，PBS洗涤1次后弃上清，加入相应的抗体避光30min后PBS洗涤，重悬，最后流式细胞仪检测TCR表达，抗体为anti-human TCR V13.1antibody(Biolegend)。

本实施例结果在图3显示，使用实施例3制备得到的逆转录病毒感染T细胞72小时后，NY-ESO-1-TCR-T和NY-ESO-1-aPD1–TCR-T表达效率。TCR阳性率分别为74.3％和81.2％。

实施例6：流式检测病毒中分泌型anti-PD1表达

NY-ESO-1TCR和NY-ESO-1TCR-aPD1病毒分别与293T-PD1(本公司制备的过表达PD1的细胞)孵育30min，再用anti-human Fab染色30min后上机检测。那么可分泌的anti-PD1抗体是人源化的就可以被anti-human Fab抗体检测到。

本实施例结果如图4显示，流式结果检测到可分泌的anti-PD1表达率为97.3％。

实施例7：TCR-T细胞与靶细胞共培养后CD107a表达检测

1.取一块V底96孔板，每孔加TCR-T/NT细胞2×10⁵个和靶细胞(U266、T2-NY-ESO-1)/对照细胞(T2)2×10⁵个，重悬为100ul不含IL-2的X-VIVO完全培养基，加入BDGolgiStop(含monesin，每1ml培养基中加入1μl BD GolgiStop)，每孔加入2ul CD107a抗体(1:50)，37℃孵育4小时，收集细胞。

2.将样品离心去除培养基，PBS洗细胞一次，400g，4℃离心5分钟。弃上清，每管加入适量特异性表面抗体CD3、CD4、CD8，重悬体积100ul，冰上避光孵育30分钟。

3.每管用3mL的PBS清洗细胞1次，400g离心5分钟。仔细吸去上清。

4.适量PBS重悬，流式细胞仪检测CD107a表达(Biolegend)。

本实施例结果显示在图5中。NY-ESO-1-PD1-TCR-T细胞与两个靶细胞(U266、T2-NY-ESO-1)共培养后CD8阳性细胞中CD107a表达的百分率分别为70.3％和70.4％。

实施例8：TCR-T细胞与靶细胞共培养后IFNγ分泌检测

1.取制备好的TCR-T细胞，重悬与Lonza培养基中，调整细胞浓度为1×10⁶/mL。

2.实验组每孔含靶细胞(U266、T2-NY-ESO-1)或阴性对照细胞(T2)2×10⁵个，TCR-T/NT细胞2×10⁵个，100μl不含IL-2的Lonza培养基。充分混匀后加入96孔板中。加入BDGolgiStop(含monesin，每1ml培养基中加入1μl BD GolgiStop)，充分混匀后，37℃孵育4小时。收集细胞，作为实验组。

3.每管用1mL的PBS清洗细胞1次，300g离心5分钟。仔细吸去或倒掉上清。

4.PBS洗细胞后，加入250μl/EP管Fixation/Permeabilization solution，4℃孵育20分钟以固定细胞及破膜。用1×BD Perm/Wash^TMbuffer清洗细胞2次，1mL/次。

5.进行胞内因子染色，取适量IFN-γ细胞因子荧光抗体或阴性对照，用BD Perm/Wash^TMbuffer稀释至50μl。用此抗体稀释液充分重悬已固定破膜的细胞，4℃避光孵育30min，1×BD Perm/WashTMbuffer 1mL/次清洗细胞2次，然后用PBS重悬。

6.流式细胞仪检测。

本实施例结果显示在图6中。NY-ESO-1-PD1-TCR-T细胞与两个靶细胞(U266、T2-NY-ESO-1)共培养后CD8阳性细胞中IFN-γ表达的百分率分别为56.8％和54.8％。

实施例9：TCR-T细胞与靶细胞共培养后检测肿瘤特异性细胞杀伤作用

1.K562细胞(阴性对照细胞)重悬在无血清培养基RPMI 1640中，调整细胞浓度为1×10⁶/ml，加入荧光染料BMQC(2,3,6,7-tetrahydro-9-bromomethyl-1H,5Hquinolizino(9,1-gh)coumarin)至终浓度为5μM。

2.混匀，37℃孵育30min。

3.室温，1500rpm离心5min，弃上清，并重悬细胞于细胞毒性培养基(无酚红1640+5％AB血清)中，37℃孵育60min。

4.新鲜培养基清洗细胞两遍，并重悬在新鲜细胞毒性培养基中，密度1×10⁶/ml。

5.U266细胞(靶细胞)悬浮在含有0.1％BSA的PBS中，调整浓度为1×10⁶/ml。

6.加入荧光染料CFSE(carboxyfluoresceindiacetatesuccinimidyl ester)至终浓度为1μM。

7.混匀，37℃孵育10min。

8.孵育结束后，加入与细胞悬液等体积的FBS，室温孵育2min以终止标记反应。

9.清洗细胞并重悬在新鲜细胞毒性培养基中，密度1×10⁶/ml。

10.清洗效应TCR-T细胞并悬浮在细胞毒性培养基中，调整浓度为5×10⁶/ml。

11.在所有的实验中，感染了NY-ESO-1-aPD1的效应T细胞(TCR-T cell)的细胞毒性和未感染的阴性对照效应T细胞(NT cell)的细胞毒性做比较，并且这些效应T细胞来自同一个病人。

12.NY-ESO-1-aPD1TCR-T和阴性对照效应T细胞，按照T细胞：靶细胞＝5:1，1:1，的比例，于5ml无菌试验管(BD Biosciences)进行培养。每一个共培养组中，靶细胞为Raji细胞100,000个(50μl)，阴性对照细胞为100,000个K562细胞(50μl)。同时设置一组只包含U266靶细胞和K562阴性对照细胞。

13.将共培养细胞置于37℃孵育16h。

14.孵育完成后，PBS清洗细胞，然后立即按照说明书推荐的浓度快速加入7-AAD(7-aminoactinomycin D)，冰上孵育30min。

15.不需清洗，直接进行流式上机检测，数据用Flow Jo进行分析。

16.分析使用7AAD阴性的活细胞设门，测定T细胞和靶细胞共培养后活的U266靶细胞和活的K562阴性对照细胞的比例。

a)对于每一组共培养的T细胞和靶细胞，

靶细胞存活％＝U266活细胞数/K562活细胞数。

b)细胞毒性杀伤细胞％＝100-校准的靶细胞存活％，即(无效应细胞时U266活细胞数-含效应细胞时U266活细胞数)/K562活细胞数的比例。

本实施例结果显示在图7中。图7显示，在效靶比为5:1情况下，NY-ESO-1-PD1TCR-T细胞对靶细胞HLA-A2-T2-NY-ESO-1的杀伤效率分别为85％。

实施例10：TCR-T细胞与靶细胞共培养后表面PD1表达检测

1.取一块V底96孔板，每孔加TCR-T/NT细胞2×10⁵个和靶细胞(U266)，设置加K562细胞组为阴性对照，重悬为100ul含IL-2的X-VIVO完全培养基，37℃孵育24小时和48小时，收集细胞。

2.将样品离心去除培养基，PBS洗细胞一次，400g，4℃离心5分钟。弃上清，每管加入适量特异性表面抗体CD3、PD1，重悬体积100ul，冰上避光孵育30分钟。

3.每管用3mL的PBS清洗细胞1次，400g离心5分钟。仔细吸去上清。

4.适量PBS重悬，流式细胞仪检测CD3、PD1，分析CD3+细胞群中PD1表达情况。

本实施例结果显示在图8中。图8显示，NY-ESO-1TCR-T和NY-ESO-1-PD1TCR-T细胞与靶细胞(U266)共培养24小时后TCR-T表面PD1表达。在U266细胞中，NY-ESO-1TCR-T表面PD1表达率为28.4％，NY-ESO-1-PD1TCR-T表面PD1表达率为17.2％。48H结果趋势一致。说明本专利构建的NY-ESO-1-PD1TCR-T可分泌PD1与PDL1相结合，可对免疫抑制微环境进行调节。

序列表

<110> 上海恒润达生生物科技有限公司

<120> 靶向NY-ESO-1的T细胞受体联合表达PD1抗体可变区及其用途

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 890

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp

1 5 10 15

Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val

20 25 30

Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala

35 40 45

Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr

50 55 60

Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg

65 70 75 80

Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile

85 90 95

Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg

100 105 110

Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser

115 120 125

Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln

130 135 140

Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp

145 150 155 160

Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr

165 170 175

Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser

180 185 190

Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn

195 200 205

Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro

210 215 220

Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp

225 230 235 240

Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu

245 250 255

Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp

260 265 270

Ser Ser Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu

275 280 285

Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ser Ile

290 295 300

Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala Gly Pro Val

305 310 315 320

Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr Gly

325 330 335

Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr Met

340 345 350

Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

355 360 365

Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly Tyr

370 375 380

Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu Ser

385 390 395 400

Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr Val

405 410 415

Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val

420 425 430

Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu

435 440 445

Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys

450 455 460

Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val

465 470 475 480

Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu

485 490 495

Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg

500 505 510

Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg

515 520 525

Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln

530 535 540

Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly

545 550 555 560

Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu

565 570 575

Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr

580 585 590

Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys

595 600 605

Asp Phe Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu

610 615 620

Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Tyr Arg Met Gln

625 630 635 640

Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu Val Thr Asn Ser Gln

645 650 655

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser

660 665 670

Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly

675 680 685

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

690 695 700

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

705 710 715 720

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu

725 730 735

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

740 745 750

Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

755 760 765

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

770 775 780

Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu

785 790 795 800

Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu

805 810 815

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

820 825 830

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

835 840 845

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

850 855 860

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr

865 870 875 880

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

885 890

<210> 2

<211> 2670

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggaaacac tgctgggcct gctgatcctg tggctgcagc tgcagtgggt gtccagcaag 60

caggaagtga cccagatccc tgccgccctg tctgtgcctg agggcgagaa cctggtgctg 120

aactgcagct tcaccgacag cgccatctac aacctgcagt ggttcagaca ggaccccggc 180

aagggcctga caagcctgct gctgattcag agcagccaga gagagcagac cagcggcaga 240

ctgaacgcca gcctggataa gagcagcggc cggtccaccc tgtatatcgc cgcttctcag 300

cctggcgact ccgccacata tctgtgtgct gtgcggcctc tgtacggcgg cagctacatc 360

cctaccttcg gcagaggcac cagcctgatc gtgcacccct acatccagaa ccccgacccc 420

gccgtgtacc agctgagaga cagcaagtcc agcgacaaga gcgtgtgcct gttcaccgac 480

ttcgacagcc agaccaacgt gtcccagagc aaggacagcg acgtgtacat caccgacaag 540

accgtgctgg acatgcggag catggacttc aagagcaaca gcgccgtggc ctggtccaac 600

aagagcgatt tcgcctgcgc caacgccttc aacaacagca ttatccccga ggacacattc 660

ttcccaagcc ccgagagcag ctgcgacgtg aagctggtgg aaaagagctt cgagacagac 720

accaacctga acttccagaa cctgagcgtg atcggcttcc ggattctgct gctgaaggtg 780

gccggcttca acctgctgat gaccctgaga ctgtggtcca gccgggccaa gagatctggc 840

agcggcgcca ccaatttcag cctgctgaaa caggccggcg acgtggaaga gaaccctggc 900

cctatgagca tcggcctgct gtgttgtgcc gctctgtccc tgctgtgggc cggacctgtg 960

aatgctggcg tgacacagac ccccaagttc caggtgctga aaaccggcca gagcatgacc 1020

ctgcagtgcg cccaggacat gaaccacgag tacatgagct ggtatcggca ggaccctggc 1080

atgggactgc ggctgatcca ctactctgtg ggcgccggca tcaccgatca gggcgaggtg 1140

cccaacggct acaatgtgtc cagatccacc accgaggact tcccactgag actgctgtct 1200

gccgccccta gccagacctc cgtgtacttc tgtgccagca gctacgtggg caacaccggc 1260

gagctgttct ttggcgaggg cagcagactg acagtgctgg aagatctgaa gaacgtgttc 1320

cccccagagg tggccgtgtt cgagccttct gaggccgaga tcagccacac ccagaaagcc 1380

accctcgtgt gtctggccac cggcttctac cccgaccacg tggaactgtc ttggtgggtc 1440

aacggcaaag aggtgcacag cggcgtgtcc accgatcccc agcctctgaa agagcagccc 1500

gccctgaacg acagccggta ctgtctgtcc tcccggctga gagtgtccgc caccttctgg 1560

cagaaccccc ggaaccactt cagatgccag gtgcagttct acggcctgag cgagaacgac 1620

gagtggaccc aggacagagc caagcccgtg actcagatcg tgtctgccga ggcctggggc 1680

agagccgatt gtggctttac cagcgagagc taccagcagg gcgtgctgag cgccaccatc 1740

ctgtacgaga tcctgctggg caaggccacc ctgtacgccg tgctggtgtc cgccctggtg 1800

ctgatggcca tggtcaaacg gaaggacttc agagccaagc ggggctctgg cgagggcaga 1860

ggctctctgc tgacctgcgg agatgtggaa gaaaatcccg gccctatgta cagaatgcag 1920

ctgttgtctt gtattgccct ttctctcgcc ctcgtaacaa attcacaagt ccaattggtg 1980

gagtctggcg gtggggtagt tcagcccggc cgatccctgc gcctggactg caaagcttct 2040

ggaattacgt tctcaaactc cggaatgcac tgggtgcggc aagcacctgg gaaagggctg 2100

gagtgggttg cggtgatttg gtacgatggc tctaagaggt actacgcaga cagcgttaaa 2160

ggcagattta ctatatcccg agataactct aaaaatacgc tcttcctcca aatgaatagc 2220

ctgagggcag aagacacagc cgtttactat tgtgctacca atgatgatta ctggggacag 2280

ggcaccctgg ttaccgtaag ttccggcggt ggtggaagtg gaggaggggg atccggaggc 2340

gggggttctg agatcgtcct gacccagtct ccagccactc tctccctgtc tccaggcgag 2400

cgcgctacac tgagttgtag agcttcccag tccgtgagca gctatctggc ctggtatcag 2460

cagaagcctg ggcaggctcc acggttgctg atttatgacg cctccaaccg cgcgactggg 2520

ataccagcta ggttttccgg atcaggcagc ggcactgatt ttacactgac catctcatct 2580

ctcgagccgg aagatttcgc cgtttactat tgtcaacaga gttcaaactg gccacggaca 2640

ttcggtcagg ggaccaaggt tgaaattaag 2670

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物

<400> 3

agcatcgttc tgtgttgtct c 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 引物

<400> 4

tgtttgtctt gtggcaatac ac 22

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Asp Ser Ala Ile Tyr Asn

1 5

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu

1 5

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ala Val Arg Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr

1 5 10

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Asn His Glu Tyr

1 5

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Ser Val Gly Ala Gly Ile

1 5

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Ala Ser Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe

1 5 10

Claims (13)

1.一种T细胞受体(TCR)，其特征在于，其包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域，并且所述TCRα链可变域为与SEQ ID NO:1 1-274位氨基酸序列有至少90％序列相同性的氨基酸序列；和/或

所述TCRβ链可变域为与SEQ ID NO:1 302-610具有至少90％序列相同性的氨基酸序列；

优选地，所述TCRα链可变域的CDR3的氨基酸序列为AVRPLYGGSYIPT(SEQ ID NO:7)；

和/或所述TCRβ链可变域的CDR3的氨基酸序列为ASSYVGNTGELF(SEQ ID NO:10)。

2.如权利要求1所的TCR，其特征在于，所述TCRα链可变域的3个互补决定区(CDR)

为：

αCDR1-DSAIYN(SEQ ID NO:5)

αCDR2-IQSSQRE(SEQ ID NO:6)

αCDR3-AVRPLYGGSYIPT(SEQ ID NO:7)；和/或

所述TCRβ链可变域的3个互补决定区为：

βCDR1-MNHEY(SEQ ID NO:8)

βCDR2-SVGAGI(SEQ ID NO:9)

βCDR3-ASSYVGNTGELF(SEQ ID NO:10)。

3.一种多价TCR复合物，其特征在于，包含至少两个TCR分子，并且其中的至少一个TCR分子为上述任一项权利要求所述的TCR。

4.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：

(1)含有依次连接的NY-ESO-1TCRα链的编码序列、P2A的编码序列、NY-ESO-1TCRβ链的编码序列、T2A的编码序列、人IL2信号肽的编码序列、抗人PD1单克隆抗体的重链和轻链可变区(aPD1scFv)的编码序列串联构成

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。

5.一种人工合成多核苷酸序列，其特征在于，

所述NY-ESO-1TCRα链编码序列如SEQ ID NO:2第1-822位核苷酸序列所示；和/或

所述P2A的编码序列如SEQ ID NO:2第823-903位核苷酸序列所示；和/或

所述NY-ESO-1TCRβ链编码序列如SEQ ID NO:2第904-1830位核苷酸序列所示；和/或

所述T2A编码序列如SEQ ID NO:2第1831-1905位核苷酸序列所示；和/或

所述人IL2信号肽的编码序列如SEQ ID NO:2第1906-1965位核苷酸序列所示；和/或

所述抗人PD1单克隆抗体的重链可变区编码序列如SEQ ID NO:2第1966-2304位核苷酸序列所示；和/或

所述抗人PD1单克隆抗体的轻链可变区编码序列如SEQ ID NO:2第2350-2670位核苷酸序列所示。

6.一种人工合成的氨基酸序列，其特征在于，

所述NY-ESO-1TCRα链编码序列如SEQ ID NO:1第1-274位氨基酸序列所示；和/或

所述P2A的编码序列如SEQ ID NO:1第275-301位氨基酸序列所示；和/或

所述NY-ESO-1TCRβ链编码序列如SEQ ID NO:1第302-610位氨基酸序列所示；和/或

所述T2A编码序列如SEQ ID NO:1第611-635位氨基酸序列所示；和/或

所述人IL2信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1第636-655位氨基酸序列所示；和/或

所述抗人PD1单克隆抗体的重链可变区编码序列如SEQ ID NO:1第656-768位氨基酸序列所示；和/或

所述抗人PD1单克隆抗体的轻链可变区编码序列如SEQ ID NO:1第784-890位氨基酸序列所示。

7.一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：

(1)含有依次连接的NY-ESO-1TCRα链的编码序列、P2A的编码序列、NY-ESO-1TCRβ链的编码序列、T2A的编码序列、人IL2信号肽的编码序列、抗人PD1单克隆抗体的重链和轻链可变区(aPD1scFv)的编码序列串联而成；和

(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白。

8.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一个或多个特征：

所述NY-ESO-1TCRα链编码序列如SEQ ID NO:1第1-274位氨基酸序列所示；和/或

所述P2A的编码序列如SEQ ID NO:1第275-301位氨基酸序列所示；和/或

所述NY-ESO-1TCRβ链编码序列如SEQ ID NO:1第302-610位氨基酸序列所示；和/或

所述T2A编码序列如SEQ ID NO:1第611-635位氨基酸序列所示；和/或

所述人IL2信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1第636-655位氨基酸序列所示；和/或

所述抗人PD1单克隆抗体的重链可变区编码序列如SEQ ID NO:1第656-768位氨基酸序列所示；和/或

所述抗人PD1单克隆抗体的轻链可变区编码序列如SEQ ID NO:1第784-890位氨基酸序列所示。

9.一种核酸构建物，所述核酸构建物含有权利要求4中所述的多核苷酸序列；

优选地，所述核酸构建物为载体；

更优选地，所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，以及权利要求4中所述的多核苷酸序列。

10.一种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有权利要求6所述的核酸构建物，优选含有所述载体，更优选含有所述逆转录病毒载体。

11.一种基因修饰的T细胞或含该基因修饰的T细胞的药物组合物，其特征在于，所述细胞含有权利要求2中所述的多核苷酸序列，或含有权利要求6所述的核酸构建物，或感染了权利要求7所述的逆转录病毒。

12.权利要求4中所述的多核苷酸序列、权利要求7-8中任一项所述的融合蛋白、权利要求9所述的核酸构建物或权利要求10所述的逆转录病毒在制备活化的T细胞中的应用。

13.权利要求4中任一项所述的多核苷酸序列、权利要求7-8中任一项所述的融合蛋白、权利要求9所述的核酸构建物、权利要求10所述的逆转录病毒、或权利要求12所述的基因修饰的T细胞或其药物组合物在制备治疗NY-ESO-1介导的疾病的药物中的用途；

优选地，所述NY-ESO-1介导的疾病包括神经母细胞瘤、滑膜肉瘤、恶性黑素瘤、卵巢癌；

更优选地，所述NY-ESO-1介导的疾病包括神经母细胞瘤、滑膜肉瘤、恶性黑素瘤、卵巢癌、结直肠癌、肝癌、尿路上皮癌、多发性骨髓瘤、肺癌。