CN102526146B - 含有人参皂苷和斑蝥素的药物组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中医药领域，公开了含有人参皂苷和斑蝥素的药物组合物及其用途。本发明所述含有人参皂苷和斑蟊素的药物组合物包含斑蟊素或含有斑蟊素的中药材提取物和人参皂苷或含有人参皂苷的中药材提取物，其中所述人参皂苷或含有人参皂苷的中药材提取物的含量足以降低斑蟊素产生的毒副作用。本发明所述含有人参皂苷和斑蟊素的药物组合物明显减弱了斑蟊素的对肾脏的毒性，不良反应发生率明显降低，从而大大提高了斑蟊素使用的安全性，同时具有提高抗肿瘤作用的功效，临床使用安全，毒副作用小，可广泛用于制备治疗各种癌症的药物。
Description
技术领域
本发明涉及中医药领域，具体的说是涉及含有人参皂苷和斑蝥素的药物组合物及其用途。
背景技术
斑蝥，别名花斑蝥、花壳虫，为芫菁科昆虫南方大斑蝥(Mylabris phalerataPallas)或黄黑小斑蝥(Mylabris cichorii Linnaeus)的干燥体。夏、秋二季捕捉，闷死或烫死，晒干。斑蝥是一种贵重的中药材，明代大医学家李时珍在《本草纲目》巨著中称斑蝥性味辛、寒有大毒，有主治寒热、鬼疰盅毒、鼠瘘、疮疽、蚀死肌、破石癃、血积、伤人肌、治疥癣、堕胎、治瘰疬、通利水道、疗淋疾、傅恶疮瘘烂、治疝、解疖毒，治狂犬病等功效。
斑蝥主要含有斑蝥素、单萜烯类脂肪、树脂、蚁酸及色素等成份，其中，斑蝥素是其主要的活性成分。现代药理研究表明具有抗肿瘤作用，斑蝥素给药3-4次能使焦油诱发的家兔癌瘤消失。近年发现斑蝥素对小鼠腹水型肝癌和网织细胞肉瘤ARS均有一定抑制作用。尤其当腹水型肿瘤接种的瘤细胞数较少时，可见小鼠生存期延长。斑蝥素还抗病毒的作用，填喂斑蝥素0.6-1.0mg可以治疗急性型新城疫鸡瘟病，治愈率达90％以上。此外，斑蝥素对治疗皮肤病、白癜风及顽癣有特效，同时对斑秃还有毛发再生的功效，对病毒性肝炎亦有较好抑制作用。
然而，斑蟊素毒性较大，小鼠急性实验显示腹腔注射的半数致死量为1.25毫克/公斤；其内脏切片检查，无论急性或亚急性毒性试验，各脏器皆出现病变：心肌纤维浊肿明显(尤以亚急性试验为着)；肝细胞浊肿、脂变；肺、脾郁血，并有小灶性出血；肾小管上皮浊肿。很大。斑蝥素临床应用毒副作用在消化系主要有口、咽部烧灼感，恶心、呕吐或呕出血水样物、血丝、血块，腹部绞痛等剧烈反应，在泌尿系有不同程度的血尿和毒性肾炎症状。皮肤、粘膜吸收中毒者，局部常发生水泡或充血、灼痛等。大多数患者经及时而有效的救治，均可恢复，但亦有少数严重中毒患者因急性肾功能不全和全身循环衰竭，抢救无效而死亡。因此，斑蝥及其提取物和有效成分斑蟊素的临床应用受到很大限制。
发明内容
本发明提供了一种含有人参皂苷和斑蟊素的药物组合物，其包含斑蟊素或含有斑蟊素的中药材提取物和人参皂苷或含有人参皂苷的中药材提取物，其中所述人参皂苷或含有人参皂苷的中药材提取物的含量足以降低斑蟊素产生的毒副作用。
作为优选，所述药物组合物，其包含人参皂苷和斑蟊素，其中所述人参皂苷和斑蟊素的重量比为100∶1至500∶1，优选为200∶1至400∶1，更优选为300∶1。
优选的，所述人参皂苷为人参总皂苷或人参皂苷单体中的一种或几种，如人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2、Re、Rg1、Rg2、Rh1等达玛烷型四环三萜皂苷活性组分中的一种或几种。优选的，所述人参皂苷为人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rb3、Rf、Rd、Re或Rg1中的一种或几种。
作为优选，本发明所述药物组合物，其包含含有斑蟊素的中药材提取物和含有人参皂苷的中药材提取物，其中所述含有人参皂苷的中药材提取物的含量足以降低斑蟊素产生的毒副作用。
优选的，所述含有人参皂苷的中药材提取物为五加科人参属植物如人参、三七、红参、竹节参、西洋参等含有人参皂苷的中药材的提取物。更优选为，所述含有人参皂苷的中药材提取物为人参总皂苷。
作为优选，所述含有斑蟊素的中药材提取物为斑蝥提取物。
作为优选，所述含有人参皂苷的中药材提取物为人参总皂苷，并且所述含有斑蟊素的中药材提取物为斑蝥提取物，其中人参总皂苷与斑蝥提取物的重量比相当于20∶1～100∶1的生药人参∶斑蝥，即本发明所述药物组合物其包含人参总皂苷和斑蝥提取物，其中所述人参总皂苷与斑蝥提取物的重量比相当于20∶1至100∶1的生药人参∶斑蝥。
优选的，所述人参总皂苷与斑蝥提取物的重量比相当于20∶1至100∶1的生药人参∶斑蝥，更优选为50∶1。
本发明还提供了药物组合物在制备用于治疗各种癌症的药物中的用途。其中，所述癌症可以为肝癌、宫颈癌和胶质瘤。
本发明中所述斑蟊素和各人参皂苷单体的结构是本领域技术人员公知的，可以通过商业途径获得或通过现有技术中公开的方法制备得到和鉴定。其中所述人参皂苷单体的可以为任何来源的各种人参皂苷单体或其混合物。
本发明中所述斑蝥提取物是指从斑蝥中提取得到的含有斑蟊素的任何形式的提取物，包括但不限于本发明实施例中制备得到的斑蝥提取物。同样地，所述人参总皂苷是指本领域技术人员可获得的含有人参皂苷任何形式的人参总皂苷，包括但不限于本发明实施例中制备得到的人参总皂苷。
本发明还提供了一种治疗癌症的药物制剂，由有效量的上述药物组合物和药学上可接受的辅料组成。
本发明所述含有人参皂苷和斑蟊素的药物组合物包含斑蟊素或含有斑蟊素的中药材提取物和人参皂苷或含有人参皂苷的中药材提取物，其中所述人参皂苷或含有人参皂苷的中药材提取物的含量足以降低斑蟊素产生的毒副作用。本发明所述含有人参皂苷和斑蟊素的药物组合物明显减弱了斑蟊素对肾脏的毒性，不良反应发生率明显降低，从而大大提高了斑蟊素使用的安全性，同时具有提高抗肿瘤作用的功效，临床使用安全，毒副作用小，可广泛用于制备治疗各种癌症的药物。
附图说明
图1示实施例1制备的人参总皂苷HPLC-ELSD图谱；
图2示实施例4人参总皂苷对斑蝥提取物抑制SMMC-7721肝癌细胞增殖的影响的统计图，其中，
为斑蝥提取物组，
为人参总皂苷与斑蝥提取物组合物组，**P＜0.01，与斑蝥提取物组相比；
图3示实施例4人参总皂苷对斑蝥提取物抑制hela宫颈癌细胞增殖的影响的统计图，其中，
为斑蝥提取物组，
为人参总皂苷与斑蝥提取物组合物组，*P＜0.05，与斑蝥提取物组相比；
图4示实施例4人参总皂苷对斑蝥提取物抑制U251人胶质瘤细胞增殖的影响的统计图，其中，
为斑蝥提取物组，
为人参总皂苷与斑蝥提取物组合物组，*P＜0.05，**P＜0.01，与斑蝥提取物组相比；
图5示实施例6人参总皂苷与斑蝥提取物的组合物对大鼠肾细胞(NRK)的毒性的MTT实验结果图，其中，
为斑蝥提取物组，
为人参总皂苷与斑蝥提取物组合物组，*P＜0.05，*P＜0.01，与斑蝥提取物组相比；
图6示实施例7人参总皂苷对斑蝥提取物引起正常的大鼠肾细胞(NRK)的毒性的形态观察图，其中，A为人参总皂苷组；B为正常对照组；C为人参总皂苷与斑蝥提取物组合物组。
具体实施方式
本发明实施例公开了含有人参皂苷和斑蝥素的药物组合物及其用途。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
人参皂苷(Ginsenoside)是一种达玛烷型三萜皂苷类化合物，达玛烷型三萜皂苷，主要存在于人参属药材中，广泛地作用于人体的神经系统、免疫系统，在心血管疾病和肿瘤等疑难杂症的治疗上显示出与众不同的独特效果。现已明确的人参皂苷单体约有40余种，如Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2及Re等等。
人参皂苷都具有相似的基本结构，他们依糖苷基架构的不同而被分为两组：达玛烷型和齐墩果烷型。达玛烷类型又可分为两类：(1)人参二醇型-A型，苷原为20(S)-原人参二醇，包含了最多的人参皂苷，如人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2及糖苷基PD；(2)人参三醇型-B型，苷原为20(S)-原人参三醇，包含了人参皂苷Re、Rg1、Rg2、Rh1及糖苷基PT。近年大量研究发现，在体内人参皂苷类成分在生物酶的作用下代谢成为含糖更少、分子量更小、可以被人体直接吸收的Rg3、Rg5、Rh2、Rh3、C-K、Rg2、Rh1等稀有活性皂苷，吸收入血发挥治疗作用。因此，Rg3、Rg5、Rh2、Rh3、C-K、Rg2、Rh1等稀有活性皂苷，是人参皂苷发挥其医疗保健功能的主要活性成分。
本发明通过大量的配伍筛选研究发现人参皂苷可以明显降低斑蟊素对肾脏的毒性作用，同时还能增强斑蟊素的抗肿瘤效果，并且发现不同来源的人参皂苷均有类似作用，如含有人参皂苷的五加科植物人参、西洋参、三七等，均含有人参皂苷Rg2、Rh2、Rh3、Re等达玛烷型四环三萜皂苷等活性成分。
因此，本发明提供了一种药物组合物，其包含斑蟊素或含有斑蟊素的中药材提取物和人参皂苷或含有人参皂苷的中药材提取物，其中所述人参皂苷或含有人参皂苷的中药材提取物的含量足以降低斑蟊素产生的毒副作用。
在一个具体实施方案中，所述药物组合物，其包含人参皂苷和斑蟊素，其中所述人参皂苷和斑蟊素的重量比为100∶1至500∶1，优选为200∶1至400∶1，更优选为300∶1。
优选的，所述人参皂苷为人参总皂苷或单体人参皂苷中的一种或几种，如人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2、Re、Rg1、Rg2、Rh1等达玛烷型四环三萜皂苷活性组分中的一种或几种。在某一具体实施例中，所述人参皂苷为人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3和Rc的混合物。在某一具体实施例中，所述人参皂苷为人参皂苷Rc、Rb2、Re和三七皂苷NR4的混合物。在某一具体实施例中，所述人参皂苷为Rb1、Rb2、Rg1、3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖(2-1)-α-L-吡喃鼠李糖(3-1)-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷和3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖(2-1)-α-L-吡喃鼠李糖[-(4-1)-β-D-吡喃葡萄糖]-(3-1)-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷的混合物。在某一具体实施例中，所述人参皂苷为人参皂苷Rf、Rb1、Rb2、Rd、Rg1、三七皂苷NR4和3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖(2-1)-α-L-吡喃鼠李糖(3-1)-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷的混合物。在另一具体实施例中，所述人参皂苷为人参皂苷Rf、Rb1、Rb2、Rg1、Re和Rb3的混合物。
在另一个具体实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含含有斑蟊素的中药材提取物和含有人参皂苷的中药材提取物，其中所述含有人参皂苷的中药材提取物的含量足以降低斑蟊素产生的毒副作用。
优选的，所述含有人参皂苷的中药材提取物为五加科人参属植物如人参、三七、红参、竹节参、西洋参等含有人参皂苷的中药材的提取物。在某一具体实施例中，所述含有人参皂苷的中药材提取物为人参总皂苷。HPLC-ELSD图谱测定，所述人参总皂苷包括人参皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、Rg1、Re、3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、三七皂苷NR4、3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖(2-1)-α-L-吡喃鼠李糖(3-1)-β-D-吡喃葡萄糖-(4-1)-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖(2-1)-α-L-吡喃鼠李糖(3-1)-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、人参皂苷Rb312种成分，总皂苷含量大于80％。
作为优选，所述含有斑蟊素的中药材提取物为斑蝥提取物。
在一个具体实施方案中，所述含有人参皂苷的中药材提取物为人参总皂苷，并且所述含有斑蟊素的中药材提取物为斑蝥提取物，其中人参总皂苷与斑蝥提取物的重量比相当于20∶1～100∶1的生药人参∶斑蝥，即本发明所述药物组合物其包含人参总皂苷和斑蝥提取物，其中所述人参总皂苷与斑蝥提取物的重量比相当于20∶1至100∶1的生药人参∶斑蝥。
优选的，所述人参总皂苷与斑蝥提取物的重量比相当于20∶1至100∶1的生药人参∶斑蝥，更优选为50∶1。
本发明还提供了药物组合物在制备用于治疗各种癌症的药物中的用途。其中，所述癌症可以为肝癌、宫颈癌和胶质瘤。
在某一具体实施例中，所述人参皂苷为人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3和Rc的混合物，其与斑蟊素的组合物在SMMC-7721肝癌细胞上对斑蝥素有增效作用。在某一具体实施例中，所述人参皂苷为人参皂苷Rc、Rb2、Re和三七皂苷NR4的混合物，其与斑蟊素的组合物在Hela宫颈癌细胞上对斑蝥素有增效作。在某一具体实施例中，所述人参皂苷为Rb1、Rb2、Rg1、3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖(2-1)-α-L-吡喃鼠李糖(3-1)-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷的混合物，其与斑蟊素的组合物在U251胶质瘤细胞上对斑蝥素有增效作用。在某一具体实施例中，所述人参皂苷为人参皂苷Rf、Rb1、Rb2、Rd、Rg1、三七皂苷NR4和3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖(2-1)-α-L-吡喃鼠李糖(3-1)-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷的混合物，其与斑蟊素的组合物在NRK大鼠正常肾细胞对斑蝥素有减毒作用。在另一具体实施例中，所述人参皂苷为人参皂苷Rf、Rb1、Rb2、Rg1、Re和Rb3的混合物，其与斑蟊素的组合物在QSG-7701人正常肝细胞上对斑蝥素有减毒作用，在SMMC-7721肝癌细胞和H22肝癌小鼠上对斑蝥素有增效作用。
本发明中所述斑蟊素和各人参皂苷单体的结构是本领域技术人员公知的，可以通过商业途径获得或通过现有技术中公开的方法制备得到和鉴定。其中所述人参皂苷单体的可以为任何来源的各种人参皂苷单体或其混合物。
本发明中所述斑蝥提取物是指从斑蝥中提取得到的含有斑蟊素的任何形式的提取物，包括但不限于本发明实施例中制备得到的斑蝥提取物。同样地，所述人参总皂苷是指本领域技术人员可获得的含有人参皂苷任何形式的人参总皂苷，包括但不限于本发明实施例中制备得到的人参总皂苷。
本发明所述药物组合物可以通过本领域中的常规技术或本发明中公开的方法与药学上可接受的辅料制备成各种常规制剂。因此，本发明还提供了一种治疗癌症的药物制剂，由有效量的上述药物组合物和药学上可接受的辅料组成。所述制剂可以片剂、胶囊剂、滴丸剂、丸剂、粉剂、注射剂、混悬剂、颗粒剂或冻干粉针剂等制剂。含本发明所述组合物的制剂可以通过以下方式中的适合方式给药：口服、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药、阴道给药、局部给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌肉、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内或颅内注射或输入，或借助一种外植的储器用药，其中优选口服、肌注、腹膜内或静脉内用药方式。
本发明的药物组合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病程严重程度以及诊治医师的主观判断。本领域的技术人员根据上述因素可以容易地决定药物组合物的使用剂量和使用方法。
本发明所述含有人参皂苷和斑蟊素的药物组合物包含斑蟊素或含有斑蟊素的中药材提取物和人参皂苷或含有人参皂苷的中药材提取物，其中所述人参皂苷或含有人参皂苷的中药材提取物的含量足以降低斑蟊素产生的毒副作用。本发明所述含有人参皂苷和斑蟊素的药物组合物明显减弱了斑蟊素对肾脏的毒性，不良反应发生率明显降低，从而大大提高了斑蟊素使用的安全性，同时具有提高抗肿瘤作用的功效，临床使用安全，毒副作用小，可广泛用于制备治疗各种癌症的药物。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：人参总皂苷的制备
20kg人参，切成1～2cm的小段，加入160L50％乙醇回流提取两次，第一次3小时，第二次1.5小时，合并提取液，4500rpm离心20分钟，取上清液用滤纸过滤，收集滤液备用。
取处理好的AB-8树脂5kg，装入直径为30cm的不锈钢层析柱中，树脂床的径高比1∶10，水洗，过滤所得的人参提取液以1mL/min.cm2速度上样两次，静态吸附12h。先用水洗4BV，弃去；接着用30％乙醇洗3BV，弃去；最后用75％乙醇以2-3mL/min.cm2速度洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥即得人参总皂苷50g。
实施例2：人参总皂苷的HPLC-ELSD图谱测定
取实施例1制得的人参总皂苷，进行HPLC-ELSD图谱测定。色谱柱：Kromasil C18(250mm×4.6mm，5.0μm)。流动相：A为乙腈，B为水，梯度洗脱程序：0～10min，5％A～20％A；10～35min，20％A；10～35min，20％A～29％A；36～70min，29％A，；70～100min，47％A。流速：1mL·min-1；柱温：35℃。进样量：20μL。蒸发光散射检测器：T＝40℃，P＝0.35MPa，载气为高纯氮。检测结果如图1所示。
由图1可见，本发明实施例1制得的人参总皂苷包括人参皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd、Rg1、Re、3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、三七皂苷NR4、3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖(2-1)-α-L-吡喃鼠李糖(3-1)-β-D-吡喃葡萄糖-(4-1)-β-D-吡喃葡萄糖基--齐墩果酸-28-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖(2-1)-α-L-吡喃鼠李糖(3-1)-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷和人参皂苷Rb312种成分，总皂苷含量大于80％。其中，各指标性成分结构式如下：
实施例3：斑蝥提取物的制备
称取斑蝥粉末20g，倒入1000mL圆底烧瓶中，加入250mL丙酮，在30℃条件下间歇振摇2h，提取两次。提取液合并，减压浓缩，用95％乙醇∶石油醚(1∶1.5)洗涤至洗涤液无色，获得近白色粗品，再加入约5mL丙酮，加热溶解，趁热过滤，滤液在4℃放置自然析晶，得白色透明针状结晶50mg，得率0.25％。产物经液相色谱和气相色谱检测，均未见杂质峰，表明产品纯度大于99.5％。
实施例4：本发明所述人参皂苷组合物对肿瘤细胞的抑制作用
分别选择SMMC-7721肝癌细胞、Hela宫颈癌细胞、U251胶质瘤细胞，采用MTT法测定本发明所述人参皂苷组合物对肿瘤细胞的抑制作用。
1、人参总皂苷与斑蝥提取物的组合物对肿瘤细胞的抑制作用
将SMMC-7721肝癌细胞、Hela宫颈癌细胞、U251胶质瘤细胞细胞密度分别调整至1.0×105/mL，接种于96孔板，每孔100μL。肿瘤细胞给药处理方法：实施例3制备的斑蝥提取物与实施例1制备的人参总皂苷的浓度为5μg/mL+1540μg/mL、2.5μg/mL+770μg/mL、1.25μg/mL+385μg/mL、0.625μg/mL+192.5μg/mL、0.3125μg/mL+96.25μg/mL。不加药加等量PBS缓冲液作为阴性对照。每组设三个平行孔，继续培养。给药作用48h后每孔加入5mg/mLMTT10μL，轻振培养板，置培养箱中孵育4h，弃去上清液，加入二甲基亚砜100μL，室温振荡10min，使其彻底溶解，于酶标仪中测定OD492值。实验重复三次。结果如图2～4所示。
由图2～4可见，实施例3制备的斑蝥提取物与实施例1制备的人参总皂苷的浓度为5μg/mL+1540μg/mL和2.5μg/mL+770μg/mL时，人参总皂苷能明显提高斑蝥素抑制SMMC-7721肝癌细胞、hela宫颈癌细胞和U251人胶质瘤细胞增殖的作用。
2、人参皂苷单体与斑蝥素的组合物对肿瘤细胞的抑制作用
将SMMC-7721肝癌细胞、Hela宫颈癌细胞、U251胶质瘤细胞细胞密度分别调整至1.0×105/mL，接种于96孔板，每孔100μL。肿瘤细胞给药处理方法：单体三个浓度T1、T2、T3(250、125、62.5μg/mL)；斑蝥素两个浓度B1、B2(1.25、2.5μg/mL)；单体的三个浓度与斑蝥素两个浓度分别联合作用；不加药加等量PBS缓冲液作为阴性对照。每组设三个平行孔，继续培养。给药作用48h后每孔加入5mg/mLMTT 10μL，轻振培养板，置培养箱中孵育4h，弃去上清液，加入二甲基亚砜100μL，室温振荡10min，使其彻底溶解，于酶标仪中测定OD492值。实验重复三次。结果如表1～3所示。
表1人参皂苷组合物对SMMC-7721肝癌细胞增殖的影响
表2人参皂苷组合物对Hela宫颈癌细胞增殖的影响
表3人参皂苷组合物对U251胶质瘤细胞增殖的影响
由表1结果可见人参皂苷在62.5～250μg/ml范围内对SMMC-7721细胞的抑制率呈明显量效关系，其中人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rb3能明显增加斑蝥素在1.25μg/mL和2.5μg/mL的抑制作用(P＜0.01)，且q＞0.85；人参皂苷Rf、Rd、Rg1明显增加斑蝥素在2.5μg/mL的抑制作用，且q＞0.85。结果表明人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rb3、Rf、Rd和Rg1对斑蝥素抑制SMMC-7721肝癌细胞有增效作用。
由表2结果可见人参皂苷在62.5～250μg/mL范围内对Hela细胞的抑制率呈明显量效关系，其中人参皂苷Rb1明显增加斑蝥素在1.25μg/mL和2.5μg/mL抑制作用(P＜0.01)，且q＞0.85；人参皂苷Rc、Rb2、Re、三七皂苷NR4明显增加斑蝥素在2.5μg/mL的抑制作用，且q＞0.85，结果表明人参皂苷Rb1、Rc、Rb2、Re和三七皂苷NR4对斑蝥素抑制Hela宫颈癌细胞有增效作用。
由表3结果可见人参皂苷在62.5～250μg/mL范围内对U251细胞的抑制率呈明显量效关系，其中人参皂苷Rb1、Rb2、Rg1、3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖(2-1)-α-L-吡喃鼠李糖(3-1)-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷明显增加斑蝥素在1.25μg/mL和2.5μg/mL的抑制作用(P＜0.01)，且q＞0.85；3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、人参皂苷Rb3明显增加斑蝥素在1.25μg/mL的抑制作用，且q＞0.85；三七皂苷NR4能明显增加斑蝥素在2.5μg/mL的抑制作用。结果表明人参皂苷在62.5～250μg/mL范围内对U251细胞的抑制率呈明显量效关系，其中人参皂苷Rb1、Rb2、Rg1、3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖(2-1)-α-L-吡喃鼠李糖(3-1)-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、人参皂苷Rb3和三七皂苷NR4对斑蝥素抑制U251胶质瘤细胞有增效作用。
实施例5：本发明所述人参皂苷组合物体内抗肿瘤作用
取不同浓度的实施例1制备的人参总皂苷与实施例3制备的斑蝥提取物配伍，考察其对移植H22肿瘤的昆明小鼠的影响，评价人参总皂苷体内对斑蝥提取物的增效作用。具体操作为：复苏H22细胞，用生理盐水调配成细胞数为1×107，取KM小鼠腹腔传代3次，最后无菌条件下，用75％酒精擦拭小鼠腹部，取出腹水，调细胞数为1×107，每只右腋下接种0.2mL。接种后24h后随机分组，连续给药10天，末次给药后1h后，处死动物。不加药加等量PBS缓冲液作为空白对照。每组设三个平行。统计结果见表4
表4人参总皂苷对斑蝥提取物抑制H22小鼠瘤重的影响
注：*P＜0.05，*P＜0.01，与斑蝥素组相比。
由表4结果可见，与空白对照组相比，斑蝥提取物能明显降低小鼠瘤重，抑制率为53.48％，0.66mg/kg和1.33mg/kg人参总皂苷能明显增高斑蝥提取物的抑制率，抑制率分别为64.31％和74.31％。
实施例6：本发明所述人参皂苷组合物体外细胞毒性实验
1、人参总皂苷与斑蝥提取物的组合物体外对正常肾细胞毒性实验
选择NRK大鼠正常肾细胞，采用MTT法测定实施例1制备的人参总皂苷与实施例3制备大斑蝥提取物的组合物的体外细胞毒性作用。给药处理方法：实施例3制备的斑蝥提取物与实施例1制备的人参总皂苷的浓度为5μg/mL+1540μg/mL、2.5μg/mL+770μg/mL、1.25μg/mL+385μg/mL、0.625μg/mL+192.5μg/mL、0.3125μg/mL+96.25μg/mL。每组设三个平行孔，继续培养。给药作用48h后每孔加入5mg/mL MTT 10μL，轻振培养板，置培养箱种孵育4h，弃去上清液，加入二甲基亚砜100μL，室温振荡10min，使其彻底溶解，于酶标仪种测定OD492值。实验重复三次。统计结果见图5。
图5结果显示人参总皂苷在31.25～250μg/mL浓度范围内对NRK大鼠正常肾细胞的抑制率呈明显量效关系，表明人参总皂苷对斑蝥提取物大鼠正常肾细胞NRK有减毒作用。
2、人参皂苷单体与斑蝥素组合物体外正常肾和肝细胞毒性实验
选择NRK大鼠正常肾细胞和QSG-7701人正常肝细胞，采用MTT法测定人参皂苷组合物的体外细胞毒性作用。具体操作为：将NRK大鼠正常肾细胞和QSG-7701人正常肝细胞细胞密度分别选择NRK大鼠正常肾细胞和QSG-7701人正常肝细胞，采用MTT法测定人参皂苷组合物的体外细胞毒性作用。具体操作为：将NRK大鼠正常肾细胞和QSG-7701人正常肝细胞细胞密度分别调整至1.0×105/mL，接种于96孔板，每孔100μL。细胞给药处理方法：单体三个浓度T1、T2、T3(250、125、62.5μg/mL)；斑蝥素两个浓度B1、B2(1.25、2.5μg/mL)；单体的三个浓度与斑蝥素两个浓度分别联合作用；不加药加等量PBS缓冲液作为阴性对照。每组设三个平行孔，继续培养。给药作用48h后每孔加入5mg/mL MTT 10μL，轻振培养板，置培养箱种孵育4h，弃去上清液，加入二甲基亚砜100μL，室温振荡10min，使其彻底溶解，于酶标仪种测定OD492值。实验重复三次。统计结果见表5和6。
表5人参单体化合物对NRK大鼠正常肾细胞增殖的影响
表6人参单体化合物对QSG-7701人正常肝细胞增殖的影响
由表5结果可见，人参皂苷在62.5～250μg/mL浓度范围内对NRK大鼠正常肾细胞的抑制率呈明显量效关系，其中人参皂苷Rf、Rb1、Rb2、Rd、Rg1、三七皂苷NR4和3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖(2-1)-α-L-吡喃鼠李糖(3-1)-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷明显减少斑蝥素在1.25μg/mL和2.5μg/mL的抑制作用；3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖(2-1)-α-L-吡喃鼠李糖(3-1)-β-D-吡喃葡萄糖-(4-1)-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷明显减少斑蝥素在1.25μg/mL的抑制作用，且均P＜0.05，q＜0.85；人参皂苷Rb3明显减少斑蝥素在2.5μg/mL的抑制作用，q＜0.85，结果表明，人参皂苷Rf、Rb1、Rb2、Rd、Rg1、三七皂苷NR4、3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖(2-1)-α-L-吡喃鼠李糖(3-1)-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷、3-O-α-L-呋喃阿拉伯糖(2-1)-α-L-吡喃鼠李糖(3-1)-β-D-吡喃葡萄糖-(4-1)-β-D-吡喃葡萄糖基-齐墩果酸-28-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷和人参皂苷Rb3对斑蝥素抑制肾细胞NRK有减毒作用。
由表6结果可见，人参皂苷在62.5～250μg/mL浓度范围内对QSG-7701人正常肝细胞的抑制率呈明显量效关系，其中人参皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rg1、Re、Rb3明显减少斑蝥素在1.25μg/mL和2.5μg/mL的抑制作用，结果表明人参皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rg1、Re和Rb3对斑蝥素抑制QSG-7701有减毒作用。
实施例7：本发明所述人参皂苷组合物对斑蝥素引起正常的大鼠肾细胞(NRK)的毒性形态观察
在显微镜下，正常肾细胞贴壁，呈不规则状，细胞形态正常，实施例3制备的斑蝥素提取物组(1.25μg/mL)肾细胞变圆，贴壁细胞减少，细胞形态明显改变。本发明实施例1制备人参总皂苷和实施例3制备的斑蝥素提取物(385μg/mL+1.25μg/mL)合用后，细胞形态明显好转，结果见图6。
实施例8：本发明所述人参皂苷组合物对斑蝥素引起正常的大鼠肾细胞(NRK)的毒性细胞凋亡实验
采用24孔板，调整NRK大鼠正常肾细胞细胞浓度为4×105，分别按照表7接种实施例1制备的人参总皂苷和实施例2制备的斑蝥提取物，每孔接500μL，每组设三个平行孔。给药48h后收集各组细胞，PBS吹洗两遍，弃上清液，按照V-FITV/PI双染凋亡试剂盒(购自南京建成生物有限公司)说明书进行染色，并进行流式细胞仪检测，统计结果见表7。
表7人参总皂苷对斑蝥素引起正常大鼠肾细胞的细胞凋亡的影响
| 组别 | 完整细胞(％) | 凋亡细胞(％) | 死细胞(％) |
| 正常对照组 | 95.63±0.65 | 3.97±0.51 | 0.40±0.26 |
| 斑蝥提取物(0.625μg/mL) | 77.10±4.24△ | 21.40±6.36△ | 0.60±0.28 |
| 斑蝥提取物(1.25μg/mL) | 65.97±3.05△△ | 33.37±4.11△△ | 0.53±0.40 |
| 斑蝥提取物(2.5μg/mL) | 58.55±1.91△△ | 36.45±2.76△△ | 0.90±0.14 |
| 斑蝥提取物+人参总皂苷(1.25μg/mL+0.385mg/mL) | 90.30±0.20** | 8.55±0.92** | 0.73±0.25 |
| 斑蝥提取物+人参总皂苷(1.25μg/mL+0.77mg/mL) | 8670±283△* | 12.40±3.82* | 0.45±0.35 |
注：*P＜0.05，**P＜0.01，与斑蝥素(1.25ug/mL)组比较；△P＜0.05，△△P＜0.01，与正常组比较。
实验结果表明人参总皂苷(0.385，0.77mg/mL)明显降低斑蝥提取物引起的NRK细胞凋亡，凋亡率从33.37％降至8.55％。
实施例9：本发明所述人参皂苷组合物对斑蝥素引起大鼠肾脏毒性的抑制作用
采用连续15天腹腔注射斑蝥素(0.14mg/kg)致大鼠肾损伤模型，人参皂苷在给斑蝥素前1小时腹腔注射，剂量为1.6mg/kg和3.2mg/kg。末次给药1h后放入代谢笼收集24h尿液，测尿量及尿液中尿蛋白含量，考察本发明所述人参皂苷组合物对于由斑蝥素所致SD大鼠肾损伤的抑制作用，结果见表8。
表8人参总皂苷对斑蝥素引起大鼠肾脏毒性的影响
注：*P＜0.05，**P＜0.01，与斑蝥素(1.25ug/mL)组比较；△△P＜0.01，与正常对照组比较。
由表8结果可见，斑蝥素能升高大鼠尿蛋白含量，升高血中尿素氮和肌酐的含量，人参总皂苷能明显降低斑蝥素引起的尿蛋白含量、尿素氮和肌酐的升高，表明人参总皂苷有降低斑蝥素致肾脏毒性的作用。
实施例10：本发明所述片剂的制备
配方(按1000片计)：
斑蟊素 1g
人参皂苷Rb1 300g
制备方法：取上述配方量的斑蟊素和人参皂苷Rb1混合均匀后，加入适量淀粉、乙基纤维素、乳糖、交联聚维酮加入高效湿法制粒机中6速搅拌，高速切割预混合3min。将95％乙醇250g加入高效湿法制粒机中，6速搅拌、高速切割3min。进风温度50±5℃干燥15～25min。用1.5mm筛整粒，加入处方量的硬脂酸镁、微粉硅胶、混匀，压片，包装，检验，即得。
实施例11：本发明所述胶囊剂的制备
配方(按1000粒计)：
斑蟊提取物 5g
人参总皂苷 600g
制备方法：取上述配方量的斑蟊提取物和人参总皂苷加入适量碳酸钙、甘露醇、预胶化淀粉、羧甲基淀粉钠，加入高效湿法制粒机中6速搅拌，高速切割预混合3min。将5％预胶化淀粉浆约200g加入高效湿法制粒机中，6速搅拌、高速切割2min。进风温度50±5℃干燥15～20min。用1.5mm筛整粒，加入处方量的硬脂酸镁、微粉硅胶、混匀，填囊，包装，检验，即得。
实施例12：本发明所述胶囊剂的制备
配方(按1000粒计)：
斑蟊提取物 5g
人参总皂苷 600g
制备方法：取上述配方量的斑蟊提取物和人参总皂苷加入适量碳酸钙、甘露醇、预胶化淀粉、羧甲基淀粉钠，加入高效湿法制粒机中6速搅拌，高速切割预混合3min。将5％预胶化淀粉浆约200g加入高效湿法制粒机中，6速搅拌、高速切割2min。进风温度50±5℃干燥15～20min。用1.5mm筛整粒，加入处方量的硬脂酸镁、微粉硅胶、混匀，填囊，包装，检验，即得。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的应用及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (7)
1.一种药物组合物，其包含斑蟊素或含有斑蟊素的中药材提取物和人参皂苷或含有人参皂苷的中药材提取物，所述人参皂苷为人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rb3、Rf、Rd、Re或Rg1中的一种或几种，其中所述人参皂苷或含有人参皂苷的中药材提取物的含量足以降低斑蟊素产生的毒副作用。
2.一种药物组合物，其包含含有斑蟊素的中药材提取物和含有人参皂苷的中药材提取物，所述人参皂苷为人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rb3、Rf、Rd、Re或Rg1中的一种或几种，其中所述含有人参皂苷的中药材提取物的含量足以降低斑蟊素产生的毒副作用。
3.根据权利要求1所述药物组合物，其包含人参皂苷和斑蟊素，其中所述人参皂苷和斑蟊素的重量比为100:1～500:1。
4.根据权利要求1或2所述药物组合物，其中所述含有斑蟊素的中药材提取物为斑蝥提取物。
5.权利要求1至4任意一项所述药物组合物在制备用于治疗各种癌症的药物中的用途。
6.权利要求1至4任意一项所述药物组合物在制备用于治疗各种肝癌、宫颈癌和胶质瘤的药物中的用途。
7.一种治疗癌症的药物制剂，其特征在于，由有效量的权利要求1至4任意一项所述药物组合物和药学上可接受的辅料组成。
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