CN102488863A - 一种具有抗癌作用的中药组合物及其制备方法和检测方法 - Google Patents
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- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明公开了一种具有抗癌作用的药物组合物及其制备工艺和质量检测方法，该药物组合物由益母草、人参、白芍等三十四味中药组成，通过煎煮、水蒸气蒸馏、醇沉等方法，使其有效成分充分发挥。同时本发明还提供了该药物组合物的含量测定方法，该方法专属性强，精密度、稳定性、重复性良好。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药组合物及其制备方法和检测方法，具体涉及一种具有抗癌作用的中药组合物及其制备方法及质量检测方法，属中医药技术领域。
背景技术
癌症是危及人类健康的重大疾病，其致死率呈逐年上升的趋势，它的发生和发展是多因素参与、多基因改变及多阶段发展的复杂病变过程。目前对于癌症的治疗大多采用手术治疗结合放、化疗方法，但是该方法对病人的创伤大，危险性高，且费用昂贵，但疗效却并不理想。中药作为我国传统防病治病的武器，伴随着近年来逐步深入的研究与探索，在癌症治疗中越来越受到重视。研究表明，在肿瘤防治过程中，中药主要是从提高机体免疫功能、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移以及对化疗的减毒增效等方面发挥作用的。
本发明所述中药组合物配伍合理，既能调节气血阴阳和脏腑功能，保护骨髓造血功能，又能启动自身防御系统，提高机体免疫力，对于肿瘤的辅助治疗很有益处。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗癌作用的中药组合物。
本发明的另一个目的在于提供该组合物的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供该组合物的口服液制备方法，该制备方法制备的口服液质量高、澄清、含量温度，药效好。
本发明的另一个目的在于提供该组合物的质量检测方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明所述中药组合物由如下原料药制成(按重量份计)：
益母草130-150重量份 红花15-20重量份 花椒15-20重量份
水蛭15-20重量份 当归30-40重量份 苏木15-20重量份
三棱15-20重量份 两头尖15-20重量份 川芎15-20重量份
降香15-20重量份 香附15-20重量份 人参50-55重量份
高良姜15-20重量份 姜黄8-15重量份 没药15-20重量份
苦杏仁20-30重量份 大黄60-80重量份 紫苏子15-20重量份
小茴香20-30重量份 桃仁20-30重量份 五灵脂15-20重量份
虻虫15-20重量份 鳖甲130-150重量份 丁香15-25重量份
延胡索15-20重量份 白芍30-40重量份 蒲黄15-20重量份
乳香15-20重量份 干漆15-20重量份 吴茱萸15-20重量份
阿魏15-20重量份 肉桂15-20重量份 艾叶15-20重量份
熟地黄30-40重量份。
所述中药组合物的原料药优选为：
益母草140重量份 红花17.5重量份 花椒(炭)17.5重量份
水蛭(制)17.5重量份 当归35重量份 苏木17.5重量份
三棱(醋炙)17.5重量份 两头尖17.5重量份 川芎17.5重量份
降香17.5重量份 香附(醋炙)17.5重量份 人参52.5重量份
高良姜17.5重量份 姜黄10.5重量份 没药(醋炙)17.5重量份
苦杏仁(炒)26.25重量份 大黄70重量份 紫苏子17.5重量份
小茴香(盐炒)26.25重量份 桃仁26.25重量 五灵脂(醋炙)17.5重量份
虻虫17.5重量份 鳖甲140重量份 丁香21.25重量份
延胡索(醋炙)17.5重量份 白芍35重量份 蒲黄(炭)17.5重量份
乳香(醋炙)17.5重量份 干漆(煅)17.5重量份
吴茱萸(甘草水炙)17.5重量份
阿魏17.5重量份 肉桂17.5重量份 艾叶(炙)17.5重量份
熟地黄35重量份。
上述中药组合物可按常规工艺加入常规辅料制成片剂、胶囊、口服液、丸剂、颗粒剂等临床可接受的剂型。
以生药材(原料药)量计算，相当于10g生药的所述组合物制剂中大黄素、大黄酚的总量不得少于0.28mg。
人参皂苷Rg1、Re总量计不低于100μg、人参皂苷Rb1不低于50μg；水苏碱不低于50μg；吴茱萸碱、吴茱萸次碱总量计不低于100μg；芍药苷50μg。
中药组合物的口服液制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
步骤1：鳖甲加水煎煮2-4次，每次2-4小时，合并提取液，滤过，滤液浓缩为鳖甲煎液；
步骤2：当归、川芎、姜黄、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸气蒸馏提取5-7小时，收集挥发油与蒸馏液，
步骤3：步骤2水蒸气蒸馏提取剩余的药渣与其余原药材加水煎煮2-4次，每次1-3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至清膏1，
步骤4：步骤3的清膏1加乙醇至含醇量达60-80％，调节pH值为7.5～8.0，静置，滤过，滤液回收乙醇，加水得清膏2，
步骤5：步骤4中的清膏2步骤1的鳖甲煎液，煮沸，放冷，加步骤2的挥发油与蒸馏液及口服液的常规辅料，加水搅拌使溶解，静置，滤过，滤液经常规工艺制成口服液；
所述步骤2和/或4的静置为：0～5℃静置；
所述步骤5中加入口服液的常规辅料为：1-5重量份聚山梨酯80、1-5重量份甜蜜素。
所述制备方法还包括步骤6：大黄素、大黄酚的总量的含量测定；和/或下述鉴别A、B、C任一一种或几种。
本发明还提供该组合物口服液的制备方法，该方法包括如下步骤：
鳖甲加水煎煮2-4次，每次2-4小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至适量；当归、川芎、姜黄、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸气蒸馏提取5-7小时，收集挥发油与蒸馏液适量，药渣及其余二十五味加水煎煮2-4次，每次1-3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约1.15(50～60℃)的清膏，加乙醇使含醇量达60-80％，调节pH值为7.5～8.0，静置(0～5℃)10-40小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至相对密度约1.06(50～60℃)的清膏，再加入鳖甲煎液，煮沸10-30分钟，放冷，加挥发油与蒸馏液及1-5重量分聚山梨酯80、1-5重量分甜蜜素，加水搅拌使溶解，静置(0～5℃)24～48小时，滤过，滤液加水至1000体积份，灌封，灭菌，即得；所述体积份与重量份的关系为g/ml。
所述中药口服液的制备方法优选为：
以上三十四味，鳖甲加水煎煮3次，每次3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至适量；当归、川芎、姜黄、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸气蒸馏提取6小时，收集挥发油与蒸馏液适量，药渣及其余二十五味加水煎煮3次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约1.15(50～60℃)的清膏，加乙醇使含醇量达60-80％，调节pH值为7.5～8.0，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至相对密度约1.06(50～60℃)的清膏，再加入鳖甲煎液，煮沸20分钟，放冷，加挥发油与蒸馏液及2重量分聚山梨酯80、甜蜜素2重量分，加水搅拌使溶解，静置24～48小时，滤过，滤液加水至1000体积份，灌封，灭菌，即得。
本发明所述组合物口服液的制备方法，该方法包括如下步骤：
选取如下原料药：
益母草140g 红花17.5g 花椒(炭)17.5g
水蛭(制)17.5g 当归35g 苏木17.5g
三棱(醋炙)17.5g 两头尖17.5g 川芎17.5g
降香17.5g 香附(醋炙)17.5g 人参52.5g
高良姜17.5g 姜黄10.5g 没药(醋炙)17.5g
苦杏仁(炒)26.25g 大黄70g 紫苏子17.5g
小茴香(盐炒)26.25g 桃仁26.25g 五灵脂(醋炙)17.5g
虻虫17.5g 鳖甲140g 丁香21.25g
延胡索(醋炙)17.5g 白芍35g 蒲黄(炭)17.5g
乳香(醋炙)17.5g 干漆(煅)17.5g 吴茱萸(甘草水炙)17.5g
阿魏17.5g 肉桂17.5g 艾叶(炙)17.5g
熟地黄35g；
鳖甲加加9倍水煎煮3次，每次3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至160-200ml；当归、川芎、姜黄、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香加12倍水，水蒸气蒸馏提取6小时，收集挥发油与蒸馏液40-60ml，药渣及其余二十五味加水煎煮三次，第一次加水12倍量煎煮2小时，第二、三次分别加水10倍、8倍，煎煮各1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至50～60℃相对密度为1.15的清膏，加乙醇使含醇量达70％，调节pH值为7.5～8.0，0～5℃静置20-30小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至50～60℃相对密度为1.06的清膏，再加入鳖甲煎液，煮沸20分钟，放冷，加挥发油与蒸馏液及聚山梨酯80、甜蜜素，加水搅拌使溶解，0～5℃静置24～48小时，滤过，滤液加水，灌封，105℃灭菌60min。
本发明药物组合物口服液的检测方法包括如下鉴别方法和/或含量测定中的一种或几种：
鉴别
鉴别A：取相当生药材量20-40g的中药组合物口服液，加盐酸调pH值至1～2，离心，取上清液，通过强酸性阳离子交换树脂柱上，先用水洗脱，再用1-3mol/L氨溶液洗脱，收集氨溶液洗脱液，蒸干得残渣，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取盐酸水苏碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5-2mg盐酸水苏碱的对照品溶液；吸取等量的上述两种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-盐酸-乙酸乙酯以3-12∶1-5∶0.5-2的比例为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液；
鉴别B：称取相当生药材量20-40g的中药组合物口服液，用水饱和的正丁醇提取1-3次，合并正丁醇提取液，蒸干得残渣，残渣加氨试液使溶解，加于大孔吸附树脂柱上，先后分别用氨试液、水、20-40％乙醇洗脱，分别弃去洗脱液；继用60-80％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干得残渣，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每1ml含0.2-1mg的对照品溶液；等量吸取上述两种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以8-20∶2-12∶1-5为比例的氯仿-甲醇-水在10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外灯下检视；
鉴别C：称取含相当于生药材量20-40g口服液，用水饱和的正丁醇提取1-3次，合并正丁醇提取液，蒸干得残渣，残渣加甲醇使溶解，加中性氧化铝1-3g，拌匀，蒸干，加于中性氧化铝柱上，用甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.2-1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取等量的两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以5-10∶0.5-2∶1-8∶0.5-2比例的氯仿-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；
含量测定方法：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60～80∶40～20甲醇-0.07％磷酸溶液为流动相；检测波长为250～260nm。理论塔板数按大黄素峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备：取大黄素对照品、大黄酚对照品加甲醇制成混合溶液；
供试品溶液的制备包括如下步骤：步骤1：所述组合物口服液用水、盐酸、氯仿加热回流提取；步骤2：回流提取液冷却、静置后得氯仿液和水液；步骤3：水液再用氯仿提取；步骤4：合并步骤2、3的氯仿提取液，回收溶剂至干，得残渣，残渣加甲醇使溶解；所述供试品溶液制备步骤1中盐酸的摩尔浓度为：2.5mol/L；所述供试品溶液制备步骤2中加热回流0.5-2小时；所述对照品溶液制备步骤3中氯仿提取2-4次；氯仿为：分析纯。
本发明药物组合物口服液的检测方法包括如下方法：
鉴别
鉴别A：称取相当生药材量20-40g的中药组合物口服液，加稀盐酸调pH值至1～2，离心，取上清液，通过强酸性阳离子交换树脂柱上，用水洗脱至流出液近无色，弃去水液，再用1-3mol/L氨溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取盐酸水苏碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5-2mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-盐酸-乙酸乙酯(3-12∶1-5∶0.5-2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
鉴别B：称取相当生药材量20-40g的中药组合物口服液，用水饱和的正丁醇提取1-3次，每次30ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加氨试液5ml使溶解，加于大孔吸附树脂柱上，用氨试液100ml洗涤，弃去氨洗脱液，再用水洗脱至中性，弃去水洗脱液，再用20-40％乙醇50ml洗脱，弃去乙醇洗脱液，继用60-80％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每1ml含0.2-1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(8-20∶2-12∶1-5)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯下(365nm)检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
鉴别C：称取含相当于生药材量20-40g口服液，用水饱和的正丁醇提取1-3次，每次30ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，加中性氧化铝1-3g，拌匀，蒸干，加于中性氧化铝柱上，用甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.2-1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(5-10∶0.5-2∶1-8∶0.5-2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
含量测定方法：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60～80∶40～20甲醇-0.07％磷酸溶液为流动相；检测波长为250～260nm。理论塔板数按大黄素峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备：取大黄素对照品、大黄酚对照品加甲醇制成混合溶液；
供试品溶液的制备包括如下步骤：步骤1：所述组合物口服液用水、盐酸、氯仿加热回流提取；步骤2：回流提取液冷却、静置后得氯仿液和水液；步骤3：水液再用氯仿提取；步骤4：合并步骤2、3的氯仿提取液，回收溶剂至干，得残渣，残渣加甲醇使溶解。所述供试品溶液制备步骤1中盐酸的摩尔浓度为：2.5mol/L；氯仿为：分析纯。所述供试品溶液制备步骤2中加热回流0.5-2小时；所述对照品溶液制备步骤3中氯仿提取2-4次。
本发明所述中药组合物的检测方法优选包括如下一种或几种方法：
鉴别A：称取相当生药材量30g的中药组合物，加稀盐酸调pH值至1～2，离心，取上清液，通过001×7型(732)Na-型强酸性阳离子交换树脂柱(内径2cm，柱高15cm)上，用水洗脱至流出液近无色，弃去水液，再用2mol/L氨溶液120ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取盐酸水苏碱对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-盐酸-乙酸乙酯(8∶3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
鉴别B：称取相当生药材量30g的中药组合物口服液，用水饱和的正丁醇提取2次，每次30ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加氨试液5ml使溶解，加于D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm)上，用氨试液100ml洗涤，弃去氨洗脱液，再用水洗脱至中性，弃去水洗脱液，再用30％乙醇50ml洗脱，弃去30％乙醇洗脱液，继用70％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯下(365nm)检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
鉴别C：称取含相当于生药材量30g的中药组合物口服液，用水饱和的正丁醇提取2次，每次30ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，加中性氧化铝2g，拌匀，蒸干，加于中性氧化铝柱(100～200目，3g，内径1cm)上，用甲醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(8∶1∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
含量测定方法：
照高效液相色谱法测定，色谱条件与系统适用性试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.07％磷酸溶液(70∶30)为流动相；检测波长为254nm；理论塔板数按大黄素峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：取大黄素对照品、大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含4μg、8μg的混合溶液，即得；供试品溶液的制备：量取相当于生药材2g的所述组合物口服液，加水7ml与盐酸1ml，再加氯仿10ml，加热回流1小时，立即冷却，转移分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，静置，分取氯仿液，水液再用氯仿提取3次，每次10ml，合并氯仿提取液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明组合物用于治疗原发性肝癌、肺癌、胃肠道癌、乳腺癌、妇科癌；本发明组合物含量测定方法具有专属性强、快速、简便。本发明含量测定方法中，在水解时加入了有机溶剂，使水解后的大黄素、大黄酚溶解更加完全，从而克服了现有技术由于被测成分粘贴瓶壁和沉淀结块导致提取不完全的缺点，使含量测定结果更加准确、科学，具有明显的效果。
实验例1：含量测定实验
(一)样品水解方法的考察
1样品与试剂
样品：实施例1制备的口服液，批号060502、060503、060504；由成都地奥集团天府药业股分有限公司提供。
大黄素、大黄酚对照品：批号大黄素：110756-200110、大黄酚：110796-200311，由中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用。
试剂：除甲醇为色谱纯外，其余试剂均为分析纯。
2试验方法：
2.1色谱条件及系统适应性实验
高效液相色谱仪：Alltech426，UVIS200紫外检测器；色谱柱：迪马C18柱，5μ，150*4.6mm；柱温：35℃；流动相：甲醇-0.07％磷酸溶液(70∶30)；检测波长为254nm；流速：1ml/min；理论板数按大黄素峰计算应不低于3000。
2.2对照品溶液的制备
精密称取在硅胶干燥器中干燥至恒重的大黄素、大黄酚对照品3.83mg、8.72mg，置100ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。(每1ml中含大黄素3.83μg、大黄酚8.72μg)。
2.3供试品溶液制备
方法1：精密量取本品2ml，加2.5mol/L硫酸溶液8ml，加热回流2小时，放冷，用乙醚振摇提取4次(30ml、15ml、15ml、15ml)，合并乙醚液，用无水硫酸钠脱水，滤过，滤器用少量乙醚洗涤，洗液并入滤液中，低温缓慢蒸干乙醚，残渣用甲醇-丙酮(1∶1)溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇-丙酮(1∶1)至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
方法2：精密量取本品2ml，置于25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置50ml圆底烧瓶中，挥去甲醇，加2.5mol/L硫酸溶液10ml，超声处理5min，再加氯仿10ml，加热回流1h，放冷，分取氯仿层，酸液用氯仿提取两次，每次10ml，合并氯仿液，以无水硫酸钠脱水，氯仿液置水浴上蒸干，残渣加甲醇适量微热使溶解，移至5ml量瓶中，并加甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
方法3：精密量取本品2ml，加水7ml和盐酸1ml，水浴回流1h，放冷，用乙醚振摇提取3次(20、15、15ml)，合并提取液，用少量无水硫酸钠脱水，滤过，滤器用少量乙醚洗涤，洗液并入滤液中，低温蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇定容，摇匀，离心，即得供试品溶液。
方法4：精密量取本品2ml，加水7ml与盐酸1ml，再加氯仿10ml，加热回流1小时，立即冷却，转移分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，静置，分取氯仿液，水液再用氯仿提取3次，每次10ml，合并氯仿提取液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
3结果
按照方法4制得的供试品溶液所测得的大黄素和大黄酚的含量明显高于其他三组，故采用该方法作为含量测定供试品溶液制备的方法。见表1
表1水解方法的比较
(二)方法学考察
1线性考察
分别精密量取大黄素(38.3μg/ml)、大黄酚(87.2μg/ml)对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0μl，进样，记录色谱图，测定其峰面积，结果见表4。并以峰面积值(Y)对进样量(X)进行回归，得大黄素标准曲线方程为：Y＝2865509.1X+7066.3，r＝0.9998；大黄酚标准曲线方程为：Y＝3891218.2X+265424.9，r＝0.9998。并以峰面积值(A)对进样量(C)作图，得一直线，结果表明大黄素在0.0383～0.2298μg范围内线性良好，大黄酚在0.0872～0.5232μg范围内线性良好。
表2大黄素、大黄酚的线性考察
2精密度考察
取同一浓度的大黄素、大黄酚对照品溶液20μl，在相同色谱条件下连续进样5次，记录峰面积，考察仪器精密度。大黄素、大黄酚RSD分别为1.93％、0.96％，精密度考察结果符合要求。结果见表3。
表3大黄素、大黄酚的精密度考察结果
| 序号 | 峰面积 | RSD(％) | |
| 1 | 227015.60 | ||
| 2 | 218583.54 | ||
| 大黄素 | 3 | 223751.87 | 1.93％ |
| 4 | 230185.39 | ||
| 5 | 226489.35 | ||
| 1 | 702079.68 | ||
| 2 | 713654.34 | ||
| 大黄酚 | 3 | 709375.34 | 0.96％ |
| 4 | 720274.14 | ||
| 5 | 715385.83 |
3大黄素、大黄酚的稳定性考察
大黄素、大黄酚标准品及供试品中的大黄素、大黄酚在48小时内均是稳定的。
4重现性考察
取同一批号实施例1口服液(060401)，按供试品溶液的制备方法平行制备5份，分别进样20μl，同时取对照品溶液20μl进样测定，按外标法测定含量并计算RSD，结果见表4。其RSD为0.94％，重现性考察结果符合要求。
表4大黄素、大黄酚重复性考察结果
| 序号 | 总含量(mg/支) | RSD(％) |
| 1 | 0.5795 | |
| 2 | 0.5730 | |
| 3 | 0.5835 | 0.94％ |
| 4 | 0.5814 | |
| 5 | 0.5878 |
5加样回收试验
精密量取已知含量的样品(060503)1ml，共取6份，分别加入一定量的对照品，按供试品溶液的制备方法制备。分别进样测定，计算加样回收率。结果见表5。大黄素、大黄酚加样回收率为97.91％。
表5大黄素、大黄酚加样回收试验结果
6样品含量测定
采用正文拟定的含量测定方法，测定6批实施例1口服液，结果见表6。
表6样品含量测定结果(n＝2)
| 批号 | 大黄素和大黄酚总含量(mg/支) | RSD(％) |
| 060301 | 0.5155 | 0.52 |
| 060401 | 0.4568 | 0.80 |
| 060402 | 0.4051 | 1.13 |
| 060501 | 0.2977 | 1.61 |
| 060502 | 0.3422 | 1.78 |
| 060503 | 0.5816 | 1.25 |
| 060504 | 0.5127 | 0.79 |
7专属性考察
按照上述方法，对实施例1口服液以及缺大黄的实施例1口服液阴性对照品进行了测定，结果阴性对照品在相应的保留时间无吸收峰出现。说明其他成分对大黄素、大黄酚的测定无干扰，所拟定的方法具有专属性及可行性。
实验例2白芍薄层鉴别中供试品溶液制备方法考察
供试品溶液1的制备：取本发明中药组合物口服液30ml，用水饱和的正丁醇提取2次，每次30ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，加中性氧化铝2g，拌匀，蒸干，加于中性氧化铝柱(100～200目，3g，内径1cm)上，用甲醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液1；
供试品溶液2的制备：加乙醚20ml振摇提取，弃去乙醚液，水液再用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇液，用水30ml洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，加中性氧化铝1g低温拌匀，干燥，装入一预先装填好的中性氧化铝小柱(200～300目，2g，内径10～15mm)上，以乙醇60ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液2；
对照品溶液1的制备：取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液1。
薄层层析：照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述四种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(8∶1∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
结论：供试品色谱中，方法1在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，方法2在与对照品色谱相应的位置上未显相同颜色的斑点，有干扰成分。
实验例3：益母草的薄层鉴别方法专属性的考察
供试品溶液的制备：取三批实施例1口服液各30ml，加稀盐酸调pH值至1～2，离心，取上清液，通过001×7型(732)Na-型强酸性阳离子交换树脂柱(内径2cm，柱高15cm)上，用水洗脱至流出液近无色，弃去水液，再用2mol/L氨溶液120ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：取盐酸水苏碱对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。
缺益母草阴性对照溶液的制备：按处方比例及制法，制成缺益母草的阴性样品，取30ml，按照供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。
薄层层析：照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上(由左向右依次为对照品溶液，三批样品溶液，阴性对照溶液)，以正丁醇-盐酸-乙酸乙酯(8∶3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。
结论：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照在相应位置无干扰。
实验例4人参的薄层鉴别方法专属性考察
供试品溶液制备：取三批本发明中药组合物口服液各30ml，用水饱和的正丁醇提取2次，每次30ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加氨试液5ml使溶解，加于D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm)上，用氨试液100ml洗涤，弃去氨洗脱液，再用水洗脱至中性，弃去水洗脱液，再用30％乙醇50ml洗脱，弃去30％乙醇洗脱液，继用70％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：取人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
缺人参阴性对照溶液的制备：按处方比例及制法，制成缺人参的阴性样品，取30ml，按照供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。
薄层层析：照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上(由左向右依次为对照品溶液，三批样品溶液，阴性对照溶液)，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯下(365nm)检视。
结论：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照在相应位置无干扰。
实验例5静置温度考察试验
现有的口服液制备技术中，一般在温度降低，绝大部分物质溶解度降低，但对一小部分物质来讲是溶解度升高的。在本发明口服液产品中，理论上来讲，随着温度的降低，沉淀效果越明显，大黄素等物质会随着沉淀物一起沉降下去。
取本发明口服液在制备过程中，包括两次静置过程，一次为醇沉后，一次为加挥发油与蒸馏液及聚山梨酯80、甜蜜素后，当在低温度下静置，会出现主要成分被沉降，影响活性成分的含量。
本实验依据实施1的制备方法制成样品1，其中两次静置温度均为(0～5℃)；按实施例1工艺，将两次静置温度均改为(20℃)，制成样品2，进行加速试验；主要考察性状沉淀、含量指标的情况。试验条件：在40±2℃条件下于0、1、2、3、6个月进行试验见表7。
表7加速试验结果
通过加速试验证明，与常规的认识不同，本发明口服液冷藏静置后的药液沉淀不仅少，而且大黄素、大黄酚含量含量稳定，符合质量标准要求。
下述实施方式均能实现上述实验例的效果
具体实施方式
实施例1：
益母草140g 红花17.5g 花椒(炭)17.5g
水蛭(制)17.5g 当归35g 苏木17.5g
三棱(醋炙)17.5g 两头尖17.5g 川芎17.5g
降香17.5g 香附(醋炙)17.5g 人参52.5g
高良姜17.5g 姜黄10.5g 没药(醋炙)17.5g
苦杏仁(炒)26.25g 大黄70g 紫苏子17.5g
小茴香(盐炒)26.25g 桃仁26.25g 五灵脂(醋炙)17.5g
虻虫17.5g 鳖甲140g 丁香21.25g
延胡索(醋炙)17.5g 白芍35g 蒲黄(炭)17.5g
乳香(醋炙)17.5g 干漆(煅)17.5g 吴茱萸(甘草水炙)17.5g
阿魏17.5g 肉桂17.5g 艾叶(炙)17.5g
熟地黄35g；
以上三十四味药材，鳖甲加水煎煮3次(加9倍水)，每次3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至适量(约180ml)；当归、川芎、姜黄、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸气蒸馏提取6小时(加12倍水)，收集挥发油与蒸馏液适量(约50ml)，药渣及其余二十五味加水煎煮三次，第一次2小时(加水12倍)，第二、三次各1.5小时(分别加水10倍、8倍)，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15(50～60℃)的清膏，加乙醇使含醇量达70％，调节pH值为7.5～8.0，静置(0～5℃)24小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至相对密度为1.06(50～60℃)的清膏，再加入鳖甲煎液，煮沸20分钟，放冷，加挥发油与蒸馏液及聚山梨酯80、甜蜜素，加水搅拌使溶解，静置(0～5℃)24～48小时，滤过，滤液加水至规定量(1000ml)，灌封，灭菌(105℃，60min)，即得。每支10ml。
实施例2：
益母草140g 红花17.5g 花椒(炭)17.5g
水蛭(制)17.5g 当归35g 苏木17.5g
三棱(醋炙)17.5g 两头尖17.5g 川芎17.5g
降香17.5g 香附(醋炙)17.5g 人参52.5g
高良姜17.5g 姜黄10.5g 没药(醋炙)17.5g
苦杏仁(炒)26.25g 大黄70g 紫苏子17.5g
小茴香(盐炒)26.25g 桃仁26.25g 五灵脂(醋炙)17.5g
虻虫17.5g 鳖甲140g 丁香21.25g
延胡索(醋炙)17.5g 白芍35g 蒲黄(炭)17.5g
乳香(醋炙)17.5g 干漆(煅)17.5g 吴茱萸(甘草水炙)17.5g
阿魏17.5g 肉桂17.5g 艾叶(炙)17.5g
熟地黄35g
制备方法：以上三十四味，鳖甲加水煎煮3次，每次3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至适量；当归、川芎、姜黄、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸气蒸馏提取6小时，收集挥发油与蒸馏液适量，药渣及其余二十五味加水煎煮三次，第一次2小时，第二、三次各1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约1.15(50～60℃)的清膏，加乙醇使含醇量达70％，调节pH值为7.5～8.0，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至相对密度约1.06(50～60℃)的清膏，再加入鳖甲煎液，煮沸20分钟，放冷，加挥发油与蒸馏液，经常规工艺制成片剂。
实施例3：
益母草140g 红花17.5g 花椒(炭)17.5g
水蛭(制)17.5g 当归35g 苏木17.5g
三棱(醋炙)17.5g 两头尖17.5g 川芎17.5g
降香17.5g 香附(醋炙)17.5g 人参52.5g
高良姜17.5g 姜黄10.5g 没药(醋炙)17.5g
苦杏仁(炒)26.25g 大黄70g 紫苏子17.5g
小茴香(盐炒)26.25g 桃仁26.25g 五灵脂(醋炙)17.5g
虻虫17.5g 鳖甲140g 丁香21.25g
延胡索(醋炙)17.5g 白芍35g 蒲黄(炭)17.5g
乳香(醋炙)17.5g 干漆(煅)17.5g 吴茱萸(甘草水炙)17.5g
阿魏17.5g 肉桂17.5g 艾叶(炙)17.5g
熟地黄35g
制备方法：以上三十四味，鳖甲加水煎煮3次，每次3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至适量；当归、川芎、姜黄、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸气蒸馏提取6小时，收集挥发油与蒸馏液适量，药渣及其余二十五味加水煎煮三次，第一次2小时，第二、三次各1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约1.15(50～60℃)的清膏，加乙醇使含醇量达70％，调节pH值为7.5～8.0，静置24小时，滤过，滤液回收乙醇，加水至相对密度约1.06(50～60℃)的清膏，再加入鳖甲煎液，煮沸20分钟，放冷，加挥发油与蒸馏液，经常规工艺制成颗粒剂。
实施例4：实施例1口服液检测方法
鉴别：
(1)取口服液30ml，加稀盐酸调pH值至1～2，离心，取上清液，通过001×7型(732)Na-型强酸性阳离子交换树脂柱(内径2cm，柱高15cm)上，用水洗脱至流出液近无色，弃去水液，再用2mol/L氨溶液120ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取盐酸水苏碱对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-盐酸-乙酸乙酯(8∶3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(2)取口服液30ml，用水饱和的正丁醇提取2次，每次30ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加氨试液5ml使溶解，加于D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm)上，用氨试液100ml洗涤，弃去氨洗脱液，再用水洗脱至中性，弃去水洗脱液，再用30％乙醇50ml洗脱，弃去30％乙醇洗脱液，继用70％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯下(365nm)检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(3)取口服液30ml，用水饱和的正丁醇提取2次，每次30ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，加中性氧化铝2g，拌匀，蒸干，加于中性氧化铝柱(100～200目，3g，内径1cm)上，用甲醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(8∶1∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
含量测定：照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.07％磷酸溶液(70∶30)为流动相；检测波长为254nm。理论塔板数按大黄素峰计算应不低于3000。对照品溶液的制备取大黄素对照品、大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含4μg、8μg的混合溶液，即得。供试品溶液的制备：精密量取口服液2ml，加水7ml与盐酸1ml，再加氯仿10ml，加热回流1小时，立即冷却，转移分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，静置，分取氯仿液，水液再用氯仿提取3次，每次10ml，合并氯仿提取液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每支含大黄以大黄素(C15H10O5)、大黄酚(C15H10O4)的总量计，不得少于0.28mg。
实施例5：实施例1口服液检测方法
鉴别：
(1)取口服液30ml，加稀盐酸调pH值至1～2，离心，取上清液，通过001×7型(732)Na-型强酸性阳离子交换树脂柱(内径2cm，柱高15cm)上，用水洗脱至流出液近无色，弃去水液，再用2mol/L氨溶液120ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取盐酸水苏碱对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-盐酸-乙酸乙酯(8∶3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(2)取口服液30ml，用水饱和的正丁醇提取2次，每次30ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加氨试液5ml使溶解，加于D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm)上，用氨试液100ml洗涤，弃去氨洗脱液，再用水洗脱至中性，弃去水洗脱液，再用30％乙醇50ml洗脱，弃去30％乙醇洗脱液，继用70％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯下(365nm)检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(3)取口服液30ml，用水饱和的正丁醇提取2次，每次30ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，加中性氧化铝2g，拌匀，蒸干，加于中性氧化铝柱(100～200目，3g，内径1cm)上，用甲醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(8∶1∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(4)取口服液40ml，用浓氨试液调节PH值至碱性，加乙醚提取两次，每次30ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取吴茱萸对照药材0.5g，加乙醇10ml，加热回流30分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，分别吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
含量测定：照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.07％磷酸溶液(70∶30)为流动相；检测波长为254nm。理论塔板数按大黄素峰计算应不低于3000。对照品溶液的制备取大黄素对照品、大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含4μg、8μg的混合溶液，即得。供试品溶液的制备：精密量取口服液2ml，加水7ml与盐酸1ml，再加氯仿10ml，加热回流1小时，立即冷却，转移分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，静置，分取氯仿液，水液再用氯仿提取3次，每次10ml，合并氯仿提取液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每支含大黄以大黄素(C15H10O5)、大黄酚(C15H10O4)的总量计，不得少于0.28mg。
实施例6：实施例1口服液检测方法
鉴别：
(1)取口服液30ml，加稀盐酸调pH值至1～2，离心，取上清液，通过001×7型(732)Na-型强酸性阳离子交换树脂柱(内径2cm，柱高15cm)上，用水洗脱至流出液近无色，弃去水液，再用2mol/L氨溶液120ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取盐酸水苏碱对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-盐酸-乙酸乙酯(8∶3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(2)取口服液30ml，用水饱和的正丁醇提取2次，每次30ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加氨试液5ml使溶解，加于D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，柱高12cm)上，用氨试液100ml洗涤，弃去氨洗脱液，再用水洗脱至中性，弃去水洗脱液，再用30％乙醇50ml洗脱，弃去30％乙醇洗脱液，继用70％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯下(365nm)检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(3)取口服液30ml，用水饱和的正丁醇提取2次，每次30ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，加中性氧化铝2g，拌匀，蒸干，加于中性氧化铝柱(100～200目，3g，内径1cm)上，用甲醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(8∶1∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(4)取口服液40ml，用浓氨试液调节PH值至碱性，加乙醚提取两次，每次30ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取吴茱萸对照药材0.5g，加乙醇10ml，加热回流30分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，分别吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(5)取口服液30ml，加盐酸3ml，置水浴中加热回流1小时，放冷，用乙醚振摇提取2次，每次30ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加氯仿2ml使溶解，作为供试品溶液。另取大黄素对照品、大黄酚对照品，加氯仿制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述二种溶液各8ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后，日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(6)取口服液30ml，加乙醚提取2次，每次30ml，合并乙醚液，挥干，残渣加乙醚1ml使溶解，作为供试品溶液。另取丁香酚对照品，加乙醚制成每1ml含16μl的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯(10∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
含量测定：照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)测定。色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.07％磷酸溶液(70∶30)为流动相；检测波长为254nm。理论塔板数按大黄素峰计算应不低于3000。对照品溶液的制备取大黄素对照品、大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含4μg、8μg的混合溶液，即得。供试品溶液的制备：精密量取口服液2ml，加水7ml与盐酸1ml，再加氯仿10ml，加热回流1小时，立即冷却，转移分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，静置，分取氯仿液，水液再用氯仿提取3次，每次10ml，合并氯仿提取液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每支含大黄以大黄素(C15H10O5)、大黄酚(C15H10O4)的总量计，不得少于0.28mg。
Claims (10)
1.一种具有抗癌作用的中药组合物，其特征在于该中药组合物是由如下原料药制成：
益母草130-150重量份 红花15-20重量份 花椒15-20重量份
水蛭15-20重量份 当归30-40重量份 苏木15-20重量份
三棱15-20重量份 两头尖15-20重量份 川芎15-20重量份
降香15-20重量份 香附15-20重量份 人参50-55重量份
高良姜15-20重量份 姜黄8-15重量份 没药15-20重量份
苦杏仁20-30重量份 大黄60-80重量份 紫苏子15-20重量份
小茴香20-30重量份 桃仁20-30重量份 五灵脂15-20重量份
虻虫15-20重量份 鳖甲130-150重量份 丁香15-25重量份
延胡索15-20重量份 白芍30-40重量份 蒲黄15-20重量份
乳香15-20重量份 干漆15-20重量份 吴茱萸15-20重量份
阿魏15-20重量份 肉桂15-20重量份 艾叶15-20重量份
熟地黄30-40重量份。
2.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物是由如下原料药制成：
益母草140重量份 红花17.5重量份 炭制花椒17.5重量份
制水蛭17.5重量份 当归35重量份 苏木17.5重量份
醋炙三棱17.5重量份 两头尖17.5重量份 川芎17.5重量份
降香17.5重量份 醋炙香附17.5重量份 人参52.5重量份
高良姜17.5重量份 姜黄10.5重量份 醋炙没药17.5重量份
炒苦杏仁26.25重量份 大黄70重量份 紫苏子17.5重量份
盐炒小茴香26.25重量份 桃仁26.25重量份
醋炙五灵脂17.5重量份
虻虫17.5重量份 鳖甲140重量份 丁香21.25重量份
醋炙延胡索17.5重量份 白芍35重量份 炭蒲黄17.5重量份
醋炙乳香17.5重量份 煅干漆17.5重量份
甘草水炙吴茱萸17.5重量份
阿魏17.5重量份 肉桂17.5重量份 炙艾叶17.5重量份
熟地黄35重量份；
以原料药量计算，相当于10g原料药的所述组合物中大黄素、大黄酚的总量不少于0.28mg。
3.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物可按常规工艺加入常规辅料制成临床可接受的剂型。
4.如权利要求1或2所述的中药组合物的口服液制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
步骤1：鳖甲加水煎煮2-4次，每次2-4小时，合并提取液，滤过，滤液浓缩为鳖甲煎液；
步骤2：当归、川芎、姜黄、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸气蒸馏提取5-7小时，收集挥发油与蒸馏液，
步骤3：步骤2水蒸气蒸馏提取剩余的药渣与其余原药材加水煎煮2-4次，每次1-3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至清膏1，
步骤4：步骤3的清膏1加乙醇至含醇量达60-80％，调节pH值为7.5～8.0，静置，滤过，滤液回收乙醇，加水得清膏2，
步骤5：步骤4中的清膏2步骤1的鳖甲煎液，煮沸，放冷，加步骤2的挥发油与蒸馏液及口服液的常规辅料，加水搅拌使溶解，静置，滤过，滤液经常规工艺制成口服液；
所述步骤2和/或步骤4的静置温度为：0～5℃。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤5中加入口服液的常规辅料为：1-5重量份聚山梨酯80、1-5重量份甜蜜素。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于该方法还包括步骤6：大黄素、大黄酚的总量的含量测定；
所述大黄素、大黄酚的总量的含量测定方法为：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60～80∶40～20甲醇-0.07％磷酸溶液为流动相；检测波长为250～260nm，理论塔板数按大黄素峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备：取大黄素对照品、大黄酚对照品加甲醇制成混合溶液；
供试品溶液的制备包括如下步骤：步骤a：所述组合物制剂用水、盐酸、氯仿加热回流提取；步骤b：回流提取液冷却、静置后得氯仿液和水液；步骤c：水液再用氯仿提取；步骤d：合并步骤b、c的氯仿提取液，回收溶剂至干，得残渣，残渣加甲醇使溶解。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述大黄素、大黄酚的总量的含量测定方法中，所述供试品溶液制备中步骤a中盐酸的摩尔浓度为：2-3mol/L；所述供试品溶液制备步骤b中加热回流0.5-2小时；所述对照品溶液制备步骤c中氯仿提取2-4次。
8.如权利要求4所述方法制备的中药组合物口服液的检测方法，其特征在于该方法主要包括如下鉴别方法和/或含量测定中的一种或几种：
鉴别方法：
鉴别A：取相当生药材量20-40g的中药组合物口服液，加盐酸调pH值至1～2，离心，取上清液，通过强酸性阳离子交换树脂柱上，先用水洗脱，再用1-3mol/L氨溶液洗脱，收集氨溶液洗脱液，蒸干得残渣，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取盐酸水苏碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5-2mg盐酸水苏碱的对照品溶液；吸取等量的上述两种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-盐酸-乙酸乙酯以3-12∶1-5∶0.5-2的比例为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液；
鉴别B：称取相当生药材量20-40g的中药组合物口服液，用水饱和的正丁醇提取1-3次，合并正丁醇提取液，蒸干得残渣，残渣加氨试液使溶解，加于大孔吸附树脂柱上，先后分别用氨试液、水、20-40％乙醇洗脱，分别弃去洗脱液；继用60-80％乙醇洗脱，收集该洗脱液，蒸干得残渣，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每1ml含0.2-1mg的对照品溶液；等量吸取上述两种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以8-20∶2-12∶1-5为比例的氯仿-甲醇-水在10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，置紫外灯下检视；
鉴别C：称取含相当于生药材量20-40g口服液，用水饱和的正丁醇提取1-3次，合并正丁醇提取液，蒸干得残渣，残渣加甲醇使溶解，加中性氧化铝1-3g，拌匀，蒸干，加于中性氧化铝柱上，用甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.2-1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取等量的两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以5-10∶0.5-2∶1-8∶0.5-2比例的氯仿-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰；
含量测定方法：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60～80∶40～20甲醇-0.07％磷酸溶液为流动相；检测波长为250～260nm；理论塔板数按大黄素峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备：取大黄素对照品、大黄酚对照品加甲醇制成混合溶液；
供试品溶液的制备包括如下步骤：步骤1：所述组合物口服液用水、盐酸、氯仿加热回流提取；步骤2：回流提取液冷却、静置后得氯仿液和水液；步骤3：水液再用氯仿提取；步骤4：合并步骤2、3的氯仿提取液，回收溶剂至干，得残渣，残渣加甲醇使溶解；所述供试品溶液制备步骤1中盐酸的摩尔浓度为：2.5mol/L；所述供试品溶液制备步骤2中加热回流0.5-2小时；所述对照品溶液制备步骤3中氯仿提取2-4次。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于该方法主要包括如下步骤：
鉴别
鉴别A：称取相当生药材量20-40g的中药组合物口服液，加稀盐酸调pH值至1～2，离心，取上清液，通过强酸性阳离子交换树脂柱上，用水洗脱至流出液近无色，弃去水液，再用1-3mol/L氨溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取盐酸水苏碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5-2mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以3-12∶1-5∶0.5-2的比例的正丁醇-盐酸-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
鉴别B：称取相当生药材量20-40g的中药组合物口服液，用水饱和的正丁醇提取1-3次，每次30ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加氨试液5ml使溶解，加于大孔吸附树脂柱上，用氨试液100ml洗涤，弃去氨洗脱液，再用水洗脱至中性，弃去水洗脱液，再用20-40％乙醇50ml洗脱，弃去乙醇洗脱液，继用60-80％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Re对照品，加甲醇制成每1ml含0.2-1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以8-20∶2-12∶1-5比例的氯仿-甲醇-水在10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
鉴别C：称取含相当于生药材量20-40g口服液，用水饱和的正丁醇提取1-3次，每次30ml，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，加中性氧化铝1-3g，拌匀，蒸干，加于中性氧化铝柱上，用甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.2-1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以5-10∶0.5-2∶1-8∶0.5-2比例的氯仿-乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
含量测定方法：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60～80∶40～20甲醇-0.07％磷酸溶液为流动相；检测波长为250～260nm，理论塔板数按大黄素峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备：取大黄素对照品、大黄酚对照品加甲醇制成混合溶液；
供试品溶液的制备包括如下步骤：步骤1：所述组合物口服液用水、盐酸、氯仿加热回流提取；步骤2：回流提取液冷却、静置后得氯仿液和水液；步骤3：水液再用氯仿提取；步骤4：合并步骤2、3的氯仿提取液，回收溶剂至干，得残渣，残渣加甲醇使溶解；所述供试品溶液制备步骤1中盐酸的摩尔浓度为：2.5mol/L；氯仿为：分析纯；所述供试品溶液制备步骤2中加热回流0.5-2小时；所述对照品溶液制备步骤3中氯仿提取2-4次；
测定法：分别等量吸取对照品溶液与供试品溶液l，注入液相色谱仪，测定，即得。
10.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于该中药组合物中：
人参皂苷Rg1、Re总量计不低于100μg、人参皂苷Rb1不低于50μg；水苏碱不低于50μg；吴茱萸碱、吴茱萸次碱总量计不低于100μg；芍药苷50μg。
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