CN102459624A - 包含（α1→4）和（α1→6）糖苷键的葡萄糖-低聚糖、其用途、及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多糖和低聚糖以及它们的营养效果的领域。尤其是，本发明涉及α-葡聚糖转移酶在制备包括益生元低聚糖在内的膳食纤维的方法中的应用，以及由此获得的新型低聚糖。提供了一种生产具有一个或多个连续(α1→6)糖苷键和一个或多个连续(α1→4)糖苷键的葡萄糖-低聚糖混合物的方法，该方法包括使包含至少两个(α1→4)键合的D-葡萄糖单元的多糖和/或低聚糖底物与能够断开(α1→4)糖苷键并生成新的(α1→4)和(α1→6)糖苷键的α-葡聚糖转移酶相接触。还提供了可由此获得的(分离的)葡萄糖-低聚糖，以及它们在营养组合物和化妆品组合物中的应用。

Description

包含(α1→4)和(α1→6)糖苷键的葡萄糖-低聚糖、其用途、及其制备方法

本发明涉及多糖和寡糖以及它们的营养效果的领域。尤其是，本发明涉及α-葡聚糖转移酶在制备包括益生元低聚糖在内的膳食纤维的方法中的应用，以及由此获得的新型低聚糖。

术语“膳食纤维”在1953年被Hipsley首次用来描述食物的植物细胞壁组分。今天，有很多纤维的定义在使用中，但是至今仍没有普遍接受的定义。通常，纤维来自含有不易消化成分的碳水化合物来源。纤维典型地被分为两类；不溶性纤维，例如麦麸、抗性淀粉、半纤维素、木质素等，以及可溶性纤维，可溶性纤维又能够进一步被分为两个亚类：短链长度的可溶性纤维，包括聚葡萄糖、菊糖和低聚糖，以及长链长度的可溶性纤维，包括果胶、树胶(古柯豆胶、槐豆胶、角叉菜胶、黄原胶)和β-葡聚糖(例如来自燕麦或大麦)。

益生元是膳食纤维，因为它们不被人类体内的酶消化却能被大肠菌群发酵。因此它们能使生物量和排便次数增加，因此对便秘和大肠粘膜的健康具有积极效果。益生元碳水化合物是天然存在的，且能够在许多食物中被发现，包括芦笋、菊苣、番茄和小麦，并且是母乳的天然成分。

术语“益生元”在1995年被Gibson和Roberfroid首次定义。然而，被证实的最初定义难以考证，且从那时起作者已进一步发展了该概念，提出新的定义：“益生元是一种选择性发酵成分，其使得能够对寄主的福利和健康有利的肠道微生物群落的组成和/或活性发生特定变化。”(Nutr ResRev 2004；17：259-275)。为了符合益生元的分类，因此需要一种成分(i)耐消化(胃液酸度，哺乳动物的酶的水解作用和胃肠道吸收)；(ii)被肠道微生物发酵；且(iii)选择性地刺激与健康和福利有关的肠道细菌的生长和/或活性。最后一条标准是膳食纤维和益生元的主要区别特征。益生元通常由于其改变结肠微生物菌群，通过增加糖化(碳水化合物发酵)微生物的数量同时减少致腐败(蛋白质发酵)微生物而促进更健康的组成和/或活性的能力而被识别。

满足益生元标准的确定的不易消化碳水化合物包括低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、乳果糖、菊糖和聚葡萄糖。

聚葡萄糖是一种由所有类型糖苷键随机交联的葡萄糖单元组成的多糖。利体素聚葡萄糖(Litesse polydextrose)由于其独特的糖苷键排列而不易消化。在分子中，(α1→6)键占优势，而约13％该聚合物具有(α1→4)键合，其能够被人体小肠中的酶水解。它在整个结肠中发酵，且在末端结肠中调节的益生元作用是特别有效的。人类干预研究已经证实，利体素聚葡萄糖以剂量依赖的方式增加双歧杆菌和乳酸杆菌。

淀粉是在含有叶绿素的绿色植物中作为储存能量的方式普遍存在的多糖。淀粉构成了数十亿食品配料市场不可缺少的一部分，并且其特征在于它复杂和稳定的性质。淀粉是具有广泛工业应用的必需品的理想实例，这些工业应用包括造纸和纸板制造、发酵、生物燃料、生物降解塑料和清洁剂、生物农药、表面活性剂、聚氨酯、树脂、粘合剂和溶剂。然而，正是食品工业为淀粉及其衍生物提供了最大的市场。

淀粉或者在小肠中被完全降解为葡萄糖并在血液中被摄取，或者未被消化的部分最终在大肠中作为结肠微生物菌群的一般底物。淀粉及其衍生物本身并不刺激特定的有益结肠微生物。因此，淀粉本身不是益生元化合物。该问题的部分解决方案是将淀粉降解为双糖麦芽糖，然后利用转葡萄糖苷酶将麦芽糖转化为聚合度是2至4的(α1→6)-键合的异麦芽低聚糖(IMO)。然而，这些IMO产物太短且大部分在小肠中被降解，因此不能到达结肠。到达结肠的那部分IMO产物在结肠近端部分被肠道菌群迅速降解，而没到达远端部分的那部分IMO产物更有害，蛋白降解细菌存在。为了通过刺激有益细菌类群，特别是双歧杆菌，来战胜这些有害细菌，就需要更长的异麦芽低聚糖。

以前，已经开发了各种方法用于麦芽低聚糖(MOS)和淀粉(直链淀粉、支链淀粉)的化学修饰。最近，也有各种葡萄糖基转移酶(环糊精葡聚糖基转移酶、麦芽糖转葡糖基酶、淀粉分支酶)已被用于淀粉(直链淀粉、支链淀粉)的修饰。

本发明提供了用于淀粉、淀粉衍生物和/或不同链长度的MOS的(酶)修饰的进一步的手段和方法，以便改变它们的功能特性并提高它们的营养价值。

出人意料地发现，通过使用葡聚糖蔗糖酶(glucansucrases)的GTFB型α-葡聚糖转移酶(其为糖苷水解酶家族GH70的成员)能够满足这些目的[http://www.cazy.org]。然而，葡聚糖蔗糖酶催化蔗糖向α-葡聚糖多糖和低聚糖的转化，以前有报道GTFB根本不与蔗糖发生反应(Kralj 2004)。本文中公开了GTFB对包含(α1→4)键合的葡萄糖残基的葡萄糖-低聚糖，例如麦芽-低聚糖(MOS)显示出高活性。GTFB催化歧化反应，缩短一个底物分子且延伸第二个底物分子。两种产物在下一个反应中又都能再作为底物。GTFB活性因此能产生一系列线性葡萄糖-低聚糖直至至少DP35。产物的结构分析已显示GTFB断开(α1→4)糖苷键并生成新的(α1→4)和(α1→6)键。它是具有这种反应和产物特异性的酶的第一个实例。因此，这种酶被命名为(1→4)-α-D-葡聚糖：(1→4)(1→6)-α-D-葡聚糖α-D-葡聚糖转移酶，或者，可替代地，被命名为α-葡聚糖转移酶。葡聚糖蔗糖酶也利用MOS，但是在蔗糖作为供体底物存在时它仅作为受体底物。这引起许多低聚糖的合成，例如，在存在葡聚糖蔗糖酶的情况下，麦芽糖通过一系列葡萄糖单元经由(α1→6)键连接而延长。然而，在葡聚糖蔗糖酶存在的情况下，MOS底物中的(α1→4)连接没有发生断裂且MOS仅被用作受体底物。这是与不能作用于蔗糖而代之以利用MOS作为供体和受体底物的GFTB酶的主要区别，断开(α1→4)连接并通过歧化反应引入新的(α1→6)和(α1→4)连接。GTFB能够从淀粉或淀粉衍生物合成的产物含有相对长的异麦芽低聚糖(IMO)侧链，特别是聚合度为4或更高的IMO侧链。部分IMO-麦芽糖糊精(IMO-MALT)在小肠中被降解，少于未变性的淀粉/衍生物被消耗时应被降解的量。这是因为接近IMO部分的那部分麦芽糖糊精未被肠道淀粉酶降解，因为淀粉酶需要一定长度的线性(α1→4)键合葡萄糖残基来起作用。因此，IMO-MALT被视为部分抗性淀粉衍生物，在小肠中比未变性的麦芽糖糊精产生更少的葡萄糖产物。这被认为是有益的且有利于健康的生活方式(降低发生肥胖症、II型糖尿病、以及与过度消费快速降解的淀粉/衍生物有关的心脏病和冠心病的风险)。运输未变性的至结肠的那部分IMO-MALT将被剩余菌群进一步降解。含有(α1→6)键合的IMO-MALT的IMO部分能够作为有益的双歧杆菌的特异性底物起作用，使IMO-MALT成为益生元成分。因此，IMO-MALT至少具有下列益处：

1.部分抗性麦芽糖糊精/淀粉，产生较少量的葡萄糖且从而有助于肥胖症和II型糖尿病的预防。

2.刺激有益的肠道双歧杆菌的益生元效果并从而促进肠道健康。

在第一种实施方式中，本发明涉及一种生产具有一个或多个(α1→6)糖苷键和一个或多个(α1→4)糖苷键的葡萄糖-低聚糖混合物的方法，包括使在非还原末端含有至少两个(α1→4)-键合的D-葡萄糖单元的多糖和/或低聚糖底物与能够断开(α1→4)糖苷键并生成新的(α→4)和(α1→6)糖苷键的α-葡聚糖转移酶接触。可替代地，或另外，所述α-葡聚糖转移酶能够通过新的(α1→6)糖苷键将麦芽糖基-、麦芽三糖基-或麦芽四糖基-单元转移至底物。

葡萄糖-低聚糖产物是线性的或者含有主要为(α1→4)和(α1→6)糖苷键的线性延伸/部分使它们在小肠中具有耐酶作用是有利的，特别是对于作为膳食纤维应用是有利的。因此，所述α-葡聚糖转移酶优选不引入(α1→6)分支点，也不引入(α1→2)和(α1→3)键。

在一个具体方面，所述α-葡聚糖转移酶(GTFB)是葡聚糖蔗糖酶GH70家族的新成员[http://www.cazy.org]，或如上所述的具有特定酶活性和底物偏好的其功能同系物。例如，该酶选自表2所示的那些，或者选自由来自罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)121的GTFB、来自罗伊氏乳杆菌TMW 1.106的GTF106B、来自罗伊氏乳杆菌ML1的GTML4和来自罗伊氏乳杆菌DSM 20016^A的GTFDSM、来自发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)ATCC 14931的GTF构成的组，在蛋白质和核酸水平上，它们都是本领域公知的。登录号具体参见下图2和表2。当然，也能够使用这些已知序列的天然或人工同系物(突变体)，包括在热稳定性、底物特异性、酶活性等方面显示理想特性的基因工程突变体。在一种实施方式中，所使用的GTFB同系物与来自表2列出的GTFB(-类似)酶的GTFB，或者，优选地，与罗伊氏乳杆菌121(AAU08014)、来自罗伊氏乳杆菌TMW1.106的GTF106B(ABP88725)、来自罗伊氏乳杆菌ML1的GTML4(AAU08003)、来自罗伊氏乳杆菌DSM 20016^A的GTFDSM(ABQ83597)或来自发酵乳杆菌ATCC 14931的GTF(ZP_03945763)在氨基酸水平上表现出至少55％、优选至少60％、75％、至少80％、85％或至少90％序列同一性。例如，使用与来自罗伊氏乳杆菌121的GTFB在氨基酸水平上表现出至少55％、优选至少60％、75％，至少80％、85％或至少90％序列同一性的GTFB同系物。

优选地，该酶与GTFB的催化核心在氨基酸水平上表现出至少45％、更优选至少50％序列同一性，或至少60％序列同一性，所述催化核心由在罗伊氏乳杆菌121的GTFB的蛋白质序列中发现的连续氨基酸序列W⁷⁹⁰YRP....IVMNQ¹⁴⁸⁴表示：基因文库登陆号AAU08014(蛋白质编码)。

所述GTFB同系物优选包含一个或多个下列保守的氨基酸残基，其中，与罗伊氏乳杆菌121的GTFB中的位置对应的编号是：Arg1013；Asp1015；Ala1017；Asn1019；Glu1053，Gly1054，Tyr1055，His1124，Asp1125，Gln1126，Arg1127，Lys1128，Asp1479；Ile1480，Met1482，Asn1483，Gln1484。优选地，至少存在催化残基Asp1015、Glu1053和Asp1125。更优选地，所有这些残基都存在。

在GTF酶的催化区中，已经鉴定出四个保守区域。以前的蛋白质工程研究已经证实就形成的糖苷键类型而言，定位在保守序列区域III和IV(序列比对见图1)中的氨基酸残基控制GTF酶的产物特异性(Hellmuthet al.Biochemistry(2008)；Kralj et al.(2005)Biochemistry 44，9206-9216；Kralj et al.(2006)FEBS J.273，3735-3742)。同样，区域I和区域II含有有利于酶活性和反应特异性的氨基酸残基[Kralj et al.(2005)；Swistowska etal.(2007)FEBS Lett.581，4036-4042.]。在一个具体方面，所述酶包含下列共有序列中的至少一种，其中的编号对应于GTFB中的氨基酸位置(见图1)：

A)(保守区域II)：F¹⁰⁰⁹DGFRVDAADNIDADVLDQ¹⁰²⁷

B)(保守区域III)：H¹⁰⁴⁸L(S/V)YNEGYHSGAA¹⁰⁶⁰

C)(保守区域IV)：W¹¹¹⁸SFVTNHDQRKN(L/V)I¹¹³¹

D)(保守区域I)：G¹⁴⁷³LKVQED(I/L)VMNQ¹⁴⁸⁴

在一种实施方式中，所述酶是来自葡聚糖蔗糖酶组的GTFA成员，例如，来自罗伊氏乳杆菌121的GTFA(基因文库登陆号AX306822或AY697435(GTF序列+侧翼序列a.o.GTFB+转座酶)，其已经通过基因工程改造获得了实施本发明的方法所需的独特的“GTFB-类似”底物特异性和活性。因此，本发明也涉及属于含至少一个表1中突变的gtfA型葡聚糖蔗糖酶的基因修饰酶，所述酶能够断开(α1→4)糖苷键并生成新的(α1→4)和(α1→6)糖苷键，并且对含(α1→4)-连接的D-葡萄糖单元的多糖和/或低聚糖底物，特别是麦芽低聚糖，具有底物偏好。技术人员将理解，可将与表1中提到的那些等同的突变能够引入到来自其他有机体的GTFA酶同系物中。例如，来自罗伊氏乳杆菌180的GTF180、来自罗伊氏乳杆菌ML1的GTFML1、来自肠膜状明串珠菌B512-F的DSRS、来自变异链球菌GS-5的GTFD(参见van Hijum等，2006)。优选地，选自表1的多重突变被引入。在一种具体实施方式中，表1所示的所有位置被改变。

表1：用于在GTFA-类似(葡聚糖蔗糖酶)酶中引入GTFB-类似(α-葡聚糖转移酶)活性的突变

位置#	突变*	位置#	突变*
				981	L→V	1136	删除S
1026	P→A	1134-1136	NNS→QR
				1062	D→G	1137	Q→K
1063	W→Y	1414	N→L
				1064	N→H	1463	D→R、T或M
1062-1064	DWN→GYH	1510	W→I或L
				1134	N→Q	1512	P→M
1135	N→R	1513	D→N

#与罗伊氏乳杆菌121GTFA对应的编号

^*单字母氨基酸代码

还提供了能够断开(α1→4)糖苷键并生成新的(α1→4)和(α1→6)糖苷键、和/或转移生成新(α1→6)糖苷键的麦芽糖-、麦芽三糖-或麦芽四糖-单元的酶在生产淀粉衍生物，优选(部分)难消化淀粉衍生物的方法中的用途。在一种实施方式中，所述酶是GTFB型葡聚糖蔗糖酶，例如，选自表2或选自由来自罗伊氏乳杆菌121的GTFB、来自罗伊氏乳杆菌TMW 1.106的GTF106B、来自罗伊氏乳杆菌ML1的GTML4和来自罗伊氏乳杆菌DSM 20016^A的GTFDSM或来自发酵乳杆菌ATCC 14931的GTF构成的组，或者是它们的天然或人工同系物(突变体)。优选地，所述酶是选自罗伊氏乳杆菌121的GTFB。

本领域的技术人员能够通过常规实验确定实施本文中提供的方法的合适工艺条件，例如温度、培养时间、pH、酶的量，等等。能够使用的pH范围是4-5，优选4-4.5。在一种实施方式中，所使用的温度至少为30℃，优选37℃。在另一种实施方式中，例如考虑到底物的特性和/或无菌性，在更高的温度，如至少70℃，工作是理想的，只要所述酶是足够地热稳定即可。反应混合物的干物质含量可变化。在一种实施方式中，其为至少10％，优选至少25％。

各种低聚糖或葡聚糖底物或底物混合物能被用于根据本发明所述的方法中，只要它们包含非还原末端含有(α1→4)键合的葡萄糖残基的多糖和/或低聚糖。优选地，所述非还原末端含有3个或更多个连续(α1→4)-键合的葡萄糖残基。线性底物是优选的。因此，还提供了生产具有一个或多个(α1→6)糖苷键和一个或多个(α1→4)糖苷键的线性葡萄糖-低聚糖混合物的方法，包括，例如通过培养，使在非还原末端含有至少两个(α1→4)-键合的D-葡萄糖单元的线性多糖和/或低聚糖底物与能够断开(α1→4)糖苷键并生成新的(α1→4)和(α1→6)糖苷键的α-葡聚糖转移酶接触。

当底物具有至少为4，优选至少为5，更优选至少为6的聚合度时，观察到非常好的结果。例如，底物选自由天然淀粉、变性淀粉、淀粉衍生物、麦芽低聚糖、直链淀粉、支链淀粉、麦芽糊精、(α1→4)葡聚糖、reuteran、或它们的组合构成的组。本文中使用的术语“淀粉衍生物”是指通过物理和/或(生物)化学的方法已经经过一次或多次修饰的天然淀粉的产物。修饰包括解聚、交联和取代。所述淀粉或淀粉衍生物能够来源于各种植物来源，包括马铃薯、玉米、木薯或小麦。一些其他原材料包括：大米、树薯、竹芋、绿豆、豌豆、大麦、燕麦、荞麦、香蕉、高粱和小扁豆。源自马铃薯、玉米、木薯或小麦的淀粉(衍生物)是优选的。

在一个具体的方面，本发明的方法利用麦芽糖转葡糖基酶(淀粉麦芽糖酶，AMase)处理的淀粉(ATS)，优选马铃薯淀粉作为底物。ATS可从AVEBE(Veendam The Netherlands)购买到，商品名称为Etenia^TM。一个进一步的具体实施方式使用reuteran作为底物，它是reuteran蔗糖酶(reuteransucrase)活性的α-葡聚糖产物并包含(α1→4)和(α1→6)键。reuteran和麦芽低聚糖(MOS)的混合物也产生非常好的结果。还提供了用降解α，1-4-O-糖苷键的水解酶，例如α-淀粉酶、β-淀粉酶、α-葡糖苷酶或麦芽糖淀粉酶，对用GTFB或GTFB-相关酶培养淀粉、淀粉衍生物、麦芽糊精或麦芽低聚糖而获得的产物的处理。这提供了一种缓慢或难消化的低聚糖/纤维。

如下文举例说明的，上文所述的本发明的一种方法将典型地产生多种具有一个或多个连续(α1→6)糖苷键和一个或多个，优选两个或多个连续(α1→4)糖苷键的线性葡萄糖-低聚糖的混合物。对于很多工业(例如，营养)应用，所述混合物能够基本上像这样被使用且不需要进一步纯化。然而，如果需要的话，当然也可以从混合物中分离或去除一种或多种单独的葡萄糖-低聚糖。为了达到那个目的，能够使用本领域中已知的各种方法，例如，沉淀分级或色谱技术。在一种实施方式中，本发明的一种方法包括使混合物经历体积排阻和/或阴离子交换色谱，且分离至少一种具有一个或多个(α1→6)糖苷键和一个或多个，优选两个或多个(α1→4)糖苷键的葡萄糖-低聚糖。

正如所说，在本文中公开的酶的活性能够产生一种具有唯一结构的低聚糖。提供了通式A-B的线性(也就是不分支的)葡萄糖-低聚糖，包含这种线性部分的葡聚糖或包含不同葡萄糖-低聚糖/通式A-B的部分的混合物，其中部分A和部分B之间的连接是(α1→6)糖苷键且其中B包含至少两个，优选至少三个连续的(α1→4)连接葡萄糖残基。优选地，只有(α1→6)和(α1→4)糖苷键存在。通式A-B的线性基团能够被连接于任何类型的葡聚糖(它是分支的或不分支的)，例如蜡质支链淀粉(waxyamylopectin)。

在一种实施方式中，通式A-B的线性(也就是不分支的)葡萄糖-低聚糖，或包含通式A-B的不同葡萄糖-低聚糖的混合物，特征在于(i)部分A与部分B之间的连接是(α1→6)糖苷键，(ii)部分A包含两个或多个连续(α1→6)糖苷键，优选其中A包含具有聚合度至少为4的葡萄糖残基的异麦芽低聚糖，以及(iii)B包含至少两个，优选至少三个连续的(α1→4)连接葡萄糖残基。例如，所述A部分由一系列连续的(α1→6)连接葡萄糖残基组成且B部分由一系列连续的(α1→4)连接葡萄糖残基组成。

在另一种实施方式中，所述A部分包含一个或多个连续(α1→4)糖苷键，优选地，其中A包含具有至少四个(α1→4)连接的葡萄糖残基的麦芽低聚糖。因此，一段(α1→4)键合的残基能够通过(α1→6)键被连接于另一段(α1→4)键合的残基。

提供了不同链长度的低聚糖。在一种实施方式中，所述葡萄糖-低聚糖(部分)具有至少为7(DP≥7)，优选至少为10(DP≥10)，更优选至少为15，高达约50的聚合度(DP)。根据MALDI-TOF-MS分析，已经观察到长度超过30个残基的低聚糖。典型地，混合物中高分子质量产物DP10-DP35的相对量低于DP＜10的产物的量。典型的混合物具有至少为5，优选至少为6，例如在6到15之间的平均聚合度。

当使用麦芽低聚糖(例如，DP7或DP6)作为底物时，生成一系列线性葡萄糖-低聚糖，且通常观察到给定DP的不同结构。例如，鉴别出至少4个DP8结构，它们的(α1→6)糖苷键和(α1→4)糖苷键的数目彼此不同。见图6。通常说来，(α1→6)糖苷键与(α1→4)糖苷键的比值和结构的多样性随着链长度的增加而增加。

在一个方面，至少20％，优选至少25％的键是(α1→6)。(α1→6)糖苷键和(α1→4)糖苷键之间的比值范围通常在20∶80到90∶10之间。例如，提供了具有两个连续(α1→6)键和四个连续(α1→4)键的线性DP7产物；具有两个连续(α1→6)键和五个连续(α1→4)键的线性DP8产物；或具有三个连续(α1→6)键和四个连续(α1→4)键的DP8；具有五个连续(α1→6)键和三个连续(α1→4)键的DP9；具有四个连续(α1→6)键和四个连续(α1→4)键的DP9；具有五个连续(α1→6)键和四个连续(α1→4)键的DP10(见图6)。

对于作为提供给消费者益生元纤维以及能量来源的营养成分的应用，所述低聚糖(混合物)优选包含大量的(α1→6)糖苷键和(α1→4)糖苷键。因此，在一种实施方式中，(α1→6)糖苷键和(α1→4)糖苷键之间的比值是30∶70到70∶30之间。

根据本发明所述的葡萄糖-低聚糖或葡萄糖-低聚糖混合物具有重要的工业应用，特别是在营养和膳食组合物中。提供了包含根据本发明所述的葡萄糖-低聚糖或葡萄糖-低聚糖(混合物)的(人类或动物)食品产品。所述食品产品可以是固体、半固体或液体食品产品。所述食品产品可以是常规营养产品或饮食产品。它可以是即食食品或在消费之前需要进一步处理的食品产品，如面包房的面包产品。典型的产品包括乳制品、婴幼儿配方食品、烘焙食品、面食产品、面条产品、糖果产品(confectionery product)、液体饮料、运动饮料、饮料和冰淇淋。

进一步的实施例涉及根据本发明所述的葡萄糖-低聚糖或葡萄糖-低聚糖混合物作为食品添加剂，例如作为益生元纤维的用途。益生元能够被用于多种食品应用中，从乳制品到烘焙食品、糖果和饮料应用。由于它们的化学和物理结构，它们趋于具有高溶解度且具有改善机体、质地和口感的能力。

另一个有用的应用涉及抑制α-淀粉酶类型的酶，例如唾液和胰淀粉酶。这些酶通常作用于具有范围从4-6的DP的(α1→4)麦芽低聚糖链。假定本发明的低聚糖中(不可水解的)(α1→6)键的存在只引起酶结合但不引起葡萄糖释放。这种低聚糖的添加将会降低代谢(例如淀粉代谢)速率，从而降低食品产品的升糖指数(GI)。根据本发明所述的葡萄糖-低聚糖(混合物)因此也能够有助于降低食品产品的热值和/或血糖负荷。因此，它有助于低GI饮食。在普通的以及特殊的代谢疾病中，包括糖尿病和肥胖症，这对于人类健康特别有利。

在进一步的实施方式中，所述葡萄糖-低聚糖(混合物)也用于治疗或化妆品应用中，特别是控制正常皮肤菌群和促进健康的皮肤。所述低聚糖能够带来益生元效果，因为它能够优选地被腐生菌选择性地利用。例如，与不太理想的细菌，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和干燥棒状杆菌(Corynebacterium xerosis)的生长相比，所述低聚糖能够促进有益皮肤细菌(例如，克氏微球菌(Micrococcus kristinae))的生长。提供了包含根据本发明所述的葡萄糖-低聚糖或葡萄糖-低聚糖混合物以及合适载体的化妆品组合物。也可以在个人护理用品中使用所述葡萄糖-低聚糖(混合物)，例如，包括诸如尿布、卫生巾等吸水物品，当这种吸水物品被使用时，它们能够减少所产生的气味和皮肤炎(皮疹)。

附图说明

图1.(A)(推定的)α-葡聚糖转移酶，(B)DSRE和DSRP，含有两个催化结构域(CD1和CD2)的葡聚糖蔗糖酶，和(C)乳酸菌的葡聚糖蔗糖酶、变聚糖蔗糖酶(mutansucrase)、交替糖蔗糖酶(交替蔗糖酶，alternansucrase)和reuteran蔗糖酶(reuteransucrase)的催化结构域中的保守区域(II、III、IV和I)的氨基酸序列比对[http://www.cazy.org]。对葡聚糖蔗糖酶中-1和+1子位点具有重要贡献的七个严格保守的氨基酸残基(1-7)在α-葡聚糖转移酶中也是保守的(如罗伊氏乳杆菌121的GTFA和GTFB中加下划线和加灰色阴影示出的)。氨基酸编号(斜体)是根据罗伊氏乳杆菌180的GTF180的。GTFB氨基酸D1015(推定的亲核体残基)用粗体表示。

图2.来源于对可从Pfam数据库中获得的所有108种糖苷水解酶家族的70个蛋白质序列进行系统发生分析的GTFB-样蛋白质的系统发育树。该集群中序列的更多细节参见上面表2。

图3.90nM GTFB在pH为4.7的50mM NaAc缓冲液，含有25mM蔗糖或25mM麦芽低聚糖的1mM CaCl₂中培养13h的反应产物的TLC分析。St＝标样，Suc，蔗糖；G1，葡萄糖；G2，麦芽糖；G3，麦芽三糖；G4，麦芽四糖；G5，麦芽五糖；G6，麦芽六糖；G7，麦芽七糖；Pol，多聚物。

图4.90nM GTFB在pH为4.7的50mM NaAc缓冲液，含有A)25mM麦芽六糖或B)25mM麦芽七糖的1mM CaCl₂中培养0、1、2或8h的反应产物的戴安分析(Dionex analysis)。

图5.在pH为4.7的25mM NaAc，以0.25％直链淀粉-V(缩写为AMV)单独作为供体底物且以含25mM葡萄糖(G1)或25mM麦芽糖(G2)的直链淀粉-V作为受体底物的1mM CaCl₂中于37℃过夜培养的没有酶(组A)或有90nM GTFB(组B)的培养底物样品的戴安分析。

图6.各种α-葡聚糖在具有GTFB(-样)活性的麦芽-低聚糖DP7的培养产物混合物中的示意图。

图7.具有GTFB(250mM)的麦芽低聚糖DP7(100mM)培养120h后的产物混合物的¹H NMR谱。

图8.GTFB的可能作用机制。在GTFB类型酶的活性位点发生的反应序列的示意图。GTFB类型酶的供体和(受体)子位点基于葡聚糖蔗糖酶(具有一个供体(-1)子位点)的可获得的3D结构信息和本研究中获得的数据而被标出。G7向子位点-1以及+1向+6的结合引起α-1，4糖苷键的断裂(G6被释放，灰色部分所示)，和(推定的)共价中间体在子位点-1(用灰色线标出)处形成。取决于所使用的受体底物，(与水)发生水解作用或与低聚糖受体发生糖基转移(见下文)。所述罗伊氏乳杆菌121GTFB酶也催化与麦芽低聚糖的歧化反应。例如，两个麦芽七糖(G7)分子被转化为一个G6分子和一种含有8个葡萄糖残基但在非还原末端有一个新合成的α-1，6糖苷键的G8产物。

具体实施方式

简介

乳酸菌(LAB)的葡聚糖蔗糖酶(GS)(或葡糖基转移酶；GTF)酶(EC 2.4.1.5)利用蔗糖合成多种多样的具有(α1→6)[葡聚糖，主要见于明串珠菌属]、(α1→3)[变聚糖(mutan)，主要见于链球菌属]、交替的(α1→3)和(α1→6)[交替糖(alternan)，仅在肠膜状明串珠菌中有报道]、(α1→4)[reuteran，由来自罗伊氏乳杆菌菌株的GTFA和GTFO催化]糖苷键的α-葡聚糖{Monchois，1999；van Hijum，2006；Arguello-Morales，2000；Kralj，2002；Kralj，2005}。

罗伊氏乳杆菌121利用葡聚糖蔗糖酶GTFA和蔗糖作为底物合成具有大量(α1→4)糖苷键的reuteran产物。该gtfA基因的上游另一个推定的葡聚糖蔗糖酶基因被鉴定为指定的gtfB。以前，已表明在该基因的克隆和表达之后，所示出的酶对作为底物的蔗糖无活性。同样，在罗伊氏乳杆菌ML1的基因组中，gtfB同系物，gtfML4的推定的催化和C-末端区域被鉴定为编码变聚糖蔗糖酶(mutansucrase)的gtfML1的上游{Kralj，2004}。在罗伊氏乳杆菌DSM 20016最近阐明的基因组序列中，也鉴定出了GTFB同系物(883个氨基酸序列中73％同一性85％相似性)。此外，除了GTFA同系物(GTFA106)之外，罗伊氏乳杆菌TMW1.106还含有GTFB同系物(GTFB106)。该酶在1383个氨基酸中显示出与来自罗伊氏乳杆菌121的GTFB具有92％同一性和95％相似性。然而，与GTFB相反，GTF106B对蔗糖显示出低(培养27h后)水解活性{Kaditzky，2008}。

本文中示出GTFB对麦芽低聚糖具有歧化类型和聚合类型的活性。所述酶利用麦芽低聚糖(只含有(α1→4)糖苷键)作为底物合成聚合度(DP)高达35的低聚物。在延伸/聚合过程中，大量(α1→6)糖苷键(～32％)被引入到终产物中。此外，我们示出了伴随大分子直链淀粉底物(直链淀粉-V)作为供体且较小分子的糖(葡萄糖、麦芽糖)作为受体，也合成了通过(α1→4)糖苷键而连接的较大分子的糖，其含有超过五个葡萄糖单元。通过甲基化分析和¹H NMR对麦芽七糖合成的产物所作的详细分析显示，高达32％(α1→6)糖苷键被引入到终产物中。虽然GTFB的一级结构与GH 70酶相似，包括互换的(β/α)₈筒，但它的活性更类似于利用麦芽低聚糖作为优选底物的GH 13α-淀粉酶型的酶。

材料与方法

菌株、质粒、培养基和生长条件。大肠杆菌TOP 10(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)被用作克隆目的的宿主。质粒pET15b(Novagen，Madison，WI)被用于大肠杆菌BL21Star(DE3)(Invitrogen)中(突变体)gtfB基因的表达。大肠杆菌菌株在有氧条件下37℃在LB培养基中生长{Ausubel，1987}。含有重组质粒的大肠杆菌菌株在添加了100μg ml^-1氨苄青霉素的LB培养基中培养。通过向LB培养基中添加1.5％琼脂，制备琼脂平板。

来自罗伊氏乳杆菌的GTFB的氨基酸序列比对。利用具有开放空位和10和0.2扩展罚分的MEGA版本4中的ClustalW interface(www.megasoftware.net)分别进行GTFB和已知葡聚糖蔗糖酶以及来自乳酸菌的推定的α-葡聚糖转移酶的多种氨基酸序列比对。

分子技术。基因克隆的一般步骤，大肠杆菌DNA的转化、DNA的操作、和琼脂糖凝胶电泳如所述{Sambrook，1989}。限制性核酸内切酶消化以及与T4DNA连接酶的连接按照酶供应商推荐的方法完成(NewEngland Biolabs，Beverly，MA；Roche Biochemicals，巴塞尔，瑞士)。引物从比利时的Eurogentec，Seraing获得。使用GATC(Konstanz，德国)完成测序。DNA通过PCR在DNA热循环仪PTC-200(MJ Research，Waltham，Massachusetts)中使用Pwo DNA聚合酶(Roche Biochemicals)或延伸高保真聚合酶(Expand High Fidelity polymerase)(Fermentas)被扩增。利用Wizard Plus SV质粒提取试剂盒(Sigma)分离大肠杆菌的质粒DNA。

质粒的构建。使用合适的引物对和模板DNA来构建两个不同的C-末端His-标签表达构建体：对于完整的GTFB(1587个氨基酸)，使用前文中对来自罗伊氏乳杆菌121的GTFA所描述的方法利用三个独立的PCR反应构建(见下文){Kralj，2002}，和GTFB的N-末端截断的突变体(没有N-末端)可变区域(889个氨基酸)。

为了有利于进一步突变和核苷酸测序，gtfB在三个部分被分开和克隆。两个PstI限制性位点(1385bp，1751bp)中的第一个被改变，使用大引物方法(megaprimer method){Sarkar，1990}和以下引物：BpstI正向5’-GTAAGTCGTTACTC

GCAGATGCTAATGG-3’，含有突变的PstI限制位点(加下划线的，通过如黑体所示碱基的改变而发生沉默突变)，以及，BpstI反向5’-GGTCAGTAAATCCACCGTTATTAATTGG-3’。在随后的PCR反应中，扩增的产物(420bp)与含有SalI(斜体)和NcoI(粗体)限制位点的B正向：5’-GCAATT

ATACAAATACTGGTGATCAGCAAACTGAACA-GG-3’一起被用作(反向)引物。生成的1700bp产物被SalI和PstI消化，在pBluescript II SK⁺相应的位点被结合，生成pBSP1600。扩增的420bp产物与BrevBamHI5’-GGACTGTTATCACTATTATTATTTCCGGCC-3’、BamHI限制位点的下游70bp也一起被用作正向引物。生产的(～1500bp)产物被PstI和BamHI消化，且在pBluescript II SK⁺相应的位点被结合，生成pBPB1000。使用引物BforBamHI 5’-CGCTATGTAATTGAACAGAGTATTGCTGC-3’、BamHI限制位点的下游200bp、和含XbaI(斜体)与BglI(粗体)及6×组氨酸标记(下划线)的BRevHis5’-CCTCCTT

ATTAGTGATGGTGATGGTGATGGTTGTTAAAGTTTAATGAAATTGCAGTTGG-3’获得第三个片段。生成的2300bp产物被BamHI和XbaI消化，且在pBluescript II SK+相应的位点被结合，生成pBBX2300。完整的基因按如下被组装：pBPB1000被PstI和BamHI消化，且生成的片段被连接到生成pBSB2600(含第一个和第二个片段)的相同限制酶所限制的pBSP1600上。随后，质粒pBBX2300被BamHI和SacII(存在于质粒上，代替XbaI被使用)消化，且片段被连接到生成含全长gtfB基因的pBSS4900的pBSB2600上。该质粒被NcoI和BglII消化，且gtfB基因被连接到pET15b的NcoI和BamHI位点，生成pET15B-GTFB。

GTFB的表达和纯化。含(突变)GTFB的大肠杆菌BL21star(DE3)的过夜培养物{Kralj，2004}被稀释1/100。细胞生长至OD₆₀₀为0.4并被0.2mM IPTG诱变，生长4h后，通过离心收获细胞(10min，在4℃，10,000×g)。通过声裂法提取蛋白并用Ni-NTA和阴离子交换层析法纯化，如前文中对来自罗伊氏乳杆菌121的GTFA所描述的{Kralj，2004}，做了以下修改：对于阴离子交换层析法纯化，使用1ml Hi-trap^TM Q HP柱(GeHealthcare)。

(i)最适pH和温度。通过用TLC定性测定由过夜培养后的25mM麦芽四糖合成的多聚-和低聚糖的量来确定最适pH和温度(数据未示出)。

(ii)由麦芽低聚糖和其他糖类合成的产物。单底物培养90nM GTFB和25mM蔗糖(Acros)、棉籽糖(Sigma)、帕拉金糖(Sigma)、潘糖(Sigma)、0.25％直链淀粉-V(Avebe，Foxhol，荷兰)、0.25％支链淀粉、25mM异麦芽五糖、异麦芽六糖(Sigma)、不同聚合度的麦芽低聚糖(G2-G7)在pH为4.7的25mM NaAc 1mM CaCl₂中于37℃分别过夜培养并用TLC分析。由G6和G7合成的产物随时间的推移用TLC和HPAEC分析。受体/供体研究。90nM GTFB和25mM不同聚合度的葡萄糖和麦芽低聚糖(G2-G7)与0.25％直链淀粉-V一起在pH为4.7的25mM NaAc 1mM CaCl₂中于37℃过夜培养并用TLC分析。

(i)由G7生成的低聚糖和多聚糖的特征。纯化的GTFB酶制剂(90nM)与150mM G7(Sigma)一起培养7天，使用如上所述酶检测的条件。由纯化的重组GTFB生成的低聚糖和多糖用96％乙醇沉淀分离(绝大多数较大分子的糖产物沉淀出来){van Geel-Schutten，1999}。

(ii)甲基化分析。低聚糖和多糖用甲基碘和二甲基亚砜钠盐(dimesylsodium)(CH₃SOCH₂ ^--Na⁺)在DMSO中室温下被预甲基化。

结果

GTFB的比对

GTFB是在不同乳酸杆菌中鉴定的一组同系物酶中的首要代表。这组新颖的酶中的成员与其他葡聚糖蔗糖酶的对比显示出相似性，但也有一些特征的差异。存在于葡聚糖蔗糖酶中的三个催化残基(在全文中使用GTFA罗伊氏乳杆菌121编号D1024、E1061和D1133，除非另有说明)也存在于α-葡聚糖转移酶的组(罗伊氏乳杆菌121编号D1015、E1053和D1125GTFB)中。然而，大量在葡聚糖蔗糖酶区域I、II、III和IV中保守的氨基酸残基在α-葡聚糖转移酶组中是缺失的(图1)。在区域II(包含推定的亲核性残基)中，保守的V1025(GTFA和GTFO中的Pro)在α-葡聚糖转移酶中被丙氨酸所取代。区域III，推定的酸/碱催化剂E1061的下游区域，在葡聚糖蔗糖酶和α-葡聚糖转移酶中是完全不同的。

然而，大量在葡聚糖蔗糖酶区域I、II、III和IV中保守的氨基酸残基在α-葡聚糖转移酶组中是缺失的(图1)。在区域II(包含推定的亲核性残基)中，保守的P1025(GTFA和GTFO中的Pro，在大多数GTF中的Val)在α-葡聚糖转移酶中被丙氨酸所取代。区域III，推定的酸/碱催化剂E1061的下游区域，在葡聚糖蔗糖酶和α-葡聚糖转移酶中是完全不同的。保守的色氨酸1063在α-葡聚糖转移酶中被酪氨酸残基所取代(图1)。在区域IV中，所述GTFB同系物在Q1137残基位置的上游紧挨着含有一个间隙，并且在保守的谷氨酰胺位置处存在一个赖氨酸残基。

GTFB同系物

基因和蛋白质序列数据库查询显示出几个可能与GTFB具有相同催化活性的序列。所述信息基于所有糖苷水解酶家族70个成员的系统发育树(2010年4月27日，Pfam数据库提供的108个序列)。所述系统发育树也是从Pfam服务器获得，见图2。

表2.来自Pfam数据库(http://pfam.sanger.ac.uk)与GTFB有明显相似性的糖苷水解酶家族70个序列，从比对和系统发育树来看是显而易见的。请注意9号是GTFB，并且编号按图2系统发育树中所示的顺序。

	UniProt登入	微生物
			1	B1YMN61	sibiricum微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)255-15
2	C0X0D3	发酵乳杆菌ATCC 14931
			3	C2F8B9	罗伊氏乳杆菌MM4-1
4	C0YXW9	罗伊氏乳杆菌MM2-3
			5	A5VL73	罗伊氏乳杆菌DSM 20016
6	B2G8K2	罗伊氏乳杆菌JCM 1112
			7	B7U9D3	融合乳杆菌MBF8-1
8	A9Q0J0	罗伊氏乳杆菌TMW1.106
			9	Q5SBM0	GTFB(罗伊氏乳杆菌121)
10	Q5SBN1	罗伊氏乳杆菌ML1
			11	Q9R4L72	肠膜明串珠菌
12	B1YMN61	sibiricum微小杆菌255-15

¹该序列在表中列出两次，是因为该序列的两个片段在发育树中。

²11号的表观序列相似性仅基于20个氨基酸。该序列因而被忽略。

所述9个GTFB-类似序列中，来自罗伊氏乳杆菌DSM 20016(表中5号)的推定的葡聚糖蔗糖酶在大肠杆菌中被克隆并表达。重组蛋白通过亲和层析与阴离子交换层析相结合而被纯化。当与麦芽低聚糖培养时，纯化的蛋白显示出GTFB-类似的活性。来自罗伊氏乳杆菌DSM 20016的推定的葡聚糖蔗糖酶对蔗糖显示无活性，替代地，它利用麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖作为底物，生成一系列较短和较长的产物。所述产物的质子-NMR(核磁共振)分析证实引入了α-1，6-糖苷键，也见于对GTFB的培养。此外，来自罗伊氏乳杆菌DSM 20016的推定的葡聚糖蔗糖酶也增加了Sigma-Aldrich的可溶性马铃薯淀粉中α-1，6-糖苷键的百分比。

GTFB的克隆和表达

GTFB的全长、N-末端截断片段和推定的亲核突变被成功构建和表达。全长以及N-末端截断突变体都显示出对麦芽低聚糖明显的活性，如通过TLC测量的(数据未示出)。构建的截断GTFB片段(GTFB-ΔN)没有如全长GTFB那样高效地被表达，并且因此，所有试验使用全长GTFB进行。为了排除来自大肠杆菌本身的任何本底活性，空白pET15b质粒被纯化，并且在His-tag纯化之后没有检测到对麦芽低聚糖(G2-G7)的活性(数据未示出)。此外，纯化的全长D1015N(推定的)亲核突变体对麦芽低聚糖显示无活性(G2-G7；数据未示出)。

酶的特性

以麦芽四糖为底物的GTFB的最佳活性如TLC定性测定的是在温度为30-37℃且pH为4-5时(数据未示出)。不同温度和pH缓冲液的组合表明最佳活性在温度为30-37℃且pH为4-5时，这被用于所有随后的分析中。

供体底物

因为已显示GTFB不能利用蔗糖作为供体底物{Kralj，2004}，因而测试了不同的蔗糖类似物(松二糖、帕拉金糖)和棉籽糖的活性。我们不能检测到对这些底物中任何一种的活性(数据未示出)。对于异麦芽低聚糖(IG5和IG6)底物的活性也没有被观测到(数据未示出)。也没有检测到对源自部分纯化的reuteran(GTFA)水解产物或潘糖的低聚糖的活性(数据未示出)。然而，在短时间培养后已观察到对线性麦芽低聚糖明显的活性。尤其是对于具有4和更大聚合度的麦芽低聚糖，合成了不同低聚糖(图3)。从6和更大的DP开始，除了低聚糖，更大的聚合材料也开始积累。观察到对于直链淀粉-V(Avebe，Foxhol，荷兰)也有低活性(主要是G1和G2释放)(图5)。对于单独的麦芽糖，事实上并没有观察到活性。然而，当直链淀粉-V与葡萄糖或麦芽糖同时培养时，合成了一系列低聚糖(图5)。与单独培养直链淀粉-V相比，用直链淀粉-V作供体且葡萄糖做受体，合成了更多数量的麦芽糖，显示出(α1→4)合成能力。对于单独的麦芽糖，事实上并没有释放出G3。直链淀粉-V与作为受体的麦芽糖培养明显地产生潘糖和G3，表明了GTFB对潘糖的能力(表明(α1→6)合成能力)，也合成了麦芽三糖，证实了该酶合成(α1→4)糖苷键的能力。

随时间的推移对G6和G7的产物特征描述

在G6中可检测到的第一个反应产物是G1(葡萄糖)和G5(麦芽五糖)(图4)。同样在G7中释放的第一个产物是G1(葡萄糖)和G6(麦芽六糖)。后来随时间的推移在G6中也有诸如G2、G3和G4的其他麦芽低聚糖出现。同样在G7和G8之后的未知的糖被识别，它们除了(α1→4)糖苷键之外还必须含有在它们的保留时间内发生的变化所表示的其他连接。

在麦芽七糖与GTFB培养120h后，总产物混合物的1D¹H-NMR谱通过在δ_H-1～4.96广泛的信号表明新形成(α1→6)键的存在。(α1→4)信号在δ_H-1～5.39存在。在培养120h后，产物混合物中(α1→4)∶(α1→6)比值是67∶33。产物混合物的MALDI-TOF MS分析显示存在范围从DP2到DP35的化合物(m/z 365-m/z 5711，[M+Na]⁺)。

在MOS DP7与重组GFTB培养获得的反应混合物中，十七种不同的结构(图6)，范围从DP2-DP10，可通过NMR(核磁共振)波谱法被详细说明。被说明的结构仅构成形成的化合物总数的一部分。存在更多高分子质量产物，包括多糖类。很明显比DP7小的低聚糖一定是源于GTFB对底物[仅含有(α1→4)的产物]的水解活性以及对形成的低聚糖[含有(α1→4)和(α1→6)的产物]的水解活性。应注意的是，没有发现具有6-取代还原末端葡萄糖残基的结构。直到现在，仅发现了一种具有通过连续(α1→4)-键合葡萄糖残基延伸而成的(α1→6)-键合葡萄糖残基的结构(DP8)。在其他情况下，仅发生(连续)(α1→6)延伸。所有低聚糖在还原末端具有4-取代葡萄糖残基。然而，在总产物混合物的1D¹H-NMR谱(图7)中，发现了微量的末端还原-(1→)-D-葡萄糖单元(H-1α在δ5.240和H-1β在δ4.669)，但在被说明的结构中没有发现该单元。

因此，重组GTFB仅催化(α1→4)键合的断裂且引起新(α1→4)和(α1→6)键的形成。很多产物以这种方式形成，范围从单糖到多糖(DP＞30)。对于单一-分子-质量的产物，不同的结构是可能的，正如形成的DP7和DP8-低聚糖(-糖醇)清楚显示的那样。此外，观察到(α1→6)键的数量与(α1→4)键相比随链长度的增加而增加，至最大值50∶50。没有4，6-或其他类型的分支点被引入。重组GTFB酶对游离的麦芽低聚糖以及对它们的还原形式(麦芽-低聚糖-糖醇)显示出相似的活性的事实证实了非还原末端延伸机制。

能够从上面的结果中得到以下重要结论：

-没有发现具有6-取代还原末端葡萄糖残基的结构；

-GTFB仅催化(α1→4)键合的断裂且引起新(α1→4)和(α1→6)键的形成；

-(α1→6)键的数量与(α1→4)键相比随链长度的增加而增加，至最大值50∶50；

-没有4，6-或其他类型的分支点被引入；

-GTFB具有非还原末端延伸机制。

通过蛋白质工程将GTFB类似活性引入到GTFA中

以前的蛋白质工程研究已经证实，位于保守序列区域III和IV(序列比对见图1)的氨基酸残基就形成的葡萄糖苷键类型而言控制GTF酶的产物特异性。区域I和区域II也含有有助于酶活性和反应特异性的氨基酸残基。该保守序列区域的氨基酸残基形成GTF酶的部分受体底物结合区域。在利用蔗糖作为底物的聚合反应中，这些残基与蔗糖的葡萄糖(子位点-1)和果糖(子位点+1)部分相互作用。由于GTFB利用麦芽七糖(和其他麦芽-低聚糖)作为底物，葡萄糖部分将作用在GTFB酶中的受体子位点处。与传统的GTF相比，GTFB的独特底物特异性更有可能是通过在受体子位点处的差异来确定的。因此，为了在传统的GTFA酶中引入GTFB-类似活性，设想在位于区域I、II、III和IV的受体子位点处取代残基从而与GTFB酶的序列类似。

此外，GTF180的3D结构(Vujicic，格罗宁根大学(University ofGroningen)博士论文)显示了一些作用在对GTF反应特异性的互变作用可能很重要的子位点-1和+1的其他残基。981L→V突变是基于在GTF180的3D结构中可见的反应，其中Leu 981与蔗糖的果糖部分发生范德华相互作用。在GTFB以及其他α-葡聚糖转移酶GTFDSM、GTF106B、GTFML4中，这个位置被缬氨酸残基占据。1463D→R、T或M突变的目的在于取代天冬氨酸残基，该天冬氨酸残基在葡聚糖蔗糖酶中是高度保守的，但在GTFB及相关的酶中却不是，并且在GTF 1803D结构的子位点-1处与葡萄糖部分相互作用。

另外，所述突变可以以任何方式被结合以便在改变GTF酶反应特异性中获得更强效果。建议的突变如下：

区域I

位置W1510：W→I/L

位置P1512：P→

位置D1513：D→N

区域II

位置1026：P→A

区域III

位置1062：D→G

位置1063：W→Y

位置1064：N→H

位置1062-1064DWN→GYH

区域IV

位置1134：N→Q

位置1135：N→R

位置1136：S→删除这个残基

位置1134-1136：NNS→QR

位置1137：Q→K

3D结构

位置981：L→V

位置1414：N→L

位置1463：D→R、T或M

参考文献

Arguello-Morales MA，Remaud-Simeon M，Pizzut S，Sarcabal P&Monsan P(2000)FEMSMicrobiol.Lett.182，81-85.

Ausubel，F.M.，Brent，R.E.，Kingston，D.D.，Moore，J.G.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，&Struhl，K.(1987)Current protocols in molecular biology.John Wiley&Sons，Inc，New York.

Barends TR，Bultema JB，Kaper T，van der Maarel MJ，Dijkhuizen L&Dijkstra BW(2007)J.Biol.Chem.282，17242-17249.

Fabre E，Bozonnet S，Arcache A，Willemot RM，Vignon M，Monsan P&Remaud-SimeonM(2005)J.Bacteriol.187，296-303.

van Geel-Schutten GH，Faber EJ，Smit E，Bonting K，Smith MR，Ten Brink B，Kamerling JP，Vliegenthart JF&Dijkhuizen L(1999)Appl.Environ.Microbiol.65，3008-3014.

Hard K，Van ZG，Moonen P，Kamerling JP&Vliegenthart FG(1992).Eur.J.Biochem.209，895-915.

Hondoh H，Kuriki T&Matsuura Y(2003)J.Mol.Biol.326，177-188.

van Hijum SA，Kralj S，Ozimek LK，Dijkhuizen L&van Geel-Schutten IG(2006).Microbiol.Mol.Biol.Rev.70，157-176.

Kaditzky，S.，Behr，J.，Stocker，A.，Kaden，P.，&Vogel，R.F.Food Biotechnol.22[4]，398-418.2008.

Kamerling，J.P.&Vliegenthart，J.F.(1989)Mass Spectrometry.In Clinical Biochemistry-Principles，Methods，Applications.(Lawson，A.M.，ed)，pp.176-263.Walter de Gruyter，Berlin.

Kelly RM，Dijkhuizen L&Leemhuis H(2009).J.Biotechnol.140，184-193

Kralj S，van Geel-Schutten GH，Rahaoui H，Leer RJ，Faber EJ，van der Maarel MJ&Dijkhuizen L(2002)Appl.Environ.Microbiol.68，4283-4291.

Kralj S，van Geel-Schutten GH，van der Maarel MJ&Dijkhuizen L(2003).Biocatal.Biotransform.21，181-187.

Kralj S，van Geel-Schutten GH，Dondorff MM，Kirsanovs S，van der Maarel MJ&Dijkhuizen L(2004)Microbiology 150，3681-3690.

Kralj S，van Geel-Schutten GH，van der Maarel MJ&Dijkhuizen L(2004)Microbiology150，2099-2112.

Kralj S，Stripling E，Sanders P，van Geel-Schutten GH&Dijkhuizen L(2005).Appl.Environ.Microbiol.71，3942-3950.

van Leeuwen SS，Kralj S，van Geel-Schutten IH，Gerwig GJ，Dijkhuizen L&Kamerling JP(2008)Carbohydr.Res.343，1237-1250.

van Leeuwen SS，Kralj S，van Geel-Schutten IH，Gerwig GJ，Dijkhuizen L&Kamerling JP(2008)Carbohydr.Res.343，1251-1265.

van Leeuwen SS，Leeflang BR，Gerwig GJ&Kamerling JP(2008)Carbohydr.Res.343，1114-1119.

Linden A，Mayans O，Meyer-Klaucke W，Antranikian G&Wilmanns M(2003).J.Biol.Chem.278，9875-9884.

MacGregor EA，Jespersen HM&Svensson B(1996)FEBS Lett.378，263-266.

MacGregor EA，Janecek S&Svensson B(2001)Biochim.Biophys.Acta 1546，1-20.

Monchois V，Willemot RM&Monsan P(1999)FEMS Microbiol.Rev.23，131-151.

Moore AD，Bjorklund AK，Ekman D，Bornberg-Bauer E&Elofsson A(2008).TrendsBiochem.Sci.33，444-451.

Peisajovich SG，Rockah L&Tawfik DS(2006)Nat.Genet.38，168-174.

Pijning T，A，Kralj S，Eeuwema W，Dijkstra BW&Dijkhuizen L(2008).

Biocatal.Biotransform.26，12-17.

Przylas I，Tomoo K，Terada Y，Takaha T，Fujii K，Saenger W&Strater N(2000)J.Mol.Biol.296，873-886.

Rondeau-Mouro C，Veronese G&Buleon A(2006)Biomacromolecules.7，2455-2460.

Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，&Maniates，T.(1989)Molecular cloning：a laboratory manual，2edn.Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York.

Sarkar G&Sommer SS(1990).Biotechniques 8，404-407.

Stam MR，Danchin EG，Rancurel C，Coutinho PM&Henrissat B(2006)Protein Eng DesSel.19，555-562.

Tokuriki N&Tawfik DS(2009).Science.324，203-207.

Uitdehaag JC，Mosi R，Kalk KH，van der Veen BA，Dijkhuizen L，Withers SG&DijkstraBW(1999)Nat.Struct.Biol.6，432-436.

2007.University of Groningen.PhD Thesis/Dissertation.

Claims (20)

1.一种生产具有一个或多个连续(α1→6)糖苷键和一个或多个连续(α1→4)糖苷键的葡萄糖-低聚糖混合物的方法，包括使在其非还原末端包含至少两个α-1→4-键合的D-葡萄糖单元的多糖和/或低聚糖底物与能够断开(α1→4)糖苷键且生成新的(α1→4)和(α1→6)糖苷键的α-葡聚糖转移酶接触。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述α-葡聚糖转移酶没有引入(α1→6)分支点也没有引入(α1→2)或(α1→3)键。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述α-葡聚糖转移酶是GTFB类型的酶、或具有特定酶活性的其功能同系物。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述α-葡聚糖转移酶选自由来自罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)121的GTFB、来自罗伊氏乳杆菌TMW 1.106的GTF106B、来自罗伊氏乳杆菌ML1的GTML4、来自罗伊氏乳杆菌DSM 20016^A的GTFDSM和来自发酵乳杆菌ATCC 14931的GTF构成的组，或显示至少55％序列同一性的其同系物。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述底物的聚合度至少为4，优选至少为6。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述底物选自由淀粉、蜡质淀粉、高直链淀粉、它们的衍生物、麦芽低聚糖、直链淀粉、支链淀粉、麦芽糖糊精、(α1→4)葡聚糖、reuteran、或它们组合构成的组。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述淀粉、蜡质淀粉、高直链淀粉或淀粉衍生物来源于马铃薯、玉米、木薯、豌豆、绿豆、大米或小麦。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述淀粉衍生物通过用麦芽糖转葡糖基酶/4-α-葡聚糖转移酶或糖原-分支酶处理淀粉、蜡质淀粉或高直链淀粉而产生。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括从混合物中分离至少一种具有一个或多个连续(α1→6)糖苷键和一个或多个连续(α1→4)糖苷键的葡萄糖-低聚糖的步骤，优选使用沉淀-分级和/或色谱技术。

10.一种包含具有一个或多个连续(α1→6)糖苷键和一个或多个，优选两个或多个连续(α1→4)糖苷键的不同线性葡萄糖-低聚糖的混合物，其可通过根据权利要求1至8中任一项所述的方法获得。

11.一种分离的具有一个或多个连续(α1→6)糖苷键和一个或多个，优选两个或多个连续(α1→4)糖苷键的线性葡萄糖-低聚糖，其可根据权利要求9所述的方法获得。

12.一种通式为A-B的线性葡萄糖-低聚糖或葡萄糖-低聚糖部分，或一种包含通式为A-B的不同线性葡萄糖-低聚糖或葡萄糖-低聚糖部分的混合物，其中，A与B之间的键合是(α1→6)糖苷键并且其中B包含至少两个，优选至少三个，连续(α1→4)键合的葡萄糖残基。

13.根据权利要求12所述的葡萄糖-低聚糖或葡萄糖-低聚糖混合物，其中，(α1→6)糖苷键和(α1→4)糖苷键的比值范围为20∶80至90∶10，优选至少30∶70至70∶30。

14.根据权利要求12或13所述的葡萄糖-低聚糖或葡萄糖-低聚糖混合物，其中，A包含两个或多个连续(α1→6)糖苷键，优选地，其中A包含聚合度至少为4个葡萄糖残基的异麦芽低聚糖。

15.根据权利要求12或13所述的葡萄糖-低聚糖或葡萄糖-低聚糖混合物，其中，A包含一个或多个连续(α1→4)糖苷键，优选地，其中A包含聚合度至少为4个葡萄糖残基的麦芽低聚糖。

16.根据权利要求12至15中任一项所述的葡萄糖-低聚糖或葡萄糖-低聚糖混合物，其中，(平均)聚合度至少为7，优选至少为10，更优选至少为15。

17.包含根据权利要求10至16中任一项所述的葡萄糖-低聚糖或葡萄糖-低聚糖混合物的营养组合物或化妆品组合物，优选地，其中所述营养组合物选自由乳制品、婴幼儿配方食品、烘焙食品、糖果产品、压缩干粮、糖块、面食产品、面条产品、液体饮料、运动饮料、饮料和冰淇淋构成的组。

18.根据权利要求10至16中任一项所述的葡萄糖-低聚糖或葡萄糖-低聚糖混合物作为营养或化妆品添加剂，尤其是作为益生元纤维，的用途。

19.一种属于包含至少一种表1中突变的GTFA型葡聚糖蔗糖酶的基因工程修饰的酶，所述突变酶能够断开(α1→4)糖苷键并生成新的(α1→4)和(α1→6)糖苷键，并且对包含(α1→4)-键合的D-葡萄糖单元的多糖和/或低聚糖底物，尤其是麦芽低聚糖，具有底物偏好。

20.能够断开(α1→4)糖苷键并生成新的(α1→4)和(α1→6)糖苷键，和/或转变麦芽糖、麦芽三糖或麦芽四糖-单元生成新的(α1→6)糖苷键的酶在生产淀粉衍生物，优选(部分)难消化的淀粉衍生物的方法中的用途。

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