JP4893980B2 - 分岐澱粉とその製造方法並びに用途 - Google Patents

Description

本発明は、分岐澱粉とその製造方法並びに用途、詳細には、６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を有する分岐澱粉とその製造方法並びに用途に関する。

澱粉は、主として高等植物の種子や地下茎の細胞内に貯蔵されている高分子グルカンであり、一般に、アミロースとアミロペクチンの混合物である。アミロースは、グルコースがα−１，４結合で直鎖状に結合した構造を有するα−１，４グルカンである。一方、アミロペクチンは、α−１，４グルカンの直鎖のところどころで、通常、グルコース重合度６以上のα−１，４グルカンがα−１，６結合で分岐した構造を有している。澱粉は、その水分散液を加熱すると膨潤して粘稠な糊化澱粉となるものの、冷却して放置すると老化してゲル化を起こし易い性質を持っている。澱粉は、古くより糊化されて食用に供され、また、優れた加工性と安価であること、貯蔵性があることから、食品の主原料として利用され、さらに、増粘剤、保水剤、コロイド安定剤などとしても、食品の物性改良と品質保持の目的で広く利用されている。また、澱粉は液化されて、グルコース、異性化糖、マルトオリゴ糖、水飴などの原料として工業的に利用されている。しかしながら、糊化澱粉や液化澱粉は保存中に老化し、ゲル化を起こし易く、保水性が失われ硬くなって、食用に適さなくなったり、酵素作用を受け難くなるなどの欠点がある。

このような状況下、澱粉の構造を化学的に修飾し、その糊化澱粉に耐老化性を賦与する試みが多く行なわれており、具体的には、エステル化澱粉、エーテル化澱粉、酸化澱粉などの種々の修飾澱粉が挙げられる。しかしながら、修飾澱粉は、特殊な官能基等を付与することにより本来のグルコース構造が失われ、長期的使用において安全性が懸念されることから、好んで利用される状況にない。

また、澱粉を酵素的に改変し、老化抑制を図ろうとする提案も行われている。特許文献１には、澱粉液化液に、澱粉のα−１，４結合を切断し、転移反応によりα−１，６結合を合成する枝作り酵素（ブランチング酵素；ＥＣ ２．４．１．１８）、４−α−グルカノトランスフェラーゼ（Ｄ−酵素；ＥＣ ２．４．１．２５）又はＣＧＴａｓｅ（ＥＣ ２．４．１．１９）を作用させることにより、水溶性の大環状構造グルカンを形成させる方法が提案されている。しかしながら、この大環状構造グルカンは、環状構造の形成と共に分子量が大幅に低下し、粘度が低下することから、原料液化澱粉の持つ物性が失われるという問題がある。また、特許文献２には、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）由来の枝作り酵素を利用して、糊化澱粉からほとんど分子量を低下させることなく、原料の澱粉と比較して分岐構造が密で、グルコース重合度４乃至７を中心とする分岐構造を有する高度分岐澱粉を形成させる方法が提案されている。しかしながら、ニューロスポラ・クラッサは特殊なカビであり、食品組成物を製造する上で安全性が確認されていないことから工業的製造、産業上の使用には至っていない。さらに、特許文献３には大麦由来の枝作り酵素（ＳＢＥ−ＩＩ）とホスホリラーゼを利用し、グルコース−１−リン酸とマルトオリゴ糖を反応基質として、グルコース重合度６又は７を中心とする分岐構造を有する分岐澱粉を形成させる方法が提案されている。しかしながら、大麦由来の枝作り酵素（ＳＢＥ−ＩＩ）やホスホリラーゼ、基質であるグルコース−１−リン酸を工業的製造に利用するのは極めて困難である。このような状況下、澱粉質をほとんど低分子化することなく、老化性などの物性の改善された澱粉質の提供が望まれる。

特開平８−１３４１０４号公報 特開２００１−２９４６０１号公報 特開２００２−７８４９７号公報

本発明は、耐老化性を有する新規澱粉質と、当該澱粉質を原料澱粉質から酵素的に効率よく製造する方法並びにその用途を提供することを課題とするものである。

本発明者等は、上記課題を解決するために、各種糖転移酵素の利用に着目し、鋭意研究を重ねる過程において、本発明と同じ出願人による特願２００４−１７４８８０号明細書に開示した、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトース（以下、本明細書では「環状マルトシルマルトース」と略称する。）を、α−１，４グルカンから生成する環状マルトシルマルトース生成酵素を高濃度の液化澱粉又は澱粉部分分解物に作用させたところ、意外にも、環状マルトシルマルトースの生成は僅かであり、分子間及び／又は分子内の６−α−マルトシル転移作用により、酵素的に改変された澱粉が生成することを見出した。この改変澱粉の構造及び物性を調べたところ、環状マルトシルマルトース生成酵素は、原料の澱粉質に対して分子量の低下や還元力の増加をほとんど起こすことなく、液化澱粉又は澱粉部分分解物から６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を有する新規分岐澱粉を生成することを見出した。さらに、この６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を有する分岐澱粉が、顕著な耐老化性を有することを見出して本発明を完成した。

すなわち、本発明は、顕著な老化耐性を有する、６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を有する分岐澱粉と、原料澱粉質をほとんど低分子化することなく、当該分岐澱粉を製造する方法並びに当該分岐澱粉の用途を提供することにより上記課題を解決するものである。

本発明によれば、耐老化性を有する新規分岐澱粉が大量・安価に供給できることとなり、飲食物をはじめとする様々な分野における利用が可能となる。

本発明でいう６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を有する分岐澱粉（以下、本明細書では、単に「分岐澱粉」と略称することもある。）とは、分子内に、マルトース単位及び／又はマルトテトラオース単位でα−１，６結合により分岐した構造を有する澱粉質全般を意味し、澱粉質におけるα−１，４グルカン鎖の内部のみならず、その非還元末端グルコースの６位にマルトース及び／又はマルトテトラオースがα−１，６結合した構造を有するものをも包含する。本発明の分岐澱粉の分子量は特に限定されないものの、１．０×１０^４ダルトン以上のものが好ましい。本発明の６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を有する分岐澱粉は、α−１，６結合を特異的に加水分解する澱粉枝切酵素の１種であるプルラナーゼで消化すると固形物当たりマルトースを１．８質量％以上及び／又はマルトテトラオースを０．７質量％以上生成することを特徴とする。通常の澱粉の分岐構造の鎖長（グルコース重合度）は、一般に９乃至１０にピークを有していることから、本発明の分岐澱粉は、極端に短く、特定の鎖長を有する分岐構造を有しており、原料として用いる既存の澱粉と明瞭に区別することができる。また、本発明の分岐澱粉は、通常の澱粉と比較して分岐の箇所が増加し、直鎖部分が短いものとなっているにもかかわらず、分子量はほとんど低下していない。

また、本発明の６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を有する分岐澱粉において、既存の澱粉に比べα−１，６結合による分岐した箇所が増加していることは、公知のメチル化分析を行い、部分メチル化物中に１位及び６位水酸基がグルコシド結合に関与しているグルコースの存在を示す、２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトール（以下、「２，３，４−トリメチル化物」と略称する）の含量が、原料澱粉のそれよりも増加しており、通常、部分メチル化物の固形物当たり０．４質量％以上を示すことから判定することができる。また、β−アミラーゼによる分解試験（β−アミロリシス）を行い、本発明の分岐澱粉のβ−アミラーゼ分解限度が、原料澱粉のそれよりも小さいことから判定することができる。

さらに、本発明の６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を有する分岐澱粉は、具体的には実験の項で後述するものの、当該分岐澱粉を濃度２５質量％の水溶液とし、これを５℃で１０日間保持した場合においても、澱粉の老化による白濁を実質的に示さず、原料液化澱粉に比べ、著しい耐老化性を示すという特徴を有している。

本発明の６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を有する分岐澱粉を製造する方法としては、例えば、液化澱粉を原料とし、これに作用して澱粉分子内に６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を生成する酵素を用いる方法が好適である。このような酵素としては、液化澱粉に作用し、非還元末端に存在するマルトース構造を認識し、このマルトースを澱粉分子の他の非還元末端グルコース残基若しくは澱粉分子内部のグルコース残基の６位水酸基にα−マルトシル転移するか、又は、このマルトースを澱粉分子の他の非還元末端グルコース残基の４位水酸基にα−マルトシル転移する反応を触媒するかぎり、いずれの酵素も用いることができる。例えば、本出願人と同一の出願人により特願２００４−１７４８８０号明細書に開示された環状マルトシルマルトース生成酵素を好適に用いることができる。

本発明の分岐澱粉の製造に使用できる環状マルトシルマルトース生成酵素の環状マルトシルマルトース生成機構は以下のようなものである。
１）基質としてグルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、その非還元性末端のマルトシル残基を他のα−１，４グルカン分子の非還元性末端グルコース残基の６位水酸基に転移する分子間の６−α−マルトシル転移を触媒することにより、非還元末端に６−α−マルトシル基を有するグルコース重合度が２増加した６−α−マルトシル−マルトオリゴ糖と、グルコース重合度が２減じたマルトオリゴ糖とを生成する。
２）さらに、６−α−マルトシル−マルトオリゴ糖に作用し、分子内α−マルトシル転移することにより環状化し、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトースと、グルコース重合度が４減じたマルトオリゴ糖を生成する。
３）本酵素は、僅かながら分子間の４−α−マルトシル転移も触媒し、マルトオリゴ糖から、グルコース重合度が２増加したマルトオリゴ糖と、グルコース重合度が２減じたマルトオリゴ糖とを僅かに生成する。
上記の反応を触媒する酵素はその給源、形態、粗酵素又は精製酵素の区別なく本発明の環状マルトシルマルトース生成酵素に包含される。

本発明に用いる環状マルトシルマルトース生成酵素の具体例としては、例えば、下記の理化学的性質を有する環状マルトシルマルトース生成酵素が挙げられる。
（１）分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において、７２，０００±２０，０００ダルトン。
（２）等電点
アンフォライン含有等電点電気泳動法において、ｐＩ３．６±０．５。
（３）至適温度
ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５０℃乃至５５℃。
（４）至適ｐＨ
４０℃、３０分間反応の条件下で、ｐＨ５．５乃至６．５。
（５）温度安定性
ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で、３０℃まで安定。
１ｍＭカルシウムイオン存在下では、５０℃まで安定。
（６）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ５．０乃至９．０で安定。

本発明に用いる環状マルトシルマルトース生成酵素はその給源によって制限されないものの、好ましい給源として、微生物が挙げられ、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）が産生する環状マルトシルマルトース生成酵素が好適に用いられる。環状マルトシルマルトース生成酵素産生能を有する微生物には、上記菌はもとより、その変異株、更には、環状マルトシルマルトース生成酵素産生能を有する組換え体微生物を含む他の微生物、及び、それらの変異株なども包含される。

本発明の分岐澱粉の製造に用いる環状マルトシルマルトース生成酵素は、当該分岐澱粉の調製に使用できるかぎり精製酵素であっても粗酵素であっても良く、また、遊離の酵素であっても、固定化された酵素であっても使用することができる。固定化酵素の場合、反応の形式は、バッチ式、半連続式及び連続式のいずれでもよい。固定化方法としては、担体結合法、（例えば、共有結合法、イオン結合法、あるいは物理的吸着法）、架橋法あるいは包括法（格子型あるいはマイクロカプセル型）など、公知の方法を使用することができる。

本発明の分岐澱粉を製造するための原料となる澱粉は、例えば、コーンスターチ、ワキシーコーンスターチ、米澱粉、餅米澱粉などの地上澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、タピオカ澱粉、くず澱粉などの地下澱粉などを工業的に有利に用いることができる。さらに、澱粉から得られたアミロース、アミロペクチン、澱粉部分分解物などを原料とすることもできる。澱粉から本発明の分岐澱粉を製造するに際しては、上記のような原料澱粉を、通常、糊化及び／又は液化して用いるのが好適である。澱粉の糊化・液化の方法自体は、公知の方法を採用することができる。

例えば、液化澱粉へ環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させる方法は、次のような条件下で好ましく実施できる。まず、液化澱粉の濃度は、通常、１０乃至４５質量％が好ましい。液化澱粉の濃度が１０質量％未満であると環状マルトシルマルトース生成酵素が分子内マルトシル転移反応を触媒し易くなり、分岐澱粉よりも環状マルトシルマルトースを生成し、分岐澱粉の収率が低下する。一方、４５質量％を超えると澱粉の水への溶解が困難となるため好ましくない。

本発明の分岐澱粉を製造するに際し、環状マルトシルマルトース生成酵素は、液化澱粉固形物１グラム当たり、０．０１乃至１０単位、好ましくは０．０２乃至１単位となるように使用される。ここでいう酵素１単位とは、後述する環状マルトシルマルトース生成酵素の活性測定法の条件下において、１分間に１μｍｏｌの環状マルトシルマルトースを生成する酵素量を１単位としたものである。環状マルトシルマルトース生成酵素の使用量が０．０１単位未満であると反応が不十分で酵素添加の意味がなく、一方、１０単位を超えると効果が頭打ちとなる上、製造コストが増大するため、いずれも好ましくない。

酵素反応における反応温度は、反応が進行する温度、即ち６０℃付近までで行えばよい。好ましくは３０乃至５０℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通常、５乃至９の範囲、好ましくはｐＨ５乃至７の範囲に調整するのがよい。酵素の使用量と反応時間とは密接に関係しており、目的とする酵素反応の進行により適宜選択すればよい。

反応により得られた反応物を、そのまま分岐澱粉製品とすることもできる。必要に応じて、反応により得られた生成物を遠心分離、濾過等により不溶物を除去し、水溶性画分を濃縮することで、目的とする本発明の分岐澱粉の溶液を得ることもできる。得られた分岐澱粉の溶液は、そのまま利用できるものの、保存に有利で、かつ用途によっては利用しやすいように、乾燥し、粉末として得ることが望ましい。乾燥は、通常、凍結乾燥、或いは噴霧乾燥やドラム乾燥などの方法が利用できる。乾燥物は、必要により粉砕することが望ましい。

環状マルトシルマルトース生成酵素を液化澱粉に作用させて得られる反応物は、通常、本発明の分岐澱粉とともに少量の環状マルトシルマルトースを含有しているものの、この反応物はそのまま本発明の分岐澱粉として用いることができる。また、必要に応じて、このようなオリゴ糖を除去し、精製した分岐澱粉として用いることも有利に実施できる。精製の方法としては、ゲル濾過クロマトグラフィーなど常法の多糖類の精製方法を適宜、必要に応じて選択すればよい。

このようにして得られる本発明の分岐澱粉は、その溶液を低温下で放置しても通常の澱粉と比較して、老化による白濁が観察されず、顕著な耐老化性を有するという特徴を有している。一般に、澱粉は冷水に不溶であるが、本発明の分岐澱粉は、少なくとも２０質量％までは冷水に対して溶解する。また、本発明の分岐澱粉は、原料澱粉液化液に比べて、その水溶液が低粘度のものであり、取扱い性に優れている。

本発明の分岐澱粉は、澱粉を含有する飲食物における通常の澱粉の代替品として用いると、それ自体が耐老化性を有するため、澱粉の老化が抑制された飲食物が得られる。この飲食物は、澱粉の老化に起因する保水性、保形性、冷凍耐性、消化性などの低下が抑制されたものである。なお、澱粉を含有する飲食物としては、もち、だんご、クッキー、パン、麺類、澱粉含有スポーツドリンク、澱粉含有栄養補助食品などが挙げられる。

以上述べたような各種組成物に、本発明の分岐澱粉を含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常１質量％以上、望ましくは５質量％以上、さらに望ましくは１０質量％以上含有せしめるのが好適であり、目的に応じて、適宜選択することができる。

本発明の分岐澱粉は、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性などの性質を具備している。従って、本発明の分岐澱粉は、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。また、接着用組成物、コーティング用組成物の他、フィルム、シート、チューブ、カプセル、短棒などの各種成形物としても有利に使用できる。

本発明の分岐澱粉は、例えば、通常のプラスチック成形機を利用することにより、フィルム、シート、チューブ、カプセルの形態に成形することができる。成形方法は特に限定されず、例えば、押出成形、射出成形、加圧成形、注型成形、スタンピング成形、カッティング成形及びフィルム成形法など適宜の方法を用いることができる。得られる成型物は生分解性成形物として使用することができる。本発明の分岐澱粉を含有してなる成形物には、必要に応じて、他の水溶性多糖類、例えば、澱粉、澱粉部分分解物、アミロース、アミロペクチンなどの澱粉質、エステル化、エーテル化、酸化及び／又は架橋化された澱粉誘導体、プルラン、アルギン酸ナトリウム、寒天、ペクチン、キサンタンガム、デキストラン、カラギーナン、コンドロイチン硫酸などを併用することもできる。また、成型物の可塑性を調節するために可塑剤を添加することも有利に実施できる。可塑剤としては、水や各種ポリオール類、例えば、グリセリン、ポリビニルアルコールなどの多価アルコール、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マルチトールなどの糖アルコール、α，α−トレハロースなどの非還元性糖質、尿素、大豆油やひまし油などの天然油脂、有機酸のアルキルエステルなどが挙げられる。

また、分岐澱粉含有成型物には、上記の成分に加えて、無機及び有機の他の成分を適宜含有させることができる。無機成分としては、タルク、二酸化チタン、炭酸カルシウム、砂、クレー、石灰石、珪藻土、雲母、ガラス、石英、セラミックスなどが挙げられる。有機成分としては澱粉、セルロース、木材粉、繊維、蛋白質及びその分解物、脂質類、糖脂肪酸エステル類、エタノールなどのアルコール類、着色料、保存料、着香料、矯味剤などが挙げられる。

以下、実験により本発明をさらに具体的に説明する。

＜実験１：環状マルトシルマルトース生成酵素の調製＞
実験に先立ち、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）を培養し、培養上清中の環状マルトシルマルトース生成酵素を精製して酵素標品を調製した。

＜実験１−１：アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６の培養＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社製造）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社製造）０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．３ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコ２本に１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アルスロバクター・グロビホルミス Ｍ６（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで４８時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量３０Ｌのファーメンターに種培養と同じ組成の液体培地を約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液約２００ｍｌを接種し、温度２７℃、ｐＨ５．５乃至８．０に保ちつつ、９６時間通気攪拌培養した。培養後、ファーメンターから培養液を抜き出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清約１８Ｌを得た。

環状マルトシルマルトース生成酵素の酵素活性は、以下の方法で測定した。可溶性澱粉を濃度２ｗ／ｖ％となるよう２ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液０．５ｍｌに酵素液０．５ｍｌを加えて、４０℃で３０分間酵素反応し、その反応液を１０分間、約１００℃で加熱して反応を停止させた後、残存可溶性澱粉や夾雑オリゴ糖を分解するためにα−グルコシダーゼ（『トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」』、天野エンザイム株式会社製造））を固形物１グラム当り４０００単位とグルコアミラーゼ（グルコチーム、ナガセ生化学工業株式会社販売）を固形物１グラム当り２５０単位添加して５０℃、１時間処理し、その処理液中の環状マルトシルマルトース量を、高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と略称する）法で定量する。環状マルトシルマルトース生成酵素の活性１単位は、上記の条件下で１分間に１μモルの環状マルトシルマルトースを生成する酵素量と定義する。なお、ＨＰＬＣは、カラムに『Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＫＳ−８０１』（昭和電工株式会社製造）を用い、溶離液に水を用いて、カラム温度６０℃、流速０．５ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩ−８０１２（東ソー株式会社製造）を用いて行った。

＜実験１−２：環状マルトシルマルトース生成酵素の精製＞
培養上清のうち、約９．２Ｌに、最終濃度６０％飽和となるように硫安を添加し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。生成した塩析沈殿物を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、３０分間）にて回収し、これを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、粗酵素液として約２４０ｍｌを得た。この粗酵素液を東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ） ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー（ゲル容量１００ｍｌ）に供した。環状マルトシルマルトース生成酵素活性は、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した『ＤＥＡＥ−トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ） ６５０Ｓ』ゲルに吸着し、食塩濃度０Ｍから０．４Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、食塩濃度約０．２２Ｍ付近に溶出した。この活性画分を回収し、終濃度１Ｍとなるように硫安を添加して４℃、２４時間放置した後、遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『フェニル−トヨパール（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ） ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル容量１０ｍｌ）に供した。環状マルトシルマルトース生成酵素活性は、１Ｍ硫安を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した『フェニル−トヨパール（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ） ６５０Ｍ』ゲルに吸着し、硫安濃度１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．１Ｍ付近に溶出した。この精製の各ステップにおける環状マルトシルマルトース生成酵素活性、環状マルトシルマルトース生成酵素比活性及び収率を表１に示す。

疎水クロマトグラフィー後の環状マルトシルマルトース生成酵素精製標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。

＜実験２：分岐澱粉の調製＞
液化澱粉に環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させた際に生成する反応生成物の構造と物性を調べるため、以下の実験を行った。

＜実験２−１：酵素反応＞
市販のワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業株式会社製）２，５００ｇを１ｍＭの塩化カルシウムを含む水道水２５Ｌに懸濁し、２Ｎ塩酸にてｐＨ６．０に調整して濃度１０質量％の澱粉乳を調製した。この澱粉乳にα−アミラーゼ（商品名「ネオスピターゼＰＫ２」、ナガセ生化学工業株式会社製）を２０，０００単位添加し、３０分間攪拌した後、連続液化装置に流速１Ｌ／分で通液した。澱粉乳を連続液化装置にて１００℃で２５分間、次いで、１４０℃で５分間加熱することにより液化澱粉を調製した。得られた液化澱粉は、活性炭により脱色し、珪藻土濾過した後、減圧下で濃度２５質量％まで濃縮した。この濃縮液化澱粉を５等分し、内、４つの液化澱粉に実験１で得た環状マルトシルマルトース生成酵素精製標品を、液化澱粉固形物１グラム当たり０．０１２５、０．０２５、０．０５又は０．１単位の割合で加え、５０℃、ｐＨ６．０で２４時間作用させた。１００℃で１０分加熱することにより酵素反応を停止した後、それぞれの反応液中の環状マルトシルマルトース含量をＨＰＬＣにて測定した。なお、環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させていない原料液化澱粉を対照とした。

なお、ＨＰＬＣは、『ＭＣＩｇｅｌ ＣＫ０４ＳＳ』（三菱化学株式会社製造）カラムを２本直列に連結して用い、溶離液に水を用いて、カラム温度８０℃、流速０．４ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩ−８０１２（東ソー株式会社製造）を用いて行った。

表２から明らかなように、各反応液において環状マルトシルマルトース生成酵素の作用量が多いほど環状マルトシルマルトース含量が増加する傾向が認められた。しかしながら、その含量は、今回検討した最大の酵素作用量、液化澱粉１グラム当たり０．１単位の場合においても約５％と僅かであった。

＜実験２−２：分岐澱粉の精製＞
実験２−１で得た各種反応液をそれぞれ濾過し、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製後、エバポレーターで固形分濃度２０質量％まで濃縮した。続いて、副生成物として混在する環状マルトシルマルトースを除去するため、強酸性カチオン交換樹脂（アンバーライトＣＲ−１３１０、Ｎａ型、オルガノ株式会社製造）を用いたカラム分画を行なった。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ樹脂層全長２４０ｃｍとした。カラム内温度６０℃に維持しつつ、澱粉溶液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに６０℃の温水をＳＶ０．１３で流して分画し、溶出液の糖組成をＨＰＬＣ法でモニターし、環状マルトシルマルトースを含まない高分子画分を採取した。得られた高分子画分は、２５質量％まで濃縮した後、真空乾燥し、いずれも固形物当たりの収率９０％以上で各分岐澱粉粉末を得た。これらの分岐澱粉は実験２−１と同じＨＰＬＣ分析に供し、環状マルトシルマルトースを含まないことを確認した。

＜実験３：分岐澱粉の構造分析＞
実験２の方法で得た分岐澱粉につき、以下の試験を行い、分岐澱粉の構造を調べた。

＜実験３−１：分岐澱粉の分子量分布＞
実験２の方法で得た分岐澱粉の分子量分布を、ゲル濾過分析により検討した。ゲル濾過分析は、「ＴＳＫ−ＧＥＬ ＡＬＰＨＡ−Ｍ」カラム（東ソー株式会社製）２本を直列に連結し、溶離液に水を用いて、カラム温度３０℃、流速０．３ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計「ＲＩ−８０１２」（東ソー株式会社製）を用いて行った。分岐澱粉は、水に懸濁し、終濃度１Ｎになるよう水酸化ナトリウムを添加して溶解し、５℃で一夜放置した後、１Ｎ塩酸で中和し、メンブラン濾過したものをゲル濾過分析の試料とした。対照として、ワキシーコーンスターチ液化液を同様に分析した。なお、試料中のグルカンの分子量は、分子量測定用プルラン標準品（株式会社林原生物化学研究所販売）を同様にゲル濾過分析して作成した分子量の検量線に基づき算出した。ゲル濾過クロマトグラフィーにおける溶出パターンを図１に示した。なお、図１中、ａは対照（原料液化澱粉）であり、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ液化澱粉固形物当たり環状マルトシルマルトース生成酵素を０．０１２５単位、０．０２５単位、０．０５単位及び０．１単位作用させて得られた分岐澱粉である。以下、液化澱粉固形物当たり環状マルトシルマルトース生成酵素を０．０１２５単位、０．０２５単位、０．０５単位及び０．１単位作用させて得られた分岐澱粉を、それぞれ分岐澱粉１、２、３及び４と呼称する。

図１から明らかなように、対照の液化澱粉は、ゲル濾過クロマトグラフィーにおいて、大別して３つのピーク（図１における符号１、２及び３）を示した。３つのピークの内、溶出が最も遅いピーク３に含まれるグルカンの重量平均分子量は検量線のデータから１．１×１０^６ダルトンと算出されたものの、溶出が早いピーク１及び２は分子量の検量線の範囲外の高分子であり、ピーク１及び２に含まれるグルカンの分子量は測定不能であった。液化澱粉に環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させて得られた分岐澱粉１（図１中のｂ）から分岐澱粉４（図１中のｅ）のいずれも、そのゲル濾過クロマトグラフィーにおける溶出パターンは原料液化澱粉のそれと大差なく、環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させても、その分子量分布に大きな変化が生じていないことが判明した。

＜実験３−２：分岐澱粉の加水分解率＞
実験２−２で得た４種の分岐澱粉又は対照の液化澱粉の還元力を測定した。各試料の全糖量をアンスロン−硫酸法により、また、還元糖量を改良パーク・ジョンソン法（檜作ら、「カーボハイドレート リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、第９４巻、２０５乃至２１３頁（１９８１年）を参照）により定量し、全糖量中に占める還元糖量の割合（％）を意味する加水分解率を、次式 加水分解率（％）＝（還元糖量／全糖量）×１００ にて算出した。結果を表３に示す。

表２から明らかなように、環状マルトシルマルトース生成酵素の作用量が液化澱粉固形物１グラム当たり０．１単位と最も多い分岐澱粉においても、対照の原料液化澱粉と比較して加水分解率の増加は僅か約０．１％であり、環状マルトシルマルトース生成酵素の反応によって起こる加水分解は、ほとんど無視できる程度であった。

＜実験３−３：分岐澱粉のメチル化分析＞
実験２−２で得た４種の分岐澱粉又は対照の液化澱粉について、構成糖であるグルコースの結合様式を調べるため、常法に従いメチル化した後、酸により加水分解し、続いて還元、アセチル化し、得られた部分メチル−アセチルグルシトール（以下、「部分メチル化物」と略称することがある。）をガスクロマトグラフィー法（以下、「ＧＬＣ」と略称する。）にて分析し、部分メチル化物の組成を調べた。結果を表４に示す。

表４の結果から明らかなように、対照の液化澱粉では、２，３，４−トリメチル化物が全く検出されないことから、他のグルコースと１位及び６位で結合しているグルコース残基が存在しないと考えられる。一方、環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させて得られた分岐澱粉では、２，３，４−トリメチル化物が検出され、酵素の作用量が多くなるにつれて、その割合が増加した。この結果は、酵素の作用量が多くなるにつれて、グルコース残基の６位に他のグルコースが１位で結合した構造、すなわち、分岐構造が増加することを物語っている。加えて、２，３−ジメチル化物の割合も増加傾向にあることから、１位、４位及び６位で他のグルコースと結合しているグルコース残基も僅かに増加していると考えられた。このことは、環状マルトシルマルトース生成酵素の作用による６−α−マルトシル転移が、基質澱粉の非還元末端グルコース残基の６位だけでなく、澱粉を構成するグルコース鎖の内部に位置するグルコース残基の６位に対しても起こることを示唆している。

＜実験３−４：分岐澱粉のプルラナーゼ消化における生成物＞
実験２−２の方法で得た４種の分岐澱粉又は対照の液化澱粉について分岐構造を調べる目的で、澱粉のα−１，６結合を特異的に加水分解するプルラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）を作用させ、それぞれのプルラナーゼ消化物の糖組成を調べた。

実験２−２の方法で得た４種の分岐澱粉又は対照の液化澱粉を、終濃度１ｗ／ｖ％になるよう脱イオン水に溶解し、酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を終濃度２０ｍＭになるよう加えた後、基質固形分１グラム当たり２０単位のプルラナーゼ（試薬結晶品、株式会社林原生物化学研究所製造）を加え、４０℃で２４時間反応させた。反応後、１００℃、１０分間の加熱処理を行い、プルラナーゼを失活させた後、反応液の糖組成を実験２と同じＨＰＬＣ法にて測定した。結果を表５に示す。また、表５における対照の液化澱粉と分岐澱粉３（環状マルトシルマルトース生成酵素の作用量：０．０５単位／ｇ−液化澱粉）の結果を、グルコースの重合度を横軸とし、プルラナーゼ消化物中の含量（％）を縦軸とした図に表したものを図２に示す。なお、図２中の符号ａ及びｄは、それぞれ対照の液化澱粉及び分岐澱粉３を意味する。

表５及び図２の結果から明らかなように、対照の液化澱粉の場合、ＤＰ６以上のマルトオリゴ糖が生成し、ＤＰ５以下のマルトオリゴ糖は認められないのに対して、環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させて調製した本発明の分岐澱粉では、プルラナーゼ消化物中のＤＰ５以下のマルトオリゴ糖、とりわけ、マルトース（ＤＰ２）及びマルトテトラオース（ＤＰ４）が顕著に増加していた。この結果から、環状マルトシルマルトース生成酵素の作用によって、６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を有する新たな分岐澱粉が生成していることが判明した。

＜実験３−５：分岐澱粉のβ−アミラーゼ分解限度（β−アミロリシス）＞
実験２−２で得た４種の分岐澱粉又は対照の液化澱粉をそれぞれ終濃度１ｗ／ｖ％、酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を終濃度２０ｍＭになるよう調製した基質溶液に、固形物１ｇ当たり１００単位のβ−アミラーゼ（大豆由来、ナガセ生化学工業製）を加え、５０℃で２４時間作用させ、１００℃で１０分間熱処理して酵素反応を停止した。なお、β−アミラーゼの活性１単位は、濃度１質量％の可溶性澱粉を基質とし、ｐＨ５．５、４０℃の条件下で１分間に１μｍｏｌのマルトースに相当する還元力を生成する酵素量と定義した。各分岐澱粉及び対照の液化澱粉のβ−アミラーゼ消化物中のマルトースとβ−アミラーゼで分解されないβ−リミットデキストリンの含量を実験１と同じＨＰＬＣ条件にて測定した。結果を表６に示す。

表６の結果から明らかなように、分岐澱粉は、作用させた環状マルトシルマルトース生成酵素の量が多いほど、β−アミラーゼ消化により生成するマルトースの含量が低い値を示し、逆にβ−リミットデキストリンの含量は高い値を示した。β−アミラーゼは澱粉を非還元末端からマルトース単位で加水分解し、α−１，６結合による分岐点の手前で加水分解反応を停止する酵素であることから、上記結果は、環状マルトシルマルトース生成酵素が液化澱粉に作用し、そのα−１，６マルトシル転移により分岐構造が形成され、環状マルトシルマルトース生成酵素の作用量が多いほど分岐澱粉における分岐構造の割合も増加する（分岐が密になる）ことを物語っている。

＜実験３−６：分岐澱粉のヨウ素呈色＞
実験２−２で得た４種の分岐澱粉又は対照の液化澱粉を、脱イオン水にそれぞれ濃度０．１５質量％になるよう溶解し、この溶液０．５ｍｌに０．０２Ｎ硫酸を１０ｍｌ、０．１Ｎヨウ素−ヨウ化カリウム溶液を０．５ｍｌ添加し、２５℃で２５分間放置した後、４５０乃至７００ｎｍの範囲でヨウ素−澱粉複合体の吸収スペクトルを測定した。結果を図３に示す。なお、図３中の符号ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、実験３−１、図１で述べたものと同様である。図３の結果から明らかなように、環状マルトシルマルトース生成酵素の作用量が多い分岐澱粉ほど全体として吸光度が低かった。最大吸収波長はおよそ５２０ｎｍで各試料間に差は認められなかった。実験３−２の結果から、環状マルトシルマルトース生成酵素の作用による加水分解はほとんど認められなかったにもかかわらず、環状マルトシルマルトース生成酵素の作用量が多い分岐澱粉ほど吸光度が低い理由として、環状マルトシルマルトース生成酵素の作用量が多い分岐澱粉ほどヨウ素と複合体を形成する澱粉の直鎖構造の存在比が低下し、澱粉へのヨウ素の結合量が低下したものと考えられた。

実験３の結果から、液化澱粉に環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させて得られる分岐澱粉は、６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を有する新規な分岐澱粉であることが判明した。本発明の分岐澱粉の構造を示す模式図を液化澱粉のそれとともに図４に示す。図４中、Ａ及びＢは、それぞれ原料液化澱粉及び本発明の分岐澱粉の模式図である。なお、図４に示す模式図において、符号１、２及び３はそれぞれ、液化澱粉における、グルコースがα−１，４結合で連なった直鎖状構造（アミロース構造）、α−１，６結合により前記直鎖状構造が分岐した部位、及び還元末端グルコースを意味し、また、符号４及び５は、本発明の分岐澱粉における６−α−マルトシル分岐構造及び６−α−マルトテトラオシル分岐構造を意味している。

＜実験４：分岐澱粉の耐老化性＞
実験２の方法で得た分岐澱粉４種と対照の液化澱粉について、耐老化性を検討した。濃度２５質量％になるよう水に加熱・溶解した各試料をガラス製試験管に分注し、密閉状態で、温度５℃で１０日間冷蔵保存した後、澱粉の老化の程度を観察した。結果を図５に示す。なお、図５中の符号ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、実験３−１及び図１で述べたものと同様である。図５の結果から明らかなように、対照の液化澱粉（ａ）は上記保存条件下において白濁し、さらに一部固化も生じており、澱粉の老化が顕著であった。一方、環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させて調製した分岐澱粉（ｂ〜ｅ）は、いずれも透明な溶液状態を維持しており、６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を有する本発明の分岐澱粉は、顕著な耐老化性を有していることが判明した。

以下、実施例により、さらに具体的に本発明を説明する。本発明の分岐澱粉の製造例を実施例１乃至５で示し、本発明の分岐澱粉を含有せしめた組成物を実施例６乃至１４で示す。しかしながら、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。

ワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業株式会社製）を水道水に懸濁し、これに最終濃度１ｍＭとなるように塩化カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整して濃度約１０質量％の澱粉乳を調製した。この澱粉乳に耐熱性α−アミラーゼ（商品名「スピターゼＨＳ」、ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉固形物１グラム当たり０．０５ｍｇ添加し、３０分間攪拌した後、連続液化装置に流速１Ｌ／分で通液した。澱粉乳を連続液化装置にて１００℃で２５分間、次いで、１４０℃で５分間加熱して液化澱粉を調製した。次いで、この液化澱粉溶液減圧下で濃縮し、濃度約２５質量％の液化澱粉溶液とした後、実験１の方法で得た環状マルトシルマルトース生成酵素精製標品を澱粉固形物１グラム当り０．１単位になるように加え、ｐＨ６．０、温度５０℃で２０時間反応させた。１００℃、２０分間の熱処理により酵素反応を停止させた後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、珪藻土濾過し、濃度約２５質量％の分岐澱粉溶液を固形物当たり収率約９０％で得た。なお、得られた分岐澱粉のプルラナーゼ消化物は、マルトースを３．７質量％、マルトテトラオースを１．７質量％含有していた。また、得られた分岐澱粉の部分メチル化物は、２，３，４−トリメチル化物を８．２質量％含有していた。本品は、固形物当たり、９６．７質量％の分岐澱粉及び３．３質量％の環状マルトシルマルトースを含有していた。本品は、適度の粘度、保湿性、耐老化性、包接性を有し、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。

実施例１で得た溶液状の分岐澱粉を濾過し、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製後、エバポレーターで固形分濃度２０質量％まで濃縮した。続いて、強酸性カチオン交換樹脂（アンバーライトＣＲ−１３１０、Ｎａ型、オルガノ株式会社製造）を用いたカラム分画に供し、副生成物として混在する環状マルトシルマルトースを除去した。分画は、樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ樹脂層全長２４０ｃｍとしたカラムを用い、カラム内温度６０℃に維持しつつ、澱粉溶液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに６０℃の温水をＳＶ０．１３で流す条件にて行った。環状マルトシルマルトースを含まない高分子画分を採取し、２５質量％まで濃縮した後、パルス燃焼式乾燥システムＰＵＬＣＯ（パルテック株式会社製）にて脱水、乾燥し粉末化した。この操作により、吸湿性が少なく、粒度特性の優れた分岐澱粉粉末が得られた。本品は、固形分濃度３０質量％までは水に容易に溶解し、水溶性は良好であった。本品は呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。

市販の澱粉部分分解物（商品名「パインデックス＃１００」、松谷化学工業株式会社製）を濃度約３０％（ｗ／ｖ）水溶液とし、終濃度１ｍＭとなるように塩化カルシウムを加え、ｐＨ６．０に調整した。これに実験１の方法で得た環状マルトシルマルトース生成酵素精製標品を基質固形物１グラム当り１単位加え、４０℃で４８時間反応させた後、１００℃に加熱し１０分保持して反応を停止させた。反応液を、常法に従って、活性炭で脱色し、珪藻土濾過して精製し、更に、濃縮して濃度３０質量％の分岐澱粉部分分解物溶液を固形物当たり収率約９０％で得た。本品は、固形物当たり、グルコース重合度７以上の分岐澱粉部分分解物９０．８質量％、グルコース重合度１乃至６のマルトオリゴ糖６．７質量％、及び環状マルトシルマルトースを２．５質量％含有していた。本品は、適度の粘度、保湿性、耐老化、包接性を有し、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。

なお、原料の澱粉部分分解物をプルラナーゼ消化したところ、生成するアミロースの老化により不溶化したのに対し、本品のプルラナーゼ消化物は、耐老化性を示し清澄な溶液を維持しており、マルトースを２６．３質量％、マルトテトラオースを１５．４質量％含有していた。

環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させるに際し、基質固形物１グラム当たり２，５００単位のイソアミラーゼを作用させた以外は実施例３と同様に反応し、常法に従って、活性炭で脱色し、珪藻土濾過して精製し、更に、濃縮して濃度３０質量％の分岐澱粉部分分解物溶液を固形物当たり収率約９０％で得た。本品は、固形物当たり、グルコース重合度７以上の分岐澱粉部分分解物６９．６質量％、グルコース重合度１乃至６のマルトオリゴ糖２７．３質量％、及び環状マルトシルマルトースを３．１質量％含有していた。本品は、適度の粘度、保湿性、耐老化、包接性を有し、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。

なお、本品のプルラナーゼ消化物はマルトースを４１．５質量％、マルトテトラオースを２６．２質量％含有する清澄な溶液であった。本品のプルラナーゼ消化物におけるマルトース及びマルトテトラオース含量を実施例３で得た分岐澱粉部分分解物のプルラナーゼ消化物のそれと比較すると、約１．５倍程度高い値を示した。このことは、イソアミラーゼによりグルコース重合度の大きい分岐を加水分解しつつ、環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させると、６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造の数を増加させることができることを示唆している。

実施例４で得た溶液状の分岐澱粉部分分解物を濾過し、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製後、エバポレーターで固形分濃度２０質量％まで濃縮した。続いて、強酸性カチオン交換樹脂（アンバーライトＣＲ−１３１０、Ｎａ型、オルガノ株式会社製造）を用いたカラム分画に供し、混在する環状マルトシルマルトースを含むオリゴ糖を除去した。分画は、樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ樹脂層全長２４０ｃｍとしたカラムを用い、カラム内温度６０℃に維持しつつ、澱粉溶液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに６０℃の温水をＳＶ０．１３で流す条件にて行った。オリゴ糖を含まない高分子画分を採取し、２５質量％まで濃縮した後、パルス燃焼式乾燥システムＰＵＬＣＯ（パルテック株式会社製）にて脱水、乾燥し粉末化した。この操作により、吸湿性が少なく、粒度特性の優れた分岐澱粉粉末が得られた。本品は、固形分濃度３０質量％までは水に容易に溶解し、水溶性は良好であった。本品は呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。

＜おはぎ＞
マルトース（登録商標『サンマルト』、株式会社林原商事販売）３５０質量部、トレハロース（登録商標『トレハ』、株式会社林原商事販売）１５０質量部を温水に溶解し、濃度７０質量％の糖液を調製して５５℃に保温した。次いで、予め水に浸漬しておいた８００質量部の餅米を常法により蒸し器で蒸し上げ、５５℃まで冷却した後、前記糖液５００質量部と実施例３の方法で得た分岐澱粉２００質量部を加えて均質に攪拌した。これを保温容器に入れて約１時間、４５〜５０℃に保持した後、取り出し、こし餡を用いておはぎを調製した。本品は、耐老化性を有する分岐澱粉を含有していることから老化が抑制されており、冷蔵、或いは冷凍保存後に解凍しても離水などの発生もなく、調製直後の柔らかさが保持される高品質のおはぎである。

＜ういろう＞
米粉７０質量部に、実施例２の方法で得た分岐澱粉４０質量部、無水結晶マルチトール７０質量部、含水結晶トレハロース（登録商標『トレハ』、株式会社林原商事販売）５０質量部、及びプルラン４質量部を均一に混合してういろうの素を製造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混練し、これを容器に入れて６０分間蒸し上げて抹茶ういろうを製造した。本品は、照り、口当たりも良好で、風味も良い。また、澱粉の老化も抑制され、日持ちも良く、低カロリーのういろうとしても好適である

＜カスタードクリーム＞
実施例２の方法で得た分岐澱粉１００質量部、マルトテトラオース含有シラップ（登録商標「テトラップ」、株式会社林原商事販売）１００質量部、トレハロース含水結晶６０質量部、蔗糖４０質量部、および食塩１質量部を充分に混合し、鶏卵２８０質量部を加えて攪拌し、これに沸騰した牛乳１、０００質量部を徐々に加え、更に火にかけて攪拌を続け、全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、なめらかな光沢を有し、風味良好で、澱粉の老化も抑制されており、高品質のカスタードクリームである。

＜粉末ペプチド＞
４０％食品用大豆ペプチド溶液（不二製油株式会社販売、商品名『ハイニュートＳ』）１質量部に、実施例２の方法で得た粉末状分岐澱粉２質量部を混合し、プラスチック製バットに入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを得た。本品は風味良好で、プレミックス、冷菓などの低カロリー製菓材料として有用であるのみならず、経口流動食、経管流動食のための材料としても有用である。

＜流動食用固体製剤＞
実施例２の方法で得た粉末状分岐澱粉１００質量部、トレハロース含水結晶２００質量部、マルトテトラオース高含有粉末２００質量部、粉末卵黄２７０質量部、脱脂粉乳２０９質量部、塩化ナトリウム４．４質量部、塩化カリウム１．８質量部、硫酸マグネシウム４質量部、チアミン０．０１質量部、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム０．１質量部、ビタミンＥアセテート０．６質量部およびニコチン酸アミド０．０４質量部からなる配合物を調製し、この配合物２５グラムずつ防湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、経口的、または鼻腔、胃、腸などへ経管的使用方法により利用され、耐老化性を有する分岐澱粉が生体へのエネルギー補給用に有利に利用できる。

＜錠剤＞
アスピリン５０質量部にトレハロース含水結晶粉末１４質量部、実施例３の方法で調製した分岐澱粉４質量部を充分に混合した後、常法に従って打錠機により打錠して厚さ５．２５ｍｍ、１錠６８０ｍｇの錠剤を製造した。本品は、分岐澱粉とトレハロースの賦形性を利用したもので、吸湿性がなく、物理的強度も充分にあり、しかも水中での崩壊はきわめて良好である。

＜外傷治療用膏薬＞
マルトース４００質量部に、ヨウ素３質量部を溶解したメタノール５０質量部を加え混合し、更に実施例５の方法で調製した分岐澱粉含有粉末の１０ｗ／ｖ％水溶液２００質量部を加えて混合し、適度の延び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、分岐澱粉による適度な粘度、保湿性を有しており、経時変化が少ない商品価値の高い膏薬である。また、本品は、ヨウ素による殺菌作用のみならず、マルトースによる細胞へのエネルギー補給剤としても作用することから治癒期間が短縮され、創面もきれいに治る。

＜フィルム＞
実施例１の方法で得た分岐澱粉溶液を濃度２５質量％に調整し、平板上に固定したポリエチレンテレフタレートフィルム上に適当量滴下し、ＹＢＡ型ベーカリーアプリケーター（ヨシミツ精機社製６型）にて薄く延ばした後、室温で４時間程度乾燥し、厚さ１９μｍ、水分含量１０．５質量％のフィルムを調製した。乾燥した分岐澱粉フィルムはポリエチレンテレフタレートフィルムから剥離し、ＲＨ５２．８％に調湿したデシケーター内で一夜以上保存し、製品とした。本品は、プルランフィルムと同様に、透明度が高く、光沢があり、柔軟性に優れた良質なフィルムであった。本品の引っ張り強度は１．７６０ｋｇｆであり、水溶性は良好であった。本品は、可食性フィルムとして有利に利用できる。

＜フィルム＞
実施例２の方法で得た分岐澱粉８質量部、カラギーナン（商品名「ＮＥＷＧＥＬＩＮ ＮＣ−４００」、中央フーズマテリアル株式会社販売）２質量部、ショ糖ステアリン酸エステル（商品名「シュガーエステルＳ１６７０」、三菱化学フーズ株式会社販売）０．０１質量部、グリセリン２５質量部、及び脱イオン水６５質量部を混合し加熱溶解した後、これをアプリケーター（商品名「ベーカーアプリケーターＹＢＡ型」ヨシミツ精機株式会社販売）を使用して、ガラス平板上にポリエチレンテレフタレートを密着させたものの上に適量滴下し、展延し、ゲル化させた後、５０℃で６時間乾燥して、水分含量約１８％、厚さ０．５ｍｍの分岐澱粉フィルムを調製した。本品はヒートシール性、透明性に優れており、また、崩壊性、水溶性に優れており、可食性フィルムやカプセル皮膜として好適である。

＜カプセル＞
実施例２の方法で得た分岐澱粉２５０質量部、カラギーナン（商品名「ＮＥＷＧＥＬＩＮ ＮＣ−４００」、中央フーズマテリアル株式会社販売）２０質量部、グリセリン４０質量部、及び脱イオン水７００質量部を混合し、加熱溶解して原料水溶液を調製し、減圧脱泡した。この溶液を５０℃に保温し、カプセル形成用ピンの先端を溶液中に入れた後、取り出し、乾燥してハードカプセルを調製した。本カプセルは、表面に光沢を持ち、透明性に優れ、酸素透過性を示さず、湿度変化に対する安定性に優れていた。また、水系で適度な徐崩性を有していることから、食品、医薬品の充填容器として好適である。

＜カプセル＞
市販のプルラン（商品名「プルランＰＦ−２０」、株式会社林原商事販売）２００質量部、実施例５の方法で得た分岐澱粉５０質量部、カラギーナン（商品名「ＮＥＷＧＥＬＩＮ ＮＣ−４００」、中央フーズマテリアル株式会社販売）１質量部、塩化アンモニウム２質量部、及び脱イオン水７５０質量部を混合し、加熱溶解して原料水溶液を調製し、減圧脱泡した。この溶液を５０℃に保温し、カプセル形成用ピンの先端を溶液中に入れた後、取り出し、乾燥してハードカプセルを調製した。本カプセルは、表面に光沢を持ち、透明性に優れ、酸素透過性を示さず、湿度変化に対する安定性に優れていた。また、水系で適度な徐崩性を有していることから、食品、医薬品の充填容器として好適である。

＜肥料杭＞
配合肥料（Ｎ＝１４％、Ｐ_２Ｏ_５＝８％、Ｋ_２Ｏ＝１２％）、実施例２の方法で得た分岐澱粉粉末、硫酸カルシウム、水の割合を質量でそれぞれ７０、１０、１５、５とし、充分混合した後、押出機（Ｌ／Ｄ＝２０、圧縮比＝１．８、ダイスの口径＝３０ｍｍ）で８０℃に加熱して成形し、肥料杭を製造した。本品は、肥料用容器が不溶で取り扱い容易であり、全層施肥に適した強度を有し、更に、配合割合を変えることにより肥料成分の溶出速度を調節できるものである。また、必要ならば、この肥料杭に植物ホルモン、農業用薬剤及び土壌改良剤などの混合も容易である。

本発明によれば、液化澱粉をほとんど低分子化させることなく澱粉本来の性質を著しく改良することができ、分岐構造が密で、耐老化性を有する新規分岐澱粉を大量・安価に提供することができる。本発明の新規分岐澱粉は、高溶解性を利用した澱粉高含有スポーツドリンクや栄養補助食品などとして有効に利用することができる。また、これを澱粉代替品として澱粉質含有食品に添加することにより、澱粉の老化に起因する様々な品質劣化を低減することができる。さらに、食品用途にとどまらず、接着剤や生分解性ポリマー用の原料などの工業用途や、オブラートに代表される各種フィルム、カプセルの原料などの医薬用途としても利用が期待され、各産業分野における意義は極めて高い。

液化澱粉に環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させて得られた各種分岐澱粉のゲル濾過クロマトグラフィーにおける溶出パターンを示す図である。 液化澱粉に環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させて得られた各種分岐澱粉のプルラナーゼ消化物中におけるグルコース重合度７以下のマルトオリゴ糖の含量を重合度別に比較した図である。 液化澱粉に環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させて得られた各種分岐澱粉のヨウ素−澱粉複合体の吸収スペクトルを示す図である。 原料液化澱粉と本発明の分岐澱粉の構造を模式的に示した図である。 本発明の分岐澱粉及び原料液化澱粉を濃度２５質量％の溶液とし、ガラス製試験管に分注して温度５℃で１０日間冷蔵保存したものの写真である。

符号の説明

ａ：対照の液化澱粉
ｂ：分岐澱粉１（環状マルトシルマルトース生成酵素作用量０．０１２５単位）
ｃ：分岐澱粉２（環状マルトシルマルトース生成酵素作用量０．０２５単位）
ｄ：分岐澱粉３（環状マルトシルマルトース生成酵素作用量０．０５単位）
ｅ：分岐澱粉４（環状マルトシルマルトース生成酵素作用量０．１単位）
図１における
１：ワキシーコーンスターチ液化液のゲル濾過クロマトグラフィーにおけるピーク１
２：ワキシーコーンスターチ液化液のゲル濾過クロマトグラフィーにおけるピーク２
３：ワキシーコーンスターチ液化液のゲル濾過クロマトグラフィーにおけるピーク３
図４における
Ａ：液化澱粉の模式図
Ｂ：本発明の分岐澱粉の模式図
１：グルコースがα−１，４結合で連なった鎖状構造（アミロース構造）
２：α−１，６結合による鎖状構造の分岐部位
３：還元末端グルコース
４：６−α−マルトシル分岐構造
５：６−α−マルトテトラオシル分岐構造

Claims (9)

1. ６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を有する分岐澱粉。
2. プルラナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４１）消化により、固形物当たりマルトースを１．８質量％以上及び／又はマルトテトラオースを０．７質量％以上生成することを特徴とする請求項１記載の分岐澱粉。
3. メチル化分析において、部分メチル化物が、固形物当たり２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールを０．４質量％以上含有することを特徴とする請求項１又は２記載の分岐澱粉。
4. 分岐澱粉が、その濃度２５質量％の水溶液を５℃で１０日間保持した場合においても、澱粉の老化による白濁を実質的に示さない、耐老化性を有することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の分岐澱粉。
5. 液化澱粉及び／又は澱粉部分分解物に下記の理化学的性質を有する環状マルトシルマルトース生成酵素を作用させて６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を有する分岐澱粉を生成せしめる工程と、生成する６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を有する分岐澱粉を採取する工程とを含んでなる６−α−マルトシル分岐構造及び／又は６−α−マルトテトラオシル分岐構造を有する分岐澱粉の製造方法：
   （１）作用
   グルコース重合度が３以上のα−１，４グルカンに作用し、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する環状マルトシルマルトースを生成する；
   （２）分子量
   ＳＤＳ−ゲル電気泳動法において、７２，０００±２０，０００ダルトン；
   （３）等電点
   アンフォライン含有等電点電気泳動法において、ｐＩ３．６±０．５；
   （４）至適温度
   ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、５０℃乃至５５℃；
   （５）至適ｐＨ
   ４０℃、３０分間反応の条件下で、ｐＨ５．５乃至６．５；
   （６）温度安定性
   ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で、３０℃まで安定；
   １ｍＭカルシウムイオン存在下では、５０℃まで安定；
   （７）ｐＨ安定性
   ４℃、２４時間保持の条件下で、ｐＨ５．０乃至９．０で安定。
6. 環状マルトシルマルトース生成酵素が、アルスロバクター属微生物由来の酵素である請求項５記載の分岐澱粉の製造方法。
7. アルスロバクター属微生物が、アルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ） Ｍ６（独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８４４８）又はその変異株である請求項６記載の分岐澱粉の製造方法。
8. 請求項１乃至４のいずれかに記載の分岐澱粉又は請求項５乃至７のいずれかに記載の製造方法により製造される分岐澱粉を含有する飲食物。
9. 請求項１乃至４のいずれかに記載の分岐澱粉又は請求項５乃至７のいずれかに記載の製造方法により製造される分岐澱粉を含んでなる成形物。