CN102356316A

CN102356316A - 肝内胆管癌的检出、辨别方法

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Publication number: CN102356316A
Application number: CN2010800099587A
Authority: CN
Inventors: 久野敦; 平林淳; 松田厚志; 成松久; 池原让; 正田纯一; 川本彻
Original assignee: JAPAN GOVERNMENT; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: JAPAN GOVERNMENT; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2009-03-05
Filing date: 2010-02-23
Publication date: 2012-02-15
Anticipated expiration: 2030-02-23
Also published as: CN104634974A; EP2405269B8; EP2405269B1; JP5787389B2; CN104634974B; JP5704570B2; EP2405269A1; US20120065089A1; CN102356316B; JP2015007654A; US8557602B2; EP2405269A4; JPWO2010100862A1; WO2010100862A1

Abstract

本发明以提供在早期用简便的方法、灵敏度良好且切实地检出、辨别肝脏原发的恶性肿瘤中的肝内胆管癌的方法以及用于此的试剂盒为课题，通过将由来源于肝内胆管癌的凝集素WFA(多花紫藤凝集素(Wisteria fioribunda Agglutinin))结合性糖蛋白质构成的糖链生物标记物作为癌标记物，检出受检样品中的该癌标记物，来检出肝内胆管癌。本发明的肝内胆管癌的检出方法，可以明确地鉴别肝内胆管癌和肝细胞癌，且在适用性、灵敏度、精度方面，可以以临床上容许的性能进行早期检出以及辨别。

Description

肝内胆管癌的检出、辨别方法

技术领域

本发明涉及提供在早期用简便的方法、灵敏度良好且切实地检出、辨别作为肝脏原发的恶性肿瘤的肝内胆管癌的方法以及用于此的试剂盒，进一步地，具体地说，涉及提供以由来源于肝内胆管癌的凝集素WFA(多花紫藤凝集素(Wisteria fioribunda Agglutinin))结合性糖蛋白质构成的糖链生物标记物作为癌标记物，检出该糖链生物标记物的肝内胆管癌特异性糖链结构，由此早期且特异性地检出肝内胆管癌，以此为手段，在适用性、灵敏度、精度的方面，以临床上容许的性能且利用临床上可以适用的简便的手段，检出以及辨别肝内胆管癌的方法以及用于此的试剂盒。

背景技术

癌位列日本致死疾病的第一位，大幅领先于心疾病、脑疾病等其它疾病所导致的死亡人数。另一方面，癌在大部分、所有内脏器官中通过发病、恶化而向各种内脏器官浸润转移。因此，为了对于癌进行有效的治疗，通过早期发现，在可以治疗的时期进行处理比什么都重要。现在，由于通过各种诊断方法的开发以及诊断可以早期发现，从而伴随早期治疗，延长寿命。然而，尽管开发了各种诊断和治疗方法，但是仍然会由于来自原发病灶的浸润转移而对治疗带来困难，经历甚至死亡的疗程。

肝癌为存在于肝脏的恶性肿瘤。肝癌可以分为肝脏原发的原发性肝癌和在肝以外的内脏器官产生的癌种转移到肝内而产生的转移性肝癌。肝脏产生的主要的恶性肿瘤(原发性肝癌)存在来源于肝细胞的肝细胞癌和来源于胆管上皮细胞的肝内胆管癌(或胆管细胞癌)。也存在应该视为两者的混合型的原发性肝癌。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma：HCC)为来源于肝细胞的恶性肿瘤，占原发性肝癌的90％以上。肝细胞癌大部分由病毒性肝炎产生。肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarinoma：ICC)为占原发性肝癌的3％的癌，难以在早期发现，外科上切除后的存活率低，对于化学疗法缺乏反应性，预后不良。

为了早期检出肝癌，一直以来开发了使用肿瘤标记物的检出手段。对于肝细胞癌，直到现在开发了大量的癌检出用的标记物。例如α1胎蛋白(AFP)在临床上用作肝细胞癌的肿瘤标记物，此外，PIVKA-II(NewEng.J.Med.310，1427-1431，1984)也用作肝细胞癌的肿瘤标记物。此外，作为肝癌的肿瘤标记物，例如已知CEA、CA19-9、KMO-1、DuPAN-2、SPan-1、CA50、SLX、碱性胎蛋白(BFP)、NCC-ST-439、碱性磷酸酶同功酶、γ-GTP同功酶、IAP、TPA、β2-微球蛋白、铁蛋白、POA和胰蛋白酶抑制剂等(日本特开2002-323499号公报)。

此外，近年，作为由在肝细胞癌中表达的基因、多肽构成的肝细胞癌的肿瘤标记物，公开了很多。例如公开了Gla不全第VII凝血因子(日本特开平8-184594号公报)，醛缩酶β基因、氨基甲酰磷酸酯合成酶I基因、纤溶酶原基因、EST51549、白蛋白基因、细胞色素P450亚科2E1基因、视黄醇结合蛋白质基因、或有机阴离子转运蛋白C基因(日本特开2004-105013号公报)，具有锌指区以及SET区的人基因ZNFN3A1(日本特表2005-511023号公报)，作为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)(日本特表2005-526979号公报)，位于染色体带1p36.13的区域、调节肌动蛋白细胞骨架的解聚的发生·促分化因子1(DDEFL1)(日本特表2005-503176号公报)等由基因或多肽构成的肝细胞癌的肿瘤标记物。

进一步地，公开了由下述基因或多肽构成的肝细胞癌的肿瘤标记物：染色体区域的8p12、16p13.2-p13.3、16q23.1-q24.3或19p13.2-p13.3区域中的缺损的有无(日本特开2006-94726号公报)，编码富半胱氨酸分泌蛋白的家族的Wnt-1(日本特开2007-139742号公报)，氨基甲酰基-磷酸酯合成酶L链MGC47816和含有螺旋-环-螺旋区和橙色域(orange domain)的蛋白质HES6的基因(日本特表2007-506425号公报)，由SEMA5A(臂板蛋白5A)、SLC2A2(溶质载体家族成员)、ABCC2(ATP结合盒亚家族-C成员2)、或HAL(组氨酸脱氨酶)构成的细胞关联性的肝细胞癌(HCC)蛋白质(日本特表2007-534722号公报)，或人α2、6唾液酸转移酶(日本特开2007-322373号公报)等。

最近，作为对于肝细胞癌的特异性高的标记物，公开了关注于血清中的糖蛋白质的构成糖链组的肝细胞癌标记物(日本特开2007-278803号公报)。该肝细胞癌标记物由肝细胞癌标记物构成，所述肝细胞癌标记物由随着肝细胞癌的发病而消失或减少的三唾液酸糖链构成，使用该肿瘤标记物的肝细胞癌的检出按照以下进行，使用标记化的糖链，通过阴离子交换色谱柱进行分离提取，通过使用ODS硅胶色谱柱的高效液相色谱得到洗脱图案，利用该洗脱图案进行分析，由此算出从检样中制备的肝细胞癌标记物的量。

另一方面，也公开了一些用于检出包括肝内胆管癌的胆管癌的肿瘤标记物。例如日本特表2003-527583号公报中公开了使用胰蛋白酶原活化肽(TAP)作为胆管-胰脏系癌的检出用标记物，日本特开2005-304497号公报中公开了使用选自ZNF131、DOC2、DAB2、PC4、SKP2、CDH10、CDH12、TERT、CDK5、BA11、PSCA、MLZE、RECQL4、BCL1、FGF4、ITGB4、存活素(survivin)、SRC、PTPN1、PCTK1、CTAG中的1种以上基因组基因作为胆管癌的基因标记物，WO2005/023301中公开了使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体作为胆管癌诊断药，以及日本特开2008-72952号公报中公开了使用由选自(1)胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growthfactor-binding protein)5(IGFBP5)、(2)闭合蛋白(Claudin)4(CLDN4)、(3)PDZ和LIM域7(PDLIM7)、以及(4)双糖链蛋白多糖(Biglycan)(BGN)中的除了闭合蛋白(Claudin)4的1种基因、或至少2种基因的碱基序列构成的核苷酸作为用于检出胆管癌的标记物。而且，对于胆管癌和闭合蛋白(Claudin)4的关系本身来说，在“Modern Pathology 19，460-469(2006)”中有报告。

从包括肝内胆管癌的胆管系肿瘤的克服战略等观点考虑，原发性肝癌中的肝细胞癌、肝内胆管癌、以及可以确认两者的成分的混合型肝细胞癌的鉴别诊断是重要的。作为组织标记物，一直以来使用细胞角蛋白(cytokeratin)，最近，还关注EpCAM等新的标记物。但是，这些现有的标记物，由于不仅胆管癌形成阳性，而且正常胆管、周边的间质区域也形成阳性，因此期待开发胆管癌更特异性的标记物(Cytokeratinl：OncologyRep.17，737-741，2007；Cytokeratin2：Med.Pathology 9，901-909，1996；EpCAM1：Gastoroenterology 136，1012-1024，2009；EpCAM2：CancerRes.68，1451-1461，2008)。

如上所述，为了早期检出肝细胞癌、肝内胆管癌等肝癌，公开了很多癌检出用标记物，但是由于该肿瘤标记物的大部分为由在肝癌中表达的基因、多肽构成的肝癌的肿瘤标记物，因此，在用于检出基因的表达的复杂操作、用于特异性地检出癌种的检出精度的问题等临床上的适用性方面，或癌种类的鉴别诊断或癌检出的灵敏度、精度方面，在医疗现场，作为正确且简便地使用的用于肝癌的早期检出·诊断的检出手段，存在很多限制，未必可以令人满意。此外，在以在肝癌中表达的基因作为肿瘤标记物、检出肝癌的产生的方法中，例如将胆汁等物质作为受检样品时，不能适用。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平8-184594号公报

专利文献2：日本特开2002-323499号公报

专利文献3：日本特开2004-105013号公报

专利文献4：日本特开2005-304497号公报

专利文献5：日本特开2006-94726号公报

专利文献6：日本特开2007-139742号公报

专利文献7：日本特开2007-278803号公报

专利文献8：日本特开2007-322373号公报

专利文献9：日本特开2008-72952号公报

专利文献10：日本特表2003-527583号公报

专利文献11：日本特表2005-503176号公报

专利文献12：日本特表2005-511023号公报

专利文献13：日本特表2005-526979号公报

专利文献14：日本特表2007-506425号公报

专利文献15：日本特表2007-534722号公报

专利文献16：WO2005/023301

非专利文献

非专利文献1：New Eng.J.Med.310，1427-1431(1984)

非专利文献2：Modern Pathology 19，460-469(2006)

非专利文献3：Oncology Rep.17，737-741(2007)

非专利文献4：Med.Pathology 9，901-909(1996)

非专利文献5：Gastoroenterology 136，1012-1024(2009)

非专利文献6：Cancer Res.68，1451-1461(2008)

发明内容

为了对于癌有效地进行治疗，对于肝癌通过早期发现来进行早期治疗是比什么都重要的对策。原发性肝癌中存在来源于肝细胞的肝细胞癌和来源于胆管上皮细胞的肝内胆管癌，任意一种都期待早期检出，通过正确的鉴别诊断，实施适当的治疗，从而治愈。特别是与肝细胞癌相比，肝内胆管癌，由于外科上切除后的存活率低，早期发现和正确的诊断是必要的。但是，肝内胆管癌难以早期发现。进一步地，通常的经验是，即使在CT扫描等图像诊断中可以检出，鉴别为肝细胞癌也是困难的。

因此，本发明的目的在于，提供在早期用简便的方法，灵敏度良好且切实地检出、辨别作为肝脏原发的恶性肿瘤的肝内胆管癌的方法以及用于此的试剂盒，进一步地，具体地说，提供对于肝内胆管癌，通过可以明确地与肝细胞癌鉴别的癌标记物，在适用性、灵敏度、精度方面，以临床上容许的性能进行早期检出以及辨别的方法，且通过简便的手法，用医疗现场中可以适用的方法，检出肝内胆管癌的方法以及用于此的试剂盒。

本发明人为了解决上述课题对于用于在临床现场中可以适用的肝内胆管癌的检出方法的癌标记物进行深入研究过程中，通过本发明人的发现，由细胞分泌的糖蛋白质的糖链会根据正常细胞由来、或癌细胞的种类变化而特异性地变化，着眼于此，使用凝集素微阵列分析，探索特异性地识别肝内胆管癌的糖链生物标记物的过程中，发现特异性地识别肝内胆管癌的糖链生物标记物，即发现由凝集素WFA(多花紫藤凝集素(Wisteriafioribunda Agglutinin))结合性糖蛋白质构成的糖链生物标记物为特异性地识别肝内胆管癌的癌标记物，从而完成本发明。

即，本发明由肝内胆管癌的检出方法构成，该方法的特征在于，将由来源于肝内胆管癌的凝集素WFA(多花紫藤凝集素(Wisteria fioribundaAgglutinin))结合性糖蛋白质构成的糖链生物标记物作为癌标记物，检出受检样品中的该癌标记物，由此检出肝内胆管癌。本发明的肝内胆管癌的检出方法可以明确地鉴别肝内胆管癌和肝细胞癌，且在适用性、灵敏度、精度的方面，可以以临床上容许的性能早期检出以及辨别。而且，可以通过简便的手法，以在医疗现场可以适用的方法，检出肝内胆管癌。

本发明中，作为糖链生物标记物，作为特异性地检出肝内胆管癌的癌标记物的“凝集素WFA(多花紫藤凝集素(Wisteria fioribunda Agglutinin))结合性糖蛋白质”中的“凝集素WFA(多花紫藤凝集素(Wisteria fioribundaAgglutinin))”指的是作为来源于多花紫藤(Wisteria fioribunda)(紫藤)的凝集素(Agglutinin)的凝集素。其中，“凝集素”定义为“特异性地识别糖链，并与糖链结合、形成交联的蛋白质”。

本发明中，受检样品中的该癌标记物的存在的检出可以通过使用了标记化的凝集素WFA的WFA染色来进行，或通过标记化的凝集素WFA、作为癌标记物的凝集素WFA结合性糖蛋白质以及识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体的夹层处理法来进行。作为该夹层处理法中使用的识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体，可以举出以CA125、N-CAM-L1、Maspin、和MUC1作为抗原的抗体。

MUC1、CA125、N-CAM-L1和Maspin由于组织染色的结果，胆管癌特异性地发现其表达，因此不仅可以为胆汁、血清标记物，而且在组织中也可以为有力的标记物候选分子。原发性肝癌中以百分之几的比率产生的作为肝癌、肝内胆管癌两者的并发型的混合型肝癌，由于肝癌和胆管癌的治疗战略两者不同，其识别诊断是重要的。现状使用的细胞角蛋白(Cytokeratin)、EpCAM等由于并非胆管癌特异性，通过将上述候选分子活用为识别标记物，可以有助于提高诊断的正确性的的可能性值得期待。其它的上述候选分子中，由于在胆管癌之外也发现其表达，作为组织标记物的有用性低，但是在胆汁、血清中，通过与WFA组合，有可能辨别胆管癌和其以外的疾病患者以及健康者。

本发明中，作为肝内胆管癌的检出用夹层处理法进行时使用的“标记化的凝集素WFA”，可以使用荧光标记的WFA。本发明的肝内胆管癌的检出方法用夹层处理法进行时，“识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体”优选将该抗体固化在支撑体上，利用标记化的凝集素WFA，以夹层的方式准备作为癌标记物的凝集素WFA结合性糖蛋白质，使用该夹层处理法来检出。上述夹层处理法中，也可以替代将抗体固化在支撑体上，而在将含有凝集素WFA的多种凝集素固化在支撑体上而成的反应场所上示出凝集素WFA结合性糖蛋白质，使用标记的该抗体来检出。

将含有凝集素WFA的多种凝集素固化在支撑体上，示出凝集素WFA结合性糖蛋白质，使用标记的该抗体来检出的方法中，可以将凝集素WFA直接固化在支撑体上来进行(直接法)，作为该方法的改良方法，通过使凝集素WFA为生物素化WFA，以将该凝集素WFA固化在涂布有抗生蛋白链菌素的支撑体上的方式制备(间接法)，可以大幅增进检出灵敏度的提高和本底的减少。

WFA结合性糖蛋白质的测定使用夹层处理法时，该测定可以利用ELISA、免疫色谱、放射性免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA法)、化学发光免疫测定、倏逝波分析法等。这些方法对于所属领域的技术人员来说为公知，可以选择任意一种方法。此外，这些方法可以按照通常的顺序实施，实际的反应条件的设定等在所属领域的技术人员通常可以进行的技术范围内。其中，特别优选使用分别使用了抗体和凝集素作为蛋白质结合物质和糖链结合物质的凝集素·抗体夹层ELISA。

夹层处理法中，将蛋白质结合物质或糖链结合物质中的任意一种与固相结合。以下将固化的结合物质称为“捕获剂”，另一方称为“检出剂”。作为将捕获剂固化的支撑体(固相)，可以举出板(例如微孔板)、微阵列基板(例如微阵列用载波片)、管、珠(例如塑料珠、磁珠)、色谱用载体(例如Sepharose(商标))、膜(例如硝化纤维素膜、PVDF膜)、凝胶(例如聚丙烯酰胺凝胶)等。其中，优选使用板、珠和膜，从操作的简便性方面考虑，最优选使用板。捕获剂只要得到充分的结合强度则可以用任意一种方法进行固化，例如通过共价键合、离子键合、物理性吸附等来固化。此外，也可以使用预先将捕获剂固化的支撑体。

检出剂可以间接性或直接性地被标记物质标记。作为标记物质的例子，可以举出荧光物质(例如FITC、罗丹明、Cy3、Cy5)、放射性物质(例如¹³C、³H)、酶(例如碱性磷酸酶、过氧化物酶(辣根过氧化物酶等)、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶)等。此外，可以将检出剂用生物素标记，(抗生蛋白链菌素)亲和素用上述标记物质标记，利用生物素与(抗生蛋白链菌素)亲和素的结合。

使用酶作为标记物质时，使用对应于所使用的酶的适当的底物来进行检出。例如，作为酶，使用过氧化物酶时，使用邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)等作为底物；作为酶，使用碱性磷酸酶时，使用对硝基苯基磷酸酯(PNPP)等作为底物。对于酶反应终止液、底物溶解液，可以根据所选择的酶，适当选择以往公知的物质来使用。

捕获剂与体液样品中的WFA结合性标记物糖蛋白质形成复合体。对该复合体适用检出剂，对此时产生的信号进行测定，由此对体液中的WFA结合性标记物糖蛋白质进行检出、定量。信号的测定可以根据所使用的标记物质使用适当的测定装置来进行。

对比于与抗体的结合，糖链与凝集素的结合弱，因此通常抗原抗体反应的结合常数为10⁶～10⁹M^-1，而凝集素与糖链间的结合常数为10⁴～10⁷M^-1。使用凝集素作为糖链结合物质时，优选使用倏逝波激发型荧光检出法来进行信号的检出。倏逝波激发型荧光检出法是指利用在载波片的端面(侧面)产生全反射的条件下入射光时，在玻璃(固相)和水(液相)等折射率不同的2相之间的情况下，仅在距离界面数百nm左右的近场渗出称为倏逝波的射程距离极短的光(称为近场光)的方法。通过该方法，将荧光物质的激发光从端面入射，仅激发存在于近场的荧光物质，进行荧光观察。倏逝波激发型荧光检出法记载于Kuno et al.，Nature Methods，2，851-856(2005)等中。该检出可以使用GlycoStation^TMReader1200(モリテシクス)等。

作为糖链结合物质，使用凝集素。“凝集素”为识别特定的糖链结构并与该糖链结构结合的蛋白质的总称。糖链通常由多种糖构成，由于各种糖的结合方式各种各样，具有多种多样、复杂的结构。作为凝集素，已知多种来源于动植物的凝集素，可以举出例如作为对于半乳糖具有亲和性的动物凝集素家族的半乳凝集素，作为钙离子依赖性的动物凝集素家族的C型凝集素，对于糖胺聚糖具有一定亲和性的膜联蛋白，豆科凝集素，篦麻毒素等。本发明中，使用来源于紫藤的凝集素WFA(多花紫藤凝集素(Wisteria fioribunda Agglutinin))。

凝集素可以根据应该检出的糖蛋白质所具有的糖链结构适当选择。作为用于分析糖蛋白质的糖链结构的技术，可以举出通过前沿亲和色谱(FAC)、凝集素微阵列、MS或MSⁿ(质量分析或串联质量分析法)等进行糖链谱分析。若确定了糖蛋白质的糖链结构则可以基于该信息来选择适当的凝集素。对于凝集素的信息，可以由凝集素前沿数据库(Lectin FrontierDataBase)(LfDB)、或产业技术综合研究所·糖链医工学研究中心的主页等得到。

作为与WFA结合性标记物糖蛋白质的蛋白质部分特异性结合的物质，优选使用抗体。作为这样的抗体，可以使用市售的抗体，也可以基于WFA结合性标记物糖蛋白质的序列信息，通过本身公知的方法制备对于WFA结合性标记物糖蛋白质的蛋白质部分特异性的抗体。

基于上述WFA结合性标记物糖蛋白质的序列信息，制备其部分肽，根据以下记载的本身公知的方法，可以制备抗WFA结合性标记物糖蛋白质抗体。作为这些肽，只要所制备的抗WFA结合性标记物糖蛋白质抗体对于样品中可能含有的无关的抗原不发生交差反应，则可以使用任意的肽，可以含有1～数个氨基酸的置换、附加、缺失等。例如该肽可以为与WFA结合性标记物糖蛋白质的糖链结合氨基酸残基接近的肽或远离的肽。

本发明中使用的抗体可以为多克隆抗体、单克隆抗体中的任意一种。这些抗体可以通过本身公知的抗体或抗血清的制备方法来制备。抗体的制备中使用WFA结合性标记物糖蛋白质的蛋白质部分作为抗原。

使用本发明的肝内胆管癌的检出方法，进行肝内胆管癌的早期检出时，作为用于检出肝内胆管癌的受检样品，可以使用含有胆汁的临床检样或临床切片。使用该受检样品，可以以高精度检出肝内胆管癌，由此可以进行使用以往的基因标记物时难以实现的、在医疗现场的简便且精度高的、产生肝内胆管癌的早期检出。通过使用本发明的肝内胆管癌的检出方法，可以检出受检样品的肝内胆管癌，早期检出、辨别肝脏原发的肝内胆管癌。

本发明包括可用于实施本发明的肝内胆管癌的检出方法的，装备有标记化的凝集素WFA和识别凝集素WFA结合性糖蛋白质、并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体的肝内胆管癌检出和/或辨别用试剂盒。作为该识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体，可以举出以CA125、N-CAM-L1、Maspin、和MUC1作为抗原的抗体中的1种或2种以上抗体。

作为胆管癌标记物，可以举出组织标记物(细胞诊断标记物)、胆汁标记物、血清标记物。作为可以活用上述识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体的诊断期，对于通过组织染色确认胆管癌特异性表达的MUC1、CA125、N-CAM-L1和Maspin的4个分子，血清、胆汁标记物当然也具有作为组织标记物的有用性。另一方面，对于并非胆管癌特异性的染色的其它的抗体，通过与WFA组合，发现胆汁、血清作为标记物的有用性。组织染色的结果中，有必要根据各诊断期来简化抗体，至于胆汁、血清，与WFA组合是重要的。

该识别凝集素WFA结合性糖蛋白质、并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体，优选为将该抗体固化而成的方式，作为凝集素覆盖检出用的肝内胆管癌的检出和/或辨别用试剂盒而制备的抗体。上述夹层处理法中，也可以替代将抗体固化在支撑体上，而将凝集素WFA固化在支撑体上，将该抗体覆盖来检出。将凝集素WFA固化在支撑体上时，可以将凝集素WFA直接固化在支撑体上来进行(直接法)，作为该方法的改良方法，通过使凝集素WFA为生物素化WFA，以将该凝集素WFA固化在涂布有抗生蛋白链菌素的支撑体上的方式制备(间接法)，可以大幅增进检出灵敏度的提高和本底的减少。

即，具体地说，本发明由下述构成：(1)肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，通过将凝集素WFA结合性糖蛋白质作为癌标记物，体外检出受检样品中的该癌标记物，来检出肝内胆管癌；(2)上述(1)记载的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，将凝集素WFA结合性糖蛋白质作为癌标记物的肝内胆管癌的检出，是将凝集素WFA结合性糖蛋白质作为糖链生物标记物，来检出该糖链生物标记物的肝内胆管癌特异性的糖链结构；(3)上述(1)记载的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，受检样品中的癌标记物的存在在体外的检出通过使用标记化的凝集素WFA的受检细胞的WFA染色来进行；(4)上述(1)记载的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，受检样品中的该癌标记物的存在的检出通过凝集素WFA、作为癌标记物的凝集素WFA结合性糖蛋白质以及识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体的夹层处理法来进行；(5)上述(4)记载的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体，为以CA125、N-CAM-L1、Maspin、和MUC1作为抗原的抗体中的1种或2种以上抗体。

此外，本发明由下述构成：(6)上述(4)记载的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，凝集素WFA、作为癌标记物的凝集素WFA结合性糖蛋白质以及识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体的夹层处理法，使用标记化的凝集素WFA或标记化的识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体来进行；(7)上述(4)记载的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，通过凝集素WFA、作为癌标记物的凝集素WFA结合性糖蛋白质以及识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体的夹层处理法进行的肝内胆管癌的检出，通过凝集素覆盖或抗体覆盖来进行，所述凝集素覆盖，通过将识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体固化在支撑体上，利用标记化的凝集素WFA，将作为癌标记物的凝集素WFA结合性糖蛋白质夹在中间而形成；所述抗体覆盖，通过将凝集素WFA固化在支撑体上，利用标记化的抗体，将作为癌标记物的凝集素WFA结合性糖蛋白质夹在中间而形成；(8)上述(7)记载的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，通过抗体覆盖或凝集素WFA覆盖进行的肝内胆管癌的检出，使用微阵列，利用凝集素微阵列检出手段或抗体微阵列检出手段来检出；(9)上述(1)记载的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，用于肝内胆管癌在体外检出的受检样品，为由胆汁或血液构成的临床检样或临床切片；(10)肝内胆管癌的辨别方法，其特征在于，使用上述(1)记载的肝内胆管癌的检出方法，体外检出受检样品的肝内胆管癌，辨别肝脏原发的恶性肿瘤中的肝内胆管癌。

进一步地，本发明由下述构成：(11)凝集素WFA结合性糖蛋白质癌标记物在肝内胆管癌的检出方法中的应用，所述肝内胆管癌的检出方法是通过将凝集素WFA结合性糖蛋白质作为癌标记物，体外检出受检样品中的该癌标记物，来检出肝内胆管癌；(12)肝内胆管癌检出和/或辨别用试剂盒，装备有标记化的凝集素WFA、识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体，或标记化的识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体以及凝集素WFA；(13)上述(12)记载的肝内胆管癌检出和/或辨别用试剂盒，其特征在于，识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体，为以CA125、N-CAM-L1、Maspin、和MUC1作为抗原的抗体中的1种或2种以上抗体；(14)上述(12)记载的肝内胆管癌检出和/或辨别用试剂盒，其特征在于，识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体，以固化在支撑体上的方式制备，或凝集素WFA以固化在支撑体上的方式制备；(15)上述(14)记载的肝内胆管癌检出和/或辨别用试剂盒，其特征在于，使凝集素WFA为生物素化WFA，以固化在涂布有抗生蛋白链菌素的支撑体上的方式制备该凝集素WFA。

本发明的肝内胆管癌的检出方法，提供在适用性、灵敏度、精度的方面以临床上容许的性能早期检出以及辨别难以与肝细胞癌鉴别、难以早期正确发现的肝内胆管癌的方法，且通过简便的手法，用医疗现场可以适用的方法检出肝内胆管癌的方法。特别是本发明的肝内胆管癌的检出方法，由于使用含有胆汁的临床检样或临床切片作为用于检出肝内胆管癌的受检样品，可以高精度地检出肝内胆管癌，因此可以进行使用以往的基因标记物时难以实现的、医疗现场的简便且精度高的、肝内胆管癌的产生的早期的检出。进一步地，本发明中，为了实施肝内胆管癌的检出方法而提供的肝内胆管癌的检出和/或辨别用试剂盒，提供具有肝内胆管癌的检出的简便性和精度的医疗现场可以容易地适用的临床适用上优异的试剂盒。

特异性地检出肝内胆管癌的标记物候选分子中，特别是发现胆管癌特异性地染色的MY.1E12结合性MUC1、CA125、N-CAM-L1和Maspin，提供用于通过组织染色而识别诊断混合型肝癌中的肝内胆管癌的组织标记物。以往的诊断中进行的胆汁细胞诊断，除了结果取决于胆汁的采取法、标本制作技术之外，而且在辨别细胞的形状的诊断者之间，结果的差异大，灵敏度也低。与该问题相对地，通过除了进行组织染色之外，还利用含有WFA的这些分子进行细胞染色，与以往的细胞诊断相比，可以作为能够精度更良好地进行辨别的细胞诊断标记物活用。

附图说明

[图1]为表示根据本发明的使用含有胆汁的临床检样的肝内胆管癌检查的最优方式的图。“a”表示使用抗体固定孔板的情况(直接性、间接性地覆盖荧光标记的凝集素，选择性地检出用抗体捕获的候选分子中与WFA结合的分子的情况)。“b”表示使用WFA固定孔板的情况(直接性、间接性地覆盖荧光标记的抗体，选择性地检出用WFA捕获的候选分子的情况)。

[图2]为表示本发明的实施例中的肝内结石症并发以及非并发型肝内胆管癌组织切片中癌部和非癌部的利用凝集素阵列进行的比较糖链谱分析中，统计分析WFA信号的结果的图。“a”表示结石并发型的情况，“b”表示结石非并发型的情况(信号在癌部都显著上升)。“c”表示通过ROC曲线求出辨别癌和非癌的检出能力的结果(其灵敏度为84％、特异度为92％，表示良好地辨别)。

[图3]为表示本发明的实施例中，将肝内胆管癌患者组织切片通过WFA(FITC染色、绿)和MY.1E12抗体(Cy5染色、红)双重染色而得到的结果的图(WFA阳性部位与利用作为公知的肝内胆管癌标记物抗体的MY.1E12得到的染色区域大致一致)。

[图4]为表示本发明的实施例中，对于为了解除由于肝内胆管癌所导致的阻塞性黄疸而实施胆管引流、此时的胆汁细胞诊断中检出癌细胞的患者，通过细胞诊断标本的WFA染色进行组织化学分析的结果的图。

[图5]为表示在对于本发明的实施例中的WFA结合性蛋白质候选分子的简化的试验例中，通过使用对于标记物候选分子的抗体的组织染色得分进行简化的结果，得到有力的候选分子(MUC1、CA125、Maspin、N-CAM-L1、乳铁蛋白(Lactoferrin)、组织蛋白酶(Cathepsin)W、胶原蛋白(Collagen)IV)，对于这些候选分子(MUC1、CA125、Maspin、N-CAM-L1、乳铁蛋白(Lactoferrin)、组织蛋白酶(Cathepsin)W、胶原蛋白(Collagen)IV)，使用肝内胆管癌组织切片，通过各候选分子抗体进行组织染色的结果的图。

[图6]为表示本发明的实施例中的试验例中，以肝内胆管癌患者30例、肝内结石症患者22例的胆汁为对象，使用WFA固定孔板，间接性地覆盖荧光标记的MY.1E12抗体，选择性地检出用WFA捕获的候选分子的分析结果的图。“a”为表示所得到的信号，以不含有MY.1E12结合性MUC1的健康者血清作为负对照(N)，以S/N比进行数值化、作图而成的结果的图。此外，“b”为通过ROC曲线求出辨别癌和结石症的检出能力的图(其灵敏度为90％、特异度为60％)。

[图7]为表示本发明的实施例中的对于使用胆汁的肝内胆管癌的检出的试验例中，在夹层ELISA的改良WFA对ELISA·板的固定化中，将未标记的WFA固定到微量滴定板(グライナ一社制96孔平底高结合性板)，但是将板变更为涂布有抗生蛋白链菌素的板(NUNC公司制96孔平底涂布有抗生蛋白链菌素的板)，将固定化的WFA由未标记的WFA变更为生物素化WFA(Vector公司制)，将固定化改良为抗生蛋白链菌素-生物素的体系的示意图的图。

[图8]为表示本发明的实施例中的对于使用胆汁的肝内胆管癌的检出的试验例中，通过MY.1E12结合性MUC1-WFA和CA125-WFA的夹层·ELISA·抗生蛋白链菌素-生物素的系统，将WFA固定化时的WFA-MY.1E12·夹层·ELISA的结果。“a”为表示进行作为良性疾病患者的胆囊结石症、总胆管结石症、肝内结石症与胆管癌患者的比较分析的图。“b”为基于a的结果，通过ROC曲线求出的辨别癌和结石症的检出能力的图(其灵敏度为90％、特异度为76％)。此外，也表示通过抗生蛋白链菌素-生物素的系统，将WFA固定化时的WFA-CA125·夹层·ELISA的结果。“c”表示进行作为良性疾病患者的胆囊结石症、总胆管结石症、肝内结石症与胆管癌患者的比较分析的图。“d”为基于c的结果，通过ROC曲线求出辨别癌和结石症的检出能力的图(其灵敏度为57％、特异度为64％)。

[图9]为表示本发明的实施例中的对于使用血液的肝内胆管癌的检出的试验例中，各患者的血清中，WFA-MY.1E12·夹层·ELISA的结果的图。纵轴表示所得到的OD值。“a”表示来源于胆管癌患者的血清5例，“b”表示来源于PBC患者的血清，“c”表示来源于肝内结石患者的血清，“d”表示来源于健康者的血清的结果。

具体实施方式

本发明由肝内胆管癌的检出方法构成，其特征在于，将由来源于肝内胆管癌的凝集素WFA结合性糖蛋白质构成的糖链生物标记物作为癌标记物，检出该糖链生物标记物的肝内胆管癌特异性糖链结构，由此检出肝内胆管癌。本发明中，作为糖链生物标记物，与作为特异性地检出肝内胆管癌的癌标记物的“凝集素WFA(多花紫藤凝集素(Wisteria fioribundaAgglutinin))结合性糖蛋白质”结合的“凝集素WFA(多花紫藤凝集素(Wisteria fioribunda Agglutinin))”是指作为来源于多花紫藤(Wisteriafioribunda)(紫藤)的凝集素(Agglutinin)的凝集素。该“凝集素WFA”本身为公知的凝集素，可以容易地得到。本发明中，“凝集素WFA”通过荧光标记等，标记化来使用。或固定在基板、琼脂糖等支撑体上，用于由胆汁仅对WFA结合性蛋白质组进行示出或捕获、富集。

本发明中，为了预先鉴定“凝集素WFA结合性糖蛋白质”(简化候选分子)，优选作为糖蛋白质的糖链结合性凝集素，使用将WFA(多花紫藤凝集素(Wisteria fioribunda Agglutinin))固定在琼脂糖等上而成的支撑体，由胆汁等生物体样品捕获、富集WFA结合性蛋白质。所富集的蛋白质可以通过使用质量分析等的蛋白质组学来鉴定。

本发明的肝内胆管癌的检出方法中，对于受检样品中的该癌标记物的存在，可以通过使用标记化的凝集素WFA的WFA染色，或通过标记化的凝集素WFA、作为癌标记物的凝集素WFA结合性糖蛋白质以及识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体的夹层处理法来进行。使用本发明的夹层处理法的肝内胆管癌的检出的图如图1所示。该图中，使用抗体固定孔板，直接性、间接性地覆盖荧光标记的凝集素，选择性地检出用抗体捕获的候选分子中与WFA结合的分子的情况的肝内胆管癌的检出的图如图1的“a”所示，使用WFA固定孔板，直接性、间接性地覆盖荧光标记的抗体，选择性地检出用WFA捕获的候选分子的情况的肝内胆管癌的检出的图如图1的“b”所示。

本发明中，使用夹层处理法检出肝内胆管癌时，制备识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体。该抗体可以由市售的或公知的抗体中筛选。作为该识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体，可以举出以CA125(Hytest Ltd)、N-CAM-L 1(R&D systems，Inc.)、Maspin(Santa CyuzBiotechnology，Inc.)、和MUC1作为抗原的抗体。从而特异性地检出肝内胆管癌的标记物候选分子中，特别是发现胆管癌特异性地染色的MY.1E12结合性MUC1、CA125、N-CAM-L1和Maspin提供用于通过组织染色而识别判断混合型肝癌中的肝内胆管癌的组织标记物。

在本发明的使用夹层处理法检出肝内胆管癌时，对于将识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体固化在阵列上，利用标记化的凝集素WFA，将作为癌标记物的凝集素WFA结合性糖蛋白质夹在中间而形成的凝集素覆盖·抗体微阵列，可以通过微阵列检出手段来检出，作为通过上述微阵列检出手段进行的检出，可以使用利用倏逝波激发荧光法的检出(《实验医学》Vol.25，No.17(增刊)P164-171，2007)。此外，本发明的肝内胆管癌的检出法中，使用WFA固定孔板，直接性、间接性地覆盖荧光标记的抗体，选择性地检出用WFA捕获的候选分子的夹层ELISA法可以用作特别优选的肝内胆管癌的检出法。

为了实施本发明的肝内胆管癌的检出和/或辨别方法，如上所述，可以使用装备有标记化的凝集素WFA和识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体的肝内胆管癌检出和/或辨别用试剂盒，该试剂盒可以使用将识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体固化在阵列上而成的试剂盒，或将凝集素WFA固化在阵列上而成的试剂盒制备成检出用而得到的试剂盒。作为该抗体，可以举出以CA125、N-CAM-L1、Maspin、和MUC1作为抗原的抗体。

通过本发明的肝内胆管癌的检出方法，检出肝内胆管癌的存在时，制备并使用用于肝内胆管癌的检出的来源于患者的受检样品。本发明中，作为受检样品，使用由患者采取的含有胆汁的临床检样或临床切片。使用临床切片的方法适合于末梢型的肝内胆管癌的检出，使用胆汁的方法适合于肝门部型的肝内胆管癌的检出。使用该受检样品，通过上述检出手段，检出癌的存在。

以下通过实施例对本发明进行具体的说明，但是本发明的技术范围不限于这些例示。

实施例1

[使用凝集素阵列的肝内胆管癌特异糖链识别凝集素的选择]

(试验方法)

凝集素微阵列为特异性不同的40种以上的植物凝集素被固定化在同一基板上，同时分析与成为分析对象的糖蛋白质上的糖链的相互作用(结合性)的系统(Kuno et al.，Nature Methods 2，851-856，2005)。使用其尝试简化对于肝内胆管癌特异性染色来说最优的凝集素。本实验中，使用结石症并发型患者14例(同一切片内癌部·非癌部区域)、结石症非并发型患者10例(同一切片内癌部·非癌部区域)、结石症非并发型患者癌部21例和结石症非并发型患者非癌部14例。换而言之，总分析数为癌部45例和非癌部38例。而且，由组织切片回收蛋白质，直至荧光标记后进行凝集素阵列分析的试验方案根据松田等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.370，259-263，2008)进行。

<1.由组织切片回收蛋白质>

首先记录通过显微镜确认的各样品的癌部和非癌部区域(大致相当于1×1mm)，将该组织片段回收到预先加入有10mM柠檬酸(pH 6.0)200μL的1.5mL容量的微管中。对于得到的加入有组织片段的溶液，为了通过福尔马林解离分子内和分子间的交联，在95℃下进行处理90分钟。热处理后，在20000×g、5分钟、4℃的条件下进行离心分离，除去上清。向含有剩余的组织片段的颗粒中加入PBS(-)200μL(缓冲液交换步骤)。进一步地，在20000×g、5分钟、4℃的条件下进行离心后，除去上清，向颗粒中加入0.5％NP40-PBS 20μL。颗粒通过超声波粉碎而细粒化后，在冰上反应60分钟，使膜蛋白质可溶化。反应后，在20000×g、5分钟、4℃的条件下进行离心，上清作为组织抽提蛋白质回收。

<2.蛋白质的荧光标记>

将所回收的所有的组织抽提蛋白质溶液，添加到预先每10μg细分到PCR管中的Cy3-SE(GEヘルスケア社制)中。室温、暗处进行1小时化学反应后，为了完全终止反应，添加含有甘氨酸的缓冲液180μL，室温、暗处反应2小时。得到的溶液作为来源于荧光标记组织切片的蛋白质溶液。

<3.凝集素阵列分析>

将来源于荧光标记组织切片的蛋白质溶液通过凝集素阵列用缓冲液稀释到2倍、8倍，各60μL添加到凝集素阵列的各反应槽中。而且，由8个反应槽构成的凝集素阵列底座的制造根据内山等人(Proteomics8，3042-3050(2008))的手法。20℃下相互作用反应1晚后，将各反应槽用凝集素阵列用缓冲液洗涤3次，根据常规方法进行扫描。得到的扫描数据根据常规方法将信号作为净强度(Net Intensity)进行数值化，接着为了统计分析，根据久野等人(Journal of Proteomics and Bioinformatics 1，68-72(2008))的手法标准化。

<4.统计分析>

将标准化的所有数据，用于癌部和非癌部的2组比较检验。各数据用于对于各凝集素，使用Whelch′s t-test、ROC曲线分析检验显著差异，选择肝内胆管癌中表现出显著的信号上升的凝集素。

(结果)

如表1(肝内胆管癌组织癌部(T)和非癌部(N)区域中糖蛋白质的比较糖链谱分析结果)所示，由凝集素微阵列后的统计分析可知，5种凝集素中，与非癌部相比，癌部中表现出2倍以上的结合信号，WFA特异度最高(4.6倍)。因此，对于结石症并发型14个病例、结石症非并发型10个病例，对于癌部和非癌部的WFA信号，通过Whelch′s t-test，统计上确认显著差异有无后可知，风险系数分别为P＜0.0001、P＝0.0015。此外，通过ROC曲线分析，其灵敏度为84％、特异度为92％、AUC为0.93。

结果如图2所示(肝内结石症并发以及非并发型肝内胆管癌组织切片中癌部和非癌部的通过凝集素微阵列进行的比较糖链谱分析中WFA信号的统计分析的结果)。由此暗示通过WFA进行的组织染色可以检出切片中肝内胆管癌。此外发现，WFA结合糖链(WFA结合性糖蛋白质)可以成为肝内胆管癌的特异性标记物。

[表1]

平均值(Average)表示癌部45例、非癌部38例的平均值。此外黑体表示T/N比超过2。

实施例2

[使用肝内胆管组织检出肝内胆管癌]

由实施例1通过利用WFA的组织染色，可以检出组织切片中肝内胆管癌的可能性，因此对于肝内胆管癌患者组织切片结石非并发型病例，如下所述进行研究。

(实验方法)

利用WFA的组织染色，使用染色试剂盒：Histo-fine(ニチレイ)，按照如下实施。首先，对于福尔马林固定肝内胆管癌患者组织切片(5μm厚)，根据常规方法将覆盖在组织切片上的石蜡脱石蜡化。脱石蜡化的组织切片用PBS洗涤、风干后，浸渍在10mM柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中，121℃下在高压釜中处理15分钟，由此通过福尔马林解离分子间(分子内)交联。处理后的切片室温下放置一会后，在PBS中反复浸渍5分钟3次，洗涤组织表面。然后，用0.3％H²O²-MeOH室温下处理10分钟，由此进行内在性过氧化物酶的封闭反应。

用PBS洗涤(5分钟、3次)后，在1％BSA-PBS中室温下反应10分钟，进行抑制生物素化凝集素的非特异性吸附的封闭反应。进一步地，用PBS洗涤5分钟、3次后，将生物素化WFA溶液(Vector公司制、以5μg/mL用HEPES悬浮)添加到组织切片上，在保湿箱中20℃下结合反应2小时。用PBS洗涤(5分钟、3次)后，接着加入抗生蛋白链菌素溶液，在保湿箱中室温下反应10分钟。进一步用PBS洗涤(5分钟、3次)后，加入底物溶液，室温下显色反应约5分钟。为了终止反应，在MilliQ水中5分钟浸渍3次。最后用苏木精室温下处理1分钟，将核酸染色后，用流水洗涤。

(结果)

对于肝内胆管癌的诊断标记物的有力候选的WFA，通过免疫组织化学对正常肝(转移性肝癌)25例、肝内胆管癌90例、混合型肝癌10例、肝细胞癌25例的标本中的表达进行研究。如表2(组织染色的结果)所示，正常胆管上皮中为8例(32％)，肝内胆管癌中为83例(88％)，混合型肝癌的胆管细胞癌部分为8例(80％)，在其癌腺管上皮发现WFA配体的表达。混合型肝癌的肝细胞癌部分、肝细胞癌中未发现WFA配体的表达。由此认为WFA作为肝内胆管癌以及混合型肝癌的诊断标记物是有用的。此外，对于WFA表达的有无，从肝内胆管癌的临床病型分类的方面考虑进行比较研究后可知，未发现由于部位(肝门部型、末梢型)或肉眼型(肿瘤形成型、胆管浸润型、混合型、胆管内发育型)而造成的WFA配体的表达频率的变动。

此外，有意思的是，WFA阳性部位与利用作为公知的肝内胆管癌标记物抗体的MY.1E12(J.Cancer Res.，87：488-496，1999；Hepatology，30：1347-1355，1999)得到的染色区域大致一致(图3：肝内胆管癌患者组织切片的免疫组织化学：胆管癌都被WFA、MY.1E12染色)。因此，表示作为MY.1E12抗原的MUC1为WFA结合性蛋白质之一。

[表2]

^*BDE：胆管上皮

实施例3

[使用混入到胆汁中的细胞检出肝内胆管癌]

为了解除阻塞性黄疸而实施胆管引流，将此时采取的胆汁作为检样进行分析。按照与实施例2相同的顺序实施WFA染色后，在病理组织诊断和细胞诊断中确定癌的存在的检样中，确认WFA阳性的细胞，细胞学上鉴定为癌。但是，在病理组织和细胞诊断中为阴性的检样中，未确认被WFA染色的细胞(图4：细胞标本中的通过WFA染色进行的组织化学分析的结果)。

实施例4

[凝集素WFA结合性糖蛋白质的鉴定]

(实验方法)

由组织切片的WFA结合性糖蛋白质的捕获以及该蛋白质的鉴定按照以下的顺序实施。而且，由于所鉴定的蛋白质的种类有可能产生病理间差异，因此本实验中进行4位患者病例的实验，将它们汇总作为WFA结合性蛋白质组。

<1.来源于WFA阳性组织区域的蛋白质的抽提>

对于福尔马林固定肝内胆管癌患者组织连续切片(10μm厚)6块，根据常规方法将覆盖在组织切片上的石蜡脱石蜡化。脱石蜡化的组织切片用PBS洗涤、风干。将其中1块用与实施例2相同的方法进行WFA染色。WFA染色组织切片载波片用显微镜确认，确认WFA阳性区域(5×5cm方形左右)后，由5块未染色组织切片载波片，记录WFA阳性区域，将该组织片段回收到预先加入有10mM柠檬酸(pH 6.0)200μL的1.5mL容量的微管中。

对于得到的加入有组织片段的溶液，为了通过福尔马林解离分子内和分子间的交联，在95℃下进行处理90分钟。热处理后，在20000×g、5分钟、4℃的条件下进行离心分离，除去上清。向含有剩余的组织片段的颗粒中加入PBS(-)200μL(缓冲液交换步骤)。进一步地，在20000×g、5分钟、4℃的条件下进行离心后，除去上清，向颗粒中加入0.5％NP40-PBS20μL。颗粒通过超声波粉碎而细粒化后，在冰上反应60分钟，使膜蛋白质可溶化。反应后，在20000×g、5分钟、4℃的条件下进行离心，上清作为组织抽提蛋白质溶液回收。

<2.WFA结合性蛋白质的捕获>

首先将25μg的生物素化WFA固定化在抗生蛋白链菌素固定化磁珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T-1，Dynabeads公司制、100μL)上，将其形成WFA固定化磁珠。将为了预先吸收对珠非特异性地结合的蛋白质而与抗生蛋白链菌素固定化磁珠反应1小时的组织抽提蛋白质溶液添加到WFA固定化磁珠中，4℃下振荡反应一晚。结合反应后，通过磁铁回收珠，接着用含有1％Triton X-100的PBS 1mL将珠洗涤2次。向洗涤后的珠中加入洗脱缓冲液(含有0.1％SDS的PBS)100μL，加热处理5分钟，由此洗脱WFA结合性蛋白质。将其作为WFA结合性蛋白质溶液。

<3.WFA结合性蛋白质的鉴定>

步骤2中得到的WFA结合性蛋白质通过TCA处理而浓缩。将浓缩蛋白质溶液全部量应用于5～20％聚丙烯酰胺凝胶的1孔中，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离后，通过常规方法由银染色凝胶切出蛋白质染色性带。通过常规方法将凝胶中的蛋白质通过胰蛋白酶处理，进行肽片段化，由凝胶抽提、脱盐后，通过质量分析装置鉴定各种蛋白质。

(结果)

此次使用肝内胆管癌4个病例，通过上述实验，作为WFA结合性蛋白质候选分子，鉴定了171个分子。这些候选分子中，本实施例中，限定于抗体有市售的糖蛋白质47个分子，进行以后的简化。候选分子的简化，通过基于对于各分子的详细信息进行的评分，将得分高的分子作为最有力的分子进行简化。

<评分方法(16分满分)>

(1)以转录物组水平，由各组织的候选分子的表达信息，在肝内胆管癌表达的情况，加3分(info)。

(2)由于基本上以分泌蛋白质作为标的，具有信号序列的情况，加3分(S)。

(3)通过登载蛋白质水平的表达信息的Protein Human Atras(HUPO)，确认肝内胆管癌的表达、肝细胞癌组织的表达的情况，加3分，进一步在正常组织中未表达的情况，追加2分(Hu)。

(4)由已经报告的糖链附加信息，确认糖链修饰的情况，加1分(Up)。

(5)由已经报告的文献信息，指出为癌相关分子或确认存在由于癌而表达的增减的变动的情况，加2分，该报告与CCC关联的情况加1分，且指出在胆汁表达的情况，进一步追加1分(J)。

(结果)

结果如表3所示。如表所示，CA125、N-CAM-L1、Maspin、乳铁蛋白(Lactoferrin)、胶原蛋白(Collagen)IV、组织蛋白酶(Cathepsin)W的6个分子总得分为8分以上(16分满分中)，因此除了MUC1之外，将这些也作为肝内胆管癌特异性地表达的WFA结合性蛋白质的最有力候选分子。

[表3]

评分结果

蛋白质名称	N-	O-	info	S	Hu	Up	J	评分
									CA125	69	-		3+2	1	2+1+1	10
胶原蛋白IV型	1	12		3	3		2	8
									组织蛋白酶W	1	3	3	3+2			8
N-CAM-L1	6	15	3	3	3+2	1	2+1	15
									乳铁蛋白	2	0	3	3		2+1	9
Maspin	4	0	3		3+2		2+1	11

实施例5

[WFA结合性蛋白质候选分子的简化]

此时，不过于辨别癌部和非癌部，未考虑到对作为周边区域的间质、肝实质的染色性。因此，接着通过组织染色确认标记物的局部存在，尝试进一步简化。

(组织染色)

对于福尔马林固定肝内胆管癌患者组织连续切片(5μm厚)6块，根据常规方法将覆盖在组织切片上的石蜡脱石蜡化。脱石蜡化的组织切片用PBS洗涤后，在10mM柠檬酸(pH 6.0)缓冲液中，121℃下，在高压釜中处理15分钟，由此进行抗原的赋活化处理。用PBS洗涤后，浸渍在加入有0.3％过氧化氢的甲醇中20分钟，进行内在性过氧化物酶的活性抑制。PBS洗涤后，用正常兔子血清封闭后，加入各抗体(MY.1E12：0.5mg/ml，anti-CA125：1mg/mL，anti-Maspin：2mg/mL，anti-N-CAM-L1：1mg/mL，anti-组织蛋白酶(Cathepsin)W：5mg/mL，anti-胶原蛋白(Collagen)IV：，5mg/mL，anti-乳铁蛋白(Lactoferrin)：1mg/mL，全部小鼠IgG抗体)后，室温下反应1小时。用PBS洗涤后，用Histofine Simple Stain试剂盒(ニチレイ社)进行显色。用灭菌水洗涤后，通过苏木精进行对比染色后，封入。

(结果)

各候选分子的组织染色的典型例如图5所示。此外，其表达图案如表4所示。发现染色的情况表示为(+)，虽然微量但是可以确认染色的情况表示为(-/+)，未发现染色的情况表示为(-)。可以将发现胆管特异性地染色，认为具有作为组织标记物或作为胆汁、血清标记物的有用性的最有力候选组(MUC1、CA125、N-CAM-L1、Maspin)，和并非胆管特异性但是通过与WFA的组合，认为可以作为胆汁、血清中的标记物的候选组(乳铁蛋白(Lactoferrin)、胶原蛋白(Collagen)IV、组织蛋白酶(Cathepsin)W)区别。前者作为含有组织标记物的胆汁、血清标记物是最终有力候选分子。后者作为胆汁、血清标记物是最终有力的候选分子。

[表4]

实施例6

[使用胆汁检出肝内胆管癌1]

作为将由来源于肝内胆管癌的WFA结合性糖蛋白质构成的糖链生物标记物作为癌标记物，检出该糖链生物标记物的肝内胆管癌特异性的糖链结构的最优方式，考虑了对于组织溶解产物、胆汁中含有的糖链生物标记物，以临床上容许的性能且利用临床上可以适用的简便的手段，进行检出以及辨别的方法。以下，作为该例子，对于所选择的7个肝内胆管癌特异性标记物候选分子中，实施例2中作为候选分子举出的MY.1E12抗体结合性MUC1分子，表示以肝内胆管癌患者胆汁作为对象的使用抗体覆盖-WFA孔板(参照图1b)的夹层检出分析的结果。

(实验方法)

<1.WFA固化孔板的制备>

对于微量滴定板(グライナ一社制96孔平底高结合性板)，向各孔中各加入溶解在PBS缓冲液中的WFA(Vector公司制、2.5μg/mL)100μL，室温下保温2小时，将WFA固化到支撑体上。未结合WFA用作为洗涤液的含有0.1％Tween20的PBS(200μL)各洗涤2次，加入作为封闭剂的含有1％BSA的洗涤液各200μL。室温下反应2小时后，用含有0.1％Twenn20的PBS(200μL)各洗涤2次，完成WFA固化孔板。

<2.结合以及检出反应>

首先，胆汁的蛋白质定量通过微BCA蛋白质定量试剂盒(PIERCE公司制)进行。各样品用上述洗涤液稀释到200μg/mL，将其中100μL添加到1中制备的WFA固化孔板中后，室温下结合反应2小时。反应后，各孔用上述洗涤液200μL洗涤5次，除去未结合蛋白质。向其中每1孔加入预先以0.5μg/mL用洗涤液制备的检出剂(MY.1E12抗体溶液)各100μL，室温下进行2小时抗原抗体反应。

为了除去未结合抗体，用洗涤液200μL洗涤后，每1孔加入用洗涤液稀释4000倍的抗小鼠IgG抗体-HRP溶液(Jackson immuno Research公司制)各100μL，室温下保温1小时。各孔用200μL洗涤液洗涤5次后，向各孔中加入作为显色试剂的ULTRA-TMB溶液(Thermo公司制)各100μL，显色反应10分钟。每1孔加入1M的H₂SO₄溶液100μL终止反应，通过酶标仪(プレ一トリ一ダ一，plate reader)在450nm下测定吸光度。得到的信号，将不含有MY.1E12结合性MUC1的健康者血清作为负对照(N)，以S/N比数值化，用于以后的分析。

(结果)

除了来源于肝内胆管癌患者的胆汁30个病例之外，还对于来源于肝内结石症患者的胆汁22个病例进行分析。其结果如图6a所示。可知与肝内结石症患者相比，肝内胆管癌患者中S/N值显著升高。其显著差异通过T-检验，风险系数P＝0.0016。因此，将肝内胆管癌患者作为阳性，肝内结石症患者作为阴性来制作ROC曲线。其结果如图6b所示。辨别癌和结石症的灵敏度为90％，特异度为60％。该成绩比利用迄今报告的任意一种标记物得到的辨别结果优异，如表5(WFA-MY.1E12·夹层·ELISA法与已经报告的相比：斜体表示本发明的实施例，利用现有标记物进行的检查都以文献值表示)所示。特别是灵敏度即检出癌的能力为90％，比现有的手法的最高值71％优异。肝内胆管癌在其特性上要求可以早期发现且假阴性少。换而言之灵敏度高的标记物是重要的。这意味着此次开发的手法为最优异的肝内胆管癌标记物。

[表5]

WFA-MY.1E12·夹层·ELISA法与已经报告的相比

(斜体为本发明实施例)

	灵敏度(％)	特异度(％)
			CA19-9^*1	64.5(±3.2)	63.9(±3.5)
CEA^*1，2	45.2	45.8
			CA125^*1	38.0(±6.3)	90.2(±12.8)
纤维连接蛋白^*3	57.0	79.0
			K-RAS^*4	31.4	98.0
MUC5AC^*5	68.8	90.0
			Mac2-BP^*6	69.0	67.0
WFA-sTMUCl	90.0	59.9

1.J.Gastroenterol Hepatol.(1991).Hepatogastroenterology.(2002).Cancer.(2004)

2.Am.J.Surg.(1996)

3.Hepatogastroenterology.(2003)

4.Clin.Chemistry.(2004).Gut.(2008)

5.Cancer Letter (2007)

6.Cancer(2004)

实施例7

[使用胆汁检出肝内胆管癌2]

为了提高检出灵敏度、减少本底噪音，如图7(夹层ELISA改良)所示，将凝集素的固定化方法由直接法改变为间接法。对候选分子中MY.1E12抗体结合性MUC1分子和CA125进行研究。

(实验方法)

<1.WFA固化孔板的制备>

对于涂布有抗生蛋白链菌素微量滴定板(NUNC公司制96孔平底板)，将溶解在PBS缓冲液中的生物素化WFA(Vector公司制、20μg/mL)每50μL加入到各孔中，室温下保温1小时，将WFA固化到支撑体上。用作为洗涤液的含有0.1％Tween20的PBS(300μL)将未结合生物素化WFA各洗涤2次，完成WFA固化孔板。

<2.结合以及检出反应>

首先，胆汁的蛋白质定量通过微BCA蛋白质定量试剂盒(PIERCE公司制)进行。各样品用上述洗涤液稀释到400μg/mL，将其中50μL添加到1中制备的WFA固化孔板中后，室温下结合反应2小时。反应后，各孔用上述洗涤液300μL洗涤5次，除去未结合蛋白质。向其中每1孔加入预先以0.5μg/mL用洗涤液制备的检出剂(MY.1E12抗体溶液)或以1.0μg/mL用洗涤液制备的检出剂(Anti-CA125抗体)各50μL，室温下进行2小时抗原抗体反应。

为了除去未结合抗体，用洗涤液300μL洗涤后，每1孔加入用洗涤液稀释4000倍的抗小鼠IgG抗体-HRP溶液(Jackson immuno Research公司制)各50μL，室温下保温1小时。各孔用300μL洗涤液洗涤5次后，向各孔中加入作为显色试剂的ULTRA-TMB溶液(Thermo公司制)各100μL，显色反应10分钟。每1孔加入1M的H₂SO₄溶液100μL停止反应，通过酶标仪在450nm下测定吸光度。得到的信号，将不含有MY.1E12结合性MUC1或CA125的健康者血清作为负对照(N)，以S/N比进行数值化，用于以后的分析。

(结果)

除了来源于肝内胆管癌患者的胆汁30个病例之外，还对于来源于肝内结石症患者的胆汁22个病例分进行分析。其结果如图8a所示。可知与肝内结石症患者相比，肝内胆管癌患者中S/N值显著升高。其显著差异通过T-检验，风险系数P＝0.0015。因此，将肝内胆管癌患者作为阳性，肝内结石症患者作为阴性来制作ROC曲线。其结果如图8b所示。辨别癌和结石症的灵敏度为90％，特异度为76％，与直接固定凝集素的情况相比，特异度大幅升高。而且，如图8c、d所示，WFA-CA125·夹层·ELISA中，结石症患者、胆管癌患者之间的显著差异为灵敏度57％、特异度64％左右。

(考察：与细胞学(Cytology)的比较)

通过本发明进行的肝内胆管癌检出、辨别方法的成绩比以往使用胆汁进行的胆汁细胞诊断而得到的辨别结果优异，如表6(WFA-MY.1E12·夹层·ELISA法与胆汁细胞诊断的比较：斜体为本发明的实施例)所示。灵敏度即检出癌的能力，与胆汁细胞诊断的22％(4/18)相比，为83％(15/18)，比胆汁细胞诊断优异。肝内胆管癌在其特性上要求可以早期发现且假阴性少。换而言之灵敏度高的标记物是重要的。这意味着此次开发的手法为优异的肝内胆管癌标记物。

另一方面，WFA-CA125·夹层·ELISA中，在灵敏度方面比WFA-MY.1E12·夹层·ELISA差，但是表现出依赖于细胞诊断等级而阳性率升高。因此，WFA-CA125·夹层·ELISA与WFA-MY.1E12·夹层·ELISA相比，有可能更适于癌的恶化到晚期的情况。

[表6]

实施例8

[使用血液检出肝内胆管癌]

如上所述，为了可以确立高灵敏度的检出体系，接着尝试使用血清进行检出。

(实验方法)

<1.WFA固化孔板的制备>

对于涂布有抗生蛋白链菌素微量滴定板(NUNC公司制96孔平底板)，向各孔中加入溶解在PBS缓冲液中的生物素化WFA(Vector公司制、20μg/mL)各50μL，室温下保温1小时，将WFA固化到支撑体上。未结合生物素化WFA用作为洗涤液的含有0.1％Tween20的PBS(300μL)各洗涤2次，完成WFA固化孔板。

<2.结合以及检出反应>

各血清样品用上述洗涤液稀释为4μL/100μL，将其中50μL添加到1中制备的WFA固化孔板中后，室温下结合反应2小时。反应后，各孔用上述洗涤液300μL洗涤5次，除去未结合蛋白质。向其中每1孔加入预先以0.5μg/mL用洗涤液制备的检出剂(MY.1E12抗体溶液)各50μL，室温下进行2小时抗原抗体反应。

为了除去未结合抗体，用洗涤液300μL洗涤后，每1孔加入用洗涤液稀释4000倍的抗小鼠IgG抗体-HRP溶液(Jackson immuno Research公司制)各50μL，室温下保温1小时。各孔用300μL洗涤液洗涤5次后，向各孔中加入作为显色试剂的ULTRA-TMB溶液(Thermo公司制)各100μL，显色反应10分钟。每1孔加入1M的H₂SO₄溶液100μL终止反应，通过酶标仪在450nm下测定吸光度。

(结果)

除了来源于胆管癌患者的血清5个病例之外，还对于来源于原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者的血清3例、来源于肝内结石症患者的血清5个病例、健康者血清6例进行分析。其结果如图9所示。可知与PBC患者(b)、肝内结石症患者(c)、健康者(d)相比，在胆管癌患者(a)中，5例中3例的值显著升高。

Claims

1.一种肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，通过将凝集素WFA结合性糖蛋白质作为癌标记物，体外检出受检样品中的该癌标记物，来检出肝内胆管癌。

2.如权利要求1所述的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，将凝集素WFA结合性糖蛋白质作为癌标记物的肝内胆管癌的检出，是将凝集素WFA结合性糖蛋白质作为糖链生物标记物，来检出该糖链生物标记物的肝内胆管癌特异性的糖链结构。

3.如权利要求1所述的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，受检样品中的癌标记物的存在在体外的检出是通过使用标记化的凝集素WFA的受检细胞的WFA染色来进行。

4.如权利要求1所述的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，受检样品中的该癌标记物的存在的检出是通过凝集素WFA、作为癌标记物的凝集素WFA结合性糖蛋白质以及识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体的夹层处理法来进行。

5.如权利要求4所述的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体，为以CA125、N-CAM-L1、Maspin、和MUC1作为抗原的抗体中的1种或2种以上抗体。

6.如权利要求4所述的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，凝集素WFA、作为癌标记物的凝集素WFA结合性糖蛋白质以及识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体的夹层处理法，使用标记化的凝集素WFA或标记化的识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体来进行。

7.如权利要求4所述的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，通过凝集素WFA、作为癌标记物的凝集素WFA结合性糖蛋白质以及识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体的夹层处理法进行的肝内胆管癌的检出，通过凝集素覆盖或抗体覆盖来进行，所述凝集素覆盖，通过将识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体固化在支撑体上，利用标记化的凝集素WFA，将作为癌标记物的凝集素WFA结合性糖蛋白质夹在中间而形成；所述抗体覆盖，通过将凝集素WFA固化在支撑体上，利用标记化的抗体，将作为癌标记物的凝集素WFA结合性糖蛋白质夹在中间而形成，

8.如权利要求7所述的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，通过抗体覆盖或凝集素WFA覆盖进行的肝内胆管癌的检出，使用微阵列，利用凝集素微阵列检出手段或抗体微阵列检出手段来检出。

9.如权利要求1所述的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，用于肝内胆管癌在体外检出的受检样品，为由胆汁或血液构成的临床检样或临床切片。

10.肝内胆管癌的辨别方法，其特征在于，使用权利要求1所述的肝内胆管癌的检出方法，体外检出受检样品的肝内胆管癌，辨别肝脏原发的恶性肿瘤中的肝内胆管癌。

11.凝集素WFA结合性糖蛋白质癌标记物在肝内胆管癌的检出方法中的应用，所述肝内胆管癌的检出方法是通过将凝集素WFA结合性糖蛋白质作为癌标记物，体外检出受检样品中的该癌标记物，来检出肝内胆管癌。

12.肝内胆管癌检出和/或辨别用试剂盒，装备有标记化的凝集素WFA、识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体，或标记化的识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体以及凝集素WFA。

13.如权利要求12所述的肝内胆管癌检出和/或辨别用试剂盒，其特征在于，识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体，为以CA125、N-CAM-L1、Maspin、和MUC1作为抗原的抗体中的1种或2种以上抗体。

14.如权利要求12所述的肝内胆管癌检出和/或辨别用试剂盒，其特征在于，识别凝集素WFA结合性糖蛋白质并与该凝集素WFA结合性糖蛋白质结合的抗体，以固化在支撑体上的方式制备，或凝集素WFA以固化在支撑体上的方式制备。

15.如权利要求14所述的肝内胆管癌的检出方法，其特征在于，使凝集素WFA为生物素化WFA，以固化在涂布有抗生蛋白链菌素的支撑体上的方式制备该凝集素WFA。