CN101175855A

CN101175855A - 抗MUC1 α/β抗体

Info

Publication number: CN101175855A
Application number: CNA2006800034961A
Authority: CN
Inventors: 丹尼尔·B·鲁宾斯坦; 丹尼尔·H·雷施纳
Original assignee: Moody Fan Co Ltd Biozone; Ramot at Tel Aviv University Ltd
Current assignee: Moody Fan Co Ltd Biozone; Ramot at Tel Aviv University Ltd
Priority date: 2005-01-28
Filing date: 2006-01-27
Publication date: 2008-05-07
Also published as: EP1848804A4; WO2006081553A3; US20120207772A1; JP2008528623A; WO2006081553A2; AU2006209246A1; CA2595778A1; US8648172B2; ATE527285T1; EP1848804B1; EP1848804A2; US20080226619A1

Abstract

本发明提供同时结合完整MUC1蛋白的α亚基和β亚基的抗体，以及制备和使用这些抗体的方法。

Description

抗MUC1 α/β抗体

引用的相关申请

本申请要求2005年1月28日递交的申请号为60/647,870的美国临时申请的权益，出于所有目的将其整体通过引用并入本文。

关于在联邦资助的研究和开发下完成的发明的权利的声明不适用

发明领域

本发明涉及特异和同时结合MUC1的α亚基和β亚基的抗体。

发明背景

MUC1是在包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌和胰腺癌等多种人上皮恶性肿瘤中以及多发性骨髓瘤的恶性浆细胞上高表达的糖蛋白。尽管选择性剪接可产生多种MUC1亚型，但最深入研究的MUC1蛋白是I型跨膜蛋白，其由含有串联重复排列(tandem-repeat-array)的高度糖基化细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域组成(MUC1/TM)。MUC1/TM在其合成后不久就被蛋白水解切割，生成两个亚基α和β，它们特异地识别并以强的非共价相互作用结合(参见图1，MUC1/TM)。将MUC1切割成为两个亚基发生在SEA组件中，该SEA组件为在多种细胞束缚的粘蛋白样蛋白中发现的高度保守结构域(Levitin，et al.，J Biol Chem(2005)280：33374-86)。α亚基从细胞膜上脱落导致可溶的含串联重复排列的MUC1处于外周循环中，就是这种分子被用于确定MUC1阳性恶性肿瘤患者的血清MUC1水平。

存在于循环中的该可溶α亚基MUC1蛋白为递送足够量的抗MUC1抗体以直接靶向表达MUC1的恶性细胞带来巨大困难。因为MUC1的最强免疫原性部分为所述串联重复排列，并且迄今为止基本上所有产生的抗MUC1抗体仅识别在该免疫原性区的表位。可溶的循环MUC1α亚基捕获抗串联重复抗体严重地限制了能够成功结合细胞表面的MUC1的抗体含量。此外，抗串联重复抗体与其可溶的循环MUC1靶的免疫复合物的沉积可导致显著的终末器官损伤。

最近几年，进行了用全长MUC1/TM分子作为免疫原产生有效的抗MUC1抗体的多种尝试。阻碍这些尝试的主要困难在于用整个MUC1/TM分子免疫总是引起差不多完全由识别该高免疫原性的串联重复排列的抗体构成的抗体应答。对于在体内靶向表达MUC1的肿瘤细胞的最终应用来说，这类抗体显现出上述抗重复抗体固有的所有缺点。

识别束缚到细胞表面的MUC1表位的抗体有可能排除这些困难。尽管概念上简单，产生针对稳定束缚到细胞表面的MUC1的单克隆抗体首先需要表征细胞结合的非脱落表位。由MUC1α亚基结合被膜束缚的β亚基形成的连接处(junction)提供了这样的表位。

发明概述

本发明提供了同时结合完整MUC1蛋白的α亚基和β亚基的抗体(“抗MUC1α/β抗体”，其结合MUC1α/β亚基连接处，但在MUC1α亚基和MUC1β亚基中的一个不存在时所述抗体基本上不结合另一个)。本发明还提供产生所述抗体的方法和在例如诊断和免疫治疗应用中使用所述抗体的方法。

因此，在第一方面，本发明提供MUC1特异抗体，其结合完整MUC1蛋白，但须在α亚基和β亚基中的一个不存在时所述抗体不结合另一个。

关于所述抗体的实施方案，在一些实施方案中，例如在ELISA中或通过使用表达MUC1亚型的细胞的流式细胞计量法所测量的，所述抗体结合亚型MUC1/X但不结合亚型MUC1/Y。在一些实施方案中，所述抗体结合被切割为截短的α亚基和β亚基的MUC1/X亚型。

所述抗体可为多克隆的或单克隆的。所述抗体可具有约10^-7M至约10^-12M范围内的解离常数(Kd)，例如约10^-7M，10^-8M，10^-9M，10^-10M，10^-11M，10^-12M。所述抗体可具有约10⁶M^-1至约10¹⁰M^-1范围内的结合常数(Ka)，例如约10⁶M^-1，10⁷M^-1，10⁸M^-1，10⁹M^-1或10¹⁰M^-1。如在采用MUC1/TM或MUC1/X作为抗原的ELISA测定中所测量的，所述抗体可具有约1∶100或1∶300至约1∶30,000或1∶50,000的滴度，例如约1∶300，1∶1000，1∶5000，1∶10,000，1∶20,000，1∶30,000，1∶50,000。

所述抗体可包含任何天然产生的恒定区或其任意亚类，例如包括IgA(包括IgA1和IgA2)，IgD，IgE，IgG(包括IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4)，以及IgM。所述抗体可具有来自任何能产生抗体的动物的恒定区，所述动物包括哺乳动物或鸟类。可在人和非人哺乳动物中产生所述抗体，所述非人哺乳动物包括犬、猫、牛、羊、马、猪和啮齿目，包括兔形目、家鼠属、仓鼠、鼠科动物。可在鸡中产生所述抗体。

在一些实施方案中，所述抗体为人源化的或人抗体。在一些实施方案中，所述抗体缺乏恒定区。例如，所述抗体可为Fab片段或单链可变区。所述抗体可为重组产生的。

所述抗体可进一步包含细胞毒性部分，例如蓖麻毒素分子、假单胞菌属毒素、放射性同位素。所述抗体可进一步包含标签部分，例如放射性同位素、酶、荧光团。

在一些实施方案中，所述抗体防止MUC1α亚基从β亚基解离。在一些实施方案中，所述抗体减少或抑制经由MUC1β亚基的细胞内信号传导。

在一些实施方案中，所述抗体为DMC209或DMC111。

本发明还提供包含抗MUC1α/β抗体的细胞。例如，该细胞可为产生所述抗体的杂交瘤。该细胞还可以是在其表面带有完整MUC1蛋白的细胞，其中该MUC1蛋白结合(即附着)到抗MUC1α/β抗体。该细胞还可以被重组修饰以表达本发明的抗体。

另一方面，本发明提供通过给予治疗足够量的本发明抗MUC1α/β抗体而将免疫毒素靶向过表达MUC1的癌细胞的方法以及抑制或防止过表达MUC1的癌细胞的生长的方法。

另一方面，本发明提供产生结合完整MUC1蛋白的MUC1特异抗体的方法，包括以下步骤：

i)用包含α亚基串联重复的MUC1/TM抗原免疫能够产生抗体的个体一次或多次，所使用的抗原的量足以生成特异结合完整MUC1蛋白的MUC1特异性抗体；以及

ii)选择结合MUC1/X抗原的抗体；

其中在MUC1α亚基和β亚基中的一个不存在时所述抗体不结合另一个。

在所述方法的另一实施方案中，在用MUC1/TM抗原免疫后，可以随后使用亚型MUC1/X抗原免疫所述个体一次或多次。使用MUC1抗原的免疫可任选地包括佐剂。

可将MUC1/TM和MUC1/X抗原独立地以核酸或多肽的形式给予所述个体。在一实施方案中，所述个体首先被编码MUC1/TM抗原的核酸(例如cDNA)免疫一次或多次，随后被编码MUC1/X抗原的核酸免疫一次或多次。

另一方面，本发明提供筛选结合完整MUC1蛋白的MUC1特异抗体的方法，但须在α亚基和β亚基中的一个不存在时所述抗体不结合另一个，所述方法包括：

i)确定多种抗MUC1产生的抗体对切割的MUC1/X抗原和MUC1/Y抗原的结合；以及

ii)选择特异结合MUC1/X抗原但不显著结合MUC1/Y抗原的抗体。

在所述方法中产生或使用的抗体的实施方案与以上描述的相同。

在相关方面，本发明提供产生针对目的抗原的抗体的方法，包括以下步骤：

i)以包含α亚基串联重复的MUC1/TM抗原和所述目的抗原免疫个体一次或多次；以及

ii)用所述目的抗原免疫所述个体一次或多次；由此产生针对所述目的抗原的抗体。

可将MUC1/TM抗原和所述目的抗原独立地以核酸或多肽形式给予所述个体。

在一些实施方案中，将MUC1/TM抗原和目的抗原一起给予。在一些实施方案中，MUC1/TM抗原和目的抗原通过化学接头连接。在一些实施方案中，MUC1/TM抗原和目的抗原作为融合蛋白被给予。

所述目的抗原可以是任何抗原性多肽序列或任何编码抗原性多肽序列的核酸。目的抗原可以是但不限于人、哺乳动物、动物、植物、细菌、病毒或合成的。目的抗原可以是肿瘤相关抗原(例如癌胚抗原(CEA)、糖抗原(CA-125)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、黑素瘤抗原(MAGE，MART)。目的抗原可以是感染性疾病相关抗原。

定义

除非本文另有定义，本文使用的所有科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。例如，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology(简明生物医学和分子生物学词典)，Juo，Pei-Show，2nd ed.，2002，CRC Press；The Dictionary of Cell andMolecular Biology(细胞和分子生物学词典)，3rd ed.，1999，AcademicPress；以及Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology(牛津生物化学和分子生物学词典)，修订版，2000，Oxford UniversityPress为技术人员提供了用在本发明中的很多术语的通用词典。

在本文中，提及氨基酸时可使用它们通常已知的三字母符号或使用IUPAC-IUB生物化学命名法委员会推荐的单字母符号。同样地，提及核苷酸时可使用它们的通常接受的单字母代码。出于本发明的目的，一些术语定义如下。

术语“特异结合”或“附着”指，与缺乏特定靶表位的细胞或组织相比，抗-MUC1α/β抗体在整体上或部分地优先与带有这种靶表位(例如MUC1α/β连接处)的细胞或组织缔合。显然，应意识到，在抗体和非靶表位之间可发生某种程度的非特异性结合。然而，特异结合的区别可在于通过对靶表位的特异识别而介导。通常，与结合的抗体和缺乏靶表位的实体(例如，测定孔或细胞)之间的缔合相比，特异结合导致递送的分子和带有靶表位的实体(例如，测定孔或细胞)之间强得多的缔合。与缺乏靶表位的细胞或组织相比，特异结合一般导致结合带有靶表位的细胞或组织的抗MUC1α/β抗体的量增加约10倍以上，并最优选增加100倍以上(每单位时间)。两实体之间的特异结合通常意味着至少10⁶M^-1的亲和力。优选大于10⁸M^-1的亲和力。可采用本领域中已知的任何抗体结合测定法来确定特异结合，包括Western印迹、ELISA、流式细胞计量法和免疫组织化学。

用语“基本上不结合”指不超过约10-15％的特异结合靶表位的抗MUC1α/β抗体结合到特定的非靶表位。抗体与缺乏靶表位的实体的“基本上不结合”比该抗体对带有该靶表位的相同实体的结合低约10倍，优选低约100倍。

术语“MUC1”或“粘蛋白1”指这样的多态变体、等位基因、突变体和种间同源物，其：(1)与天然MUC1蛋白在约25个氨基酸的区段上，任选地在约50，100，150，200，250个氨基酸的区段上具有约85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％的氨基酸序列一致性，所述天然MUC1蛋白例如包括GenBank登录号NP_002447(MUC1粘蛋白亚型1)、NP_001018016(MUC1粘蛋白亚型2)、NP_001018017(MUC1粘蛋白亚型3)、或NP_001018021(MUC1粘蛋白亚型4)、亚型MUC1/TM、亚型MUC1/X、亚型MUC1/Y；(2)特异结合针对包含天然MUC1蛋白的氨基酸序列(包括糖基化的氨基酸序列)的免疫原和其保守修饰变体而产生的抗体；或(3)与天然MUC1核酸序列在约25个核酸的区段上，任选地在约50，100，150，200，250，500个核酸的区段上有约85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％的核酸序列一致性，所述天然MUC1核酸序列例如包括GenBank登录号NM_002456(MUC1转录变体1)、NM_001018016(MUC1转录变体2)、NM_001018017(MUC1转录变体3)、或NM_001018021(MUC1转录变体4)、变体MUC1/TM、变体MUC1/X、变体MUC1/Y。

MUC1为细胞表面和/或血清肿瘤标志物糖蛋白，其特征在于重复结构域和密集的O糖基化(Baldus，et al.，Crit Rev Clin Lab Sci(2004)41：189；Karsten，et al.，(2005)26：217)。MUC1表达在大多数单纯上皮细胞的腔面，并且在多种上皮恶性肿瘤的癌细胞上过表达，包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和胰腺癌以及恶性浆细胞(例如，多发性骨髓瘤)(参见Taylor-Papadimitriou，et al.，J Mammary Gland Biol Neoplasia(2002)7：209；Denda-Nagai and Irimura，Glycoconj J(2000)17：649)。MUC1由可溶的α亚基和锚定于细胞的β亚基构成。MUC1结合细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、介导细胞-细胞粘附(Baldus，et al.，同上以及Rahn，et al.，J Biol Chem(2004)279：29386)并作为信号分子的停靠蛋白(docking protein)。MUC1具有高度保守的胞质尾部，其在受MUC1磷酸化紧密调节的过程中结合转录调节蛋白β连环蛋白(参见Carraway，et al.，Bioessays(2003)25：66)。

本文中使用的术语“完整MUC1蛋白”指已被切割为α亚基和β亚基的MUC1蛋白，每一亚基具有天然三维折叠并且亚基间相互作用。MUC1亚型MUC1/TM和MUC1/X可为完整MUC1蛋白。

“MUC1/X”亚型在α亚基中缺乏抗原性串联重复排列并且在SEA组件中被切割为截短的α亚基和β亚基(参见Levitin，et al.，同上)。

“MUC1/Y”亚型在α亚基中缺乏抗原性串联重复排列并且没有在SEA组件中被切割(参见Levitin，et al.，同上)。

术语“生理条件”指具有使得目的细胞能够维持生存或生长的条件(例如温度、pH和渗透压)的细胞外环境。

术语“抗体”指通过在体外或体内产生体液应答而获得的免疫球蛋白分子，包括多克隆抗体和单克隆抗体。该术语还包括遗传上改变的形式，例如嵌合抗体(例如人源化的鼠抗体)、杂偶联抗体(例如双特异性抗体)以及重组单链Fv片段(scFv)。术语“抗体”还包括抗原结合形式的抗体片段(例如Fab，F(ab)₂，V_H-V_L Fab片段)。

术语“人源化抗体”指包含非人氨基酸序列但其恒定区已被改变以减少在人体内免疫原性的抗体。

术语“人抗体”指由人免疫球蛋白基因产生的抗体。可体内产生人抗体，例如在人中，或通过具有功能性人免疫球蛋白基因的非人动物(例如小鼠、仓鼠、兔、奶牛)产生。这类转基因动物在现有技术中是已知的。例如参见Lonberg，Nat Biotech(2005)23：1117；Robl，et al.，Theriogenology，(2003)59：107；以及Ishida，et al.，Cloning Stem Cells(2002)4：91。从转基因小鼠生产全人抗体的公司包括Medarex，Milpitas，CA和Abgenix(现在为Amgen)，Fremont，CA。可体外产生人抗体，例如从人免疫球蛋白基因的组合文库。

术语“细胞外”指从包围细胞的脂双层向外延伸的区域。

术语“抗原”指能够特异结合抗体的任何分子。可诱导抗原产生的抗原称为“免疫原”。参见Janeway，et al.，Immunobiology，5th Edition，2001，Garland Publishing。出于本发明的目的，抗原可为多肽或编码抗原性多肽的核酸(例如cDNA)。

术语“表位”或“抗原决定基”指抗原上的B和/或T细胞所应答的位点。B细胞表位可从邻接氨基酸或从通过蛋白的三级折叠而并置的非邻接氨基酸形成。从邻接氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时被保留，而通过三级折叠形成的表位(例如构象决定的)通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包括独特空间构象中的至少3个氨基酸，更常见地，至少5个或8-10个氨基酸。确定表位空间构象的方法例如包括x射线晶体学和2维核磁共振。例如参见Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology，Vol.66，Glenn E.Morris，Ed.(1996)。可在显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的简单免疫测定(例如竞争ELISA或固相放射免疫测定(SPRIA))中鉴定识别相同表位的抗体。对于CD8细胞，T细胞识别约9个氨基酸的连续表位，或者对于CD4细胞，T细胞识别约13-15个氨基酸的连续表位。可通过测量抗原依赖性增殖的体外测定来鉴定识别该表位的T细胞，该抗原依赖性增殖例如通过测定致敏T细胞响应表位而掺入的³H-胸腺嘧啶核苷(Burke et al.，J.Inf.Dis.170，1110-19(1994))、通过测定抗原依赖的杀伤(细胞毒性T淋巴细胞测定，Tigges et al.，J.Immunol.(1996)156：3901-3910)或通过测定细胞因子分泌而确定。

附图简要说明

图1显示MUC1蛋白亚型或MUC1融合蛋白。含有串联重复排列的切割的跨膜MUC1蛋白(MUC1/TM)显示在左侧。选择性剪接利用由S.D.→表示的剪接供体，导致形成MUC1/Y和MUC1/X亚型的两种选择性剪接受体(S.A.Y→和S.A.X→)之一。如在本文中所描述的，抗体DMC209识别存在于MUC1/X和MUC1/TM蛋白中的切割的α/β连接处，但是不与未切割的MUC1/Y蛋白反应。

图2显示MUC1/TM、MUC1/X和MUC1/Y亚型的序列。MUC1/TM核苷酸(SEQ ID NO：1)和氨基酸(SEQ ID NO：2)编号分别显示在序列的左侧和右侧。信号肽切割发生在甘氨酸23和丝氨酸24之间，由向上的红箭头表示。N30序列横跨SGHAS至EKNA。为了清楚，所剪接出的包含串联重复排列的中间区及其两翼序列被删除，并用虚线表示。对MUC1/TM的切割发生在甘氨酸357和丝氨酸358之间(在MUC1/X氨基酸编号62和63之间)并用向上的红箭头表示。在核苷酸217处(gtgag)显示产生MUC1/X和MUC1/Y的剪接供体位点，产生MUC1/X和MUC1/Y的剪接受体位点分别位于核苷酸942处(ccccag)和996处(ctccag)。紧接MUC1/X剪接受体位点C末端的MUC1/X氨基酸以斜体的1(以LSTG开始)至120(SGAG)编号，编号为120的氨基酸紧接跨膜结构域的N末端。以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别表示MUC1/X的核酸和氨基酸序列。以SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6分别表示MUC1/Y的核酸和氨基酸序列。参见上述Levitin，et al.。

图3表示用编码MUC1/TM或MUC1/X的DNA免疫的小鼠中产生的抗-MUC1/X抗体。用含有编码MUC1/TM蛋白(组II)的cDNA或编码其中串联重复被删除的MUC1/X蛋白(组I，参见图1)的cDNA的表达载体免疫小鼠。如实施例中所述，测定血清中针对切割的MUC1/X蛋白的抗体滴度。所有的组II的小鼠都显现显著的抗MUC1/X抗体滴度，但在组I的小鼠中没有检测到抗MUC1/X抗体(A和B)。

图4显示在用MUC1/TM cDNA致敏接着用单次MUC1/X蛋白加强后的小鼠中抗MUC1/X滴度。使用单次MUC1/X蛋白免疫加强之前用MUC1/TM cDNA免疫致敏的组II的小鼠(见图2)。如实施例中所述，在蛋白加强后的18或32天(分别为粉红色和绿色线)测定血清中抗MUC1/X反应性。给出了各只小鼠的滴度。

图5显示对DMC209和DMC111单克隆抗体识别的表位的详细分析。如实施例中所描述的，测定野生型MUC 1/X和MUC 1/Y蛋白(A和B)以及点突变的MUC1/X(C和D)和内部删除的MUC1/X(E和F)对DMC209和DMC111抗体的反应性。

图6显示DMC209流式细胞计量法分析表达MUC1/TM的细胞。如实施例中所述，使亲本的未转染的小鼠乳腺肿瘤细胞或经编码全长MUC1/TM或其细胞质尾部被截去的MUC1/TM的cDNA转染的细胞与DMC209反应并用流式细胞计量法分析。类似地，在与DMC209孵育后分析卵巢癌细胞系HEY和乳腺癌细胞系T47D和MDA231。红色和紫色的记录线分别代表细胞与单独的经荧光标记的第二抗体或先与第一DMC209抗体然后与第二抗体的反应。

图7显示流式细胞计量法分析DMC209与从多发性骨髓瘤患者新获得的骨髓细胞的反应性。用DMC209和针对CD45、CD138和CD38的抗体同时分析骨髓抽吸物。用荧光染料分别标记所述抗体，每一种以不同的发射波长发荧光。针对CD45(A1)和DMC209(A2)进行侧向散射分析。DMC209阳性细胞被指定为R1，CD38阳性细胞对CD138阳性细胞(A3)的作图清楚地显示DMC209阳性群(红色标记的细胞)与CD138阳性细胞一致。

详细说明

引言

我们研究了由MUC1α亚基和β亚基构成的被切割的连接处借以形成的机制。在这些研究过程中，我们分析了MUC1/TM，MUC1/Y和MUC 1/X蛋白的“可切割性(cleavageability)”(图1以及Levitin，et al.，J Biol Chem，(2005)280：33374，出于所有目的在此将其整体通过引用并入本文)。MUC1/Y和MUC1/X亚型由在两个不同位点剪接的mRNA产生，这两个位点利用了位于串联重复排列的上游和下游的供体和受体位点，结果在两个亚型中串联重复排列和两翼序列均被剪接掉(图1以及Levitin，et al.)。由此，MUC1/X和MUC1/Y的细胞外结构域明显地没有大的含串联重复排列的MUC1/TM蛋白复杂。实际上，在其细胞外结构域，MUC1/X蛋白仅包含融合到MUC1 30N末端氨基酸的120个氨基酸的SEA组件。除了SEA组件N末端的18个氨基酸的删除之外，MUC1/Y与MUC1/X完全相同。重要的是，MUC1/X亚型在与全长MUC1/TM蛋白相同的位点被切割，由此导致相同的α亚基和β亚基非共价相互作用。相反，存在于MUC1/Y亚型中的SEA组件N末端截短导致形成未切割的蛋白。

为了产生直接靶向癌细胞的抗体，我们推测对MUC1α/β连接处特异的抗体(“抗MUC1α/β抗体(Abs)”)将仅靶向膜结合的MUC1。为了防止生成抗串联重复排列的抗体，我们使用切割的MUC1/X蛋白既作为免疫原和又作为筛选试剂。这里我们公开了一种新的方法，首先用MUC1/TM(例如DNA)致敏小鼠以引起抗MUC1/TM应答。所产生的免疫应答含有与MUC1/X亚型反应的抗体。为了进一步增加抗MUC1/X滴度，用MUC1/X(例如可溶蛋白)加强小鼠。这导致极高的抗MUC1/X滴度。采用这种方案，我们成功地产生了不仅识别细胞表面切割的MUC1α/β连接处，还结合表达全长MUC1/TM的恶性细胞的单克隆抗体。

因此，本发明提供结合细胞上完整MUC1蛋白的MUC1α/β连接处的抗体，在此称为“抗MUC1α/βAbs”。该抗体同时结合由完整MUC1蛋白的α亚基和β亚基构成的构象上确定的表位。本发明部分地基于这种令人意外的发现：不含免疫原性的串联重复区的MUC1亚型MUC1/X有免疫原性，且能够与全长MUC1亚型MUC1/TM类似地被切割(参见Levitin，et al.，同上)。

抗体

抗原和免疫

本发明的抗MUC1α/β抗体针对完整MUC1蛋白的α/β连接处。通过首先用包含免疫原性的串联重复序列(“VNTR”)(参见图1和Gendler，et al.，J Biol Chem(1990)265：15286；Ligtenberg，et al.，J BiolChem(1990)265：5573；以及Wreschner，et al.，Eur J Biochem(1990)189：463)的MUC1α/β亚基序列(例如核酸或可溶蛋白)免疫能够产生抗体的个体一次或多次，所述序列例如MUC1/TM。任选地，可以通过一次或多次针对截短的MUC1α/β亚基序列(例如核酸或可溶蛋白)的后续免疫加强该个体，其中该截短的MUC1α/β亚基序列缺失免疫原性的串联重复序列，但是保留了可切割的序列片段以切割成α和β亚基，例如亚型MUC1/X。参见图1和Levitin，et al.，J Biol Chem(2005)280：33374，出于所有目的将其整体通过引用并入本文。

所述抗原通常被制备为可溶的MUC1多肽(即，其缺乏跨膜序列)或编码MUC1多肽序列(有或没有跨膜序列)的核酸。所述抗原，DNA或蛋白，可从表达或过表达MUC1的细胞分离，或从被修饰为重组表达MUC1抗原的细胞分离，该细胞例如本领域中公知的细菌、酵母或哺乳动物细胞表达系统。重组表达的MUC1抗原可方便地具有任选可去除的纯化和/或检测标签，包括但不限于FLAG(DYKDDDDK)、连续组氨酸、免疫球蛋白恒定区(Fc)等。参见Levitin，et al.，同上。

在一实施方案中，抗MUC1α/β抗体可通过用MUC1/TM cDNA进行一次或多次初次免疫，并且用MUC1/X cDNA进行一次或多次二次免疫或加强免疫而产生。在一实施方案中，抗MUC1α/β抗体可通过用MUC1/TM cDNA进行一次或多次初次免疫，并且用可溶MUC1/X蛋白进行一次或多次二次免疫或加强免疫而产生。

通常以至少2，3，4，5，6，7，8周的间隔或视情况以3，4，5，6个月的间隔对个体进行重复免疫。可以等间隔地给予重复免疫，但不是必须的。如果需要，可以1，2，3，4，5次或更多次地给予接受重复免疫的个体初级抗原(例如MUC1/TM)和/或次级抗原(例如MUC1/X)。

通过选择同时结合MUC1/X亚型的MUC1α和β亚基的抗体来鉴定抗MUC1α/β抗体，其中MUC1/X亚型优选为被切割的MUC1/X亚型。优选的抗体不结合不可切割的MUC1/Y亚型或单独的α亚基或β亚基。

抗体的产生

抗MUC1α/β抗体可为多克隆的、单克隆的、Fab片段(缺失恒定Fc区)或重组单链Fv抗体。本领域技术人员已知产生多克隆和单克隆抗体的方法。例如参见Coligan，et al.，Current Protocols in Immunology(现代免疫学方法)，1991-2006，John Wiley&Sons；以及Harlow andLane(1989)Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，ColdSpring Harbor Press，N.Y.；Harlow and Lane(1998)Using Antibodies：ALaboratory Manual(使用抗体：实验室手册)，Cold Spring Harbor Press，N.Y.；Stites et al.(eds.)Basic and Clinical Immunology(4th ed.)(基础和临床免疫学，第四版)Lange Medical Publications，Los Altos，Calif，以及其中引用的参考文献；Goding(1986)Monocloal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)(2d ed.)AcademicPress，New York，N.Y.；以及Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495-497；参见Huse et al.(1989)Science 246：1275-1281；Ward，et al.(1989)Nature 341：544-546.Birch and Lennox，Monoclonal Antibodies：Principles and Applications(单克隆抗体：原理和应用)，Wiley-Liss，NewYork，N.Y.(1995)。可以在能够产生抗体的诸如哺乳动物或鸟类的任何便利的动物中诱导抗MUC1α/β抗体和产生抗MUC1α/β抗体的B细胞。例如，可以方便地在绵羊或山羊(羊)或啮齿动物(兔形目、家鼠属、仓鼠、鼠科动物)或鸡(原鸡属)中产生抗MUC1α/β抗体。

其它适合的制备抗体的技术包括在噬菌体载体和包括病毒、细菌和酵母载体的其它载体中选择包括人免疫球蛋白基因在内的重组免疫球蛋白基因文库。通过使用载体展示(例如噬菌体)方法在载体表面表达例如重组单链Fv(scFv)片段或V_H-V_L Fab片段可快速分离针对MUC1α/β连接处的高亲和抗体。简言之，编码载体表面蛋白的基因被改变，以便能够插入抗体基因，该抗体基因在带有该基因的载体表面作为融合蛋白表达。可以选择性富集表达所需抗体的载体并借助其与MUC1α/β亚基的连接处的亲和力/亲和性而将其分离。编码抗体的DNA被包装在相同载体中，这使得能够分离编码该抗体的基因。多种这样的方法在文献中已有详细讨论并且为技术人员所熟知。例如参见Winter et al.，Annu.Rev.Immunol.12：433-455(1994)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Vaughan et al.，Nature Biotechnology14：309-314(1996)，Hallborn and Carlsson，Biotechniques，(2002)Suppl：30-7，美国专利第4,642,334号、第4,816,397号、第4,816,567号、第4,704,692号；WO 86/01533；WO 88/09344；WO 89/00999；WO90/02809；WO 90/04036；EP 0 324 162；以及EP 0 239 400。

优选地，将抗体构建为在宿主中的免疫原性最小化，例如通过使抗体中存在的自体(自身)序列的数量最大化。因而，具有非异种可变区的嵌合抗体为优选的。尤其优选使用异种部分被去除或基本上限于互补决定区的抗体(即“人源化抗体”)。

抗体结合测定

可以使用本领域中公知的技术来确定抗体与完整MUC1蛋白的结合，所述技术例如ELISA测定、流式细胞计量测定或免疫组化测定。在进行结合测定时，可将检验测定与阳性对照和/或阴性对照进行比较。

ELISA

关于ELISA测定，可用缺失免疫原性的串联重复区的可溶MUC1α/β亚基蛋白抗原(例如缺失跨膜区的亚型MUC1/X或MUC1/Y)包被ELISA板。优选地，截短的MUC1α/β亚基蛋白抗原可被切割为截短的α亚基和β亚基的细胞外区域(例如亚型MUC1/X)。在包被前，可以将包被用蛋白抗原切割为α亚基和β亚基，但不是必须在包被前切割。蛋白抗原可直接包被在ELISA板上或结合到直接包被在板上的免疫球蛋白层上。例如，与免疫球蛋白恒定区(Fc)融合的可溶亚型MUC1/X和/或MUC1/Y可以结合到直接包被ELISA板的抗Fc抗体上。然后，所结合的蛋白抗原可暴露于测试抗体。

目的抗体特异结合亚型MUC1/X和/或MUC1/Y，但是不结合α亚基免疫原性的串联重复区、单独的α亚基或单独的β亚基。优选地，该抗体特异结合MUC1/X，但不结合MUC1/Y。优选地，该抗体特异结合切割的亚型MUC1/X和切割的亚型MUC1/TM。

ELISA测定技术为本领域公知。指导实施ELISA测定的教材例如包括The Elisa Guidebook(Elisa指南)，by J.R.Crowther(Editor)，Humana Pr(2000年8月)；Delves，Antibody Applications：EssentialTechniques(抗体应用：关键技术)，John Wiley&Sons(1995)；Crowther，Elisa：Theory and Practice(Elisa：理论与实践)，Human Pr(1995)；Harlow and Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual(使用抗体：实验室手册)，Cold Spring Harbor Press(1998)；以及Coligan，et al.，Current Protocols in Immunology(免疫学的当前实验方案)，1991-2006，John Wiley&Sons。

ELISA技术很适合高通量方法，无论是直接标记测试抗体还是标记次级抗体。被标记的抗体可被酶部分、化学发光部分、荧光部分或任何其它本领域已知的方便检测的标签标记。用于进行高通量ELISA的产品可商购，例如从Panomics，Redwood City，CA；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO和BioMedTech Laboratories，Tampa，FL购得。自动化的高通量系统也可商购，例如从Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA和BMG Labtech，Durham，NC购得。

流式细胞计量法

还可以使用流式细胞计量法检测抗体与完整MUC1蛋白的结合。可以将在其细胞外表面表达MUC1亚型(例如MUC1/TM，MUC1/X，MUC1/Y)的完整细胞，无论天然产生的还是重组修饰的，暴露于抗MUC1α/β抗体。细胞可以是存活的或被固定的。可通过例如用荧光团直接标记测试抗体或次级抗体来确定结合。使用流式细胞计量法的优点在于表达在细胞表面的MUC1抗原为体内MUC1细胞表面抗原的典型三维构象。目的抗体特异结合亚型MUC1/TM和MUC1/X的α和β亚基，并且优选不结合亚型MUC1/Y。流式细胞计量法也很适于高通量方法。用于高通量流式细胞计量分析的产品和系统可商购，例如从BD Biosciences，San Jose CA和San Diego，CA；Beckman Coulter，Fullerton，CA；Partec，Münster，Germany；以及Amnis Corp.，Seattle，WA购得。

流式细胞计量技术为本领域公知。指导实施流式细胞计量法的教材例如包括Ormerod，Flow Cytometry(流式细胞计量法)，Taylor&Francis(1999)；Flow Cytometry Protocols(流式细胞计量法操作)，Hawley and Hawley(Eds.)Humana Press(2004)；以及Flow Cytometryin Clinical Diagnosis(临床诊断中的流式细胞计量法)，Keren，et al.，(Eds.)，ASCP Press(2001)。

免疫组化

还可以采用本领域公知的免疫组化技术检测抗体与完整MUC1蛋白的结合。例如参见Hayat，Handbook Of Immunohistochemistry And InSitu Hybridization Of Human Carcinomas：Molecular Pathology，Colorectal Carcinoma，And Prostate Carcinoma(人类肿瘤的免疫组化和原位杂交手册：分子病理学，结肠直肠癌和前列腺癌)，Academic Pr(2004)；Hayat，Immunohistochemistryand in Situ Hybridization of HumanCarcinomas：Molecular Genetics Lung and Breast Carcinomas(人类肿瘤的免疫组化和原位杂交手册：分子遗传学，肺癌和乳腺癌)，AcademicPr(2004)；以及Dabbs，Diagnostic Immunohistochemistry(诊断用免疫组化)，Elsevier Science Health Science(2001)。可将诸如乳腺、卵巢、前列腺、胰腺、结肠组织等已知表达或过表达MUC1抗原的组织的上皮切片暴露于抗MUC1α/β抗体。该抗体可被直接标记，例如使用酶部分、化学发光部分、荧光部分。可用显微镜技术检测结合的抗体。鉴定抗MUC1α/β抗体的试验

本发明的抗MUC1α/β抗体结合MUC1α和β亚基的连接处，而不结合单独的α亚基或β亚基。这可通过例如进行如上所述的比较ELISA测定来测量。可用具有α和β亚基的可溶MUC1蛋白抗原(例如，MUC1/TM，MUC1/X或MUC1/Y)、单独的MUC1α亚基和单独的可溶(即缺失跨膜序列)MUC1β亚基包被ELISA板孔，然后暴露于抗MUC1α/β抗体。目的抗体将会特异结合具有α和β亚基的MUC1蛋白抗原，但基本不结合单独的MUC1α亚基或单独的MUC1β亚基。或者，也可使用Western印迹来测量。Western印迹为本领域公知。参见Coligan，et al.，同上，以及Harlow and Lane，1989和1998，同上。

优选地，本发明的抗MUC1 α/β抗体结合亚型MUC1/TM和MUC1/X，但是基本不结合亚型MUC1/Y。不被理论所束缚，据信切割的MUC1/X反应了细胞表面上MUC1蛋白的MUC1α和β亚基的三维连接处。这可通过例如进行如上所述的比较ELISA测定或比较流式细胞计量测定来测量。在示例性的ELISA测定中，使被抗Fc抗体包被的ELISA板结合MUC1/TM-Fc(即具有全长α亚基的可溶MUC1)或MUC1/X-Fc以及MUC1/Y-Fc融合蛋白，然后暴露于抗MUC1α/β抗体。目的抗体特异结合具有结合的MUC1/X-Fc融合蛋白或结合的MUC1/TM-Fc融合蛋白的孔，但基本不结合具有结合的MUC1/Y-Fc融合蛋白的孔。参见下文实施例1。或者，这可在比较流式细胞计量测定中测量，其中采用在细胞外表面天然或重组表达一种MUC1亚型的细胞。目的抗体将特异结合表达MUC1/TM或MUC1/X的细胞，但基本不结合表达MUC1/Y的细胞。

使用抗MUC1α/β抗体的方法

诊断和预后方法

所述抗MUC1α/β抗体可用在诊断过表达MUC1的组织的癌症或为其提供预后的方法中。通常，该组织为上皮组织，但也可来自血液，例如浆细胞(即，B淋巴细胞谱系的，例如参见Chapter 98 of Harrison’sPrinciples of Internal Medicine(Harrison内科学原理的第98章)，16thEd.，2005，McGraw-Hill)。这些诊断和预后方法尤其可用于鉴定来自乳腺、卵巢、前列腺、胰腺、结肠、浆细胞和其它组织的过表达MUC1的癌症。与来自经证实的正常(即未转化的，非癌的)组织的相同类型组织或细胞相比，过表达MUC1的组织或细胞具有至少约20％，50％，80％，1倍，2倍，3倍，4倍或更多可检测的MUC1。使用如上所述的流式细胞计量测定和/或免疫组化方法可以方便地进行所述诊断和预后方法。

癌症免疫治疗方法

因为MUC1蛋白在很多癌症中以及多发性骨髓瘤的浆细胞上表达或过表达，所以其为癌症免疫疗法的靶点，其中所述癌症包括但不限于上皮和浆细胞骨髓瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌。

因此，本发明提供可全身使用的抗MUC1α/β抗体以治疗包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌和浆细胞骨髓瘤癌在内的癌症。抗MUC1α/β抗体还可用于治疗多种其它良性和恶性肿瘤。由此，本发明提供治疗易感于或患有表达或过表达MUC1抗原的癌症的患者的方法，包括向所述患者给予治疗有效量的特异结合MUC1α/β亚基连接处的抗体。在另一方法中，本发明提供抑制表达或过表达MUC1抗原的肿瘤细胞生长的方法，包括以有效抑制该肿瘤细胞生长的量对患者给予特异结合MUC1α/β亚基连接处的抗体。抗MUC1α/β抗体也可被用在选择性抑制或杀伤表达或过表达MUC1抗原的细胞的方法中，包括使有效抑制该细胞的生长或杀伤该细胞的量的抗MUC1α/β抗体免疫偶联物或免疫毒素与该细胞反应。

例如，可将未偶联的抗MUC1α/β抗体(包括单克隆的、多克隆的、嵌合的、人源化的、全长人抗体及其片段(例如重组蛋白))引入患者，以便该抗体结合癌细胞上的完整MUC1蛋白并介导这类细胞和肿瘤的生长抑制(包括其破坏)，其中的机制可包括补体介导的细胞溶解、抗体依赖的细胞毒性、改变MUC1的生理功能和/或抑制配体结合或信号转导通路。除了未偶联的抗MUC1α/β抗体、其片段和本发明的重组蛋白之外，与包括放射性同位素、蓖麻毒素和/或假单胞菌属毒素在内的毒性试剂偶联的抗MUC1α/β抗体还可被用于治疗性地递送该毒性试剂至带有MUC1的肿瘤细胞并由此杀灭肿瘤。

采用抗MUC1α/β抗体的癌症免疫疗法可按照由多种成功用于若干类型癌症的方法所形成的教导进行，这些癌症包括但不限于结肠癌(Arlen et al.，1998，Crit Rev Immunol 18：133-138)、多发性骨髓瘤(Ozakiet al.，1997，Blood 90：3179-3186；Tsunenari et al.，1997，Blood 90：2437-2444)、胃癌(Kasprzyk et al.，1992，Cancer Res 52：2771-2776)、B细胞淋巴瘤(Funakoshi et al.，1996，J Immunther Emphasis TumorImmunol 19：93-101)、白血病(Zhong et al.，1996，Leuk Res 20：581-589)、结直肠癌(Moun et al.，1994，Cancer Res 54：6160-6166)；Velders et al.，1995，Cancer Res 55：4398-4403)以及乳腺癌(Shepard et al.，1991，JClin Immunol 11：117-127)。针对癌症的免疫毒素疗法的更多实例综述在例如Wong，et al.，Semin Oncol(2005)32：591；Chen，et al.，ExpertOpin Drug Deliv(2005)2：873；以及Li，et al.，Cell Mol Immunol(2005)2：106中。

例如，一种临床上施用抗MUC1α/β抗体的方式为将它们以未修饰的形式给药，使用在体外和/或动物模型(例如参见Hellstrom et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 82：1499-1502(1985))中显示抗肿瘤活性(例如ADCC和CDC活性)和/或内化能力(internalizing ability)的单克隆抗MUC1α/β抗体。为了检测ADCC和CDC活性，可以测试单克隆抗体在4小时的孵育期间溶解培养的⁵¹Cr标记的肿瘤靶细胞的能力。靶细胞被⁵¹Cr标记，然后暴露在效应细胞(以使用淋巴细胞分离介质纯化的人淋巴细胞的形式)和抗体的组合中4小时，其中抗体以例如0.1μg/ml至10μg/ml的浓度加入。测量从靶细胞释放的⁵¹Cr，作为肿瘤细胞溶解(细胞毒性)的证据。对照包括仅孵育靶细胞或分别与淋巴细胞或单克隆抗体一起孵育。测量可释放的⁵¹Cr的总量，ADCC被计算为采用单克隆抗体加上效应细胞时观察到的杀死的靶细胞相对于单独孵育的靶细胞的百分比。除了加入用作补体源的人血清(1∶3至1∶6稀释)替代效应细胞外，用于CDC的方法与用于检测ADCC的方法相同。

在实施本发明方法时，将能够抑制在细胞表面表达或过表达MUC1的肿瘤细胞生长的抗MUC1α/β抗体以治疗有效量给予其肿瘤表达或过表达MUC1的癌症患者。本发明的抗体治疗方法也可以与化疗、放射和/或其它治疗方法联合。

可用于治疗癌症的抗MUC1α/β抗体包括能够引起针对肿瘤的有效免疫应答的抗体和具有直接细胞毒性的抗体。这方面，抗MUC1α/β抗体可通过补体介导的或抗体依赖的细胞毒性(ADCC)机制引起肿瘤细胞溶解，其中这二者都需要免疫球蛋白分子的完整Fc部分，用于与效应细胞Fc受体位点或补体蛋白相互作用。此外，直接对肿瘤生长施加生物学作用的抗MUC1α/β抗体也可用在本发明的实践中。这类抗体可以不需要完整的免疫球蛋白来发挥作用。这类直接细胞毒性抗体起作用的可能机制包括抑制细胞生长、调节细胞分化、调节肿瘤血管生成因子全貌和诱导细胞凋亡。可使用任意种本领域已知的用来确定ADCC、ADMMC、补体介导的细胞溶解的体外测定法来评估特定抗MUC1α/β抗体施加抗肿瘤作用的机制。例如参见Current Protocol inImmunology，同上。

优选采用适合的动物模型在体内评估特定抗MUC1α/β抗体或抗MUC1α/β抗体组合的抗肿瘤活性。将人癌移植物或传代的异种移植物组织引入免疫低下动物(如裸小鼠或SCID小鼠)的异种癌症模型是尤其适合且公知的。例如，在Klein et al.，1997，Nature Medicine 3：402-408以及1998年4月23日公开的PCT专利申请WO 98/16628，Sawyers etal.中描述了人前列腺癌的异种移植物模型(能够概括原发性肿瘤的发展、微转移和晚期疾病特征性的成骨细胞转移的形成)。本文提供的实例详述了在体内评估抗MUC1α/β抗体制剂的抗肿瘤潜力的实验方法。设想了其它的体内测定，例如测量已建立肿瘤的退化、妨碍转移的进展等等。

值得注意的是，使用鼠科或其它非人和嵌合(单克隆的)抗体可能在一些患者中诱导中度至强烈的免疫应答。在最严重的病例中，这种免疫应答可能导致广泛形成免疫复合物，其可能引起肾衰。因此，用在本发明治疗方法实践中的优选的(单克隆的)抗体为全长人或人源化的并且以高亲和力特异结合完整MUC1抗原靶但在患者中显示低或无抗原性的抗体。

本发明的方法涉及给予单一的抗MUC1α/β抗体，以及给予不同的诸如识别不同表位的单个(单克隆的)抗体的组合或“混合物(cocktails)”。这类抗体混合物可能具有某些优势，因为它们含有结合不同表位和/或利用不同效应机制的抗体或将直接细胞毒性抗体与依赖于免疫效应功能的抗体联合。这种抗体联合可能显示协同治疗作用。此外，抗MUC1α/β抗体的给药可与其它治疗剂联合，这些治疗剂包括但不限于各种化疗剂、雄激素阻断剂、免疫调节剂(例如IL-2，GM-CSF)、其它治疗性抗体(例如针对MUC1上其它表位、针对除MUC1之外的肿瘤相关抗原、针对其它治疗上有用的表位)、以及针对感染性和其它疾病的试剂。抗MUC1α/β抗体能以“裸的”或非偶联形式给药，或者可以在其上偶联有治疗剂。

用在本发明方法实践中的抗MUC1α/β抗体可被组方为药物组合物，该药物组合物包含用于所希望的递送方法的生理上相容的载体。适合的载体包括当与抗MUC1α/β抗体组合时保留该抗体的抗肿瘤功能并且与个体的免疫系统无反应性的任何物质。实例包括但不限于多种标准药物载体中的任意一种，例如无菌磷酸盐缓冲盐水溶液、抑菌水等(通常参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy(Remington：药剂科学与实践)，Gennaro(Editor)Lippincott Williams&Wilkins(2003))。

可通过任何能够将该抗体递送到肿瘤位点的途径给予抗MUC1α/β抗体制剂。可能有效的给药途径包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、肿瘤内、真皮内给药等等。优选的给药途径为静脉内注射。优选的用于静脉内注射的制剂包含抗MUC1α/β抗体的保存的抑菌水、无菌的未保存水的溶液和/或稀释在含有0.9％无菌注射用氯化钠(USP)的聚氯乙烯或聚乙烯袋中的抗MUC1α/β抗体。该抗MUC1α/β抗体制剂可被冻干并作为无菌粉末保存，优选在真空下保存，然后在注射前在含有例如苄醇防腐剂的抑菌水或在无菌水中重建。

治疗一般涉及通过可接受的诸如静脉内注射(IV)的给药途径重复给予有效剂量的抗MUC1α/β抗体。剂量将取决于本领域技术人员通常已知的多种因素，包括但不限于肿瘤的类型和严重性、等级或癌症的阶段、所用抗体的结合亲和力和半衰期、患者中MUC1表达的程度、循环的脱落MUC1α亚基抗原的程度、所期望的稳态抗体浓度、治疗的频率以及与本发明治疗方法联合使用的化疗剂的影响。通常，日剂量可以在约0.1mg/kg至100mg/kg之间。尽管甚至更高的周剂量可以是适合的和/或良好耐受的，但每周10-500mg抗体范围内的剂量能够有效并且良好耐受。确定合适剂量的主要决定因素为在特定情况下使治疗有效时所需的特定抗体的量。为了实现肿瘤抑制或消退，可以要求重复给药。起始负载剂量可以较高。起始负载剂量可以通过输注给药。如果起始剂量被良好耐受，则可以类似地给予周期性的维持剂量。

直接给予抗MUC1α/β抗体也是可能的，并且在某些情况下可能具有优势。例如，对于治疗卵巢癌，可将抗MUC1α/β抗体直接注射进腹膜内空间。

连接生物活性组分与抗体

连接生物活性组分(例如细胞毒性部分)与抗体的方法随该组分的化学结构而变化。通常，抗体含有多种官能团，它们可用于与生物活性分子上的适合官能团反应以将该试剂结合于其上。或者，可以衍生抗体和/或生物活性组分以暴露或连接其它的反应性官能团。该衍生可能涉及连接多种接头分子中的任意一种，例如那些可从PierceChemical Company，Rockford Ill得到的。用在此处的“接头”指用于共价或非共价地连接抗体和生物活性组分的分子。适合的接头为本领域技术人员所公知，包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。例如参见Birch and Lennox，Monoclonal Antibodies：Principlesand Applications(单克隆抗体：原理和应用)，第4章，Wiley-Liss，NewYork，N.Y.(1995)；美国专利第5,218,112号、第5,090,914号；Hermanson，Bioconjugate Techniques(生物偶联技术)，Academic Press，San Diego，Calif.(1996)。

当两种分子都为多肽时，所述接头可以通过它们的侧链基团连接到成分氨基酸(例如通过二硫键至半胱氨酸)。双功能接头具有一个与特定生物活性组分上的基团反应的官能团和另一个与抗体反应的基团，可被用于形成所期望的偶联物。在一些实施方案中，双功能接头可用于连接两种抗体，例如抗MUC1α/β抗体和另一种抗体。或者，衍生可能涉及对所述组分进行化学处理；例如，用高碘酸盐造成糖蛋白抗体的糖部分的甘醇断裂以生成游离的醛基团。抗体上的该游离的醛基团可以与试剂上的游离氨或肼基团反应以便结合该试剂。(参见美国专利第4,671,958号)。在抗体或抗体片段上生成游离巯基的方法也是已知的(参见美国专利第4,659,839号)。已知许多用于连接各种化合物和诸如抗体的蛋白的方法和接头分子，所述化合物包括放射性核素金属螯合物、毒素和药物。例如参见第188,256号欧洲专利申请；美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号、第4,569,789号和第4,589,071号；以及Borlinghauset al.Cancer Res.47：4071-4075(1987))。化学接头可以商购，例如从Pierce Biotechnology，Rockford，IL获得。

有时希望在其到达靶位点时释放偶联的分子。因此，可以使用包含在靶位点附近可被切割的键的偶联物。可以由酶活性或由该偶联物所处的靶细胞内或靶位点附近的条件促进切割该键以从抗体释放生物活性组分。当靶位点为肿瘤时，可使用在肿瘤位点处的条件(例如当暴露于肿瘤相关酶或酸性pH时)下可被切割的接头。顺乌头酸间隔物可用于在内体(endosome)内释放生物活性组分。类似地，二硫键可在内体的还原性环境中断裂。

本领域技术人员已知多种不同的可断裂接头。参见美国专利第4,618,492号、第4,542,225号和第4,625,014号。用于从这些接头基团释放试剂的机制例如包括照射光敏键和酸催化的水解。美国专利第5,141,648号公开了包含具有特定化学结构的接头的免疫偶联物，其中键在体内断裂，由此释放连接的化合物(放射治疗剂、药物、毒素等)。该接头易于在温和酸性pH时断裂，并被认为在向靶细胞的细胞质中转运期间断裂，由此在靶细胞内释放生物活性化合物。美国专利第4,671,958号包括对包含接头的免疫偶联物的描述，其中该接头在体内靶位点处被患者补体系统的蛋白水解酶切割。考虑到已经报道了大量用于将多种放射诊断化合物、放射治疗化合物、药物、毒素和其它组分与抗体连接的方法，本领域技术人员能够确定用于将给定组分与本发明抗体进行连接的合适方法。

刺激针对目的抗原的免疫应答的方法

本发明还提供通过免疫能够产生抗体的个体而引起免疫应答或改善免疫应答或培育针对任何目的抗原的抗体的方法，其通过(i)首先用包含免疫原性的串联重复序列的MUC1抗原和目的抗原免疫能够产生抗体的个体一次或多次，和(ii)其次用该目的抗原加强一次或多次。MUC1抗原和目的抗原可独立地作为多肽或编码该多肽的核酸被给予。可将MUC 1抗原和目的抗原作为不连接的分子、作为通过接头(如上所述)连接的分子、或作为融合蛋白同时给予。

目的抗原可以是任何抗原性序列，包括但不限于人、哺乳动物、动物、植物、细菌、病毒或合成来源的抗原性序列。

目的抗原可以包括任何肿瘤相关抗原，包括肿瘤胚胎抗原、癌基因产物、组织谱系抗原、病毒抗原。示例性的肿瘤相关抗原包括癌胚抗原(CEA)、糖抗原(CA-125)、MUC1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性抗原(PSA)、黑素细胞抗原(例如MART-1/Melan A、酪氨酸酶、gp100和TRP-1(gp75))、肿瘤胚胎抗原(OFA)、Her2/neu。

目的抗原可以是感染性疾病相关抗原，例如来自寄生虫、细菌、病毒。例如，已经描述了可用于引发针对疟疾的免疫应答的抗体，例如在The Intolerable Burden of Malaria：II.What＇sNew，What＇s Needed(疟疾的不能承受之重：II，什么是新的，什么是所需要的)，Breman，etal.，editors，The American Society of Tropical Medicine and Hygiene(2004)。已经描述了可用于引起针对HIV的抗体应答的抗原，例如在Burton，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.(2005)102：14943中。

实施例

提供以下实施例用以说明而不是限制所要求保护的发明。

实施例1：产生抗MUC1α/β抗体

以下实施例证实通过首先用MUC1/TM cDNA抗原免疫然后用MUC1/X蛋白抗原的细胞外结构域加强来产生抗MUC1α/β抗体。通过在ELISA测定中筛选结合MUC1/X免疫球蛋白恒定区融合蛋白的那些来选择抗体。

实验操作

材料和抗体

除非另外指出，试剂和化学品都从Sigma(St Louis，MO)获得。抗MUC 1串联重复抗体(抗EMA，上皮膜抗原，Mc5)从ChemiconInternational(Temeluca，CA)获得。

细胞培养

在补充有10％热灭活胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素和25μg/ml链霉素的培养基中，在37℃和5％CO₂下培养细胞。在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养DA3小鼠乳腺肿瘤细胞和人胚肾细胞HK293。使用磷酸钙方法将表达构建体转染进这些细胞。

产生表达MUC1/TM的稳定DA3小鼠乳腺肿瘤细胞转化体

用真核表达质粒pCL-MUC1/TM(或在细胞质PvuII位点截短的pCL-MUC/TM)和pSVneo(编码新霉素抗药性)共转染DA3细胞。用新霉素选择稳定的转化体。通过对细胞溶解物的免疫印迹分析来鉴定表达MUC1蛋白的转化体，该免疫印迹分析使用亲和纯化的针对MUC1细胞质结构域的多克隆抗体。

产生MUC1/X和MUC1/Y真核表达构建体和融合蛋白

在这项研究中使用的MUC1抗原多肽包括MUC1/X免疫球蛋白恒定链融合蛋白(“Flag-Yex-hFc”)和MUC1/Y免疫球蛋白恒定链融合蛋白(“Flag-Xex-hFc”)，在图1和Levitin，et al.同上中对它们进行了描述。如前所述，使用标准分子生物学方法产生所有的构建体，(参见Levitin，et al.，同上)。

产生表达Flag-MUC1/Xex-hFc和Flag-MUC1/Yex-hFc融合蛋白的HK293转化体并纯化hFc标记的融合蛋白

使用磷酸钙用编码Flag-Xex-hFc、Flag-Yex-hFc或突变MUC1/X蛋白的真核pCMV3表达载体(6μg DNA/25cm²瓶)瞬时转染HK293(人肾)细胞。为了获得稳定的转化体，在将新霉素加入至培养基后分离抗新霉素的克隆。将含有分泌的MUC1融合蛋白的条件培养基(CM)以15,000rpm离心20分钟，并用0.45μm过滤器过滤上清液并保存在-75℃。使用Protein A-Sepharose 4Fast Flow(Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)纯化C末端hFc标记的Flag-Xex(Yex)-hFc蛋白。

确定抗MUC1抗体(杂交瘤上清液)结合MUC1/X(MUC1/Y)蛋白和结合MUC1α/β连接处的ELISA测定

用多克隆山羊抗人Fc(Gα-hFc，4μg/ml)包被ElisaImmunoAssay板(Costar，Corning，NY)，随后用PBS-Tween20(0.05％)洗涤并用PBS-Tween+5％脱脂乳(Blotto)封闭。然后，向孔中施加用过的含有Flag-Xex(或Yex)-hFc蛋白(突变体和野生型)的培养基使得Flag-Xex(Yex)-hFc蛋白结合。孵育后，移除样品并用PBS/Tween洗涤孔。然后先用小鼠单克隆抗体(或杂交瘤上清液)再用HRP偶联的抗小鼠抗体孵育。

免疫小鼠和产生杂交瘤

用皮内DNA免疫以21天的间隔连续免疫小鼠。所注射的DNA是pCL-MUC1/TM或pCL-MUC1/X表达载体质粒。最后用与不完全弗氏佐剂一起注射的MUC1/X蛋白的细胞外结构域加强小鼠。将骨髓瘤细胞系与免疫脾细胞融合并通过ELISA测定筛选(如上)来制备杂交瘤。

结果

用MUC1/TM cDNA而不是用MUC1/X cDNA免疫诱导抗MUC1a/β连接处的抗体

用含有编码MUC1/TM蛋白的cDNA或含有编码MUC1/X亚型的cDNA的表达载体免疫小鼠，MUC1/TM蛋白含有α链串联重复排列，MUC1/X亚型中串联重复被删除(图1)。在四次连续的DNA免疫后，测定血清中针对MUC1/X的抗体。将与全长MUC1/TM分子在相同位点被切割的MUC1/X亚型用作筛选蛋白以鉴别抗MUC1a/β连接处的抗体。这提供了若干优点。由于MUC1/X细胞外结构域缺失中间的串联重复排列，针对高免疫原性的串联重复排列表位的抗体将不会被检测到。更重要的是，由于MUC 1/X仅由形成天然a/β连接处的两个小的相互作用的MUC 1/Xα和β亚基构成，因而只有针对MUC 1/X和MUC1/TM共同具有的表位的抗体会被检测到。天然MUC1α/β连接处就是一个这样的主要表位，使得这种筛选方法成为检测结合此目的关键区域的抗体的简单检测系统。

出乎意料的是，用MUC1/X cDNA免疫的所有小鼠(5只中的5只)都没有产生显著的抗MUC1/X抗体滴度(图2A和图2B)。相反，用MUC1/TM cDNA免疫的5只小鼠中的5只都产生了不多但有很好重复性的抗MUC1/X抗体滴度(图2A和图2B)。这些结果表明尽管用MUC1/TM cDNA免疫可诱导识别MUC1/X和MUC1/TM蛋白共同具有的表位的抗体，但用MUC1/X cDNA免疫仅引起少量滴度的抗MUC1/X抗体。

由于我们的主要目标是产生识别α/β连接处的单克隆抗体，因此需要具有高得多的抗MUC1/X滴度的小鼠。为了产生高滴度的抗MUC1/X，我们用MUC1/X蛋白加强MUC1/TM cDNA致敏的小鼠。在单次MUC1/X蛋白加强后，所有免疫的小鼠都显示了抗MUC1/X滴度的100倍的增加，从1∶300(在MUC1/TM cDNA单独免疫后)至MUC1/X蛋白加强后最小的1∶30,000(图3A-D)。在MUC1/X蛋白加强后18天观察到高滴度，其在第32天甚至更高(图3A-D)。用于形成杂交瘤的剩余未处死小鼠甚至在最初的单一MUC1/X蛋白加强后的6个月仍保持了高抗MUC1/X蛋白滴度。为了最好地产生抗α/β结合处的特异性抗体，我们用表现最高抗MUC1/X抗体滴度的小鼠的脾细胞来形成杂交瘤。

产生识别切割的a/β连接处的DMC209单克隆抗体

测定来自10个含有融合脾-骨髓瘤细胞的96孔板的用过的培养基中识别切割的a/β连接处的抗体。为了鉴定这类抗体，平行筛选抗切割的MUC1/X蛋白和结构上类似但未切割的MUC1/Y亚型(图1)的杂交瘤上清液。尽管MUC1/X在与全长MUC1/TM蛋白相同的位点被切割导致形成相互作用的α和β亚基，但未被切割的MUC1/Y不含MUC1α/β连接处表位。我们选择MUC1/X阳性和MUC1/Y阴性的杂交瘤。

对950个杂交瘤上清液的筛选得到两个对MUC1/X蛋白有高反应性但对MUC1/Y无反应性的杂交瘤。有限的细胞稀释得到纯克隆，将其命名为DMC209和DMC111，DMC209为IgM抗体，DMC111为Igγ2a抗体。

DMC209和DMC111反应性的详细表位分析

对克隆的DMC209和DMC111产生的单克隆抗体的特异性的分析证实二者均为MUC1/X阳性和MUC1/Y(＝Δ1-18，图4B)阴性。另外，DMC209和DMC111也对未切割的Δ1-11蛋白无反应性(图4F)，但与切割的Δ1-7MUC1/X蛋白反应(图4E)。其它的分析显示尽管DMC209和DMC111同样好地结合野生型MUC1/X蛋白以及切割的S63→C和S63→T突变蛋白(图4C)，但所有其它S63突变的未切割MUC1/X蛋白(图4D)与DMC209完全无反应性。相反，DMC111与切割的MUC1/X蛋白(野生型和切割的S63→C和S63→T突变蛋白，图4D)和未切割的S63突变蛋白同样好地反应(图4D)。这些结果证实由两种单克隆抗体识别的表位是不同的。更重要的是，只有DMC209的反应性完全依赖于MUC1切割。重要的是，当对每一个单独测试时，DMC209与MUC1α亚基和β亚基均无反应；只有当它们作为相互作用的实体时DMC209才与两亚基反应。这些分析提供强有力的证据表明DMC209(i)是切割依赖的和(ii)识别相互作用的α亚基和β亚基的连接处。进一步的分析(在下文中描述)揭示DMC209牢固结合表达主要MUC1亚型MUC1/TM的细胞，而非切割依赖的DMC111抗体则显著较少结合。此后我们报道的分析将限制在切割依赖的抗体DMC209。

DMC209与完整细胞上的MUC1/TM的结合

MUC1/TM是所有MUC1亚型中的主要MUC1蛋白，由与被膜束缚的α亚基非共价结合的含有大串联重复排列的α亚基构成。其在许多腺癌中由细胞作为细胞表面异二聚体以高水平表达(图1)。由于DMC209识别位于MUC1/X蛋白中的切割的α/β连接处，而且该切割位点被证实与在全长MUC1/TM蛋白中发现的相同，所以确定DMC209是否与存在于完整细胞表面的MUC1/TM蛋白结合是极其重要的。我们通过首先研究不表达人MUC1/TM的小鼠细胞在转染人MUC1/TM后是否变得与DMC209反应来着手研究这个问题。尽管未转化的亲本小鼠乳腺肿瘤细胞完全不与DMC209反应(图5A)，但DMC209显然与表达全长MUC1/TM蛋白(图5B)或缺失MUC1/TM细胞质结构域的亚型(图5C)的相同细胞结合。为了证实MUC1/TM在这些细胞上表达，如所预料的，用针对α链串联重复排列的抗体进行的对照证实了MUC1在转化的细胞上表达(图5II)。

在确定DMC209mAbs在转化细胞中结合MUC1/TM后，我们继续研究了这些抗体是否也结合已知表达MUC1/TM的肿瘤细胞系。HEY(卵巢癌细胞系)和乳腺癌细胞系T47D和MDA231都证实有显著的DMC209结合(分别见图5C、图5D和图5E)。

DMC209结合新鲜的骨髓抽吸物中表达MUC1的多发性骨髓瘤细胞

对于最终的临床应用，针对MUC1α/β连接处的抗体必须能够靶向表达MUC1的恶性细胞。为了研究DMC209抗体能否在类似体内的环境中选择性结合肿瘤细胞，使用从患有多发性骨髓瘤的患者中新获得的骨髓抽吸物中的恶性浆细胞。抽吸物中的异质性细胞群使得能够直接评估DMC209的结合特异性。DMC209应该结合已知高表达MUC1的多发性骨髓瘤细胞而不结合或极少结合存在相同吸出物样品中的不表达MUC1的细胞。此外，使用同时染色能够容易地比较抽吸物中的DMC209细胞结合和公认的骨髓瘤标志物抗syndecan(CD138)。

以侧向散射(反映细胞颗粒性)对CD45阳性细胞作图评估了存在于骨髓抽吸物中的混合细胞群的组成(图6A)。这证实骨抽吸物由预料中的异质细胞群组成，包括粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、有核红细胞和恶性浆(骨髓瘤)细胞(图6A)。用红色荧光标记的DMC209抗体进行的同时分析揭示了显示显著DMC 209反应性的个别细胞群。这种选择的细胞群称为R1(图6B)，显示和针对syndecan-CD138的抗体完全一致(图6C)。对于从患有多发性骨髓瘤的患者中新获得的其它三个骨髓抽吸物而言，从三个骨髓抽吸物都获得了相似的结果。在相同的新鲜的、未处理的抽吸物样品中对表达MUC1的恶性浆细胞的识别而缺乏对不表达MUC1的细胞谱系的结合加强了DMC209抗α/β连接处抗体在区分表达MUC1的肿瘤细胞方面的精确特异性。

用DMC209抗α/β连接处抗体免疫组化染色乳腺癌组织

为了使DMC209与存在于乳腺癌组织中的表达MUC1的肿瘤细胞的免疫反应性可见，对来自相同手术切除样品的恶性乳腺组织和正常乳腺组织进行了免疫组化分析。平行地，用识别MUC1串联重复的抗体(α-EMA-抗上皮膜抗原，参见实验操作)对切片进行免疫组化分析。α-EMA和DMC209抗α/β连接处抗体均与恶性乳腺癌细胞强烈反应。在非恶性的正常乳腺组织中观察到明显较少的染色。

随后，我们使用分别用红色和绿色荧光标记的DMC209和抗串联重复抗体进行了同时的双重染色。使用红色标记的DMC209在恶性乳腺组织的冷冻切片中容易地检测到MUC1免疫反应性。在恶性乳腺上皮细胞上看到强烈的抗MUC1免疫反应性，并且在加入未标记的DMC209抗体后基本上所有的免疫反应性都被竞争除去，由此证实了免疫反应性的特异性。在嵌入结缔组织的成纤维细胞中没有看到染色，在结缔组织自身中也没有看到染色。如所预料的，代表与抗串联重复抗体的免疫反应性的绿色标记与所看到的红色标记的DMC209共定位。

应理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于解释说明的目的，本领域技术人员将会提出根据这些内容的多种修饰或变化，它们被包括在本申请的精神和范围内以及所附的权利要求的范围内。出于所有目的，将本文引用的所有出版物、专利和专利申请以其整体通过引用在此并入。

序列表

SEQID NO：1-MUC1/TM的核酸序列

atg acaccgggca cccagtctcc tttcttcctg ctgctgctcc tcacagtgct tacagttgtt

acaggttctg gtcatgcaag ctctacccca ggtggagaaa aggagacttc ggctacccag

agaagttcag tgcccagctc tactgagaag aatgctgtga gtatgaccag cagcgtactc

tccagccaca gccccggttc aggctcctcc accactcagg gacaggatgt cactctggcc

ccggccacgg aaccagcttc aggttcagct gccacctggg gacaggatgt cacctcggtc

ccagtcacca ggccagccct gggctccacc accccgccag cccacgatgt cacctcagcc

ccggacaaca agccagcccc gggctccacc gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc

ccggacacca ggccgccccc gggctccacc gcccccccag cccacggtgt cacctcggcc

ccggacacca ggccgccccc gggctccacc gcgcccgcag cccacggtgt cacctcggcc

ccggacacca ggccggcccc gggctccacc gcccccccag cccatggtgt cacctcggcc

ccggacaaca ggcccgcctt ggcgtccacc gcccctccag tccacaatgt cacctcggcc

tcaggctctg catcaggctc agcttctact ctggtgcaca acggcacctc tgccagggct

accacaaccc cagccagcaa gagcactcca ttctcaattc ccagccacca ctctgatact

cctaccaccc ttgccagcca tagcaccaag actgatgcca gtagcactca ccatagcacg

gtacctcctc tcacctcctc caatcacagc acttctcccc agttgtctac tggggtctct

ttctttttcc tgtcttttca catttcaaac ctccagttta attcctctct ggaagatccc

agcaccgact actaccaaga gctgcagaga gacatttctg aaatgttttt gcagatttat

aaacaagggg gttttctggg cctctccaat attaagttca ggccaggatc tgtggtggta

caattgactc tggccttccg agaaggtacc atcaatgtcc acgacgtgga gacacagttc

aatcagtata aaacggaagc agcctctcga tataacctga cgatctcaga cgtcagcgtg

agtgatgtgc catttccttt ctctgcccag tctggggctg gggtgccagg ctggggcatc

gcgctgctgg tgctggtctg tgttctggtt gcgctggcca ttgtctatct cattgccttg

gctgtctgtc agtgccgccg aaagaactac gggcagctgg acatctttcc agcccgggat

acctaccatc ctatgagcga gtaccccacc taccacaccc atgggcgcta tgtgccccct

agcagtaccg atcgtagccc ctatgagaag gtttctgcag gtaatggtgg cagcagcctc

tcttacacaa acccagcagt ggcagccact tctgccaact tgtaggggca cgtcgccctc

tgagctgagt ggccagccag tgccattcca ctccactcag ggctctctgg gccagtcctc

ctgggagccc ccaccacaac acttcccagg catggaattc c

SEQ ID NO：2-MUC1/TM的氨基酸序列

MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSS

VPSSTEKNAVSMTSSVLSSHSPGSGSSTTQGQDVTLAPATEPASGSAATWGQDVTSVP

VTRPALGSTTPPAHDVTSAPDNKPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPPPGSTAPPAHGVTS

APDTRPPPGSTAPAAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDNRPALASTAPPVHNV

TSASGSASGSASTLVHNGTSARATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHSTKTDASS

THHSTVPPLTSSNHSTSPQLSTGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQRDIS

EMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY

NLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKN

YGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAV

AATSANL

SEQ ID NO：3-MUC1/X的核酸序列

1 acctctcaag cagccagcgc ctgcctgaat ctgttctgcc ccctccccac ccatttcacc

61 accaccatga caccgggcac ccagtctcct ttcttcctgc tgctgctcct cacagtgctt

121 acagttgtta cgggttctgg tcatgcaagc tctaccccag gtggagaaaa ggagacttcg

181 gctacccaga gaagttcagt gcccagctct actgagaaga atgctttgtc tactggggtc

241 tctttctttt tcctgtcttt tcacatttca aacctccagt ttaattcctc tctggaagat

301 cccagcaccg actactacca agagctgcag agagacattt ctgaaatgtt tttgcagatt

361 tataaacaag ggggttttct gggcctctcc aatattaagt tcaggccagg atctgtggtg

421 gtacaattga ctctggcctt ccgagaaggt accatcaatg tccacgacgt ggagacacag

481 ttcaatcagt ataaaacgga agcagcctct cgatataacc tgacgatctc agacgtcagc

541 gtgagtgatg tgccatttcc tttctctgcc cagtctgggg ctggggtgcc aggctggggc

601 atcgcgctgc tggtgctggt ctgtgttctg gttgcgctgg ccattgtcta tctcattgcc

661 ttggctgtct gtcagtgccg ccgaaagaac tacgggcagc tggacatctt tccagcccgg

721 gatacctacc atcctatgag cgagtacccc acctaccaca cccatgggcg ctatgtgccc

781 cctagcagta ccgatcgtag cccctatgag aaggtttctg caggtaatgg tggcagcagc

841 ctctcttaca caaacccagc agtggcagcc acttctgcca acttgtaggg gcacgtcgcc

901 cgctgagctg agtggccagc cagtgccatt ccactccact caggttcttc agggccagag

961 cccctgcacc ctgtttgggc tggtgagctg ggagttcagg tgggctgctc acagcctcct

1021 tcagaggccc caccaatttc tcggacactt ctcagtgtgt ggaagctcat gtgggcccct

1081 gagggctcat gcctgggaag tgttgtggtg ggggctccca ggaggactgg cccagagagc

1141 cctgagatag cggggatcct gaactggact gaataaaacg tggtctccca ctgcgccaaa

1201 aaaaaaaaa

SEQ ID NO：4-MUC1/X的氨基酸序列

MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSS

VPSSTEKNALSTGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQG

GFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTFAASRYNLTISDVSVS

DVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPAR

DTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL

SEQ ID NO：5-MUC1/Y的核酸序列

1 acctctcaag cagccagcgc ctgcctgaat ctgttctgcc ccctccccac ccatttcacc

61 accaccatga caccgggcac ccagtctcct ttcttcctgc tgctgctcct cacagtgctt

121 acagttgtta cgggttctgg tcatgcaagc tctaccccag gtggagaaaa ggagacttcg

181 gctacccaga gaagttcagt gcccagctct actgagaaga atgcttttaa ttcctctctg

241 gaagatccca gcaccgacta ctaccaagag ctgcagagag acatttctga aatgtttttg

301 cagatttata aacaaggggg ttttctgggc ctctccaata ttaagttcag gccaggatct

361 gtggtggtac aattgactct ggccttccga gaaggtacca tcaatgtcca cgacgtggag

421 acacagttca atcagtataa aacggaagca gcctctcgat ataacctgac gatctcagac

481 gtcagcgtga gtgatgtgcc atttcctttc tctgcccagt ctggggctgg ggtgccaggc

541 tggggcatcg cgctgctggt gctggtctgt gttctggttg cgctggccat tgtctatctc

601 attgccttgg ctgtctgtca gtgccgccga aagaactacg ggcagctgga catctttcca

661 gcccgggata cctaccatcc tatgagcgag taccccacct accacaccca tgggcgctat

721 gtgcccccta gcagtaccga tcgtagcccc tatgagaagg tttctgcagg taatggtggc

781 agcagcctct cttacacaaa cccagcagtg gcagccactt ctgccaactt gtaggggcac

841 gtcgcccgct gagctgagtg gccagccagt gccattccac tccactcagg ttcttcaggg

901 ccagagcccc tgcaccctgt ttgggctggt gagctgggag ttcaggtggg ctgctcacag

961 cctccttcag aggccccacc aatttctcgg acacttctca gtgtgtggaa gctcatgtgg

1021 gcccctgagg gctcatgcct gggaagtgtt gtggtggggg ctcccaggag gactggccca

1081 gagagccctg agatagcggg gatcctgaac tggactgaat aaaacgtggt ctcccactgc

1141 gccaaaaaaa aaaaa

SEQ ID NO：6-MUC1/Y的氨基酸序列

MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSS

VPSSTEKNAFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQ

LTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWG

IALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRY

VPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL

Claims

1.特异结合完整MUC1蛋白的MUC1特异性抗体，条件是在α亚基或β亚基中的一个不存在时所述抗体基本上不结合另一个。

2.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合亚型MUC1/X但基本上不结合亚型MUC1/Y。

3.如权利要求2所述的抗体，其中所述亚型MUC1/X被切割为截短的α亚基和β亚基。

4.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

5.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体具有约1∶300至约1∶30,000的滴度。

6.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是IgM。

7.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是DMC209。

8.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是IgG。

9.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是DMC111。

10.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是人源化的。

11.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是人的。

12.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是抗体的重组单链可变区片段。

13.如权利要求1所述的抗体，还包含细胞毒性部分。

14.如权利要求1所述的抗体，还包含标签部分。

15.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体防止所述α亚基从所述β亚基解离。

16.包含权利要求1的抗体的细胞。

17.如权利要求16所述的细胞，其中所述细胞是杂交瘤细胞。

18.如权利要求16所述的细胞，其中所述细胞在其表面包含结合权利要求1的抗体的完整MUC1蛋白。

19.将免疫毒素靶向过表达MUC1的癌细胞的方法，包括给予权利要求1的抗体。

20.产生结合完整MUC1蛋白的MUC1特异性抗体的方法，包括步骤：

i)用包含α亚基串联重复的MUC1/TM抗原以足以产生特异结合所述完整MUC1蛋白的MUC1特异性抗体的量免疫具有产生抗体的能力的个体；以及

ii)选择结合MUC1/X抗原的抗体；

其中在所述MUC1α亚基或β亚基中的一个不存在时所述抗体基本上不结合另一个。

21.如权利要求20所述的抗体，其中所述抗体结合亚型MUC1/X但基本上不结合亚型MUC1/Y。

22.如权利要求21所述的抗体，其中所述亚型MUC1/X被切割为截短的α亚基和β亚基。

23.如权利要求20所述的方法，其中所述MUC1/TM抗原是MUC1/TM多肽。

24.如权利要求20所述的方法，其中所述MUC1/TM抗原是编码MUC1/TM多肽的核酸。

25.如权利要求20所述的方法，在步骤i)之后还包括用MUC1/X抗原免疫所述个体的步骤。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述MUC1/X抗原是MUC1/X多肽。

27.如权利要求25所述的方法，其中所述MUC1/X抗原是编码MUC1/X多肽的核酸。

28.筛选特异结合完整MUC1蛋白的MUC1特异性抗体的方法，条件是在所述α亚基或所述β亚基中的一个不存在时所述抗体基本上不结合另一个，所述方法包括：

i)确定多种产生的抗MUC1抗体对切割的MUC1/X抗原和MUC1/Y抗原的结合；以及

ii)选择特异结合所述MUC1/X抗原但不明显结合所述MUC1/Y抗原的抗体。

29.产生针对目的抗原的抗体的方法，包括步骤：

i)用包含α亚基串联重复的MUC1/TM抗原和所述目的抗原免疫个体；以及

ii)用所述目的抗原免疫所述个体；

由此产生针对所述目的抗原的抗体。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述MUC1/TM抗原是MUC1/TM多肽。

31.如权利要求29所述的方法，其中所述MUC1/TM抗原是编码MUC1/TM多肽的核酸。

32.如权利要求29所述的方法，其中所述目的抗原是多肽。

33.如权利要求29所述的方法，其中所述目的抗原是编码所述目的抗原的核酸。

34.如权利要求29所述的方法，在步骤i)中进一步包括用包含MUC1/TM目的抗原的融合抗原免疫个体。

35.如权利要求29所述的方法，其中所述目的抗原选自人、动物、植物、细菌、病毒或合成抗原。

36.如权利要求29所述的方法，其中所述目的抗原为肿瘤相关抗原。

37.如权利要求29所述的方法，其中所述目的抗原为感染性疾病相关抗原。