CN102321624A - 革胡子鲶生长激素基因表达定量pcr分析中用于内参基因扩增的引物序列 - Google Patents
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Abstract
一种革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时用于内参基因(18S rRNA)扩增的2对引物的核苷酸序列，<tables id="tabl0001" num="0001" wi="150">
</tables>两对引物不仅可作为革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时内参基因(18S rRNA)的扩增引物，而且可作为革胡子鲶所有待检目标基因表达qPCR分析时，以18SrRNA为内参基因的扩增引物。两对引物不仅可应用于革胡子鲶的研究，还可应用于其它一些鲶形目鱼类的待检目标基因表达qPCR分析时以18S rRNA作为内参基因的研究。
Description
技术领域
本发明属于机理研究的分子生物学技术领域。特别涉及一种革胡子鲶(Clariasgariepinus)在养殖过程中与生长相关的重要内分泌因子——革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR分析中用于内参基因扩增的引物序列。
背景技术
革胡子鲶具有耐低氧能力强、生长快、疾病少等特点，是一种发展前景良好的水产养殖品种，在国内外养殖非常普遍。在食用价值上该鱼具有蛋白质含量高、营养丰富、肉味鲜美，刺少肉多的特点，并且具有滋补功效，对于手术伤口愈合有显著的辅助治疗作用。国内外对革胡子鲶的研究主要集中在人工繁殖和苗种培育、养殖模式及其养殖技术的研究，而对革胡子鲶的基础生物学方面的研究报道极少，主要有对其性激素、组织对氨的积累、对水中某些化学物质的组织病理学反应以及对水中重金属离子的积累等研究。而对革胡子鲶生长迅速、抗逆性强的机理的基础研究未见报道。
鱼类的生长与其他脊椎动物相同，是一个复杂的生物代谢过程，受基因型、激素、营养、环境等多方面的影响。对动物生长机理的研究其首选是从生长轴入手，生长轴是动物体内从下丘脑——垂体——靶器官的一系列激素及其受体所组成的神经内分泌系统。其中，生长激素(GH)是调控脊椎动物生长的重要内分泌因子，也是研究动物生长最重要的因子。GH除了对鱼类的生长有很强的促进作用外，同时对鱼类的免疫系统、生殖生理及海水适应性也有着重要的影响。此外还有研究显示GH基因多态性与动物的生产性能有关。
从鱼类生长轴中的关键因子GH入手，通过GH基因表达的实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)分析，探讨高密度养殖革胡子鲶快速生长的机理。对于基因表达的qPCR分析，既要有拟分析的目标基因，又要有适宜的内参基因。常用的内参基因有beta-actin、18S rRNA和GAPDH基因。在qPCR中，引物序列对产物的特异性和有效扩增来说至关重要。只有适宜的寡核苷酸序列，在qPCR中同时满足下述3个条件：第一，利用较高浓度cDNA(如反转录后稀释5～10倍的cDNA)在进行qPCR时CT值应小于18～20；第二，每个反应的熔解曲线应为1个峰；第三，通过建立标准曲线得出的扩增效率应在90～105％(标准曲线的R2值应大于0.98，重复样本CT值的标准差应≤0.5)。此时的寡核苷酸序列才能作为qPCR的引物。
尽管qPCR技术已经成熟，目前已成为不同样本间进行基因表达水平定量差异比较的权威性方法。在过去的10年间，该方法迅速流行，出版的文章超过2万余篇，涉及医学、环境和农业研究。但在应用此技术的实验过程中，需要研究人员自己设计并检测引物是否可用于qPCR。
目前没有革胡子鲶相关目标基因表达qPCR分析适宜的引物核苷酸序列，特别是用于内参基因扩增的引物核苷酸序列。
发明内容
本发明目的是提供一种革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR(qPCR)分析中用于内参基因扩增的引物核苷酸序列，提供有利于对革胡子鲶生长迅速的机理的基础研究的工具。
本发明设计并检测了2对目标基因(GH)和4对内参基因(beta-actin和18S rRNA各2对)引物序列，其中1对目标基因和2对内参基因的引物符合qPCR的要求。本发明的优点在于内参基因扩增的引物应用广，不仅可以用于革胡子鲶的GH基因表达分析，理论上可用于该种鱼类的任一基因的qPCR分析；此外，GenBank检索认为，申请的2对内参基因的扩增引物，还可用于其他一些鲶形目鱼类的基因表达的qPCR分析。这一发明为革胡子鲶以及几种鲶形目鱼类的基础研究奠定了基础。
本发明具体内容
一种革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时用于内参基因(18S rRNA)扩增的2对引物的核苷酸序列，其特征见表1
表1申请专利的引物核苷酸序列信息
表中的两对引物不仅可作为革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时内参基因(18SrRNA)的扩增引物，而且可作为革胡子鲶所有待检目标基因表达qPCR分析时，以18S rRNA为内参基因的扩增引物。
表中的两对引物不仅可应用于革胡子鲶的研究，还可应用于其它一些鲶形目鱼类的待检目标基因表达qPCR分析时以18S rRNA作为内参基因的研究。
革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时用于内参基因(18S rRNA)扩增的2对引物核苷酸序列的制作方法：
一、总体RNA的提取
应用Trizol试剂提取单个垂体的总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测，分析其完整性和纯度。图1琼脂糖凝胶电泳结果显示：RNA样本的28S/18S rRNA的条带亮度的比值在1～2之间，提示RNA样本的完整性较好；而表2中RNA样本的OD260/OD280和OD260/OD230的比值均在1.8～2.0之间，表明这两个RNA样本没有蛋白和酚的污染，均可用于qPCR实验。
表2总RNA的分光光度计检测结果
二、RNA的反转录
将上述1号RNA样本反转录成cDNA第一条链(RevertAidTM cDNA第一条链合成试剂盒)，用于所设计引物的评估。
三、引物的设计与常规PCR评估
1).GH、18S rRNA和beta-actin基因片段扩增引物的设计
本试验中待检目标基因为GH，拟用18S rRNA或beta-actin作为内参基因。GH基因扩增引物根据本实验室克隆的革胡子鲶GH全长cDNA(GenBank检索号：FJ823972)、18S rRNA和beta-actin基因的扩增引物分别根据GenBank检索的18SrRNA(GenBank检索号：AJ876383)和beta-actin(GenBank检索号：HM768299)序列，应用Primer 5.0设计。根据qPCR和引物设计的基本原则，从设计的数十对引物中预选出GH、18S rRNA和beta-actin扩增的引物各2对，并由上海生工生物工程有限公司合成，其引物信息如表3。
表3设计合成的引物信息
2).引物的常规PCR评估
首先，以稀释10倍的cDNA为模板，根据合成的6对引物的Tm值，进行常规PCR扩增，以便对引物进行初步评估。图2.1和图2.2的琼脂糖凝胶电泳结果显示：6对引物均能扩增出良好的片段，并且片段大小与引物设计时产生的片段大小相符，因此进一步对6对引物进行qPCR评估分析。
四、引物的qPCR评估
应用美国BioRad公司IQTM5 qPCR仪和该公司的SsoFast EvaGreen qPCR预混液，根据该预混液的说明书，对设计的6对引物进行qPCR评估。
1).引物的qPCR初步评估
首先以稀释10倍的cDNA为模板，与常规PCR应用相同的退火温度，对GH、18S rRNA和beta-actin基因片段进行qPCR(每个反应做2个平行)，根据得出的CT值(表4)，对6对引物进行初步评估。
表4引物在qPCR试验中的相关数据
在本部分试验中，每对引物在qPCR扩增时得到的熔解曲线均表现为一个峰，说明引物在qPCR扩增中特异性强，满足qPCR的基本要求之一。但表4的数据中引物对q-GH F1和q-GH R1、q-actin-F1和q-actin-R1以及q-actin-F2和q-actin-R2，在qPCR中的CT较大，平均值分别为22.93、26.03和26.21，均大于20，说明该浓度的cDNA或者即使是反转录的cDNA原液也不能最为制备标准曲线时的最低浓度样本，即无法应用标准曲线对这3对引物的扩增效率进行评估，所以它们不能用于后续的qPCR分析。根据此结果，仅对q-GH F和q-GH R、q-18S F1和q-18S R1以及q-18S F4和q-18SR4这3对引物进行进一步的qPCR分析。
2).引物的退火温度及熔解曲线分析
以稀释10倍的cDNA为模板，设置3个退火温度、应用q-GH F和q-GH R、q-18SF1和q-18S R1以及q-18S F4和q-18S R4分别对GH和18S rRNA的基因片段进行qPCR扩增，每个反应做2个平行。熔解曲线的结果(图3～图5)显示：3对引物在退火温度为58℃、60℃和62℃扩增时每个反应的熔解曲线均为一个峰，进一步说明了引物的特异性强，即相应的DNA片段在qPCR中为特异性扩增。表5的数据显示：3对引物在3个退火温度下qPCR的CT变化不大，因此可选择任一退火温度，通过建立标准曲线，进一步评估这3对引物的扩增效率。
表5不同的退火温度扩增GH和18S rRNA基因片段的相关数据
3).引物扩增效率的评估(标准曲线的建立)
(1)引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段的扩增效率评估
以稀释10倍的cDNA作为初始浓度，采用10倍稀释法，共设置5个浓度(表6)，以60℃作为退火温度，应用引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段，每个反应做3个平行，制备标准曲线(图6)。
本部分试验中，表6的结果显示：引物的扩增效率为103.8％，标准曲线的R2为0.999，重复样本CT值的标准差为0.068～0.260；此外，在指数扩增区相邻的扩增曲线间距相似(图7)；每个反应的熔解曲线为1个峰(图8)。
qPCR理想的引物扩增效率应在90～105％之间，标准曲线的R2值应大于0.98，重复样本CT值的标准差应≤0.50，在指数扩增区相邻的扩增曲线间距应相似。
因此，根据该对引物的扩增曲线、熔解曲线、引物的扩增效率和标准曲线的R2值，证明该对引物可用于对GH基因表达的qPCR研究。
表6引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段时的相关数据
注：反应管号中数字相同者代表平行试验。
(2)引物q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段的扩增效率评估
与GH片段的扩增效率评估相同，以稀释10倍的cDNA作为初始浓度，采用10倍稀释法，共设置5个浓度(表7)，以60℃作为退火温度，应用引物q-18S F4和q-18SR4扩增18S rRNA片段，每个反应做3个平行，制备标准曲线(图9)。
本部分试验中，表7的结果显示：引物的扩增效率为92.4％，标准曲线的R2为0.999，重复样本CT值的标准差为0.056～0.300；此外，在指数扩增区相邻的扩增曲线间距相似(图10)；每个反应的熔解曲线为1个峰(图11)。同理，证明该引物可用于GH表达qPCR分析时，对内参基因18S rRNA的扩增。
表7引物q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段时的相关数据
注：反应管号中数字相同者代表平行试验。
(3)引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段的扩增效率评估
与前2对引物扩增效率的评估相同，以稀释10倍的cDNA作为初始浓度，采用10倍稀释法，共设置5个浓度(表8)，以60℃作为退火温度，应用引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段，每个反应做2个平行，制备标准曲线(图12)。
本部分试验中，表8的结果显示：引物的扩增效率为104.2％，标准曲线的R2为0.998，重复样本CT值的标准差为0.010～0.280；此外，在指数扩增区相邻的扩增曲线间距相似(图13)；每个反应的熔解曲线为1个峰(图14)。同理证明该引物也可用于GH表达qPCR分析时，对内参基因18S rRNA的扩增。
表8引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段时的相关数据
注：反应管号中数字相同者代表平行试验。
五、引物的q-GH F和q-GH R和q-18S F4和1q-18S R4扩增片段的测序验证
1).q-GH F和q-GH R扩增GH片段的测序验证
将该对引物的常规PCR产物直接用扩增引物双向测序和拼接(北京六合华大基因科技股份有限公司)，结果如下(其中加粗字体分别为引物q-GH F序列以及q-GH R的反向互补序列)。这一序列与引物设计时产生的扩增子序列100％相同。
2).q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段的测序验证
将该对引物的常规PCR产物直接用扩增引物双向测序和拼接(北京六合华大基因科技股份有限公司)，结果如下(其中加粗字体分别为引物q-18S F4序列以及q-18SR4的反向互补序列)。这一序列与引物设计时产生的扩增子序列100％相同。
3).q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段的测序分析
由于该对引物扩增的18S rRNA片段仅为83bp，PCR产物无法直接测序，根据引物设计时，该对引物在18S rRNA中的位置，其序列如下(其中加粗字体分别为引物q-18S F1序列以及q-18S R1的反向互补序列)：
六、扩增子核苷酸序列的GenBank比对
将3对引物，即：q-GHF和q-GHR、q-18S F4和q-18S R4、q-18S F1和q-18SR1以及它们产生的3条扩增子序列分别输入GenBank比对。推测：引物q-GH F和q-GH R不仅可以用于革胡子鲶GH基因片段的qPCR，还可用于蟾胡鲶(Clariasbatrachus)。q-18S F1和q-18S R1不仅可以用于革胡子鲶的18S rRNA的qPCR扩增，还可用于20余种鲶形目鱼类，其中包括我国重要的鲶形目养殖鱼类：鲶(Silurusasotus)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)和斑点叉尾鮰(Ictalurus Punctatus)。而q-18S F4和q-18S R4不仅可以用于革胡子鲶的18S rRNA的qPCR扩增，也可用于多种鲶形目的胡鲶科鱼类，如：杜氏胡鲶(Clarias dussumieri)、钝齿胡鲶(Clarias ngamensis)和大须胡鲶(Clarias buthupogon)等。
附图说明
图1革胡子鲶2个垂体总RNA电泳结果。
图2.1和2.2引物常规PCR扩增的电泳结果。注：泳道M为DNA标准分子量。
图3引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段退火温度为58℃(曲线上标记▲)、60℃(曲线光滑)和62℃(曲线上标记×)时的扩增熔解曲线。注：曲线上标记■为阴性对照。
图4引物q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段退火温度为58℃(曲线上标记▲)、60℃(曲线光滑)和62℃(曲线上标记×)时的扩增熔解曲线。注：曲线上标记■为阴性对照。
图5引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段退火温度为58℃(曲线上标记▲)、60℃(曲线光滑)和62℃(曲线上标记×)时的扩增熔解曲线。
图6引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段时制备的标准曲线。注：C、D和E为三个平行试验。
图7引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段制备标准曲线时每个反应的扩增曲线。注：光滑曲线、曲线上标记有■和曲线上标记有×分别为C、D和E三个平行试验。
图8引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段制备标准曲线时每个反应的熔解曲线。
图9引物q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段时制备的标准曲线。注：D、E和F为三个平行试验。
图10引物q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段制备标准曲线时每个反应的扩增曲线。注：光滑曲线、曲线上标记有■和曲线上标记有×分别为D、E和F三个平行试验。
图11引物q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段制备标准曲线时每个反应的熔解曲线。
图12引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段时制备的标准曲线。注：C和D为两个平行试验。
图13引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段制备标准曲线时每个反应的扩增曲线。光滑曲线和曲线上标记有■分别为C和D两个平行试验。
图14引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段制备标准曲线时每个反应的熔解曲线。
图15引物q-GH F和q-GH R扩增的GH片段用引物q-GH F(a)和q-GH R(b)的测序图。
图16引物q-18S F4和q-18S R4扩增的18S rRNA片段用引物q-18S F4(a)和q-18S R4(b)的测序图。
图17引物q-GH F和q-GH R扩增的GH片段的GenBank检索截图。
图18引物q-18S F1和q-18S R1扩增的18S rRNA片段的GenBank检索截图。
图19引物q-18S F4和q-18S R4扩增的18S rRNA片段的GenBank检索截图。
具体实施方式
革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时用于内参基因(18S rRNA)扩增的2对引物的核苷酸序列见表1。
表1申请专利的引物核苷酸序列信息
根据内参基因的特点，本申请中扩增内参基因18S rRNA的2对引物，不仅可用于GH基因表达分析时扩增内参基因，而且可以作为革胡子鲶所有待检目标基因表达qPCR分析时，以18S rRNA为内参基因的扩增引物，且经GenBank查询后推测，这2对引物不仅可以用于革胡子鲶的研究，还可用于其它一些鲶形目鱼类的待检目标基因表达qPCR分析时以18SrRNA作为内参基因的研究。下面为这2对引物的试验过程和结果。
一、总体RNA的提取
应用Trizol试剂(购自上海生工生物工程有限公司)提取单个垂体的总RNA。经琼脂糖凝胶电泳(图1)和分光光度计检测(表2)，分析完其整性和纯度。
图1革胡子鲶2个垂体总RNA电泳结果
表2总RNA的分光光度计检测结果
图1显示RNA样本的28S/18S rRNA的条带亮度的比值在1～2之间，提示RNA样本的完整性较好；而表2中RNA样本的OD260/OD280和OD260/OD230的比值均在1.8～2.0之间，表明RNA样本没有蛋白和酚的污染。图1和表2的数据说明这2个RNA样本均可用于qPCR实验。
二、RNA的反转录
将上述1号RNA样本反转录成cDNA第一条链(RevertAidTM cDNA第一条链合成试剂盒，购自上海生工生物工程有限公司)，用于所设计引物的评估。
三、引物的设计与常规PCR评估
1.GH、18S rRNA和beta-actin基因片段扩增引物的设计
本试验中待检目标基因为GH，拟用18S rRNA或beta-actin作为内参基因。GH基因扩增引物根据本实验室克隆的革胡子鲶GH全长cDNA(GenBank检索号：FJ823972)、18S rRNA和beta-actin基因的扩增引物分别根据GenBank检索的18SrRNA(GenBank检索号：AJ876383)和beta-actin(GenBank检索号：HM768299)序列，应用Primer 5.0设计。根据qPCR和引物设计的基本原则，从设计的数十对引物中预选出GH、18S rRNA和beta-actin扩增的引物各2对，并由上海生工生物工程有限公司合成。其引物信息如表3。
表3设计合成的引物信息
2.引物的常规PCR评估
首先，以稀释10倍的cDNA为模板，根据合成的6对引物的Tm值，进行常规PCR扩增，以便对引物进行初步评估，其常规PCR扩增结果见图2.1和图2.2。图2.1和图2.2引物常规PCR扩增的电泳结果。注：泳道M为DNA标准分子量。
图2的结果显示6对引物均能扩增出良好的片段，并且片段大小与引物设计时产生的片段大小相符。因此进一步对6对引物进行qPCR评估分析。
四、引物的qPCR评估
应用美国BioRad公司IQTM5 qPCR仪和该公司的SsoFast EvaGreen qPCR预混液，根据该预混液的说明书，对设计的6对引物进行qPCR评估。
1.引物的qPCR初步评估
首先以稀释10倍的cDNA为模板，与常规PCR应用相同的退火温度，对GH、18S rRNA和beta-actin基因片段进行qPCR(每个反应做2个平行)，根据得出的CT值(表4)，对6对引物进行初步评估。
表4引物在qPCR试验中的相关数据
在本部分试验中，每对引物在qPCR扩增时得到的熔解曲线均表现为一个峰值(图片未提供)，说明引物在qPCR扩增中特异性强，满足qPCR的基本要求之一。但表4的数据中引物对q-GH F1和q-GH R1、q-actin-F1和q-actin-R1以及q-actin-F2和q-actin-R2，在qPCR中的CT较大，平均值分别为22.93、26.03和26.21，均大于20，说明该浓度的cDNA或者即使是反转录的cDNA原液也不能作为制备标准曲线时的最低浓度样本，即无法应用标准曲线对这3对引物的扩增效率进行评估，所以它们不能用于后续的qPCR分析。根据此结果，仅对q-GH F和q-GH R、q-18S F1和q-18SR1以及q-18S F4和q-18S R4这3对引物进行进一步的qPCR评估分析。
2.引物的退火温度及熔解曲线分析
以稀释10倍的cDNA为模板，设置3个退火温度、应用q-GH F和q-GH R、q-18SF1和q-18S R1以及q-18S F4和q-18S R4分别对GH和18S rRNA的基因片段进行qPCR扩增。每个反应做2个平行。熔解曲线见图3～5。该结果显示3对引物在退火温度为58℃、60℃和62℃扩增时每个反应的熔解曲线均为一个峰，进一步说明了引物的特异性强，即相应的DNA片段在qPCR中为特异性扩增。表5的数据显示：3对引物在3个退火温度下CT变化不大，因此可选择任一退火温度，通过建立标准曲线，进一步评估这3对引物的扩增效率。
表5不同的退火温度扩增GH和18S rRNA基因片段的相关数据
图3引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段退火温度为58℃(曲线上标记▲)、60℃(曲线光滑)和62℃(曲线上标记×)时的扩增熔解曲线。注：曲线上标记■为阴性对照。
图4引物q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段退火温度为58℃(曲线上标记▲)、60℃(曲线光滑)和62℃(曲线上标记×)时的扩增熔解曲线。注：注：曲线上标记■为阴性对照。
图5引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段退火温度为58℃(曲线上标记▲)、60℃(曲线光滑)和62℃(曲线上标记×)时的扩增熔解曲线。
3.引物扩增效率的评估(标准曲线的建立)
(1)引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段的扩增效率评估
以稀释10倍的cDNA作为初始浓度，采用10倍稀释法，共设置5个浓度(表6)，以60℃作为退火温度，应用引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段，每个反应做3个平行。图6为制备的标准曲线，图7为扩增曲线图，表6为扩增时得到的相关数据；图8为则为每个反应的熔解曲线图。
图6引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段时制备的标准曲线。注：C、D和E为三个平行试验。
图7引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段制备标准曲线时每个反应的扩增曲线。注：光滑曲线、曲线上标记有■和曲线上标记有×分别为C、D和E三个平行试验。
表6引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段时的相关数据
注：反应管号中数字相同者代表平行试验。
图8引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段扩增制备标准曲线时每个反应的熔解曲线。
由于qPCR理想的扩增效率应在90～105％之间，标准曲线的R2应大于0.98，重复样本CT值的标准差应≤0.50，在指数扩增区相邻的扩增曲线间距应相似。
从表6可以看出，该对引物的扩增效率为103.8％，标准曲线的R2值为0.999，重复样本CT值的标准差在0.068～0.260；此外，在指数扩增区相邻扩增曲线的间距相似(图7)，每个反应的熔解曲线均为一个峰(图8)。因此证明该引物可用于对GH基因表达的qPCR研究。
(2)引物q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段的扩增效率评估
与GH片段的扩增效率评估相同，以稀释10倍的cDNA作为初始浓度，采用10倍稀释法，共设置5个浓度(表7)，以60℃作为退火温度，应用引物q-18S F4和q-18SR4扩增18S rRNA片段，每个反应做3个平行。图9为制备的标准曲线，图10为扩增曲线图，表7为扩增时得到的相关数据，图11为则为每个反应的熔解曲线图。从表7可以看出，该对引物的扩增效率为92.4％，标准曲线的R2值为0.999，重复样本CT值的标准差在0.056～0.300，在指数扩增区相邻扩增曲线的间距相似(图10)，每个反应的熔解曲线均为一个峰(图11)。同理，证明该引物可用于GH表达qPCR分析时，对内参基因18S rRNA的扩增。
图9引物q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段时制备的标准曲线。注：D、E和F为三个平行试验。
图10引物q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段制备标准曲线时每个反应的扩增曲线。注：光滑曲线、曲线上标记有■和曲线上标记有×分别为D、E和F三个平行试验
表7引物q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段时的相关数据数据
注：反应管号中数字相同者代表平行试验。
图11引物q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段制备标准曲线时每个反应的熔解曲线。
(3)引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段的扩增效率评估
与前2对引物扩增效率的评估相同，以稀释10倍的cDNA作为初始浓度，采用10倍稀释法，共设置5个浓度(表8)，也以60℃作为退火温度，应用引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段，每个反应做2个平行。图12为制备的标准曲线，图13为扩增曲线图，表8为扩增时得到的相关数据，图14为则为每个反应的熔解曲线图。
从表8可以看出，该对引物的扩增效率为104.2％，标准曲线的R2值为0.998，重复样本CT值的标准差在0.010～0.280，在指数扩增区相邻扩增曲线的间距相近(图13)，每个反应的熔解曲线均为一个峰(图14)。同理证明该引物也可用于GH表达qPCR分析时，对内参基因18S rRNA的扩增。
图12引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段时制备的标准曲线。注：C和D为两个平行试验。
图13引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段制备标准曲线时每个反应的扩增曲线。光滑曲线和曲线上标记有■分别为C和D两个平行试验。
表8引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段时的相关数据数据
注：反应管号中数字相同者代表平行试验。
图14引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段制备标准曲线时每个反应的熔解曲线。
五、引物的q-GH F和q-GH R和q-18S F4和q-18S R4扩增片段的测序验证
1.q-GH F和q-GH R扩增GH片段的测序验证
将该对引物的常规PCR产物直接用扩增引物双向测序和拼接(北京六合华大基因科技股份有限公司)，图15(a)和(b)分别为应用引物q-GH F和q-GH R的测序图。其序列的拼接结果如下(其中加粗字体分别为引物q-GH F序列以及q-GH R的反向互补序列)。这一序列与引物设计时产生的扩增子序列100％相同。
图15引物q-GH F和q-GH R扩增的GH片段用引物q-GH F(a)和q-GH R(b)的测序图。
2.q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段的测序验证
将该对引物的常规PCR产物直接用扩增引物双向测序和拼接(北京六合华大基因科技股份有限公司)，图16(a)和(b)分别为应用引物q-18S F4和q-18S R4的测序图，其序列的拼接结果如下(其中加粗字体分别为引物q-18S F4序列以及q-18S R4的反向互补序列)。这一序列与引物设计时产生的扩增子序列100％相同。
图16引物q-18S F4和q-18S R4扩增的18S rRNA片段用引物q-18S F4(a)和q-18S R4(b)的测序图。
3.q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段的测序分析
由于该对引物扩增的18S rRNA片段仅为83bp，PCR产物无法直接测序，根据引物设计时，该对引物在18S rRNA中的位置，其序列如下(其中加粗字体分别为引物q-18S F1序列以及q-18S R1的反向互补序列)：
GGGGAGGTAGTGACGAAAAATAACGATACAGGTCTCTTTCGAGGCCC
六、扩增子核苷酸序列的GenBank比对
将3对引物，即：q-GHF和q-GHR、q-18S F4和q-18S R4、q-18S F1和q-18SR1以及它们产生的3条扩增子序列分别输入GenBank(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，图17～图19为3条扩增子GenBank比对后的部分截图。
图17引物q-GH F和q-GH R扩增的GH片段的GenBank检索截图。
图18引物q-18S F1和q-18S R1扩增的18S rRNA片段的GenBank检索截图。
图19引物q-18S F4和q-18S R4扩增的18S rRNA片段的GenBank检索截图。
从图17可推测，引物q-GH F和q-GH R不仅可以用于革胡子鲶GH的qPCR还可用于蟾胡鲶(Clarias batrachus)。从图18可推测，q-18S F1和q-18S R1不仅可以用于革胡子鲶的18S rRNA的qPCR扩增，还可用于20余种鲶形目鱼类，其中包括我国重要的鲶形目养殖鱼类：鲶(Silurus asotus)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)和斑点叉尾鮰(Lctalurus Punctatus)。而从图19可推测q-18S F4和q-18S R4不仅可以用于革胡子鲶的18S rRNA的qPCR扩增，也可用于多种鲶形目的胡鲶科鱼类，如：杜氏胡鲶(Clarias dussumieri)、钝齿胡鲶(Clarias ngamensis)和大须胡鲶(Clarias buthupogon)等。
应用实例
目前已经完成了对4个养殖密度(35kg/m3、65kg/m3、95kg/m3和125kg/m3)在养殖1个月和养殖2个月时，共相当于8个处理的96个(每个处理分析12个个体)革胡子鲶个体的GH基因表达的qPCR试验工作。目前正在对所得到的数据进行统计学分析，以探讨养殖密度对革胡子鲶GH基因表达的影响，以及GH基因的表达量与革胡子鲶个体生长的关系。
Claims (4)
1.一种革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR分析中用于内参基因扩增的引物序列，其特征是：
2.根据权利要求1所述的革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR分析中用于内参基因扩增的引物序列，这两对引物不仅可作为革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时内参基因(18S rRNA)的扩增引物，而且可作为革胡子鲶所有待检目标基因表达qPCR分析时，以18S rRNA为内参基因的扩增引物。
3.根据权利要求1所述的革胡子鲶生长激素基因表达定量PCR分析中用于内参基因扩增的引物序列，这两对引物不仅可应用于革胡子鲶的研究，还可应用于其它一些鲶形目鱼类的待检目标基因表达qPCR分析时以18S rRNA作为内参基因的研究。
4.革胡子鲶GH基因表达qPCR分析时用于内参基因(18S rRNA)扩增的两对引物核苷酸序列的制作方法：
一、总体RNA的提取
应用Trizol试剂提取单个垂体的总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测，分析其完整性和纯度。琼脂糖凝胶电泳结果显示RNA样本的28S/18S rRNA的条带亮度的比值在1～2之间，提示RNA样本的完整性较好；分光光度计检测两个RNA样本的OD260/OD280和OD260/OD230的比值分别为1.89和1.99以及1.96和2.00，即两个RNA样本的OD260/OD280和OD260/OD230的比值均在1.8～2.0之间。表明这两个RNA样本没有蛋白和酚的污染，均可用于qPCR实验。
二、RNA的反转录
将上述1个RNA样本反转录成cDNA第一条链(RevertAidTM cDNA第一条链合成试剂盒)，用于所设计引物的评估。
三、引物的设计与常规PCR评估
1).GH、18S rRNA和beta-actin基因片段扩增引物的设计
本试验中待检目标基因为GH，拟用18S rRNA或beta-actin作为内参基因。GH基因扩增引物根据本实验室克隆的革胡子鲶GH全长cDNA(GenBank检索号：FJ823972)、18S rRNA和beta-actin基因的扩增引物分别根据GenBank检索的18S rRNA(GenBank检索号：AJ876383)和beta-actin(GenBank检索号：HM768299)序列，应用软件Primer 5.0设计。根据qPCR引物设计的基本原则，从设计的数十对引物中预选出GH、18S rRNA和beta-actin扩增的引物各2对，并由上海生工生物工程有限公司合成；其引物信息如下表。
2).引物的常规PCR评估
首先，以稀释10倍的cDNA为模板，根据合成的6对引物的Tm值，进行常规PCR扩增，以便对引物进行初步评估。6对引物的常规PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果显示：6对引物的扩增产物电泳带纹清晰，片段大小与引物设计时产生的片段大小相符，因此进一步对6对引物进行qPCR评估分析。
四、引物的qPCR评估
应用美国BioRad公司IQTM5 qPCR仪和该公司的SsoFast EvaGreen qPCR预混液，根据该预混液的说明书，对设计的6对引物进行qPCR评估。
1).引物的qPCR初步评估
以稀释10倍的cDNA为模板，应用与常规PCR相同的退火温度，对GH、18S rRNA和beta-actin基因片段进行qPCR，每个反应做2个平行。结果显示：每对引物在qPCR扩增时得到的熔解曲线均表现为一个峰，说明引物在qPCR扩增中特异性强，满足qPCR的基本要求之一。但是，根据每对引物qPCR的CT值(见下表)，有3对引物，即：q-GH F1和q-GH R1、q-actin-F1和q-actin-R1以及q-actin-F2和q-actin-R2，在qPCR中的CT较大，平均值分别为22.93、26.03和26.21，均大于20，说明该浓度的cDNA或者即使是反转录的cDNA原液也不能作为制备标准曲线时的最低浓度样本，即无法应用标准曲线对这3对引物的扩增效率进行评估，所以它们不能用于后续的qPCR分析。根据上述结果，仅对q-GH F和q-GH R、q-18S F1和q-18S R1以及q-18S F4和q-18S R4这3对引物进行进一步的qPCR评估。
2).引物的退火温度及熔解曲线分析
以稀释10倍的cDNA为模板，设置3个退火温度、应用q-GHF和q-GHR、q-18S F1和q-18S R1以及q-18S F4和q-18S R4分别对GH和18S rRNA的基因片段进行qPCR扩增；每个反应做2个平行。结果显示3对引物在退火温度为58℃、60℃和62℃扩增时每个反应的熔解曲线均为一个峰，进一步说明了引物的特异性强，即相应的DNA片段在qPCR中为特异性扩增。3对引物qPCR的CT值数据(下表)显示：3对引物在3个退火温度下CT变化不大，表明可选择任一退火温度，通过建立标准曲线，进一步评估这3对引物的扩增效率。
3).引物扩增效率的评估(标准曲线的建立)
(1)引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段的扩增效率评估
以稀释10倍的cDNA作为初始浓度，采用10倍稀释法，共设置5个浓度，以60℃作为退火温度，应用引物q-GH F和q-GH R扩增GH片段，每个反应做3个平行。
qPCR理想的引物扩增效率应在90～105％之间，标准曲线的R2值应大于0.98，重复样本CT值的标准差应≤0.50，在指数扩增区相邻的扩增曲线间距应相似。
本部分试验结果显示：在指数扩增区，相邻扩增曲线的间距相似，每个反应的熔解曲线均为1个峰，通过下表显示的数据(每个反应的CT值、重复样本CT值的标准差、引物的扩增效率以及标准曲线的R2值)可以看出：该对引物的扩增效率为103.8％，标准曲线的R2值为0.999，重复样本CT值的标准差在0.068～0.260。因此，根据引物的扩增曲线、熔解曲线、引物的扩增效率和标准曲线的R2值，证明该对引物可用于对GH基因表达的qPCR研究。
注：反应管号中数字相同者代表平行试验。
(2)引物q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段的扩增效率评估
与GH片段的扩增效率评估相同，以稀释10倍的cDNA作为初始浓度，采用10倍稀释法，共设置5个浓度，以60℃作为退火温度，应用引物q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段，每个反应做3个平行。结果显示：在指数扩增区，相邻扩增曲线的间距相似，每个反应的熔解曲线均为1个峰，通过下表显示的数据(每个反应的CT值、重复样本CT值的标准差、引物的扩增效率以及标准曲线的R2值)可以看出：该对引物的扩增效率为92.4％，标准曲线的R2值为0.999，重复样本CT值的标准差在0.056～0.300。同理，证明该引物可用于GH表达qPCR分析时，对内参基因(18S rRNA)的扩增。
注：反应管号中数字相同者代表平行试验。
(3)引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段的扩增效率评估
与前2对引物扩增效率的评估相同，以稀释10倍的cDNA作为初始浓度，采用10倍稀释法，共设置5个浓度，以60℃作为退火温度，应用引物q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段，每个反应做2个平行。结果显示：在指数扩增区，相邻扩增曲线的间距相似，每个反应的熔解曲线均为1个峰，通过下表显示的数据(每个反应的CT值、重复样本CT值的标准差、引物的扩增效率以及标准曲线的R2值)可以看出：该对引物的扩增效率为104.2％，标准曲线的R2值为0.998，重复样本CT值的标准差在0.010～0.280。因此，说明该引物也可用于GH表达qPCR分析时，对内参基因(18S rRNA)的扩增。
注：反应管号中数字相同者代表平行试验。
五、引物的q-GH F和q-GH R以及q-18S F4和q-18S R4扩增片段的测序验证
1).q-GH F和q-GH R扩增GH片段的测序验证
将该对引物的常规PCR产物直接用扩增引物双向测序和拼接(北京六合华大基因科技股份有限公司)，结果如下(其中加粗字体分别为引物q-GH F序列以及q-GHR的反向互补序列)。这一序列与引物设计时产生的扩增子序列100％相同。
2).q-18S F4和q-18S R4扩增18S rRNA片段的测序验证
将该对引物的常规PCR产物直接用扩增引物双向测序和拼接(北京六合华大基因科技股份有限公司)，结果如下(其中加粗字体分别为引物q-18S F4序列以及q-18S R4的反向互补序列)。这一序列与引物设计时产生的扩增子序列100％相同。
3).q-18S F1和q-18S R1扩增18S rRNA片段的测序分析
由于该对引物扩增的18S rRNA片段仅为83bp，PCR产物无法直接测序，根据引物设计时，该对引物在18S rRNA中的位置，其序列如下(其中加粗字体分别为引物q-18S F1序列以及q-18S R1的反向互补序列)：
六、引物和扩增子核苷酸序列的GenBank比对
将3对引物，即：q-GH F和q-GH R、q-18S F4和q-18S R4、q-18S F1和q-18S R1以及它们产生的3条扩增子序列分别输入GenBank比对。推测：引物q-GH F和q-GH R不仅可以用于革胡子鲶GH基因片段的qPCR，还可用于蟾胡鲶(Clarias batrachus)。q-18S F1和q-18S R1不仅可以用于革胡子鲶的18S rRNA的qPCR扩增，还可用于20余种鲶形目鱼类，其中包括我国重要的鲶形目养殖鱼类：鲶(Silurus asotus)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)和斑点叉尾鮰(IctalurusPunctatus)。而q-18S F4和q-18S R4不仅可以用于革胡子鲶的18S rRNA的qPCR扩增，也可用于多种鲶形目的胡鲶科鱼类，如：杜氏胡鲶(Clarias dussumieri)、钝齿胡鲶(Clarias ngamensis)和大须胡鲶(Clarias buthupogon)等。
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