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CN102227448A - 生产透明质酸官能化衍生物的方法及透明质酸官能化衍生物的水凝胶的形成 - Google Patents

生产透明质酸官能化衍生物的方法及透明质酸官能化衍生物的水凝胶的形成 Download PDF

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CN102227448A
CN102227448A CN2009801477617A CN200980147761A CN102227448A CN 102227448 A CN102227448 A CN 102227448A CN 2009801477617 A CN2009801477617 A CN 2009801477617A CN 200980147761 A CN200980147761 A CN 200980147761A CN 102227448 A CN102227448 A CN 102227448A
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hyaluronic
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法比奥·帕伦博
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UNI DEGLI STUDI DI PALERMO
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Abstract

在本发明中，描述了可用于将官能团插入透明质酸(HA)的两步骤程序，该两步骤程序是通过在有机溶剂中在HA的羟基上形成特定的活性基团和随后用至少在其末端部分包含亲核官能团的侧部分NH2-R在所插入的活性基团上取代来进行的。通过亲核取代插入的基团可在其另一个末端部分包含另外的亲核官能团，以可容易地开发来进一步化学官能化的方式，由此例如获得HA官能团的甲基丙烯酰化，以获得可光致交联的衍生物。所提出的工艺的直接衍生物和通过进一步的官能化获得的那些衍生物两者都可被用于生产水凝胶。

Description

生产透明质酸官能化衍生物的方法及透明质酸官能化衍生物的水凝胶的形成
发明领域
本发明涉及用于生产官能化的透明质酸衍生物和相关水凝胶的程序。更具体地，本发明涉及可用于将官能团插入透明质酸上的两步骤方法，所述两步骤方法通过在透明质酸的羟基上形成特定的活性基团并且随后用包含作为末端部分的至少一个亲核官能团的侧部分(pendent portion)取代所插入的活性基团来进行。通过亲核取代插入的基团可包含作为另外的末端部分的另一亲核官能团，其可开发用于进一步的化学官能化以便尤其是有利于产生水凝胶的透明质酸链的交联。
现有技术
透明质酸(HA)是所有组织的细胞外基质中存在的最丰富的未硫酸化的糖胺聚糖；HA是由D-葡萄糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)的重复单元构成的多糖，它的化学结构可通过下式表示，该式显示了两个连续的重复单元(重复单元的数目n可以是这样以便确定包括50000和几百万道尔顿之间的分子量)。
Figure BDA0000064770820000011
透明质酸积极地参与大量重要的生物学过程例如细胞运动、细胞分化、伤口愈合。特别地，HA在软骨细胞外基质的机体形成中起到关键的结构上的作用，软骨细胞外基质的机体形成发生以形成更丰富的蛋白聚糖，即聚集蛋白聚糖。
具有高分子量的透明质酸被用于粘性手术和粘弹性补充疗法，并且它被用于眼科领域以及作为可通过关节内注射应用的润滑油来减轻骨关节炎中的疼痛。
近来，已经将几种官能的或交联的HA衍生物生产为薄膜或海绵以应用于伤口上，其中这种产品具有愈合组织的性能。
在组织工程学领域-关于获得受损的人类组织的再生或完全替换的有用技术的发展的新兴学科-HA已被大量用于被称为支架的三维多孔结构的生产。这些基质改进组织细胞生长和分化以有利于组织再生和重建。
对于这些应用，HA在被适当地取代以获得水凝胶时是有用的。因为已知的水凝胶是由天然的或合成的聚合物或它们的衍生物或者由天然的和合成的聚合物的组合组成的，其中这些分子由于范德华相互作用、氢键结合、静电键合或化学键合而相互作用，因此，水凝胶是能够吸收水直到它们的干重的数百倍的亲水性聚合物的网络。考虑到水凝胶的亲水特性和水凝胶的潜在的生物相容性，水凝胶受到增多的用于制药上的和生物医学制药上的应用的关注。
通过插入侧官能团的多糖类HA结构的化学官能化具有获得延长药物释放的制药装置(药物递送系统)的目的；在这样的系统中，药物被物理或化学地连接于多糖载体，并且其按照能够改进药物生物利用度的方式和时间释放。
考虑到对于所提及的制药上的、生物医学的和化妆品的透明质酸应用的重大关注，对允许新的且更简单的HA改性的新的化学策略的高需求是明显的。于是，这些新的衍生物可被用来配合各种可能的应用。
在过去，已经描述了关于透明质酸的羟基和羧基官能性的透明质酸的几种化学改性和在生物医学或制药领域中应用的几种HA衍生物。
例如，美国专利第4582865号(由Biomatrix Inc.的Balasz等人)描述了通过在高碱性条件下与二乙烯基砜的反应的HA交联。欧洲专利申请EP0216453(Fidia S.p.A.)描述了在极性非质子溶剂中使用卤代烷的透明质酸盐的酯化作用。这些衍生物已经在制药领域获得了大量的应用，例如用于组织工程学的支架以及作为控制药物释放的装置。这些酯HA衍生物具有改良的物理化学特性，例如在有机溶剂如二甲亚砜中增加的溶解度，这些特性改进工业性能以获得纤维、多孔支架以及薄膜。
近来，已经提出其他不同的化学策略以利用在葡萄糖醛酸部分的羧基上和在重复单元的羟基上的反应，采用官能侧链(pendant chain)获得透明质酸官能化。特别地，几篇文章描述了碳二亚胺化学(使用具有式R1-N＝C＝N-R2的化合物)以获得HA的D-葡萄糖醛酸部分的化学官能化。
例如，Prestwich、Poyani等人使用水溶性的碳二亚胺类将酰肼侧链插在透明质烷主链上(The Research Foundation of State University of New York的Prestwich等人的专利US 5502081；T.Pouyany等人的专利US 5616568；T.Pouyany，G.D.Prestwich Functionalized Derivatives of Hyaluronic AcidOligosaccharides：Drug Carriers and Novel Biomaterials(透明质酸低聚糖的官能化衍生物：药物载体和新的生物材料)，Bioconjugate Chem.，1994，5，339-347)。在这些实例中，透明质酸羧基与具有通式H2N-NH-CO-A-CO-NHNH2的双官能分子反应，产生带有侧酰肼基团的、具有式HA-CONH-NH-CO-A-CO-NH-NH2的官能化的透明质酸衍生物，其中A是一般的间隔基团。按照相同的研究路线，Vercruysse等人(Vercruysse等人“Synthesis and in Vitro Degradation of New PolyvalentHydrazide Cross-Linked Hydrogels of Hyalyronic Acid(透明质酸的新的多价酰肼交联的水凝胶的合成和体外降解)”，Bioconjugate Chem.，1997，8，686-694)描述如何使用带有多于两个酰肼端基的分子将透明质酸官能化，允许起始多糖的交联，之后产生水凝胶。
Aeschlimann等人(由Othogene LLC的Aeschlimann等人的对应于欧洲专利第EP 1757314号的专利US 6630457)通过将水溶性的碳二亚胺类的使用与亲核活化剂例如羟基琥珀酰亚胺类和羟基三唑(hydroxytriazole)的使用相结合，改良了由Pouyani提出的HA的羧基活化的方法。特别地，所公开的方法通过首先活化HA主链的羧基，产生中间体酯基团，之后使用包含在一侧处的良好的亲核基团和在另一侧处的化学保护的官能团的分子取代这些酯离去基团来处理HA主链上新的官能团的引入。以这样的方式，HA活化的中间体更加稳定，于是通过双官能亲核分子的随后的官能化更加有选择性。以这样的方式，已产生适于随后的交联的胺和醛HA衍生物，由此获得生物相容的基于HA的水凝胶。
此外，由Eurand Pharmaceuticals Ltd的发明人Mariotti等人提出的专利申请WO 02/098923，显示生产官能化的HA衍生物的方法，其中其羟基被酯化或氨基甲酰化(HA-O-CONH-)，并且羧基是用醇完全或部分酯化的。这样的氨基甲酰化的羟基是使多糖与异氰酸烷基酯、异氰酸芳基酯或异氰酸芳基烷基酯(R-N＝C＝O)反应而获得的。以这样的方式，已经获得氨基甲酰化的和酯化的HA衍生物以被应用为色谱分析的固定相。
与由Mariotti等人描述的相似，Chen Jui-hsiang等人在专利EP 1538166(由Industrial Technology Research Institute提出)中描述了带有作为侧链的疏水性聚合物、亲水性聚合物和两亲性聚合物的HA衍生物的生产，通过在相同的聚合物的多糖和异氰酸酯衍生物之间的反应获得。
所引用的最后两项专利描述了通过使用可溶于极性非质子溶剂的HA盐和反应性的异氰酸酯进行反应，在二糖重复单元的伯羟基上形成氨基甲酸HA衍生物。在这种情况下，透明质酸的羟基以单步反应被官能化，之后在透明质酸和新的侧官能性之间产生氨基甲酸键(carbamic linkage)(-O-CO-NH-，也被称为尿烷键(urethanic linkage))；之后可使用以下通式(HA-O-CO-NH-R)描述这样的官能化，其中R可以是亲水链、亲脂链或两亲性链。然而，所引用的方法遭受官能化被仅限于必须被用作起始反应物的异氰酸酯衍生物的不便。
考虑到上文所描述的方法，本发明具有公开用于在水溶剂和有机溶剂中生产官能化的HA衍生物的新方法的目的，所述官能化的HA衍生物可开发用于生产交联的水凝胶或作为有用的中间体以获得进一步的官能化。本发明的另外的目的是公开其中这些官能的HA衍生物可被容易地开发用于生产新的水凝胶的方法。
发明概述
按照这一目的，根据本发明，已经找到以在化学反应中不涉及透明质酸葡萄糖醛酸部分的羧基的方式获得HA官能衍生物的通用的化学方法。这一方法包括两步骤程序，其中第一步骤是在透明质酸的至少一个羟基上引入化学活性部分以得到活性中间体，并且其中在第二步骤，所述活性中间体与反应性的亲核体反应；所述反应性的亲核体带有至少一个伯氨基。两步骤程序的连续应用引起经由HA主链的羟基中的至少一个与HA主链连接的至少一个氨基甲酸基团(-O-CO-NH-)的形成。
特别地，在方法的第一步骤中，特定的活性分子例如熟知的且商业上可得到的双(4-硝基苯基碳酸酯)或氯代硝基苯基碳酸酯被用于在HA羟基(伯羟基和/或仲羟基)上插入硝基苯氧基羰基(NO2-Ph-O-CO-)；在第二步骤中，所插入的良好的离去基团(硝基苯氧基)被具有通式NH2-R的亲核分子取代。这一亲核分子应当包含至少一个伯氨基(amine primary group)并且R代表NH2、烷基氨基、烷基链、芳基烷基链、聚丙烯酸链、聚氧乙烯链或更广泛地具有低分子量(例如药物)或高分子量(例如聚合物、蛋白等)的任何分子；优选地，所述具有低分子量或高分子量的分子是生物相容的并且可溶于有机溶剂或水介质中。
根据本发明，通过使用合适的活化中间体，在HA的伯羟基和/或仲羟基上的两相反应获得新的氨基甲酸键是可能的。特别地，反应性的双(4-硝基苯基碳酸酯)已被用于在HA上生成反应性的硝基苯基碳酸酯衍生物，其与优选地带有氨基或酰肼官能性的亲核分子易于反应。
在需要的情况下，在程序的第二步骤插入的侧链可带有仍可用于在有机介质或水介质中进行进一步的化学官能化的至少另一个官能团，与带有其他官能团的分子尤其是能够允许交联反应的化学基团反应。
所公开的方法可被用于生产带有新的胺或酰肼化学官能性的HA衍生物或生产带有亲水或亲脂侧链的HA衍生物。
以这样的方式，商业上可获得的各种各样的化学官能团可通过HA的羟基(伯羟基和/或仲羟基)与HA连接。而且，按照这一程序，在有机环境中将这些氨基和酰肼衍生物进一步官能化也是可能的：特别地这些氨基或酰肼HA衍生物的四丁铵盐(TBA)可被用于进一步的官能化。通常，这样的进一步的官能化可在水介质和有机介质中进行，尤其是极性非质子溶剂例如二甲亚砜、二甲基甲酰胺和二甲基乙酰胺以及它们的混合物。
附图简述
以下图中说明一些实验结果，其中：
图1显示根据本发明的程序获得的在乙二胺基团中具有50％mol/mol的官能化的HA-EDA衍生物的1H-NMR光谱(D2O)；
图2显示根据本发明的程序获得的在丁基中具有52％mol/mol的官能化的HA-BTA衍生物的1H-NMR光谱(D2O)；
图3显示根据本发明的程序获得的在聚氧乙烯-单甲基-单氨基链中具有33％mol/mol的官能化的HA-NH-PEG衍生物的1H-NMR光谱(D2O)；
图4显示根据本发明的程序获得的在乙二胺基团中具有50％mol/mol的官能化和在甲基丙烯酸基团中具有50％mol/mol的官能化的HA-EDA-MA衍生物的1H-NMR光谱(D2O)。
图5显示0.5％w/v的冻干的HA-EDA-BC水凝胶的SEM图像。
图6显示包封在HA-EDA-BC水凝胶中的人类软骨细胞的增殖。值以吸光度±标准偏差(n＝9)来表示。
图7显示培养3天后HA-EDA-BC水凝胶中3-D包封的人类软骨细胞的活/死染色。死细胞由框指示。
发明详述
因而，本发明的具体目的是用于生产透明质酸官能衍生物的程序，该程序主要由以下连续的步骤组成：
(a)透明质酸(HA)的至少一个羟基的活化(该HA以盐的形式，可溶于有机溶剂中)；使该HA盐在极性非质子溶剂中与选自碳酸苯酯类(carbonic phenylesters)或卤代甲酸苯酯类的碳酸化试剂(carbonating agent)反应；
(b)由步骤(a)获得的活化的HA盐通过用具有通式NH2-R的化合物亲核取代的反应，其中R可以是：NH2、氨基烷基、烷基链、芳基烷基链、聚丙烯酸链、聚氧乙烯链或低分子量分子(例如药物)或高分子量分子(例如聚合物、蛋白等)；优选地，所述具有低分子量或高分子量的分子是生物相容的并且可溶于有机溶剂或水介质中。
特别地，用于第一步骤的碳酸化活性试剂可以是双(4-硝基苯基碳酸酯)(一种羰基苯酯)和/或氯代硝基苯基碳酸酯。
在有机溶剂中可溶的透明质酸盐应当优选地选自四丁铵盐(表示为TBA)或十六烷基三甲基铵盐(表示为CTA)。
根据本发明的一些优选的实现方面，用于官能化反应的有机溶剂选自二甲亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺和它们的混合物，并且活化步骤(a)和亲核取代步骤(b)都在10℃和60℃之间的温度下进行。
所获得的HA衍生物的官能化程度可从HA的唯一一个羟基至HA的全部羟基变化，并且官能化程度取决于(以成正比的方式)在上文所描述的工艺中所使用的反应性的羰基化试剂的量。优选地，官能化程度在5％和95％之间，更优选地20％和80％之间变化(为了对此更好的理解，参见实施例1)。
根据其他具体的实施方案，具有通式NH2-R的化合物可选自肼(NH2-NH2)和具有式NH2-(CH2)n-NH2的双氨基烷基，其中n是1和30之间，优选地1和10之间的数。在以下实验部分中示出的另一个具体的实施方案中，双官能分子例如乙二胺(NH2-CH2-CH2-NH2，称作EDA)和肼(NH2-NH2，称作Hy)被分别连接至HA主链以获得衍生物HA-EDA和HA-Hy。
根据本发明，透明质酸衍生物例如HA-EDA或HA-Hy可被开发以通过使用作为活化剂的碳化二亚胺类的自动交联程序或由使用双官能交联分子例如戊二醛或其他多官能分子的化学交联来生产水凝胶。所提及的实施方案的具体细节在以下实验部分中。
本发明公开了利用使用本发明中所示的程序获得的氨基或肼透明质酸衍生物的有机溶剂可溶的盐尤其是四丁铵盐或者水溶性透明质酸盐以进行进一步的衍生化的方法。这种衍生化可在有机溶剂或水介质中进行。根据本发明的其他的优选方面，如程序的步骤(b)中获得的透明质酸盐衍生物紧接着通过用具有通式Y-R’的分子亲核取代的进一步的官能化程序，其中Y是良好的离去基团例如卤素、N-氧代琥珀酰亚胺、具有1-6个碳原子的烷氧基，或者Y是酐或环氧化物的亲电子部分，并且R’是都被适当取代的诸如丙烯酰基或甲基丙烯酰基的部分；有机溶剂或水溶剂可溶的分子的一部分。
优选地，在包括5℃和60℃之间的温度下，在选自二甲亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺或它们的混合物的极性非质子溶剂中进行进一步的官能化；按照本发明的其他的优选方面，反应在选自二乙胺、三乙胺、二甲氨基吡啶和它们的混合物的催化剂的存在下进行。
为了生产丙烯酸透明质酸衍生物或甲基丙烯酸透明质酸衍生物，具有式Y-R’的这样的化合物优选地是甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酰氯、丙烯酰氯、丙烯酸缩水甘油酯或甲基丙烯酸缩水甘油酯；为了生产在以下实验部分示出的另一种特定的衍生物，透明质酸的苯甲酰基半胱氨酸(benzoylcysteine)衍生物，通式Y-R’的化合物是N-氧代琥珀酰亚胺单酯或N，N’-二苯甲酰-L-胱氨酸的二酯或其类似的衍生物。
在这一最后的实例中，从该进一步的官能化得到的衍生物随后用还原程序处理以获得与透明质酸连接的部分苯甲酰基半胱氨酸。
根据另外的方面，本发明研究由可由如上文描述的工艺获得的具有50000-1500000道尔顿范围的分子量的透明质酸的官能化衍生物组成的新产物。
下文将呈现结构式，其意图为仅仅代表当HA羟基经受上文描述的工艺时发生于HA羟基的官能化的类型(共价键合)。下文所报告的结构不意图代表官能化程度，而官能化程度是与上文工艺中所使用的反应性的羰基化试剂的量成正比，如上所述。
根据一个优选的实施方案，本发明涉及可由如上文所描述的工艺获得的具有包括在50000和1500000道尔顿之间的分子量的透明质酸丙烯酸衍生物或甲基丙烯酸衍生物。
这样的甲基丙烯酸衍生物的官能化的类型可以由描述起始透明质酸的两个连续的二糖单元的以下结构表示，其中至少一个羟基已经被官能化。
Figure BDA0000064770820000091
HA-EDA-MA
丙烯酸衍生物可由上式表示，其中丙烯酰基代替甲基丙烯酰基存在。
如上文所报告的，这样的丙烯酸衍生物或甲基丙烯酸衍生物可根据由本发明公开的“两步骤”程序以及之后进一步的官能化来生产。
而且，控制丙烯酸基团或甲基丙烯酸基团中第三步骤官能化的量以获得具有范围从5％至95％的游离氨基的衍生物是可能的。
交联的水凝胶可使用光致交联程序从上文描述的产物获得，其中所提及的官能化衍生物在水溶液或有机溶液中的浓度包括在1％w/v和20％w/v之间。优选地，水凝胶通过在有或没有自由基光敏引发剂的情况下用包括在180nm和800nm之间的波长的辐射，采用包括5分钟和10小时之间的辐射时间来获得。这些水凝胶也可通过γ辐射、微波辐射或通过其他电离辐射来获得。
这样的光致交联还可在单官能和多官能的适当的添加剂例如丙烯酸和甲基丙烯酸单体、聚乙二醇甲基丙烯酸酯和聚乙二醇丙烯酸酯的存在下或在用于改变或改进塑性、硬度、亲水特性和亲脂特性的其他添加剂的存在下发生。
根据本发明的另外的方面，这把以下衍生物作为具体的目的：根据所提出的两步骤程序获得的新的衍生物，可从上文描述的工艺获得的具有包括在50000和1500000道尔顿之间的分子量的透明质酸苯甲酰基半胱氨酸衍生物或其相似的衍生物。这样的透明质酸苯甲酰基半胱氨酸衍生物可通过以下结构表示，该结构涉及起始透明质酸的两个连续的二糖单元，其中至少一个羟基已经被官能化：
Figure BDA0000064770820000101
HA-EDA-BC
这种氨基酸的(aminoacidic)衍生物可按照根据本发明的两步骤程序并且之后按照如上文所描述的进一步的官能化以及通过随后的透明质酸衍生物二硫桥键还原来获得。
在该情况下，甚至通过空气氧化获得交联的水凝胶都是可能的。
通常，本发明在其范围内包括通过所描述的方法获得的水凝胶，应用适当的技术程序，这样的水凝胶可被生产为纳米粒子或微粒、薄膜、膜、纤维和支架。
最后，本发明涉及所描述的水凝胶用于药物或基因递送装置的生产、用于化妆品和农业食品使用、用于伤口、器官或组织覆盖系统的生产、用于组织再生的可植入材料和支架的用途。
本发明的具体的特征如其优点和其方法以及与衍生物的进一步官能化和水凝胶制备有关的具体的应用实例在下文中的详细的例证描述中将会更清楚。
实验部分
实施例1
透明质酸-乙二胺衍生物(HA-EDA)的合成
将通过使用四丁基氢氧化铵溶液中和透明质酸溶液制备的3g透明质酸四丁铵盐(HA-TBA)(透明质酸的重均分子量为270kDa)溶解于270ml的无水二甲亚砜。
将以获得分别等于0.75、0.5和0.25的4-NPBC的摩尔数/HA-TBA的摩尔数的比例的方式选择的适当的量的双(4-硝基苯基)碳酸酯(4-NPBC)溶于30ml的无水二甲亚砜；搅拌下于40℃将该溶液逐滴加入HA-TBA溶液。4小时后，将3ml的乙二胺(EDA)逐滴加入并且将该溶液于40℃静置另外3小时。然后，通过首先将透明质酸衍生物在丙酮中沉淀，之后以相同的溶剂洗涤直到已经获得不含反应中间体的产物来完成反应的操作。
将由HA-TBA-EDA共聚物形成的所获得的固体捣细。
HA的乙二胺衍生物的钠盐，即衍生物HA-EDA的钠盐已经通过使HA-TBA-EDA于二甲亚砜中的溶液流过装载有以其钠形式被活化的DOWEX 50Wx8树脂的柱来获得。使用渗析程序将DMSO溶液对水交换并且之后冻干该水溶液来回收产物。
方案1显示官能化的程序。
方案1-使用乙二胺将透明质酸四丁铵盐(HA-TBA)官能化以获得HA-EDA衍生物的反应
Figure BDA0000064770820000121
HA-EDA衍生物通过如图1中所报告的光谱中显示的1H-NMR分析来表征(见附图)。特别地，1H-NMR(D2O)显示：δ1.9(m，-NH-CO-CH3)；δ3.1(m，CO-NH-CH2-CH2-NH2)。
官能化程度已经通过将可归于HA的N-乙酰葡糖胺部分的CH3的δ1.9处的峰的面积与可归于与HA连接的乙二胺部分的δ3.1处的峰的面积相比较来计算。官能化程度已经被表示为每摩尔的HA重复单元所插入的乙二胺部分的％摩尔。
以下表1显示作为示例的使用三个不同比率的4-NPBC摩尔数/HA-TBA重复单元摩尔数获得的与HA连接的乙二胺基团的摩尔官能化。
表1
Figure BDA0000064770820000131
实施例2
透明质酸-肼衍生物(HA-Hy)的合成
将3g透明质酸四丁铵盐(HA-TBA)(透明质酸的重均分子量为270kDa)溶解于270ml的无水二甲亚砜。于搅拌下，将含有0.73g的双(4-硝基苯基)碳酸酯(4-NPBC)的30ml无水二甲亚砜溶液逐滴加至HA-TBA溶液并任其在40℃反应4小时。这段时间之后，将2.7ml的一水合肼逐滴加入并且将该溶液置于40℃持续另外1小时。之后通过首先将透明质酸衍生物在二乙醚中沉淀，之后用丙酮洗涤完成反应的操作。为了获得HA-Hy的钠盐，将反应溶液流过装载有以其钠形式被活化的DOWEX 50Wx8树脂的柱，之后在丙酮中沉淀并用相同的溶剂洗涤。之后，将所获得的固体溶于水，对水渗析并且之后冻干。通过使用三硝基苯磺酸(TNSB)的比色测定测得的官能化程度等于50％mol/mol。
方案2显示反应程序。
方案2-使用一水合肼将透明质酸四丁铵盐(HA-TBA)官能化以获得HA-Hy衍生物的反应
实施例3
用丁胺官能化的透明质酸衍生物(HA-BTA)的合成
将3g透明质酸四丁铵盐(HA-TBA)(透明质酸的重均分子量为270kDa)溶解于270ml的无水二甲亚砜。于搅拌下将含有0.73g的双(4-硝基苯基)碳酸酯(4-NPBC)的30ml无水二甲亚砜溶液逐滴加至HA-TBA溶液并任其在40℃反应4小时。这段时间之后，将4.7ml的丁胺逐滴加入并且将反应混合物置于40℃持续24小时。之后，将反应溶液流过装载有以其钠形式被活化的DOWEX 50Wx8树脂的柱，之后在丙酮中沉淀并用相同的溶剂洗涤，最后对水渗析并冻干。对于所获得的衍生物，称作HA-BTA，通过三硝基苯磺酸测定(TNSB)确认未反应的丁胺不存在。
方案3显示官能化程序。
方案3-使用丁胺(BTA)将透明质酸四丁铵盐(HA-TBA)官能化以获得HA-BTA衍生物的反应
Figure BDA0000064770820000161
衍生物HA-BTA通过如附图的图2中所示的1H-NMR表征，显示以下信号(D2O)：δ0.8(-NH-CH2-CH2-CH2-CH3)；δ1.3(-NHCH2-CH2-CH2-CH3)；δ1.4(-NH-CH2-CH2-CH2-CH3)；δ2.0(s，-NH-COCH3)；δ3.1(-NH-CH2-CH2-CH2-CH3)。官能化程度已经通过将可归于丁胺链的亚甲基的δ0.8、1.3、1.4和3.1处的峰的面积与可归于HA的N-乙酰葡糖胺部分的甲基的δ2.0处的峰的面积相比较来计算。官能化程度等于52％mol/mol。
实施例4
透明质酸-氨基聚乙二醇衍生物(HA-NH-PEG)的合成
将1g HA四丁铵盐(HA-TBA)(起始透明质酸的重均分子量等于230kDa)溶解于90ml的无水二甲亚砜。将0.4g的双(4-硝基苯基)碳酸酯(4-NPBC)溶于10mi无水二甲亚砜。在搅拌下于40℃将4-NPBC的溶液逐滴加至HA-TBA溶液，之后将反应置于相同的温度下持续4小时。
这段时间之后，将溶于5ml二甲亚砜中的6g O-(2-氨乙基)-O-甲基-聚乙二醇(PEG-NH2)(分子量750Da)逐滴加入并且将溶液置于40℃持续24小时。之后，将反应溶液流过装载有以其钠形式被活化的DOWEX 50Wx8树脂的柱，之后在丙酮中沉淀并用相同的溶剂洗涤。将获得的产物，称作HA-NH-PEG，在冻干之后溶于水并且通过使用具有等于12000-14000的截留分子量的渗析膜Spectrapor对水渗析5天。.
以下方案4显示官能化程序。
方案4-使用O-(2-氨乙基)-O-甲基-聚乙二醇(PEG-NH2)将透明质酸四丁铵盐(HA-TBA)官能化以获得衍生物HA-NH-PEG的反应
Figure BDA0000064770820000181
通过对游离氨基的NTSB比色测定证实不存在未反应的PEG-NH2。
衍生物HA-NH-PEG通过如附图的图3中所示的1H-NMR表征，其中以下峰是存在的(D2O)：δ1.4(s，-CO-NH-(O-CH2-CH2)n-O-CH3)δ2.0(s，-NH-CO-CH3)；δ3.7(s，-CO-NH-(O-CH2-CH2)n-O-CH3)。官能化程度等于33％mol/mol。
透明质酸-乙二胺的甲基丙烯酸衍生物(HA-EDA-MA)的制备
考虑到对生产组织工程学、药物递送领域、组织填充等中可提供的可光致交联的透明质酸衍生物的兴趣，本文所提出的方法的更有利的应用中的一项是使用甲基丙烯酸部分将透明质酸氨基共聚物官能化。
在科学文献中，已经报告了甲基丙烯酸透明质酸衍生物的几个实例。在由de Smeds等人(J.Biomed.Mat.Res.2001；54(1)：115-121)最初描述程序中，通过使用相对于HA的伯羟基的20倍摩尔过量的甲基丙烯酸酐在水相环境中生产HA-甲基丙烯酸衍生物(HA-MA)。然而，使用这一程序形成了两相系统，因此降低官能化效率。
近来，Oudshoorn等人(Polymer 48(2007)1915-1920)描述了通过利用在有机极性非质子溶剂(二甲亚砜)中HA四丁铵盐和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)之间的反应来形成HA-MA共聚物。在该情况下，通过使用等于200的GMA摩尔数/HA的羟基摩尔数的比率获得仅30％mol/mol的官能化。
在本文所公开的方法中，透明质酸侧链中更亲核的基团(作为实例，透明质酸的乙二胺衍生物的氨基)的存在可以便利地被开发以利用作为实例的甲基丙烯酸酐(AMA)作为反应物来获得更有效的官能化。
为了研究所述方法的潜力并且为了证明HA上游离氨基的选择性的官能化，通过利用以下实施例5中所描述的程序制备了三个不同批次的分别具有等于75％、50％和25％mol/mol的摩尔官能化程度的透明质酸氨基衍生物的四丁铵盐(HA-TBA-EDA)(如实施例1中所获得的)。特别地，在本实施例中，与HA-TBA-EDA游离氨基相比的仅两倍摩尔过量的AMA足以获得HA-乙二胺衍生物上存在的所有氨基的完全官能化，获得称作HA-EDA-MA的共聚物。通过利用三硝基苯磺酸(TNSB)的比色测定来评估HA-EDA-MA共聚物中不存在未反应的氨基。而且，控制甲基丙烯酸基团的官能化的量以获得具有范围从5％至95％的游离氨基的HA-EDA-MA衍生物是可能的。
实施例5
透明质酸-乙二胺甲基丙烯酸衍生物(HA-EDA-MA)的合成
将1g如实施例1中所报告而获得的、具有等于50％mol/mol的乙二胺基团的官能化程度的HA-TBA-EDA溶于100ml无水二甲亚砜(DMSO)。之后加入适当体积的甲基丙烯酸酐(AMA)以获得与HA-TBA-EDA上的氨基的摩尔数相比两倍的摩尔过量。以与HA-EDA-TBA的氨基的摩尔数等摩尔的比率加入催化剂二乙胺，并将最终的溶液置于40℃持续24小时。
这段时间之后，将有机溶液在容纳钠活化的DOWEX 50Wx8树脂的柱中流过。之后将所洗脱的溶液在丙酮中沉淀，并且将所获得的固体，称作HA-EDA-MA，用相同的溶剂洗涤几次，之后干燥，溶于水并且对蒸馏水渗析。将溶液过滤，之后冻干。方案5显示反应程序。
方案5-使用甲基丙烯酸酐(AMA)将透明质酸-乙二胺四丁铵盐(HA-EDA-TBA)官能化以获得HA-EDA-MA衍生物的反应
Figure BDA0000064770820000201
HA-EDA-MA衍生物通过1H-NMR表征(参见图4)，显示以下峰(D2O)：δ1.9(s，-CO-CH＝CH-CH3)；δ2.0(s，-NH-CO-CH3)；δ5.5和5.8(m，-CO-CH＝CH-CH3)。
官能化程度已经通过将可归于甲基丙氨酸基团的乙烯基质子的δ5.5和5.8处的峰的面积与可归于HA重复单元的N-乙酰葡糖胺部分的甲基的δ1.9处的峰的面积相比较来评估。与所得到的HA-EDA的重复单元连接的甲基丙烯酸基团的官能化程度等于50％mol/mol，即所有氨基已经被甲基丙烯酸酐衍生化。
透明质酸-乙二胺-苯甲酰基半胱氨酸衍生物(HA-EDA-BC)的制备
细胞外基质的最重要的结构特性中的一个是其原纤维结构，这是由于胶原蛋白和其他蛋白的存在。该原纤维结构是对于细胞与环境的连接和对于体液因子和营养物的最佳扩散的基础。近来，许多努力被放诸于生产具有原纤维结构的人造支架的可能性(Biomaterials 29(2008)1989-2006)。
在这样的背景下，可能性涉及能够与精细的分级结构自发组装的混合共聚物的生产。例如，Zhang等人生产当溶于含水缓冲液时能够自发形成纤维状支架的自我互补的寡肽(self complementary oligopeptide)；这些基质已经在组织工程学领域获得不同的应用(Chemical Biology 2002，6：865-871)。
生产能够在注射入体内之后自动交联的支架的重要性通过以下事实来证明：它们在器官或组织损伤上的直接沉积(即，用于关节软骨的重建)能够避免外科移植的必要性，于是便于新形成的细胞外基质与宿主组织整合。
从这一观点来看，最基本的是，交联应当不涉及对于组织来说可能有毒的反应，而且反应应当允许基质再生细胞的包封而不干扰它们的成活力(Advanced Drug Delivery Reviews59(2007)263-273)。例如，Shu等人近来开发了能够通过空气氧化缓慢交联或如果PEG-二丙烯酸酯衍生物被用作交联剂时能够迅速交联的硫醇透明质酸衍生物(Biomaterials25(2004)1339-1348；Biomaterials 24(2003)3825-3834WO 2005/056608)。
一些非聚合的化合物能够在有机介质和水介质中自发组装以形成水凝胶。例如，氨基酸N-N’-二苯甲酰基-胱氨酸(DBC)及其衍生物(J.Med.Chem.1967，10，1172)甚至在非常低的浓度下通过自发的自组装形成水凝胶。该自发聚集的驱动力是由芳基促进的π-π堆积相互作用的形成(Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.1995，34，584；J.Am.Chem.Soc 2000，122，11679-11691)。
考虑到DBC及其衍生物通过自发的自组装产生水凝胶纤维(fibrillar hydrogel)的特性并且由于存在的二硫桥键可在需要的情况下通过简单的氧化还原反应被可逆的断裂以形成游离硫醇基团，之后再次被氧化以形成S-S桥，本发明中报告的方法可被用于合成能够开发氧化特性和自组装特性以产生原纤维结构的衍生物，透明质酸-乙二胺-苯甲酰基半胱氨酸(HA-EDA-BC)。
实施例6
诱明质酸-乙二胺-苯甲酰基半胱氨酸衍生物(HA-EDA-BC)的合成
将1.3g N，N’-二苯甲酰基-L-胱氨酸(DBC)溶于28ml的二氯甲烷和20ml的无水二甲亚砜。已将0.6g的二环己基碳二亚胺(DCC)和0.34g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入这一溶液。于室温进行活化反应24小时。这一时间段之后，将溶液过滤并且在真空下除去过量的二氯甲烷。
将含有N，N’-二苯甲酰基-L-胱氨酸的N-氧代琥珀酰亚胺衍生物(DBC-NOS)的该溶液逐滴加至含有1g具有30％mol/mol的氨基的官能化程度的HA-TBA-EDA的80ml二甲亚砜。用二乙胺作为催化剂(960μl)进行反应。
于40℃下28小时后，将溶液在装载有以其钠形式被活化的树脂DOWEX 50Wx8的柱中洗脱，之后将共聚物在二乙醚中沉淀，并且用乙醇和丙酮洗涤。将由此获得的HA-EDA-DBC捣细并且之后分散在水中，直到获得均质的水凝胶。之后，加入NaOH 1N将获得的水凝胶的pH调节至8，且之后加入1.2g二硫苏糖醇以还原二硫桥键，获得衍生物，透明质酸-乙二胺-苯甲酰基半胱氨酸(HA-EDA-BC)。
将溶液置于室温24小时并且将pH调节至3.5后，将其对酸性水渗析5天。之后将溶液过滤并且冻干。以下的方案6显示上文描述的官能化程序。
方案6-N，N’-二苯甲酰基-L-胱氨酸的N-氧代琥珀酰亚胺衍生物(DBC-NOS)与透明质酸-乙二胺四丁铵盐(HA-TBA-EDA)的官能化反应以及随后二硫桥键还原以获得衍生物透明质酸-乙二胺-苯甲酰基半胱氨酸(HA-EDA-BC)的反应。
Figure BDA0000064770820000241
1H-NMR和比色分析显示具有苯甲酰基半胱氨酸的HA的官能化程度等于30％mol/mol。使用TNSB的比色分析证实HA-EDA-BC衍生物中不存在未反应的氨基。
交联的透明质酸衍生物水凝胶
在用γ射线、UV射线、可见辐射、微波辐射之后，在有或没有光敏引发剂的情况下在水介质或有机介质中进行系列HA-EDA-MA的甲基丙烯酸透明质酸衍生物的交联。已经在实验上证实，根据本发明的程序获得的在与透明质酸连接的乙二胺或甲基丙烯酸基团中具有不同摩尔官能化程度的HA-EDA-MA共聚物的水溶液(浓度范围在1-20％w/v内)，在暴露于具有包括在180和800nm之间的波长的辐射或使用微波源例如使用γ射线源或其他电离源之后产生水凝胶。
HA-肼衍生物(HA-Hy)的交联在水相环境优选地在pH 4.75在水溶性的碳二亚胺例如(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)(EDCI)的存在下进行。
乙二胺透明质酸衍生物(HA-EDA)的交联通过使用双官能或多官能的交联剂优选戊二醛，在磷酸缓冲液pH 7-8中进行。
HA-EDA-BC衍生物的交联在磷酸缓冲液中优选地在pH 7.4通过空气氧化工艺进行。
实施例7
基于HA-EDA-MA的水凝胶的生产
将按照实施例5获得的、具有与HA连接的乙二胺基团的等于50％mol/mol的摩尔官能化程度和与HA连接的甲基丙烯酸基团的等于50％mol/mol的摩尔官能化程度、并且具有范围从1％w/v至20％w/v的浓度的HA-EDA-MA共聚物的水溶液在陪替氏培养皿中成层，由此获得几毫米的厚度。
将陪替氏培养皿放在12℃冰箱内，并且使用125瓦的具有包括在250和370nm之间的发射范围以及310nm处的最大强度的峰的Polymer(Italquartz，Milan)灯辐射。灯和陪替氏培养皿之间的距离为约30cm。这样的辐射周期的时间在15-90分钟的范围内。对于每个聚合物浓度，出现获得易于与培养皿分离的水凝胶薄膜的时间已经被确定。
以下表2显示作为实例的、关于三个不同浓度的获得水凝胶薄膜所需的辐射时间。
表2
Figure BDA0000064770820000261
实施例8
透明质酸-肼(HA-Hy)的自动交联
将如实施例2中获得的具有肼基团的等于50％mol/mol的摩尔官能化程度的HA-Hy衍生物溶于蒸馏水中以获得等于1％w/v的浓度。已使用几滴HCl 0.1N将溶液的pH调节至4.75。
加入与HA连接的肼基团的量相同的摩尔量的(1-乙基-3-(二甲氨基丙基-碳二亚胺)(EDCI)，并且加入HCl 0.1N使pH保持恒定，直到出现水凝胶的形成。将水凝胶回收并且在蒸馏水中洗涤，之后冻干。
与起始聚合物相比，水凝胶重量收率为80％，之后，固体由FT-IR分析表征。
实施例9
HA-EDA-BC水凝胶的生产
通过将适量的聚合物分散于pH 7.4的杜氏磷酸缓冲液并且之后涡旋5分钟，直到获得完全的溶解来获得凝胶形成溶液。通过空气氧化制备基于HA-EDA-BC的0.5w/v％的水凝胶样品。在将凝胶形成样品用蒸馏水洗涤并且在液氮中冷冻、冻干之后，通过使用扫描电镜观察。如图5a和图5b所示，HA-EDA-BC水凝胶显示具有直径范围在500nm和1μm之间的互相连接的纤维的原纤维结构。
实施例10
软骨细胞包封和成活力测定
将从人类关节软骨新分离的人类关节软骨细胞在两个星期的时间内在完全DMEM中培养两次传代。将冻干的HA-EDA-BC通过UV辐射(使用125W UV灯)灭菌2小时。之后将150mg的HA-EDA-BC溶于9.4ml的DMEM，轻轻地涡旋约10分钟，之后通过超声3分钟除去所形成的泡沫。加入含有5x 106的细胞的0.6ml的DMSM并且轻轻地摇动几分钟以确保均匀的细胞分布来完成软骨细胞包封。之后将150μl的凝胶形成悬浮液倒入NUNC CC-插入物(聚碳酸酯膜)24孔多孔板。之后将凝胶形成水凝胶静置2小时，之后加入1.1ml的DMEM并且于37℃，5％的CO2下温育。2小时、3天、7天、14天和21天后通过MTS测定来评估包封的软骨细胞的成活力。每一天将含有HA-EDA-BC包封的水凝胶的三个插入物用100ml的MTS溶液处理并且任其反应4小时。之后，使用如具有软骨细胞的水凝胶一样处理的空的HA-EDA-BC水凝胶作为空白，在96孔板中于550nm处读出吸光度(n＝9)。通过利用使用钙黄绿素AM和溴乙啡锭同源二聚体-III(EthDIII)的双重染色程序，在HA-EDA-BC软骨细胞负载的水凝胶上进行活细胞相容性测定和死细胞相容性测定。钙黄绿素AM是非荧光的、细胞透性的分子，其可在细胞内部被细胞内酯酶裂解以产生其荧光对应物(绿色荧光)。EthD-III是核酸染料，不能透过活细胞，但是可扩散通过死细胞的膜，死细胞中其与DNA结合并且产生红色的荧光。培养3天后，将含有凝胶的插入物用PBS pH 7.4洗涤三次并且之后用染色溶液温育1小时，并且之后再次洗涤以除去过量的染色溶液。
将凝胶设置在盖玻片上并用Axioscop 2荧光显微镜(Zeiss)分析，并且用与计算机连接的Axiocam数码相机(Zeiss)拍摄。
如图6中所见，通过MTS分析获得的吸光度在温育的所有21天期间增加，证明了基于HA-EDA-BC的三维水凝胶支架内部的细胞的良好的成活力和增殖。
参见图7，在培养3天之后的活的死的荧光图(Live Dead fluorescence picture)显示一些活细胞和仅有的几个死细胞(参见图片中的框)，由此表明包封程序的良好的生物相容性。在原始的彩色图片中，活细胞是绿色的而死细胞是红色的。
已经关于一些具体的实施方案描述了本发明，但是意图可由本领域的专家进行明显的改变或修改，而不背离保护范围。

Claims (24)

1.一种用于生产透明质酸的官能化衍生物的工艺，所述工艺包括以下连续的步骤：
a)透明质酸的至少一个羟基的活化，所述透明质酸以其盐的形式，可溶于有机溶剂中，所述活化是通过在极性非质子溶剂中所述透明质酸盐与选自碳酸苯酯类和卤代甲酸苯酯类的羰基化试剂的反应；
b)由步骤a)产生的活化的透明质酸盐通过亲核取代反应与通式NH2-R的化合物的反应，其中R选自由NH2、氨基烷基、烷基链或芳基烷基链、聚丙烯酸链、聚氧乙烯链或低分子量的分子(例如药物)或高分子量分子组成的组。
2.根据权利要求1所述的工艺，其中所述羰基化试剂选自双(4-硝基苯基碳酸酯)和氯代苯基碳酸酯。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的工艺，其中所述通式NH2-R的化合物选自肼和式NH2-(CH2)n-NH2的二氨基烷基，其中n是1和30之间，优选地1和10之间的数。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的工艺，其中所述透明质酸盐选自四丁铵盐和十六烷基三甲基铵盐。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的工艺，其中所述极性非质子溶剂选自由二甲亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺和它们的混合物组成的组。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的工艺，其中活化步骤(a)和亲核取代步骤(b)都在包括10℃和60℃之间的温度下进行。
7.一种用于水凝胶生产的工艺，所述工艺是使根据权利要求1-6中任一项获得的透明质酸的官能化衍生物在作为活化剂的碳二亚胺的存在下经受自交联，或通过使用双官能或多官能的交联剂而经受化学交联。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的工艺，其中从所述步骤b)获得的盐形式的透明质酸的官能化衍生物通过与式Y-R’的化合物反应的亲核取代而经受进一步的官能化，其中Y是选自卤素、N-氧代琥珀酰亚胺、具有1-6个碳原子的烷氧基的良好的离去基团，或者Y代表酐或环氧化物的亲电子部分，并且R’选自由以下组成的组：都被任选取代的丙烯酰基或甲基丙烯酰基或属于在有机溶剂或水溶剂中可溶的分子的基团。
9.根据权利要求8所述的工艺，其中所述进一步的官能化在水介质或有机溶剂，优选选自由二甲亚砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺和它们的混合物组成的组的极性非质子溶剂中进行。
10.根据权利要求8-9中任一项所述的工艺，其中所述进一步的官能化在包括5℃和60℃之间的温度下进行。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的工艺，其中所述进一步的官能化在催化剂的存在下进行，所述催化剂选自由以下组成的组：二乙胺、三乙胺、二甲氨基吡啶和它们的混合物。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的工艺，其中所述式Y-R’的化合物对应于甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酰氯、丙烯酰氯、丙烯酸缩水甘油酯或甲基丙烯酸缩水甘油酯。
13.根据权利要求8-11中任一项所述的工艺，其中所述式Y-R’的化合物对应于N-氧代琥珀酰亚胺酯或N，N’-二苯甲酰-L-胱氨酸的二酯或类似的衍生物。
14.根据权利要求13所述的工艺，其中由所述进一步的官能化获得的所述衍生物经受还原工艺以获得苯甲酰基-半胱氨酸部分或其类似的衍生物。
15.一种透明质酸的官能化衍生物，具有从50000至1500000道尔顿范围内的分子量，可从权利要求1-14中任一项的工艺获得。
16.根据权利要求15所述的官能化衍生物，其中所述官能化程度包括在透明质酸的至少一个羟基和全部羟基之间。
17.根据权利要求15-16中任一项所述的官能化衍生物，可从权利要求12的工艺获得。
18.一种水凝胶，可从光致交联工艺获得，包含根据权利要求17所述的透明质酸的官能化衍生物，其中所述官能化衍生物在水溶液或有机溶液中的浓度包括在1％w/v和20％w/v之间。
19.根据权利要求18所述的水凝胶，可通过在自由基引发剂的存在或不存在下，采用从5分钟至10小时变化的辐射时间的、具有在180nm至800nm范围内的最大波长的辐射而获得。
20.一种水凝胶，可从使用γ射线、微波或其他电离辐射的辐射工艺获得，包含根据权利要求17所述的透明质酸的官能化衍生物。
21.一种根据权利要求15-16中任一项所述的官能化衍生物，可从权利要求13-14中任一项所述的工艺获得。
22.一种水凝胶，可从空气中自动氧化的工艺获得，包含根据权利要求21所述的透明质酸的官能化衍生物。
23.从权利要求7所述的工艺获得或根据权利要求18-20或22所述的水凝胶，以纳米粒子或微粒、薄膜、膜、纤维和支架的形式被生产。
24.根据权利要求23所述的水凝胶用于生产用于药物或遗传物质的持续释放的系统或用于覆盖伤口、器官或组织的系统或用于组织再生的可植入材料或支架的用途。
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