CN102165305A - 检测系统与方法 - Google Patents

Abstract

一种检测系统将激发辐射源(18)、检测器(22)以及磁体装置(24)结合，所述激发辐射源提供激发辐射(10)到具有检测表面的基底(16)内的试样(14)的分析区域，所述检测器用于检测从包括试样检测表面的分析区域采集的并由激发所产生的辐射，所述磁体装置在试样分析区域下方并且相对于激发辐射源和光耦合装置是静止的，用于将试样中的磁性珠粒(15)吸引到基底的表面。所述检测辐射由基底的检测表面采集，以赋予增强的表面特异性。本发明将表面检测的优点与用于将靶标带到表面的简单低成本磁性系统结合。

Description

检测系统与方法

技术领域

本发明尤其涉及诊断学领域的检测系统和方法。

背景技术

检测系统一个实例基于在试样中产生荧光辐射，所述荧光辐射可检测以分析试样成分，使用荧光检测的一个实例是核酸测试(NAT)。对于检测疾病的遗传倾向性、确定RNA表达水平，或对如引起感染的细菌和病毒等病原体进行鉴别，这是分子诊断学的核心要素。这种生物传感方法也可用于检测其它被分析物，如(治疗或滥用)药物，或如血液、尿液或唾液等体液内的疾病标志物。

荧光检测可用于定性或定量地确定试样(例如DNA、蛋白质或药物)中特殊靶标被分析物的存在。本发明涉及用于检测荧光的仪器及其使用方法。

使用例如固化或未固化抗体用于特定附着、捕获以及甚至隔离这种靶标的化学或生物测定方法的许多实例通常如1998年第五版Immunology(ISBN0723429189)手册所已知，例如见第6章929。这方面常使用所谓竞争式与夹心式测定。在典型的分子诊断实验中，筛选生物试样用于检测特定生物成分(“靶标”)，如基因或蛋白质，后者通常提供特定疾病的标志物。这通过对靶标选择性附着(如已知为杂交)到如抗体等捕获探针的出现情况进行检测而完成。典型地，杂交步骤之后是清洗步骤，该步骤中所有未附着靶标分子被清洗，最终执行检测步骤。通常地在检测前利用复制相进行DNA或RNA检测。在该复制相，试样内仅少量存在的待检测DNA或RNA被大量复制以便于可靠检测。由于，复制步骤耗用时间和能量，低检测边界是重要的。本发明仪器用于该方面。

有两种普通的检测方法：均相测试(在溶液中)和非均相测试(在表面上)。非均相测试使用较为广泛有若干原因，其中最重要的是它们允许使用特殊的表面敏感技术，获得更为敏感的检测。所述检测基于对附连到靶标分子的荧光标签进行荧光检测。荧光检测需非常灵敏，且对于均相测试，所述检测须具有表面特异性以使得生物背景减至最小。理想地，荧光检测需能够单独进行荧光标签检测，而保持其过程具有时效。

捕获探针采用图案样式允许多重检测(即同时检测多个不同的靶标)。这种非均相检测的主要缺点，即表面固化捕获免疫测定，是被分析物需要扩散并附着到表面，这通常为分析中的速度限制步骤。

具有表面固化捕获探针的磁性珠粒常用于从溶液中提取如上述被分析物等成分。所述珠粒可由外部磁体拉向表面。在第二步骤中，通过取消磁性吸引，可将所述珠粒再分散到淡水溶液中。致动力取决于磁场强度和珠粒磁性体积。

磁性珠粒也可用作标签。靶标分子存在的灵敏度检测可基于磁性珠粒所产生信号(基于光学、电气或磁性特性)或附连到磁性珠粒的任一其它标签所产生的信号。

利用光学检测的磁性致动的目前实施方案检测以斜角进入的激发光束的衰减。

发明内容

发明人已认识到在目前实施的前述方案中，具有噪声限度的较大信号的较小变化需要检测。从检测附着标签所发射的发光可以获得增强灵敏度。为进行即用型应用中必须的快速并有效的检测，不仅灵敏检测是重要的，紧凑构造也极为重要，因为这种设备须在混杂场合下和/或由个人进行操作。

于是当涉及适用于即护型使用的设备时，对改善光学读取与磁性致动的结合有实际构造性限制。

本发明目的之一是提供至少部分消除前述问题的检测系统。

本发明由附属权利要求所限定。附属权利要求提供有利的实施例。

根据本发明的装置能够利用已捕获靶标向检测表面的磁性致动位移，在检测表面选择性激发这些捕获靶标并检测激发响应以获知靶标存在。该表面局部激发赋予增强的表面特异性，可使检测中获得增强灵敏度。本发明将表面检测的优点与将靶标带到所述表面的简单低成本磁性系统结合。磁性系统提供高速输送机制。此外，激发与检测均在检测表面一侧进行，可获得设备的紧凑构造。相应地，通过提供固定的磁体和辐射导引系统，所述设备可制成为低成本紧凑布置。磁性致动可有效地吸引珠粒朝向(上方集中)以及远离(清洗)所述表面，而珠粒尺寸确保可产生强辐射信号。

在一个实施例中，激发辐射为瞬逝的，其优点是检测表面处具有增强的激发选择性。磁场导引装置优选地被提供以用于将磁场从磁体聚焦到分析区域。这使得磁体位于远离分析区域处，使得有足够空间用于磁体、激发源和检测器。

磁场导引装置可布置为马蹄型构形(基本为线型布置)，使所采集辐射向下通过场导引器中心传到检测器。这提供紧凑布置。辐射耦合装置则可提供激发辐射到马蹄型场导引装置的中央开口上方的分析区域，并且其具有用于将辐射聚焦到分析区域以在试样中产生瞬逝辐射的辐射耦合装置。辐射耦合装置也可再用于将所采集辐射聚焦到检测器，且辐射耦合装置可包括分光器用于为所采集辐射和激发辐射提供不同辐射通路。这提供紧凑的激发与检测组合辐射系统，部分地置于环形磁场导引器中心之内。

替代地，所述检测器可安装在磁体装置的顶部表面。

替代地，检测器和磁体装置可并排在载体上，其中所述载体可在磁性致动位置与检测位置之间移动。这可增强图像质量。所述致动器在测定过程中将仅需扫描少量次数。

通常，检测器优选地包括辐射聚焦装置。在一个布置中，辐射聚焦装置包括辐射导引器。

所述检测器可包括辐射带通或高通滤波器，以将背景噪声从所检测的辐射信号中除去。

在另一布置中，辐射耦合装置包括与激发辐射源相联的辐射耦合装置，以便将激发辐射相对于检测表面成锐角(或如果平行于基底表面，则平行于基底表面)引导到分析区域，使得检测表面提供全内反射。该全内反射在试样中提供瞬逝波。所述锐角意指接近分析区域的辐射通路不占用较大深度，使得磁体可保持接近分析区域。所述检测有效地限于检测表面之上的薄层。

在另一布置中，辐射耦合装置包括与试样接触的检测表面处的瞬逝辐射导引器，再次将激发限于在检测表面近旁或其上的非常薄的试样层。激发辐射可在距检测表面一定距离处以及由此从磁体与辐射耦合装备/和/或检测器耦合到波导管中，使得它们相对于设备中可用空间不会相互干涉。使用磁性致动可使紧凑设备在所述表面具有有利的灵敏测量。

在另一布置中，辐射耦合装置产生非瞬逝行波，它被限于接近与试样接触的表面的浅体积中，这已知为“双折射检测”。浅体积可具有数到数十微米的深度。

检测和/或激发辐射可为光学辐射，所述光学辐射包括或排除近红外辐射和/或UV辐射。试样与激发辐射的交互作用可包括反射、吸收或发光，其中发光包括磷光和/或荧光。优选地激发辐射为光学辐射，而检测辐射为提供增强灵敏度的发光辐射。最优选地，检测辐射为提供非常灵敏检测的荧光辐射。

在所述方法依赖于吸收激发辐射之后发出转换的激发辐射(如例如产生发光)的情况下，试样可可提供适用转换的种类。

检测器可包括像素化辐射检测器。所述系统优选地包括生物成分筛选系统，用于筛选如例如蛋白质、药物、DNA、RNA或其它分子等特定被分析物。

将荧光检测与使用磁性致动结合这本身是已知的(Anal.Chim.Acta 564，2006，40)。但是，所公开方案不是本发明意义上的紧凑结构。

附图说明

本发明实例将参考附图加以详述，其中：

图1用于说明瞬逝激发原理；

图2显示本发明分析仪器的第一实例；

图3显示本发明分析仪器的第二实例；

图4显示本发明分析仪器的第三实例；

图5显示本发明分析仪器的第四实例；

图6显示本发明分析仪器的第五实例；且

图7A与7B显示本发明分析仪器的第六实例。

同一参考序号用于指示不同附图中的同一部件，当各附图包括如前述附图的同一部件时，则不再重复其描述。权利要求中所使用的参考序号仅用于帮助理解本发明，并非用于限制权利要求范围。

具体实施方式

本发明涉及将表面局部激发与磁性珠粒捕获结合的光学分析仪器与方法。采用表面局部激发赋予增强的表面特异性，使得荧光检测中实现选择性增强。磁性珠粒捕获提供低成本且紧凑方式完成表面测量，且使微粒高速运动到表面。

一种获得表面局部激发的方式为采用瞬逝激发。瞬逝激发原理首先参考图1加以描述。

待调查试样14被限于给定容量，通过基底16形成微流体部分。光源18将激发光10导向基底16的表面。

通过使得该激发光入射角大于临界角度，形成光的全内反射。这消除体阻激发(bulk excitation)。瞬逝波行进至试样中，衰减场幅度为传播距离z的函数，如由曲线21示意性说明。由于该瞬逝波快速衰减，其可用于仅探测靠近界面表面存在的分子。

在(短波长)激光的激发下，荧光分子开始在所有方向发光。荧光的波长将大于激发波长。

图2显示本发明设备第一实例。

通常，所述设备包括读取仪以及一次性筒体。读取仪具有用于将磁性珠粒带到表面并将其拉离表面的磁体装置、用于诱发荧光的光学激发系统、以及光学检测器。

如参考图1所进行的解释，待调查试样14被限定为给定容量，通过基底16形成微流体部分。试样包括磁性珠粒15。如激光(或LED)18等光源所产生的激发光10用于激发荧光19。

由附着标签所发射的感生荧光(提供瞬逝激发光21到试样中的结果)由采集透镜装置20采集，并被导向检测器22。检测器为光学检测器，其可为二极管或二极管阵列、或电荷耦合器件(CCD)。通过引入光学元件，如设备一次性部分(基底)与检测器22之间的透镜，到达传感器表面的光量可进一步增加。如图2所示，一次性基底也可包括限定光学元件20的一部分的光学表面26、28。

为减小来自散射光的背景信号，在检测器顶部提供色彩选择性滤波器32(带通或高通；其中“高”是指光波长)。滤波器可为吸收式或反射式(分色)，并可与检测器光学接触。

光学元件20也可用于对检测器表面的附着表面成像。这样，产生发射光的空间图像，可使在附着表面不同点位同时检测不同靶标。这代表多重检测方案。

通过使用高渗透性材料形成导引器24，用于磁性珠粒捕获的磁场被导向光学基底16的底部。须提供接近光学基底的附着表面的磁场，以获得足够大的力(磁体顶部与基底传感器区域之间典型地小于1.5mm)。电磁源本身位于较远距离，未示于图2中。这在磁场导引器24之间产生足够空间以安放光学检测系统。在所示实例中，导引器形成马蹄形环，且中央开口用于安置检测光学组件。磁性导引结构的大的光学孔径对于增加光采集是所需的。须由成像光学元件采集的光锥开度角应较大，例如对应于数值孔径0.5或更大。

激发光10经由窗口26进入基底16，所述窗口集成在所述设备的一次性部分中。也显示退出窗口28，且光学检测器30用于激发源的反馈控制，例如用于追索和质量控制。

在图2实例中，所述激发由入射光束实现，所述入射光束在生物附着点处基底与被分析物溶液的界面处被全反射。这在所述表面上产生所需瞬逝场，其强度以指数衰减。仅接近所述表面(距离量级为100nm或更少)的标签将变为激发态。这种表面选择性激发从上层浮面溶液产生非常低的背景信号，因此可以高灵敏度进行实时检测。通过在试样分析区域侧方提供激发源和相关联透镜，且入射方向与基底平面之间具有较小锐角，可在磁场导引器与基底下表面之间提供较小空间。

在图2布置中，在由磁场导引器至少部分围绕的空间内提供检测器与相关联的光学元件。

在图3所示的第二实施例中，由例如光纤束等的光导引器40从分析区域传输发射光。检测器22放置在磁头之外的光导引器40的下端。这使得磁场导引器设计更为紧凑，并可允许使用标准组件用于光学元件。

在图4所示的第三实施例中，光电检测器22直接安放在用于致动磁性标签的磁体50顶部。但所述光电检测器22仍位于读取仪中以保持所述仪器一次性部件的成本较低。图4显示分析区域中基底的平直底侧，但如单个折射或衍射透镜，或一维或二维微透镜阵列(提供成像功能)等光学组件同样可被模塑在光学基底底部，以增强采集功效，如图2所示。

为保持光电检测器细长，其优选为半导体元件(例如光敏二极管、CCD、CMOS)或聚合物元件。

如上述实例所述全内反射的激发可由瞬逝光导引器激发所代替，如图5所示。以此方式，无需组件位于分析区域以将光耦合到分析区域。这为磁头留出更多区域。

激发源18通过光栅结构62提供光到光导引器60。

图6显示激发光被导引通过磁头内的光学元件的布置。以此方式，使用提供激发光到场导引装置中心之上的分析区域(例如仍为马蹄形构形)的光学布置。光聚焦到分析区域以在试样中产生辐射。

所述激发光由分色镜或分光器70导向试样。这可对激发光和荧光限定不同光学通路。所述激发光随后通过激发透镜72聚焦到试样中。

任何反射的漫射激光(具有激发波长)被分色镜或分束器70再次反射，而荧光发光通过分色镜/分束器70到检测器22。

带通滤波器可提供进一步过滤以拒斥激发光，由成像透镜74将经滤波的光聚焦到检测器22，所述成像透镜将试样成像到检测器22上。

读取可通过在读取通路中采集透镜的焦点处引入针孔或使用像素化检测器作为准针孔以抑制附着阵列之外其它部分的发光而以准共焦模式实施。但是，当瞬逝场仅在激发点存在时，无需针孔布置。

上述实例具有固定的磁性和光学组件，磁性和光学功能在相同筒体位置实现。

在图7所示布置中，将磁性与光学元件同轴布置代之以平行布置，其优点是具有更高成像质量。图7布置具有致动滑架80，所述滑架包含磁体装置82以及相互紧邻的成像和检测光学元件18、22。

图7A以侧视图和顶视图显示所述设备。图7B显示滑架80的两个位置。图7B顶部部分显示分析区域90在激发源通路中且在磁场之上。图7B底部部分显示分析区域在光学检测器布置之上以检测荧光。

荧光激发、光检测为同时进行(荧光弛豫时间为若干纳秒)。图7布置将磁性吸引功能与激发/检测分开。磁性吸引为较为缓慢的过程，且一旦珠粒被附着，其保持就位足以使筒体运动。

该布置使用与图2与图3实例相同的概念方法，因为分析区域成像通过磁体中心。

图7实例提供在两位置之间致动过程中滑架80的运动。提供磁体准确地在筒体的分析区域下方的位置。当致动过程终止时(磁性吸引以将微粒带到表面)，滑架移动到第二位置，使得成像/检测光学元件的光学轴线与分析区域中心重合，并进行激发和荧光检测。

在所有上述实例中，靶标分子附连到珠粒(以与现有珠粒捕获系统同样的方式)，荧光标签附连到靶标分子(以与现有光学系统同样的方式)，使得将珠粒磁性吸引到表面而在所述表面上提供所需荧光标签。吸引到所述表面上但没有附连靶标分子的珠粒将不会附着并可被通过使磁性梯度反向而被推离。

一维与二维移动机械台的技术从光学存储中已知，这些设备能够可靠制造、成本低且容量大。此外，一维致动滑架可快速移动(可达100Hz)并具有高精度(数十微米)。

该方法的可能缺点是在磁性致动过程中缺少信号。但是，由于生物测定的动力学由研究已知，对于最终用户产品这将没有问题。致动过程因此可以进行而无需反馈或分析。

本发明不同实例使得系统具有紧凑成像光学元件和检测器，且具有高图像质量。提供紧凑和有效的磁体装置。

例如使用微流体泵供应试样到分析区域可以是完全常规的。多重通道可与不同固化抗体平行。

所述设备的温度控制可由集成加热提供。可使用不同光谱的荧光珠粒。

可从未附着标签读取背景荧光。所述背景主要由无意附着的标签和其它粘在表面上的微粒造成，而某些内源性荧光由光通路中基底和所有组件造成。

通过吸收(FTIR)或散射测量珠粒密度是一种替代方式，其可代替荧光或除荧光之外进行测量。除滤波器外，其可使用基本相同的布置。

珠粒和带标签的抗体与试样预混合可在注入之前发生。优选地，对于护理点应用，混合与反应在一次性筒体内进行。

在上述实例中，所述系统用于荧光检测。但是，通常本发明更为一般地涉及试样激发和所致光的检测。

所述基底可为例如玻璃或聚合物等任一适用材料的平直板，并可具有表面密度在每平方微米0.01到106元件，优选地在每平方微米10到104元件的捕获元件。

试样、具有与试样接触的捕获元件的基底、或与试样接触后的基底典型地可筛选特定成分，例如生物成分，如寡聚核苷酸、DNA、RNA、基因、蛋白质、碳水化合物、脂肪、细胞、细胞组成(如外细胞膜或内细胞膜)、细菌、病毒、原生动物等，它们也称为靶粒子。

发光标签典型地附连到靶粒子并由此辅助检测靶粒子。在某些实施例中，试样于是包括至少一个发光标签，也称为“光学地可变微粒”。这种光学地可变微粒可为例如荧光微粒(如上所述)、电发光微粒或化学发光微粒。所述光学地可变微粒可为能够以化学或其它方式附着到附着点的任一实体。所述附着归因于筛选效应(即离子、弥散和氢键交互作用)。共价键合是一种替代方式。

在上述实例中，荧光检测透过基底进行。但是，荧光检测可在试样上方实施。

本发明应用通常在分子诊断学领域：临床诊断、护理点诊断、复杂生物分子诊断研究——生物传感器、基因与蛋白质表达阵列、环境传感器、食品质量传感器等。

不同其它更改对本领域技术人员是显然的。

Claims (15)

1.一种检测系统，包括：

用于基底(16)的支架，所述基底具有检测表面并能够包含一定容量的试样，使得所述试样至少部分地与所述检测表面接触；

用于提供激发辐射的激发辐射源(18)；

用于将所述激发辐射提供到所述试样的激发区域的辐射耦合装置，所述激发区域包括所述检测表面；

用于对检测辐射进行检测的检测器(22)，所述检测辐射由所述激发辐射与所述试样交互作用而产生、且从所述试样的所述激发区域内的分析区域采集，所述分析区域包括所述检测表面；

其中，所述系统还包括接近所述试样的所述检测表面、在所述试样的所述检测表面同一侧、并且相对于所述激发辐射源(18)和所述辐射耦合装置静止地设置的磁体装置，所述磁体装置能够将所述试样中的磁性珠粒(15)吸引到所述检测表面。

2.如权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述激发辐射为瞬逝的(21)。

3.如权利要求1所述的检测系统，其特征在于，还包括用于将磁场从所述磁体装置聚焦到所述分析区域的磁场导引装置(24)。

4.如权利要求3所述的检测系统，其特征在于，所述磁场导引装置(24)包括开口，所述辐射耦合装置能够通过所述开口导引激发和/或检测辐射。

5.如权利要求4所述的检测系统，其特征在于，所述辐射耦合装置提供激发辐射到场导引装置(24)中心上方的所述分析区域，且具有辐射装置(72)，所述辐射装置用于将辐射聚焦到所述分析区域，以在所述试样中产生瞬逝辐射。

6.如权利要求5所述的检测系统，其特征在于，所述辐射装置(72)也用于将采集的检测辐射聚焦到所述检测器(22)，其中所述辐射装置包括分束器(70)，用于为采集的检测辐射和激发辐射提供不同辐射通路。

7.如权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述检测器(22)安装在所述磁体装置(50)的最接近试样支架的表面处。

8.如权利要求1至3任一所述的系统，其特征在于，所述检测器(22)和磁体装置(82)并排在载体(80)上，所述载体(80)可在磁性致动位置与检测位置之间移动。

9.如前述任一权利要求所述的检测系统，其特征在于，所述检测器(22)包括辐射聚焦装置。

10.如前述任一权利要求所述的检测系统，其特征在于，所述检测器(22)包括辐射带通或高通滤波器。

11.如权利要求1至3任一所述的检测系统，其特征在于，所述辐射耦合装置包括与激发辐射源(18)相关联的辐射装置(26)，用于将激发辐射相对于所述基底(16)的所述检测表面成锐角地导向所述分析区域，使得所述基底提供全内反射。

12.如权利要求1至3任一要求所述的检测系统，其特征在于，所述辐射耦合装置包括瞬逝辐射导引器。

13.如前述任一权利要求所述的检测系统，其特征在于，所述激发辐射是光且所述检测辐射是发光辐射。

14.如前述任一权利要求所述的检测系统，其特征在于，所述检测器包括像素化的光检测器。

15.一种检测方法，包括：

操作设置在由基底保持的试样的分析区域下方的磁体装置，并由此将所述试样中的磁性珠粒(15)吸引到所述分析区域中的所述基底的检测表面；

从所述检测表面的第一侧由激发辐射源向所述试样的分析区域提供激发辐射(18)，在所述步骤中，所述磁体装置相对于所述激发辐射源(18)且相对于所述辐射耦合装置是静止的；

从所述试样的分析区域并且从所述检测表面的第一侧采集由于激发辐射与所述试样交互作用产生的检测辐射；以及

检测所采集的检测辐射。

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