JP5323130B2

JP5323130B2 - 蛍光分析装置および蛍光分析方法

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Publication number: JP5323130B2
Application number: JP2011117870A
Authority: JP
Inventors: 盛志伊神; 和浩牧野
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2011-05-26
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2031-05-26
Also published as: US8658989B2; JP2012247244A; EP2527820B1; EP2527820A1; US20120298885A1

Description

本発明は蛍光分析装置および蛍光分析方法に係り、特に、紫外線と可視光線を発する複数種類のＬＥＤを光源とする蛍光分析装置および蛍光分析方法に関する。

従来、例えば生化学の分野において、励起光が照射されることにより蛍光を射出する、蛍光色素で標識された蛍光試料を被写体として撮像したり、化学発光基質と接触して発光している化学発光試料を被写体として撮像したりする撮影装置が提案されている（例えば特許文献１参照）。

このような分野に向けた製品として、単色性の高い近赤外・赤・緑・青・紫外そして白色の光源を備え、コンピュータソフトによる制御で各色を任意に発光させるほか、各々の光源を機械的に交換できる製品も存在する。

この場合、例えば蛍光色素のＥｔＢｒ（臭化エチジウム）とＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（サイバーグリーン：ＳＹＢＲはMolecular Probe Inc.の登録商標である）について、双方をそれぞれ適切に励起し検出する場合、それぞれの色素の吸収特性に適切な励起光源を選択して使用する。ＥｔＢｒなら紫外光源、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎならば青光源というように光源を適宜選択する必要がある。

すなわち、一般的には光源と、光源の直後に第１フィルタ（励起フィルタ）を配した光源ユニットを作り、光源と第１フィルタはそれぞれの蛍光色素に最適化した分光特性のものを使用し、撮像者が選択した蛍光色素に応じて光源ユニットを交換する作業を行う。また、撮像素子の直前にも、第２フィルタ（検出フィルタ）を配して、撮像素子に励起光が入射しないように励起波長成分をカットしている。

一方で、ＥｔＢｒとＳＹＢＲＧｒｅｅｎのどちらにも対応可能な検出装置は、双方を励起できる波長を主発光帯とする紫外線蛍光ランプを応用したシステム(Bio-Rad ChemiDoc 等)が知られている。

ここで、励起用光源として異なる２波長の励起光を同時に照射する構成が存在する（例えば特許文献２参照）。

また青色光と紫外光に発光するＬＥＤを千鳥格子状に配列した光源を備えた構成が存在する（例えば特許文献３参照）。

さらに、２個の励起光源を異なる周波数で点滅させ、それぞれに対応する蛍光を検出する構成が存在する（例えば特許文献４参照）。

また、基板上に規則的に配置され、独立して光量が制御可能に構成されたＬＥＤ光源を備えた構成が存在する（例えば特許文献５参照）。

さらに、基板上に規則的に配置された複数のＬＥＤ光源を備え、この複数のＬＥＤ光源が独立して光量および励起光の発光波長を制御可能に構成された励起光源を備えた構成が存在する（例えば特許文献６参照）

特開２００５−２８３３２２号公報特開２００８−１４５４０５号公報特開２００５−１７２６１４号公報特開２００９−３００３５６号公報特開２０１０−０９１４５６号公報特開２００１−０８３０９０号公報

しかしながら、双方を励起できる波長を主発光帯とする紫外線蛍光ランプを応用したシステムにおいて、蛍光色素ＳＹＢＲＧｒｅｅｎに対する励起効率は決して高くなく、光源の発熱が試料に影響するほか、小型化設計においても不利になる欠点が存在する。

特許文献２の構成においては、光源の取付け位置によって試料への励起光の当たり方が異なるので、波長毎に等しい条件で照射することはできず、また光源ごとに適切な励起フィルタを用意し、必要に応じて交換する手間も生じる。

特許文献３の構成においては、検出器側で各波長毎の画像を得るために検出フィルタの交換が必要であり、また当該構成は特に蛍光色素を用いていない関係上、励起光をフィルタでカットあるいはパスさせる概念は存在しない。

特許文献４の構成においては、この構成では２個の励起光源によって試料を同軸照射させるために高価なダイクロイックフィルタ（干渉フィルタ）を励起フィルタとして使用しており、複数の励起光源に単一の励起フィルタを用いることはできない。

特許文献５の構成においては、使用される蛍光染料ごとに異なる波長帯域の蛍光を透過させるために、各蛍光染料ごとに蛍光フィルタを用意する必要があり、フィルタの種類や数が増えてしまう上に交換の手間がかかる欠点がある。

特許文献６の構成においては、当該構成はガラス版板などに多数の窪みを設けたマイクロタイタープレート用の光源であり、１個のウェル（窪み）ごとに１個のＬＥＤを用いる都合上、それぞれ独立して励起光をフィルタリングするには多数のフィルタを設けねばならず、これもフィルタの種類や数が増えてしまう上に交換の手間がかかる欠点が存在する。

上記のように、使用する蛍光色素によって光源ユニットを交換する作業は作業者（撮像者）に余計な手間を強いるものとなる。

そこで本発明は、まず紫外と青の双方に発光分布を有するような分光特性の光源を使用し、（これは単一でなくとも複数光源組合せで可とする）紫外領域と青領域とをそれぞれ点灯できるものとする。次いで、励起フィルタとして、例えば３００ｎｍ以短の波長と５００ｎｍ以長の波長をカットし、３００〜５００ｎｍの波長を通す単一のバンドパスフィルタを光源上に配する。次いで検出フィルタ（蛍光フィルタ）として、５２０ｎｍ以長の波長を通し、それ以短の波長をカットするフィルタを一つのみ撮像レンズ前に配する。

ＥｔＢｒの発する蛍光は５００ｎｍ以上、５９０ｎｍ前後をピークとする橙色光であり、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎの発する蛍光は４９０ｎｍ以上、５３０ｎｍ前後をピークとする緑色光なので、光源からの光に含まれる上記蛍光と同じ波長の範囲が除去されることにより、蛍光色素が発した蛍光のみを取り出し、かつ検出フィルタによって紫外領域と青領域とからなる励起光が除去されるので、撮像レンズには蛍光のみが入射する。

これにより作業者（撮像者）は、いずれの蛍光色素を用いても、それを意識することなくフィルタや光源ユニットなど何等の交換操作を行うことなく、正しく作業することができる。

本発明は上記の点に鑑み、フィルタ交換を行わずに複数種類の蛍光色素を励起する光源および励起フィルタと、検出用の単一のロングパスフィルタとを備えた安価な蛍光分析装置および蛍光分析方法を提供することを目的とする。

請求項１に記載の発明は、少なくとも２種類の、主波長の異なる励起用のＬＥＤが基板上に二次元配列されたＬＥＤ光源と、被写体を撮影する撮像レンズと、前記ＬＥＤ光源と前記被写体との間に設けられ、前記ＬＥＤ光源の各主波長成分を透過させる単一の励起フィルタと、前記撮像レンズと前記被写体の間に設けられた単一の検出用ロングパスフィルタと、を備え、前記ＬＥＤはそれぞれ３１２ｎｍあるいは３６５ｎｍを主波長成分とする近紫外線ＬＥＤと、４７０ｎｍを主波長成分とする青色ＬＥＤであり、前記単一の励起フィルタは近紫外から青色帯を透過するバンドパスフィルタであり、前記ＬＥＤ光源は、単位面積あたりの前記近紫外線ＬＥＤの個数が、前記被写体からの距離が近いほど多くなるように基板上に二次元配列されたことを特徴とする。

上記の発明によれば、基板上に二次元配列された少なくとも２種類のＬＥＤから照射される光が、単一の励起フィルタを透過する構成としたことで、作業者が励起フィルタおよび光源部を交換する手間が不要となり、また安価に複数の蛍光染料を励起させることが可能であり、かつ各ＬＥＤ間の照射光量や照射指向性について厳密に統一する必要がないので製造工数を少なくでき、また単一のロングパスフィルタを検出用として用いることで、安価に複数の蛍光染料を検出することができる。また、例えば紫外線ＬＥＤで代表的な蛍光染料であるＥｔＢｒを励起し、青色ＬＥＤでＳＹＢＲＧｒｅｅｎを励起できるので、それぞれを各個にあるいは同時に検出することができる。さらに、一般的に可視光線と比較して光量の少ない紫外線光を、被写体からの距離が近いほど紫外線ＬＥＤの個数が多くなるように基板上に二次元配列されたことによって、被写体表面での紫外光の照度を上げ、感度を向上させることができる。

請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の構成において、前記検出用ロングパスフィルタは波長５２０ｎｍ以下をカットする橙色透明のアクリル板であることを特徴とする。

上記の発明によれば、検出用に安価な着色アクリル板を使用することで安価に複数の蛍光染料を検出することができる。

請求項３に記載の発明は、請求項１または請求項２に記載の構成において、前記バンドパスフィルタは３００ｎｍ以下および５００ｎｍ以上をカットし、４００ｎｍ近傍に透過ピークをもつことを特徴とする。

上記の発明によれば、例えば代表的な蛍光染料であるＥｔＢｒを３００〜５００ｎｍの光で励起し、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎを３７０ｎｍ近傍のピーク波長を含む光で励起できるので、それぞれを各個にあるいは同時に検出することができる。

請求項４に記載の発明は、請求項１または請求項２に記載の構成において、前記バンドパスフィルタは２６０ｎｍ以下および４００ｎｍ以上をカットし、３３０ｎｍ近傍に透過ピークをもつことを特徴とする。

上記の発明によれば、例えば代表的な蛍光染料であるＥｔＢｒを３００〜４００ｎｍの光で励起し、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎを３００ｎｍ近傍のピーク波長を含む光で励起できるので、それぞれを各個にあるいは同時に検出することができる。

請求項５に記載の発明は、基板上に二次元配列された、少なくとも２種類の主波長の異なる励起用のＬＥＤと、前記ＬＥＤをカバーしそれぞれの主波長成分を透過させる単一の励起フィルタを備えた光源部で、最大吸収波長の異なる少なくとも２種類の蛍光物質を励起し、前記ＬＥＤはそれぞれ３１２ｎｍあるいは３６５ｎｍを主波長成分とする近紫外線ＬＥＤと、４７０ｎｍを主波長成分とする青色ＬＥＤであり、前記単一の励起フィルタは近紫外から青色帯を透過するバンドパスフィルタであり、前記ＬＥＤ光源は、単位面積あたりの前記近紫外線ＬＥＤの個数が、前記被写体からの距離が近いほど多くなるように基板上に二次元配列され、検出用フィルタとして撮像レンズと前記被写体の間に設けられた単一のロングパスフィルタを通して前記蛍光物質の放つ蛍光を検出することを特徴とする。

上記の発明によれば、基板上に二次元配列された少なくとも２種類のＬＥＤから照射される光が、単一の励起フィルタを透過する励起光としたことで、作業者が励起フィルタおよび光源部を交換する手間が不要となり、また安価に複数の蛍光染料を励起させることが可能であり、かつ各ＬＥＤ間の照射光量や照射指向性の影響を受けにくいので調整を簡易にでき、また単一のロングパスフィルタを検出用として用いることで、安価に複数の蛍光染料を検出することができる。

請求項６に記載の発明は、請求項５に記載の構成において、前記蛍光物質はＥｔＢｒおよびＳＹＢＲＧｒｅｅｎで染色されていることを特徴とする。

上記の発明によれば、代表的な蛍光染料であるＥｔＢｒのような紫外域に吸収帯をもつ蛍光色素と、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎのように青色域に吸収帯をもつ蛍光色素とを、それぞれ各個にあるいは同時に検出することができる。

請求項７に記載の発明は、請求項５に記載の構成において、前記蛍光物質はＥｔＢｒおよびＳＹＢＲＳａｆｅで染色されていることを特徴とする。

上記の発明によれば、代表的な蛍光染料であるＥｔＢｒのような紫外域に吸収帯をもつ蛍光色素と、ＳＹＢＲＳａｆｅのように青色域に吸収帯をもつ蛍光色素とを、それぞれ各個にあるいは同時に検出することができる。

請求項８に記載の発明は、請求項５に記載の構成において、前記蛍光物質はＥｔＢｒおよびＳＹＢＲＧｏｌｄで染色されていることを特徴とする。

上記の発明によれば、代表的な蛍光染料であるＥｔＢｒのような紫外域に吸収帯をもつ蛍光色素と、ＳＹＢＲＧｏｌｄのように青色域に吸収帯をもつ蛍光色素とを、それぞれ各個にあるいは同時に検出することができる。

本発明は上記の構成としたことにより、フィルタ交換を行わずに複数種類の蛍光色素を励起する光源および励起フィルタと、検出用の単一のロングパスフィルタとを備えた安価な蛍光分析装置および蛍光分析方法とすることができる。

本発明の実施形態に係る撮影装置を含む撮影システムの全体斜視図である。本発明の実施形態に係る撮影装置の正面断面図である。本発明の実施形態に係る撮影装置の全体を示すブロック図である。図３に示す撮影装置の撮影部を示すブロック図である。本発明の実施形態に係る撮影装置を示す斜視図である。本発明の実施形態に係る撮影装置の励起光源を示す斜視図である。典型的なブルーバンドパスフィルタおよび紫外線透過フィルタの分光透過率を示す図である。本発明の実施形態に係る検出用ロングパスフィルタの分光透過率を示す図である。従来の検出用フィルタの分光透過率を示す図である。臭化エチジウム（EtBr）の吸収および蛍光の分光特性を示す図である。サイバーグリーン（SYBR Green）の吸収および蛍光の分光特性を示す図である。サイバーセーフ（SYBR Safe）の吸収および蛍光の分光特性を示す図である。サイバーゴールド（SYBR Gold）の吸収および蛍光の分光特性を示す図である。図６に示す励起光源のＬＥＤ配列を示す概念図である。

＜主要部分＞

以下、図面を参照して本発明の実施形態について説明する。

図１は、本発明に係る撮影装置を用いた撮影システムの一例を示す斜視図である。撮影システム１は、被写体に応じて励起光を照射せずに又は励起光を照射して被写体を撮影し、被写体の撮影画像を取得する撮影システムであり、撮影装置１０及び画像処理装置１００を含んで構成されている。

撮影装置１０は、被写体を撮影して取得した被写体の画像データを画像処理装置１００に出力する。画像処理装置１００は、受信した画像データに対して、必要に応じて所定の画像処理を施して表示部２０２に表示させる。

なお被写体に関しては、本実施形態では化学発光試料ではなく蛍光色素（蛍光物質）で染色した試料に励起光を照射し、試料から発せられる蛍光を検出するものとする。

図２には、撮影装置１０の蓋２２（図１参照）を開けた状態の正面図を示した。同図に示すように、撮影装置１０は、被写体ＰＳが配置される被写体配置部４０と、被写体配置部４０を内部に収容した筐体２０と、被写体配置部４０に配置された被写体ＰＳを撮影する撮影部３０と、被写体ＰＳに励起光を照射する、筐体２０内に配置された落射光源５０と、を備えている。

筐体２０は、略直方体に形成された中空部２１を有するものであって、内部に被写体ＰＳが配置される被写体配置部４０を有している。また、筐体２０には図１に示す蓋２２が開閉可能に取り付けられており、ユーザーが蓋２２を開けて筐体２０内に被写体ＰＳを収容することができるようになっている。このように、筐体２０は中空部２１内に外光が入らないような暗箱を構成している。

撮影装置１０は、筐体２０の上面２０ａに固定されており、例えばＣＣＤ等の撮像素子を含んで構成されている。撮像素子には、例えばペルチェ素子などの冷却手段が取り付けられており、撮像素子を冷却することにより、撮影された画像情報に暗電流によるノイズが増大するのを防止する構成とされていてもよい。

撮影装置１０には撮像レンズ３１が取り付けられており、この撮像レンズ３１は、被写体ＰＳにフォーカスを合わせるためにヘリコイド機構を備えているか、あるいは撮像レンズ３１自体が矢印Ｚ方向に移動可能に設けられている。

落射光源５０は、後述のように被写体配置部４０の上に配置された被写体ＰＳに向けて励起光を射出する。被写体ＰＳとして蛍光試料を撮影する場合には、被写体に応じて落射光源５０から後述する蛍光色素に応じた励起光を被写体に照射させる。

図３に示す画像処理装置１００は、メインコントローラ７０を含んで構成されている。

メインコントローラ７０は、ＣＰＵ（ＣｅｎｔｒａｌＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇＵｎｉｔ）７０Ａ、ＲＯＭ（ＲｅａｄＯｎｌｙＭｅｍｏｒｙ）７０Ｂ、ＲＡＭ（ＲａｎｄｏｍＡｃｃｅｓｓＭｅｍｏｒｙ）７０Ｃ、不揮発性メモリ７０Ｄ、及び入出力インターフェース（Ｉ／Ｏ）７０Ｅがバス７０Ｆを介して各々接続された構成となっている。

Ｉ／Ｏ７０Ｅには、表示部２０２、操作部７２、ハードディスク７４、及び通信Ｉ／Ｆ７６が接続されている。メインコントローラ７０は、これらの各機能部を統括制御する。

表示部２０２は、例えばＣＲＴや液晶表示装置等で構成され、撮影装置１０で撮影された画像を表示したり、撮影装置１０に対して各種の設定や指示を行うための画面等を表示したりする。

操作部７２は、マウスやキーボード等を含んで構成され、ユーザーが操作部７２を操作することによって撮影装置１０に各種の指示を行うためのものである。

ハードディスク７４は、撮影装置１０で撮影された撮影画像の画像データ、後述する制御ルーチンの制御プログラムや画像処理プログラム、テーブルデータ等の各種データ等が記憶される。

通信インターフェース（Ｉ／Ｆ）７６は、撮影装置１０の撮影部３０、落射光源５０と接続される。ＣＰＵ７０Ａは、通信Ｉ／Ｆ７６を介して、被写体の種類に応じた撮影条件での撮影を撮影部３０に指示したり、被写体に励起光を照射する場合には、落射光源５０に励起光の照射を指示すると共に、撮影部３０で撮影された撮影画像の画像データを受信して画像処理等を施したりする。

図４には撮影部３０の概略構成を示す。図４に示すように、撮影部３０は制御部８０を備えており、制御部８０はバス８２を介して通信インターフェース（Ｉ／Ｆ）８４と接続されている。通信Ｉ／Ｆ８４は、画像処理装置１００の通信Ｉ／Ｆ７６と接続される。

制御部８０は、通信Ｉ／Ｆ８４を介して画像処理装置１００から撮影が指示されると、指示内容に応じて各部を制御して被写体配置部４０に配置された被写体ＰＳを撮影し、その撮影画像の画像データを通信Ｉ／Ｆ８４を介して画像処理装置１００へ送信する。

制御部８０には、撮像レンズ３１、タイミング発生器８６、及び撮像素子８８を冷却する冷却素子９０が接続されている。

撮像レンズ３１は、図示は省略するが、例えば複数の光学レンズから成るレンズ群、絞り調整機構、ズーム機構、及び自動焦点調節機構等を含んで構成されている。レンズ群は、図２において被写体ＰＳにフォーカスを合わせるために、矢印Ｚ方向に移動可能に設けられているか、またはヘリコイド機構を備えている。絞り調節機構は、開口部の径を変化させて撮像素子８８への入射光量を調整するものであり、ズーム機構は、レンズの配置する位置を調節して撮影範囲を拡大あるいは縮小するものであり、自動焦点調節機構は、被写体ＰＳと撮影装置１０との距離に応じて合焦（フォーカス）調節するものである。

図２に示すように、落射光源５０から発せられた励起光で励起され蛍光を発する被写体ＰＳからの光（蛍光）は、検出フィルタ６０を透過したのち撮像レンズ３１を透過して被写体像として撮像素子８８に結像される。

撮像素子８８は、図示は省略するが、複数の各画素に対応する受光部、電荷転送あるいは信号電圧伝送のためのマトリクス等を含んで構成されている。撮像素子８８は、その撮像面に結像される被写体像を電気信号に光電変換する機能を有し、例えば電荷結合素子（ＣｈａｒｇｅＣｏｕｐｌｅｄＤｅｖｉｃｅ：ＣＣＤ）や金属酸化膜型半導体（ＭｅｔａｌＯｘｉｄｅＳｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：ＭＯＳ）等のイメージセンサが用いられる。

ここでは撮像素子８８がＣＣＤであるとして説明する。撮像素子８８は、タイミング発生器８６からのタイミング信号により制御され、被写体ＰＳからの入射光を各受光部で光電変換する。

撮像素子８８で光電変換された信号電荷は、電荷電圧変換アンプ９２によって電圧変換されたアナログ信号となり、信号処理部９４に出力される。

タイミング発生器８６は、撮影部３０を動作させる基本クロック（システムクロック）を発生する発振器を有しており、例えば、この基本クロックを各部に供給すると共に、この基本クロックを分周して様々なタイミング信号を生成する。例えば、垂直同期信号、水平同期信号及び電子シャッタパルスなどを示すタイミング信号を生成して撮像素子８８に供給する。また、相関二重サンプリング用のサンプリングパルスやアナログ・デジタル変換用の変換クロックなどのタイミング信号を生成して信号処理部９４に供給する。

信号処理部９４は、タイミング発生器８６からのタイミング信号により制御され、入力されたアナログ信号に対して相関二重サンプリング処理を施す相関二重サンプリング回路（ＣｏｒｒｅｌａｔｅｄＤｏｕｂｌｅＳａｍｐｌｉｎｇ：ＣＤＳ）及び相関二重サンプリング処理が施されたアナログ信号をデジタル信号に変換するアナログ・デジタル（Ａｎａｌｏｇ／Ｄｉｇｉｔａｌ：Ａ／Ｄ）変換器等を含んで構成される。

相関二重サンプリング処理は、撮像素子８８の出力信号に含まれるノイズ等を軽減することを目的として、撮像素子８８の１受光素子（画素）毎の出力信号に含まれるフィードスルー成分レベルと画像信号成分レベルとの差をとることにより正確な画素データを得る処理である。

相関二重サンプリング回路により相関二重サンプリング処理が行われたアナログ信号は、アナログ・デジタル変換器によりデジタル信号に変換されてメモリ９６に出力され、一次記憶される。メモリ９６に一次記憶された画像データは、通信Ｉ／Ｆ８４を介して画像処理装置１００に送信される。

冷却素子９０は、例えばペルチェ素子等により構成され、制御部８０によって冷却温度が制御される。撮像素子８８の暗電流ノイズ（熱由来の雑音）が温度と露光時間に応じて増加すること等により画質に悪影響を及ぼす場合がある。このため、制御部８０では、画像処理装置１００から指示された冷却温度に基づいて冷却素子９０を制御し、撮像素子８８を冷却する。

＜光源（落射光源）＞

図４には被写体配置部４０近傍の中空部２１の内部構造が示されている。被写体配置部４０上の被写体ＰＳに励起光を照射する落射光源５０は、図６に示す構造とされている。

すなわち、基板１５０上に二次元配列された、少なくとも２種類の、主波長の異なるＬＥＤ１５２からなるＬＥＤアレイ１５６（図６（Ａ））を、使用される蛍光色素に応じた波長を含む励起光を透過する単一のバンドパスフィルタ１５４が覆う形状とされている（図６（Ｂ））。

これにより図６に示すように、例えば近紫外線領域（２００〜３８０ｎｍ）のうち主として３６５ｎｍ近傍に主波長成分をもつＬＥＤ１５２ＵＶと、４６０ｎｍ近傍の青色可視光領域に主波長成分をもつＬＥＤ１５２ＢＬとが、例えば千鳥配列や１列毎に交互に配列される等の二次元配列とされ、各のＬＥＤ１５２から発せられた光は、個々のＬＥＤ１５２の分光特性に合わせず単一フィルタとして設けられたバンドパスフィルタ１５４を透過した光が被写体ＰＳに照射される。なお、ＬＥＤ１５２ＵＶは必要に応じて３１２ｎｍに主波長成分をもつものとしてもよい。

またＬＥＤ１５２ＵＶとＬＥＤ１５２ＢＬとはそれぞれ単独で発光させることもできる構成としてもよい。

ここで、バンドパスフィルタ１５４は単一のフィルタであり、例えば撮影者が交換した被写体ＰＳに使用している蛍光色素の種類が複数あったとしても、フィルタ交換や光源ユニット交換などは必要とされない。

前述のように従来の蛍光分析装置においては、使用する蛍光色素によって光源ユニットや励起フィルタを交換する作業は作業者（撮像者）に余計な手間を強いるものとなっていた。

すなわち、従来は青色領域を透過し、５００ｎｍ以上の波長はカットしたい場合であれば、図７（Ａ）に示すような分光透過率（白矢印）をもつブルーバンドパスフィルタを用いて青色光のみを被写体ＰＳに照射する構成が用いられていた。

また、紫外領域を透過し、４００ｎｍ以上の波長はカットしたい場合であれば、図７（Ｂ）に示すような分光透過率（白矢印）をもつ紫外線透過フィルタを用いて紫外光のみを被写体ＰＳに照射する構成が用いられていた。

これに対して本実施形態においては、紫外線領域に主波長成分をもつＬＥＤ１５２ＵＶと、青色の可視光領域に主波長成分をもつＬＥＤ１５２ＢＬとが二次元配列され紫外領域と青領域とをそれぞれ点灯可能とされている。

あるいは３種類以上のＬＥＤを基板１５０上に配置し、さらに多種類の蛍光染料に対応する構成とされていてもよく、あるいは可視光線同士の組み合わせ、紫外線同士の組み合わせでもよい。これにより吸収波長の異なる複数種類の蛍光染料を組み合わせて使用する場合でも、バンドパスフィルタ１５４の選択次第でフィルタ交換が不要となる。

次に励起フィルタとして、例えば３００ｎｍ以短の波長と５００ｎｍ以長の波長をカットし、３００〜５００ｎｍの波長を通す単一のバンドパスフィルタ１５４を光源（ＬＥＤアレイ１５６）上に配する構成とされている。

例として、ＤＮＡの検出によく用いられるＥｔＢｒ（臭化エチジウム）とＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（サイバーグリーン）について以下に述べる。

図１０に示すようにＥｔＢｒの吸収スペクトル（蛍光励起スペクトル）は５００ｎｍ近傍にもピークがあるが、３００〜３７０ｎｍ近傍の紫外線領域にピークが存在する。バンドパスフィルタ１５４は３００〜５００ｎｍの波長を透過するので、紫外線領域に主波長成分をもつＬＥＤ１５２ＵＶからの光はバンドパスフィルタ１５４を透過し、ＥｔＢｒで染色された被写体ＰＳを励起する。

図１１に示すようにサイバーグリーンの吸収スペクトルは５００ｎｍ近傍にピークがあるが、３００〜４００ｎｍ近傍の紫外線〜青色領域にもピークが存在する。バンドパスフィルタ１５４は３００〜５００ｎｍの波長を透過するので、青色領域に主波長成分をもつＬＥＤ１５２ＢＬからの光はバンドパスフィルタ１５４を透過し、サイバーグリーンで染色された被写体ＰＳを励起する。

これにより、ＥｔＢｒで染色した試料とサイバーグリーンで染色した試料の両方を撮影したい場合、両方を単一の落射光源５０で励起することが可能となり、蛍光色素の種類をＥｔＢｒ／サイバーグリーンの間で切り替えても落射光源５０の交換作業は不要とすることができる。

また励起フィルタとしてＬＥＤアレイ１５６上に設けられた単一のバンドパスフィルタ１５４を用いているので、紫外線領域に主波長成分をもつＬＥＤ１５２ＵＶと青色領域に主波長成分をもつＬＥＤ１５２ＢＬとを同時に点灯することもできる。特にＵＶ透過フィルタは可視光フィルタよりも高価なので、本実施形態のように単一のバンドパスフィルタ１５４を使用することにより、安価に落射光源５０を提供することができる。

図１０に示すようにＥｔＢｒの発する蛍光は５００ｎｍ以上、５９０ｎｍ前後をピークとする橙色光であり、一方、図１１に示すようにＳＹＢＲＧｒｅｅｎの発する蛍光は４９０ｎｍ以上、５３０ｎｍ前後をピークとする緑色光なので、光源からの光に含まれる上記蛍光と同じ波長の範囲がバンドパスフィルタ１５４によって除去される。これにより、落射光源５０からの光が試料の発する蛍光に混じることなく、蛍光色素が発した蛍光のみを検出することが可能となる。

同様に、ＥｔＢｒ（臭化エチジウム）とＳＹＢＲＳａｆｅ（サイバーセーフ）について例を挙げると、図１０に示すようにＥｔＢｒの吸収スペクトル（蛍光励起スペクトル）は前述のように３００〜３７０ｎｍ近傍の紫外線領域にピークが存在する。バンドパスフィルタ１５４は３００〜５００ｎｍの波長を透過するので、紫外線領域に主波長成分をもつＬＥＤ１５２ＵＶからの光はバンドパスフィルタ１５４を透過し、ＥｔＢｒで染色された被写体ＰＳを励起する。

図１２に示すようにサイバーセーフの吸収スペクトルは５００ｎｍ近傍にピークがあるが、３００ｎｍ近傍の青色領域にもピークが存在する。バンドパスフィルタ１５４は３００〜５００ｎｍの波長を透過するので、青色領域に主波長成分をもつＬＥＤ１５２ＢＬからの光はバンドパスフィルタ１５４を透過し、サイバーセーフで染色された被写体ＰＳを励起する。

これにより、ＥｔＢｒで染色した試料とサイバーセーフで染色した試料の両方を撮影したい場合、両方を単一の落射光源５０で励起することが可能となり、蛍光色素の種類をＥｔＢｒ／サイバーセーフの間で切り替えても落射光源５０の交換作業は不要とすることができる。

また、図１３に示すような励起／蛍光特性をもつＳＹＢＲＧｏｌｄ（サイバーゴールド）とＥｔＢｒとを蛍光染料に使用した場合においても、サイバーゴールドの吸収スペクトルは５００ｎｍ近傍にピークがあるが、３００ｎｍ近傍の青色領域にもピークが存在する。バンドパスフィルタ１５４は３００〜５００ｎｍの波長を透過するので、青色領域に主波長成分をもつＬＥＤ１５２ＢＬからの光はバンドパスフィルタ１５４を透過し、サイバーゴールドで染色された被写体ＰＳを励起する。

これにより、ＥｔＢｒで染色した試料とサイバーゴールドで染色した試料の両方を撮影したい場合、両方を単一の落射光源５０で励起することが可能となり、蛍光色素の種類をＥｔＢｒ／サイバーゴールドの間で切り替えても落射光源５０の交換作業は上記と同様に不要とすることができる。

＜検出フィルタ＞

本実施形態においては図２および図５に示すように、検出フィルタ６０（蛍光フィルタ）として、５２０ｎｍ以長の波長を通し、それ以短の波長をカットするフィルタを一つのみ撮像レンズ前に配する。本実施形態ではオレンジ色に着色された低コストのアクリル板を使用しているが、特にこれである必要はなく、カットオフ波長が合っていれば光学ガラスなど他の素材を用いてもよい。

従来、検出フィルタとしては図９に示すように蛍光染料ごとに適した分光特性のフィルタを適宜選択し、蛍光染料を変えれば検出フィルタも交換する必要があった。

すなわち蛍光染料にＥｔＢｒを使用した場合、図９に６０５ＤＦ４０として示すような分光特性のフィルタを用いて励起光をカットする一方、６００ｎｍ近傍にピークをもつ蛍光を透過し、撮像レンズに導く構成とされていた。

また蛍光染料にＳＹＢＲＧｒｅｅｎを使用した場合、図９にＹ５１５-Ｄｉとして示すような分光特性のフィルタを用いて励起光をカットする一方、５５０〜６５０ｎｍ近傍にピークをもつ蛍光を透過し、撮像レンズに導く構成とされていた。この場合、励起側のピークが５００ｎｍであるため、励起光による検出への影響を排するためには５００ｎｍ以下の波長をシャープにカットする特性のフィルタが必要となる。これにより上記２種類の蛍光染料を使い分ける際には検出フィルタもそれぞれ専用のものを使用する必要があり、作業者の負担増加の原因となっていた。

本実施形態においては、検出フィルタ６０としてオレンジ色のアクリル板を使用することで、図８に示すように５２０ｎｍ近傍以長の波長の光を透過し、それより短い波長の光はカットすることで、励起光の影響をカットしつつ、検出に用いられる蛍光は透過させて撮像レンズ３１に入射する構成とされている。

すなわち、励起光源であるＬＥＤアレイ１５６からの励起光が、単一のフィルタであるバンドパスフィルタ１５４を透過し、励起光としてフィルタリングされた光は例えばＥｔＢｒとＳＹＢＲＧｒｅｅｎで染色された被写体ＰＳを照射する。バンドパスフィルタ１５４を透過した励起光はＥｔＢｒとＳＹＢＲＧｒｅｅｎの両方を励起することができるので、そのままフィルタ交換などの手間を要せず検出作業が可能となる。

一方で被写体ＰＳからの光には、検出に必要な蛍光以外に励起光の反射成分も含まれるが、検出フィルタ６０によって紫外領域と青領域とからなる励起光が除去されるので、撮像レンズ３１には検出すべき蛍光のみが入射する。

これにより作業者（撮像者）は、複数種類の蛍光色素を使い分ける際、いずれの蛍光色素を用いても、それを意識することなくフィルタや光源ユニットなど何等の交換操作を行うことなく、正しく作業することができる。

すなわち、ＥｔＢｒを蛍光染料に使用した試料に対して従来は主波長３１２ｎｍあるいは３６５ｎｍのＵＶで励起、中心波長６０５ｎｍ・透過波長幅４０ｎｍの干渉フィルタで検出を行い、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎを蛍光染料に使用した試料に対しては主波長４６０ｎｍの青色光で励起、５１５ｎｍにおける透過率約５０％のロングパスフィルタで検出していた場合を考える。

このとき本実施形態ではＬＥＤ１５２ＵＶとＬＥＤ１５２ＢＬとを図６のように二次元配列したＬＥＤアレイ１５６を光源に使用し、バンドパスフィルタ１５４として、例えば図７（Ａ）に示すような分光特性の青色ガラスフィルタを用いて、ＬＥＤ１５２ＵＶとＬＥＤ１５２ＢＬとを同時点灯させて被写体ＰＳを励起する。

検出フィルタ６０としては前述のように図８に示す分光透過率をもつ厚さ３ｍｍのオレンジ色のアクリル板を使用し、検出を行ったところ、ＥｔＢｒもＳＹＢＲＧｒｅｅｎもそれぞれ単独で、あるいは同時に蛍光検出可能であるという実験結果が得られている。

＜ＬＥＤの色別配列＞

図６（Ａ）（Ｂ）に示されるように、基板１５０上に二次元配置されたＬＥＤアレイ１５６は、例えば紫外線領域に主波長成分をもつＬＥＤ１５２ＵＶと、青色の可視光領域に主波長成分をもつＬＥＤ１５２ＢＬとが、例えば千鳥配列や１列毎に交互に配列される等の二次元配列とされている。

このとき、本願発明に係るＬＥＤの色別配列は被写体ＰＳとの距離によってＬＥＤ１５２の種類別の比率を変える構成とする。すなわち図１４に示されるように、被写体ＰＳに近い（図中では下）ほどＬＥＤ１５２ＵＶの比率を大きくする構成となる。

一般的に紫外線ＬＥＤは可視光ＬＥＤに比較して光量が少ないため、ＬＥＤ１５２ＵＶを可視光のＬＥＤと同じ割合で配列すると、相対的に紫外線の光量が不足する。このため紫外域に吸収ピークをもつ蛍光染料を効率的に励起するには、紫外線の光量を確保する必要がある。

基板１５０上において、単純にＬＥＤ１５２ＵＶの個数を被写体ＰＳ近傍で増加させてもよいが、台形や三角形など標準的でない形状の基板が必要となるか、基板上のＬＥＤ１５２の配列密度を被写体ＰＳからの距離で変化させるなど、コストや工数の増加する原因ともなり得る。本実施形態のように二次元配列されたＬＥＤ１５２の内訳を被写体ＰＳからの距離に応じて変化させればコストやスペース効率を悪化させずに紫外線の光量を確保することができる。

逆に、基板１５０の形状やＬＥＤの配置方法を工夫することで被写体ＰＳに近い側に光量の少ないＬＥＤを多く配置する構成としてもよい。上記のように台形や三角形などの形状の基板を用いるか、基板上のＬＥＤ１５２の配列密度を被写体ＰＳに近いほど密にするなどの方法で被写体ＰＳに近い側のＬＥＤ個数を多くすることで、光量の少ないＬＥＤの光量を確保することもできる。

また紫外線ＬＥＤを用いず可視光線を照射するＬＥＤ同士であっても、あるいは紫外線ＬＥＤ同士であっても、光量の大小によっては被写体ＰＳからの距離に応じて基板１５０上でＬＥＤの種類別に比率を変える構成とされていてもよい。すなわち光量の少ないＬＥＤは被写体ＰＳに近いほど個数を多くすることで光量を確保することができる。

さらに３種類以上のＬＥＤを基板１５０上に配列する際にも、これと同様に光量の少ないＬＥＤを被写体ＰＳに近いほど多く配置することで光量を確保することができる。

＜まとめ＞

以上説明したように、本実施形態においては、基板上に二次元配列された少なくとも２種類のＬＥＤから照射される光が、単一の励起フィルタを透過する構成としたため、以下のような効果を奏する。

すなわち、作業者が励起フィルタおよび光源部を交換する手間が不要となり、また安価に複数の蛍光染料を励起させることが可能であり、かつ各ＬＥＤ間の照射光量や照射指向性について厳密に統一する必要がないので製造工数を少なくでき、また単一のロングパスフィルタを検出用として用いることで、安価に複数の蛍光染料を検出することができる。

また、単一の検出用ロングパスフィルタを、波長５２０ｎｍ以下をカットする橙色透明の安価な着色アクリル板としたことで、安価に複数の蛍光染料を検出することができる。

さらに、３１２ｎｍあるいは３６５ｎｍを主波長成分とする近紫外線ＬＥＤと、４７０ｎｍを主波長成分とする青色ＬＥＤとを基板上に二次元配列し、単一の励起フィルタとして近紫外から青色帯を透過するバンドパスフィルタを用いたことにより、紫外線ＬＥＤで代表的な蛍光染料であるＥｔＢｒを励起し、青色ＬＥＤでは例えばＳＹＢＲＧｒｅｅｎを励起できるので、それぞれを各個にあるいは同時に検出することができる。

＜その他＞

以上、本発明の実施例について記述したが、本発明は上記の実施例に何ら限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々なる態様で実施し得ることは言うまでもない。

例えば、上記実施形態では２種類のＬＥＤ１５２を同一の基板１５０上に二次元配列する構成を例に挙げたが、これに限定せず例えば３種類以上のＬＥＤ光源を用いて本発明の実施形態が適用される機構とされていてもよい。

１撮影システム
１０撮影装置
２０筐体
２１中空部
２２蓋
３０撮影部
３１撮像レンズ
４０被写体配置部
５０落射光源
６０検出フィルタ（検出用ロングパスフィルタ）
１００画像処理装置
１５０基板
１５２ＬＥＤ
１５４バンドパスフィルタ（励起フィルタ）
１５６ＬＥＤアレイ（ＬＥＤ光源）

Claims

少なくとも２種類の、主波長の異なる励起用のＬＥＤが基板上に二次元配列されたＬＥＤ光源と、
被写体を撮影する撮像レンズと、
前記ＬＥＤ光源と前記被写体との間に設けられ、前記ＬＥＤ光源の各主波長成分を透過させる単一の励起フィルタと、
前記撮像レンズと前記被写体の間に設けられた単一の検出用ロングパスフィルタと、を備え、
前記ＬＥＤはそれぞれ３１２ｎｍあるいは３６５ｎｍを主波長成分とする近紫外線ＬＥＤと、４７０ｎｍを主波長成分とする青色ＬＥＤであり、前記単一の励起フィルタは近紫外から青色帯を透過するバンドパスフィルタであり、
前記ＬＥＤ光源は、単位面積あたりの前記近紫外線ＬＥＤの個数が、前記被写体からの距離が近いほど多くなるように基板上に二次元配列された蛍光分析装置。
前記検出用ロングパスフィルタは波長５２０ｎｍ以下をカットする橙色透明のアクリル板であることを特徴とする請求項１に記載の蛍光分析装置。
前記バンドパスフィルタは３００ｎｍ以下および５００ｎｍ以上をカットし、４００ｎｍ近傍に透過ピークをもつことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の蛍光分析装置。
前記バンドパスフィルタは２６０ｎｍ以下および４００ｎｍ以上をカットし、３３０ｎｍ近傍に透過ピークをもつことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の蛍光分析装置。
基板上に二次元配列された、少なくとも２種類の主波長の異なる励起用のＬＥＤと、前記ＬＥＤをカバーしそれぞれの主波長成分を透過させる単一の励起フィルタを備えた光源部で、最大吸収波長の異なる少なくとも２種類の蛍光物質を励起し、
前記ＬＥＤはそれぞれ３１２ｎｍあるいは３６５ｎｍを主波長成分とする近紫外線ＬＥＤと、４７０ｎｍを主波長成分とする青色ＬＥＤであり、前記単一の励起フィルタは近紫外から青色帯を透過するバンドパスフィルタであり、
前記ＬＥＤ光源は、単位面積あたりの前記近紫外線ＬＥＤの個数が、前記被写体からの距離が近いほど多くなるように基板上に二次元配列され、
検出用フィルタとして撮像レンズと前記被写体の間に設けられた単一のロングパスフィルタを通して前記蛍光物質の放つ蛍光を検出する蛍光分析方法。
前記蛍光物質はEtBrおよびSYBR Greenで染色されていることを特徴とする請求項５に記載の蛍光分析方法。
前記蛍光物質はEtBrおよびSYBR Safeで染色されていることを特徴とする請求項５に記載の蛍光分析方法。
前記蛍光物質はEtBrおよびSYBR Goldで染色されていることを特徴とする請求項５に記載の蛍光分析方法。