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CN102083968A - 通过使用小分子调节剂诱导复能基因而重编程细胞 - Google Patents

通过使用小分子调节剂诱导复能基因而重编程细胞 Download PDF

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CN102083968A
CN102083968A CN2009801214058A CN200980121405A CN102083968A CN 102083968 A CN102083968 A CN 102083968A CN 2009801214058 A CN2009801214058 A CN 2009801214058A CN 200980121405 A CN200980121405 A CN 200980121405A CN 102083968 A CN102083968 A CN 102083968A
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reprogrammed
reactivation
gene
inhibitor
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CN2009801214058A
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K·J·埃勒特森
瑞秋·A·帕沃尔
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NuPotential Inc
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Abstract

本发明涉及用于重编程细胞的方法、组合物和试剂盒。在一个实施方案中，本发明涉及包括诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因的表达的方法。在又一个实施方案中，方法包括将细胞暴露于诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因的表达的小分子调节剂。在又一个实施方案中，本发明涉及能够具有ES样细胞的特征，能够再分化或转分化为各种分化的细胞类型的重编程的细胞以及富集的重编程的细胞群。

Description

通过使用小分子调节剂诱导复能基因而重编程细胞
相关专利申请的交叉引用
本申请是2006年8月1日提交的美国专利申请第11/497,064号的部分继续申请，它根据第35U.S.C.§119(e)要求2005年8月1日提交的美国临时专利申请第60/704,465号的权益，并且还根据35U.S.C.§119(e)要求2008年4月7日提交的美国临时专利申请第61/043,066号；2008年4月7日提交的美国临时专利申请第61/042,890号；2008年4月7日提交的美国临时专利申请第61/042,995号和2008年11月12日提交的美国临时专利申请第61/113,971号的权益，它们每一个都以引用方式并入本文，就如将其全文列出一样。
发明领域
本发明的实施方案涉及细胞生物学、干细胞、细胞分化、体细胞核转移和基于细胞的治疗学的领域。更具体地，本发明的实施方案涉及用于重编程细胞以及基于细胞的治疗法的方法、组合物和试剂盒。
发明背景
再生医学作为用于许多人类疾病的治疗具有巨大的前景，但也带来一些在现代科学研究中面临的最困难的技术挑战。对再生医学的技术挑战包括低的克隆效率，潜在复能组织的供应不足，以及对于如何控制细胞分化和哪种类型的胚胎干细胞能被用于所选的治疗的知识的普遍缺乏。尽管ES细胞具有极大的可塑性，但是未分化的ES细胞能够形成含有组织类型的混合物的畸胎瘤(良性肿瘤)。此外，从一种来源向另一种来源移植ES细胞将可能需要施用药物来防止新细胞的排斥。
已经进行了尝试来鉴定由非胎儿源的组织产生干细胞的新途径。一种方法包括操纵自体的成体干细胞。使用自体的成体干细胞用于再生医学的优势在于它们来源于且返回至同一患者，并且因此不经受免疫介导的排斥反应的事实。主要的缺点是这些细胞缺少ES细胞的可塑性和复能性，并因此它们的潜能是不确定的。另一种方法旨在将来自成体组织的体细胞重编程以产生复能的ES样细胞。然而，这种方法是困难的，因为多细胞生物体中的每种细胞类型具有独特的表观遗传学标记，认为在细胞分化后或从细胞周期中退出后该标记便是固定的。
细胞DNA一般以染色质(一种包含核酸和蛋白质的复合物)的形式存在。事实上，大部分细胞RNA分子还以核蛋白复合物的形式存在。如本领域技术人员已知的，染色质的核蛋白结构已经是广泛研究的对象。一般而言，染色体DNA被包装成核小体。核小体包含核心和连接区。核小体核心包含核心组蛋白(H2A、H2B、H3和H4各二个)八聚体，约150个碱基对的染色体DNA缠绕在该八聚体周围。此外，约50个碱基对的连接区DNA区段与连接区组蛋白H1缔合。核小体被组织成更高阶的染色质丝并且染色质丝被组织成染色体。参见，例如，Wolffe“chromatin：Structure and Function(染色质：结构和功能)”第3版，Academic Press，San Diego，1998。
染色质的结构不是静态的，而是易于被统称为染色质重建的过程修饰。染色质重建可用于，例如：从DNA区去除核小体；将核小体从一个DNA区移到另一个DNA区；改变核小体之间的间距；或将核小体添加至染色体中的DNA区中。染色质重建也能导致更高阶结构的改变，从而影响转录活性的染色质(开放染色质或常染色质)和无转录活性的染色质(闭合的染色质或异染色质)之间的平衡。
染色体蛋白易受许多类型的化学修饰影响。这些核心组蛋白的翻译后修饰的一种机制是高度保守的碱性N-末端赖氨酸残基的ε-氨基的可逆的乙酰化。组蛋白乙酰化的稳态通过竞争性的组蛋白乙酰转移酶和组蛋白脱乙酰酶(本文称为HDAC)之间的动态平衡而建立。早已将组蛋白的乙酰化和脱乙酰化与转录的控制相联系。组蛋白的可逆的乙酰化能导致染色质重建并且如此可以充当基因转录的控制机制。总的来说，组蛋白的高度乙酰化有利于基因的表达，然而组蛋白的脱乙酰化与转录阻抑有关。据显示组蛋白乙酰转移酶充当转录的辅激活蛋白，然而发现脱乙酰酶属于转录阻抑途径。
组蛋白乙酰化和组蛋白脱乙酰化之间的动态平衡对于正常的细胞生长是必不可少的。组蛋白脱乙酰化的抑制导致细胞周期停滞、细胞分化、凋亡和转化的表型的逆转。
牵涉在基因表达的调节中的另一组蛋白是DNA甲基转移酶(DNMT)，其负责引起转录沉默的基因组的甲基化模式的产生。DNA甲基化对于许多哺乳动物的过程包括胚胎发育、X-失活、基因组印记和基因表达的调节是核心性的。哺乳动物中DNA的甲基化通过甲基基团从S-腺苷-甲硫氨酸转移至胞嘧啶的C5位置而实现。这个反应由DNA甲基转移酶催化并对于CpG二核苷酸中的胞嘧啶是特异性的。在人基因组的CpG二核苷酸中所有胞嘧啶的百分之七十(70％)是甲基化的并易于脱氨基，导致胞嘧啶向胸腺嘧啶转变。这个过程引起鸟嘌呤和胞嘧啶的频率全面下降至所有核苷酸的约40％，并引起CpG二核苷酸的频率进一步下降至它们的预期频率的约四分之一。
在哺乳动物中已经鉴定了四种活性DNA甲基转移酶。它们被命名为DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B。另外，DNMT3L是结构上与DNMT3A和DNMT3B紧密相关的蛋白，且对DNA甲基化是至关重要的，但单独的DNMT3L表现为是失活的。在含有CpG岛的启动子区中的胞嘧啶的甲基化引起脊椎动物细胞中下游编码序列的转录失活。
称为甲基-CpG结合蛋白(MBD 1至MBD 4)的蛋白家族被认为在甲基化介导的转录沉默中起重要作用。MeCP2是这个家族被鉴定的第一个成员且含有甲基-CpG结合结构域(MBD)和转录阻抑结构域(TRD)，MeCP2有利于与甲基化的DNA的相互作用并将Sin3A/HDAC复合物靶向甲基化的DNA。像MeCP2一样，MBD1、MBD2和MBD3已显示是有效的转录阻抑剂。MBD4是修复G:T错配的DNA糖基化酶。除MBD3之外，该家族的每个成员在哺乳动物细胞中与甲基化的DNA形成复合物，而且除MBD1和MBD4之外的所有成员都位于已知的染色质重建复合物中。Mi-2复合物结合DNA甲基化作用使染色质重建和组蛋白脱乙酰。
牵涉在表观遗传学调节中的另一组蛋白是组蛋白甲基转移酶(HMT)，组蛋白甲基转移酶是催化一个至三个甲基基团从辅因子S-腺苷甲硫氨酸转移至组蛋白的赖氨酸残基和精氨酸残基的酶组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶和组蛋白精氨酸N-甲基转移酶。甲基化的组蛋白与DNA更紧密地结合，这抑制转录。
染色质的结构也能够通过称为染色质重建复合物的高分子组件的活性而改变。参见，例如，Cairns(1998)Trends Biochem.Sci.23：20 25；Workman等.(1998)Ann.Rev.Biochem.67：545 579；Kingston等.(1999)Genes Devel.13：2339 2352及Murchardt等.(1999)J.Mol.Biol.293：185 197。染色质重建复合物参与核小体阵列的断裂或重新形成，导致转录的调节、DNA的复制和DNA的修复(Bochar等.(2000)PNAS USA 97(3)：1038 43)。虽然这些染色质重建复合物中的许多具有不同的亚基组成，但都依赖于ATPase酶的重建活性。体内也有需要染色质重建复合物的活性以活化基因的几个实例。
复能细胞或全能细胞发育为分化的、特化的表型由在发育期间表达的特定组的基因决定。基因表达由能实现正调节或负调节的基因调节蛋白的序列特异性结合直接介导。然而，这些调节蛋白的任一种直接介导基因表达的能力至少部分地取决于它们在细胞DNA内的结合位点的可接近性。如上文所讨论的，细胞DNA中序列的可接近性通常取决于在其中包装细胞DNA的细胞染色质的结构。
因此，鉴定能够诱导复能性所需要的基因的表达的方法、组合物和试剂盒，包括能够抑制参与阻抑转录的蛋白的活性的方法、组合物和试剂盒是有用的。
发明简述
本发明涉及用于重编程细胞的方法、组合物和试剂盒。本发明的实施方案涉及包括诱导复能基因或多能基因的表达的方法。在又一个实施方案中，本发明还涉及产生重编程的细胞。在还一个实施方案，本发明涉及包括抑制参与阻抑转录的蛋白的活性的方法。在又一个实施方案中，本发明涉及一种用于重编程细胞的方法，包括改变调节蛋白的活性、表达、或活性和表达二者。方法还包括诱导复能基因或多能基因的表达，及重编程细胞。
本发明的实施方案还涉及重编程细胞的方法，包括：将细胞、细胞群、细胞培养物、来自细胞培养物的细胞亚群、同质细胞的培养物或异质细胞的培养物与抑制参与阻抑转录的蛋白的活性、表达、或活性和表达二者的剂相接触，诱导复能基因或多能基因的表达，以及重编程细胞。方法还包括使重编程的细胞再分化。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于重编程细胞的方法，包括：将细胞暴露于改变调节蛋白的表达、活性、或表达和活性二者的小分子调节剂，诱导复能基因或多能基因的表达，以及筛选细胞，其中所述细胞已经恢复分化潜能。
改变参与阻抑转录的蛋白或者调节蛋白的活性、表达、或活性和表达二者的剂包括但不限于小分子、小分子抑制剂和小分子活化剂。
诱导复能基因或多能基因的表达的剂包括但不限于小分子、小分子抑制剂和小分子抑制剂。
参与阻抑转录的任何蛋白，包括但不限于DNA甲基转移酶、组蛋白脱乙酰酶、甲基结合结构域蛋白、组蛋白甲基转移酶、SWI/SNF复合物的组分、NuRD复合物的组分和INO80复合物的组分，能够被本发明的方法抑制。
在一些实施方案中，至少一种小分子抑制剂能用于抑制DNA甲基转移酶、组蛋白脱乙酰酶、甲基结合结构域蛋白或组蛋白甲基转移酶的活性。在又一个实施方案中，多于一种的小分子抑制剂能用于抑制参与阻抑转录的多于一种蛋白的活性，所述蛋白包括但不限于DNA甲基转移酶、组蛋白脱乙酰酶、甲基结合结构域蛋白或组蛋白甲基转移酶。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种包括以下的方法：将细胞与抑制至少一种DNMT的活性的小分子抑制剂相接触；将至少一个CpG二核苷酸脱甲基；诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因的表达，和重编程细胞。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种包括以下的方法：将具有第一表型的细胞暴露于改变至少一种调节蛋白的活性、表达、或活性和表达二者的小分子调节剂；将细胞的第一表型与将细胞暴露于小分子调节剂之后获得的表型相比较，以及筛选已被重编程的且是复能或多能的细胞。在又一个实施方案中，方法包括：将细胞暴露于小分子调节剂之前的细胞基因型与用小分子调节剂处理之后获得的细胞基因型相比较。在又一个实施方案中，方法包括将细胞暴露于小分子调节剂之前的细胞的表型和基因型与细胞暴露于小分子调节剂之后的细胞的表型和基因型相比较。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于重编程细胞的方法，包括：将细胞暴露于诱导复能基因或多能基因表达的小分子调节剂；以及筛选细胞，其中所述细胞已经恢复分化潜能。在又一个实施方案中，本发明涉及用于重编程细胞的方法，包括：将细胞暴露于改变调节蛋白的表达、活性、或表达和活性二者的小分子调节剂，诱导复能基因或多能基因的表达；以及筛选细胞，其中所述细胞已经恢复分化潜能。
在又一个实施方案中，方法包括将筛选的细胞培养或扩增成细胞群。在另一个实施方案中，方法包括使用与复能基因或多能基因编码的蛋白相结合的抗体或使用与多能标记物或复能标记物相结合的抗体分离细胞，所述多能标记物或复能标记物包括但不限于SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81。在又一个实施方案中，本发明还包括将暴露于所述小分子调节剂之前的复能基因或多能基因的染色质结构与暴露于所述小分子调节剂之后获得的染色质结构相比较。使用有效的用于分离细胞的任何方法也可分离细胞，所述任何方法包括但不限于荧光细胞激活分选仪、免疫组织化学和ELISA。在另一个实施方案中，方法包括筛选具有比原始细胞低的分化状态的细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于重编程细胞的方法，包括：将具有第一转录模式的细胞暴露于诱导复能基因或多能基因表达的小分子调节剂；将细胞的第一转录模式与暴露于所述调节剂之后获得的转录模式相比较；以及筛选细胞，其中所述细胞已经恢复分化潜能。在另一个实施方案中，筛选细胞包括筛选具有比原始细胞低的分化状态的细胞。
在又一个实施方案中，筛选细胞包括：鉴定具有转录模式至少5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-94％、95％或95％-99％类似于分析的胚胎干细胞的转录模式的细胞。不需要比较胚胎干细胞的整个转录模式，尽管这是可以的。反而，可比较的胚胎基因的亚组包括但不限于：1-5个、5-10个、10-25个、25-50个、50-100个、100-200个、200-500个、500-1,000个、1,000-2,000个、2,000-2,500个、2,500-5,000个、5,000-10,000个和多于10,000个基因。可用二元方式比较转录模式，即，可以进行比较来确定基因是转录的还是未转录的。在另一个实施方案中，可以比较每个基因或基因亚组的转录速率和/或程度。能使用本领域已知的任何方法来确定转录模式，所述任何方法包括但不限于RT-PCR、定量PCR、微阵列、DNA印迹和杂交。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于重编程细胞的方法，包括：将细胞暴露于干扰第一调节蛋白的活性、表达、或活性和表达二者的小分子调节剂；将所述细胞暴露于抑制第二调节蛋白的活性、表达、或表达和活性二者的第二剂，其中所述第二调节蛋白具有与第一调节蛋白不同的功能；诱导复能基因或多能基因的表达；以及筛选细胞，其中所述细胞已经恢复分化潜能。在另一个实施方案中，细胞或细胞群可同时或相继地暴露于第一剂和第二剂。第二剂包括但不限于小分子、小分子抑制剂、小分子活化剂、核酸序列、和shRNA构建体。
本发明的实施方案也包括使用根据本文公开的方法产生的重编程的细胞来治疗多种疾病的方法。在又一个实施方案中，本发明也涉及重编程的细胞和已再分化的重编程的细胞的治疗用途。
本发明的实施方案也涉及通过本发明的方法产生的重编程的细胞。重编程的细胞能够再分化成单一的谱系或多于一种谱系。重编程的细胞能够是多能的或复能的。
在又一个实施方案中，本发明涉及根据包括下列步骤的方法产生的富集的重编程的细胞群：将细胞暴露于诱导复能基因或多能基因表达的小分子调节剂；以及筛选细胞，其中多数细胞已恢复分化潜能，并培养所述筛选的细胞以产生细胞群。在又一个实施方案中，重编程的细胞表达选自由以下组成的组的细胞表面标记物：SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81。在又一个实施方案中，重编程的细胞占富集的细胞群的至少5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-95％、96％-98％；或至少99％。
本发明的实施方案也涉及用于制备本发明的方法和组合物的试剂盒。试剂盒尤其能够用于重编程细胞和产生ES-样细胞和干细胞样细胞。
附图简述
图1是报道用DNMT抑制剂(500μM RG108)处理的原代人肺成纤维细胞中的Oct-4和Nanog的上调的柱状图。MC是对照培养基。
图2是报道在VPA的存在下，在几种细胞类型中的几种复能基因的表达增加的柱状图。HDFa指的是成人皮肤成纤维细胞；HDFf指的是人胎儿皮肤成纤维细胞；HDFn指的是人新生儿皮肤成纤维细胞；且BJF指的是BJ成纤维细胞(包皮)。
图3是报道用在VPA处理的成人皮肤成纤维细胞和人胎儿皮肤成纤维细胞中对HDAC11和HDAC9表达的效应的柱状图。
图4是报道用烟酰胺处理4天的成人皮肤成纤维细胞中的Oct-4的表达增加的柱状图。
图5是报道用苯基丁酸钠处理4天的成人皮肤成纤维细胞中的Oct-4的表达增加的柱状图。
图6是报道用valproxam处理4天的成人皮肤成纤维细胞中的Oct-4的表达增加的柱状图。
图7是报道用2-PCPA(组蛋白/赖氨酸1脱甲基酶抑制剂)处理8天的BJ成纤维细胞中的Oct-4的表达增加的柱状图。
图8A是在成纤维细胞生长培养基中的成人皮肤成纤维细胞的照片。
图8B是在DMEM/F12培养基中的成人皮肤成纤维细胞的照片。
图8C是在基质胶上的mTeSR hES细胞培养基中的VPA处理的(500μM)的成人皮肤成纤维细胞的照片。
图8D是在基质胶上的mTeSR hES细胞培养基中的VPA处理的(500μM)的成人皮肤成纤维细胞的照片。
优选实施方案的详述
定义
除非另外指明，否则在本公开内容中的数值范围是近似的，并因此可包括该范围之外的值。数字范围包括来自以一个单位递增的下限值和上限值之间的所有值并且包括下限值和上限值，前提条件是在任何下限值和任何上限值之间存在至少两个单位的分隔。作为实例，如果组分性质、物理性质或其它性质诸如，例如分子量、熔化指数、温度等是100至1,000，则旨在清楚地列举所有单个的值例如100、101、102等和子范围例如100至144、155至170、197至200等。对于含有少于1的值或含有大于1的分数数字(例如1.1、1.5等)的范围，一个单位视情况被认为是0.0001、0.001、0.01或0.1。对于含有少于10的单数字的范围(例如，1至5)，通常认为一个单位是0.1。这些仅是具体旨指的范围的实例，且认为在列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能的组合在本公开内容中清楚地陈述。在本公开内容中尤其提供的数字范围是混合物中组分的相对量和方法中所引用的各种温度以及其他参数范围。
除非明确地限制为相反情况，否则“细胞”(“cell”或“cells”)包括任何体细胞、胚胎干(ES)细胞、成体干细胞、器官特异性干细胞、核转移(NT)单位和干样细胞。细胞能够从任何器官或组织中获得。细胞能够是人或其它动物的。例如，细胞能够是小鼠的、豚鼠的、大鼠的、牛的、马的、猪的、绵羊的、山羊的等。细胞也能够来自非人灵长类。
“培养基”或“生长培养基”指的是能够支持细胞生长的合适的培养基。
“分化”指的是细胞在胚胎发育期间变得结构和功能特化的过程。
“DNA甲基转移酶抑制剂”和“DNA甲基转移酶的抑制剂”指的是能够与DNA甲基转移酶相互作用且抑制DNA甲基转移酶的活性的化合物。“抑制DNA甲基转移酶活性”指的是降低DNA甲基转移酶甲基化特定底物诸如CpG二核苷酸序列的能力。在一些实施方案中，DNA甲基转移酶活性的这种降低是至少约25％至少约50％，在另外的实施方案中是至少约75％，且在其它的实施方案中是至少约90％。在又一个实施方案中，DNA甲基转移酶活性降低至少95％且在另一个实施方案中降低至少99％。
“表观遗传学”指的是关于功能上可遗传的改变而无核苷酸序列改变的DNA状态。表观遗传学改变能够由DNA的修饰诸如由甲基化或由脱甲基化引起，而无在DNA的核苷酸序列上的任何改变。
“组蛋白”指的是在染色体中发现的负责压缩DNA足以使DNA适于在细胞核中的一类蛋白分子。
“敲低(Knock down)”指的是以基因特异的方式阻抑基因的表达。具有一个或多个被“敲低”的基因的细胞被称为敲低的机体或仅仅为“敲低”。
“复能”指的是能够分化成3种胚层细胞类型或基本组织类型。
“复能基因”指的是促使细胞为复能的细胞的基因。
“复能细胞培养物”当展现与胚胎来源或成体来源的分化细胞明显区分它们的形态时被称为是“大体上未分化的”。复能细胞通常具有高的核/质比、突起的核仁、以及具有难以辨认的细胞连接的致密的集落形成，且易于被本领域技术人员识别。认识到未分化细胞集落能被分化的邻近细胞环绕。然而，当在适当的情况下培养时，大体上未分化的细胞集落将继续存在，并且在分离培养的细胞后，未分化的细胞组成细胞的主要部分。在本公开内容中描述的有用的细胞群含有任何比例的具有这些标准的大体上未分化的复能细胞。大体上未分化细胞培养物可含有约20％、40％、60％或甚至80％的未分化的复能细胞(以群中所有细胞的百分比计)。
“调节蛋白”指的是调节生物学过程的任何蛋白，包括正向调节和负向调节。调节蛋白能够对生物学过程具有直接的或间接的影响，并能直接地发挥作用或者通过参与复合物中发挥作用。
“重编程”指的是移除核中的表观遗传学标记，然后建立不同组的表观遗传学标记。在多细胞生物体的发育期间，不同的细胞和组织获得不同的基因表达程序。这些不同的基因表达模式表现为实质上由诸如DNA甲基化、组蛋白修饰和其他染色质结合蛋白等表观遗传学修饰调节。因此多细胞生物体中的每种细胞类型具有独特的表观遗传标志，通常认为该标志在细胞分化后或退出细胞周期后会变成“固定的”且不变的。但是，一些细胞在正常发育或某些疾病期间，进行主要的表观遗传学的“重编程”。
“小分子调节剂”指的是涵盖为小分子抑制剂或小分子活化剂的化合物。小分子调节剂可以在一些生理环境中起小分子抑制剂的作用且在另外的生理环境中起小分子活化剂的作用。小分子调节剂对于一个靶点可起小分子抑制剂的作用且对于另一个靶点可起小分子活化剂的作用。同一小分子调节剂可既起小分子活化剂的作用又起小分子抑制剂的作用。
“全能”指的是能够发育成完整的胚胎或完整的器官。
本发明的实施方案涉及包括诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因的表达的方法。在一些实施方案中，方法诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因的表达；且产生能够定向分化为至少一种谱系的重编程的细胞。
本发明的实施方案还涉及包括下列的方法：修饰染色质结构，和重编程细胞为复能或多能的。在又一个实施方案中，修饰染色质结构包括使用小分子调节剂以改变参与调节转录的至少一种调节蛋白的活性。
在又一个实施方案中，修饰染色质结构包括使用小分子抑制剂以抑制参与阻抑转录的至少一种蛋白的活性。
本发明的实施方案也涉及包括修饰促使细胞为复能或多能的基因的启动子区域或上游DNA序列的方法。在又一个实施方案中，修饰启动子的结构或上游DNA序列包括使用小分子调节剂以改变参与转录的至少一种调节蛋白的活性、表达、或活性和表达二者。
在另一个实施方案中，本发明涉及包括使用小分子调节剂以改变参与转录的至少一种调节蛋白的活性、表达、或活性和表达二者，并诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因的表达的方法。在又一个实施方案中，方法包括抑制至少一种DNA甲基转移酶的活性并产生重编程的细胞。
在又一个实施方案中，方法包括使用小分子抑制剂以抑制至少一种DNA甲基转移酶的活性，将CpG二核苷酸中的至少一种胞嘧啶脱甲基，并诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因的表达。
在另一个实施方案中，方法包括将细胞与小分子抑制剂相接触；抑制参与阻抑转录的至少一种蛋白的活性；以及诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因的表达。在又一个实施方案中，方法还包括产生重编程的细胞。该重编程的细胞能够是复能或多能的。
在又一个实施方案中，本发明涉及用于重编程细胞的方法，该方法包括：将细胞暴露于诱导复能基因或多能基因的表达的小分子调节剂；以及筛选细胞，其中所述细胞已经恢复分化潜能。在又一个实施方案中，本发明涉及用于重编程细胞的方法，该方法包括：将细胞暴露于改变至少一种调节蛋白的活性、表达、或活性和表达二者的小分子调节剂，诱导复能基因或多能基因的表达，以及筛选细胞，其中所述细胞已经恢复分化潜能。复能或多能基因可被诱导以任何倍数增加表达，包括但不限于0.25-0.5、0.5-1、1.0-2.5、2.5-5、5-10、10-15、15-20、20-40、40-50、50-100、100-200、200-500和大于500。在另一个实施方案中，方法包括铺板分化的细胞，将所述分化的细胞暴露于小分子调节剂，培养所述细胞，及鉴定已经被重编程的细胞。
在另一个实施方案中，改变调节蛋白的活性、表达、或表达和活性二者能够引起调节蛋白活性的增加，调节蛋白表达的增加，调节蛋白活性的降低或调节蛋白表达的降低。调节蛋白的活性或表达能够增加或降低任何的量，包括但不限于1％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-95％、及95％-99％、99％-200％、200％-300％、300％-400％、400％-500％和大于500％。
在又一个实施方案中，方法还包括使用针对由复能基因或多能基因编码的蛋白或蛋白片段的抗体或针对复能标记物或多能标记物的抗体来筛选细胞。能够使用任何类型的抗体，包括但不限于：单克隆、多克隆、抗体片段、模拟肽、活性区的抗体、及蛋白的保守区的抗体。在又一个实施方案中，方法包括筛选细胞及扩增或培养所述细胞为复能细胞培养物。
在又一个实施方案中，方法还包括使用由复能基因或多能基因驱动的报道分子或复能表面标记物或多能表面标记物来筛选细胞。能够使用任何类型的报道分子，包括但不限于：荧光蛋白、绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、细菌萤光素酶、水母发光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、dsRED、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。
在又一个实施方案中，方法还包括使用下列的抗性作为选择标记物来筛选细胞，包括但不限于：抗生素抗性、杀真菌剂抗性、嘌呤霉素抗性、潮霉素抗性、二氢叶酸还原酶抗性、胸苷激酶抗性、新霉素抗性(neo)、G418抗性、霉酚酸抗性(gpt)、博来霉素(zeocin)抗性蛋白和链霉素抗性。
在又一个实施方案中，方法还包括将暴露于小分子调节剂之前存在的细胞的复能基因或多能基因的染色质结构与用小分子调节剂处理之后获得的复能基因或多能基因的染色质结构相比较。能够比较染色质结构的任何方面，包括但不限于：常染色质、异染色质、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白或组蛋白组分的存在和不存在、组蛋白的位置、组蛋白的排列、及与染色质缔合的调节蛋白的存在或不存在。可比较基因的任何区域的染色质结构，包括但不限于：增强子元件、激活子元件、启动子、TATA盒、转录起始位点的上游区域、转录起始位点的下游区域、外显子和内含子。
小分子抑制剂或“小分子化合物”指的是在本发明的方法、组合物、和试剂盒中有用的具有可测量的活性或抑制活性的化合物。在一些实施方案中，小分子抑制剂具有不多于1000D的相对分子量，且在还一个方案中不多于500D。小分子抑制剂能够是有机性质的或无机性质的。除小有机化合物和小无机化合物外，预期肽、抗体、环肽和模拟肽也可用于本公开的方法中。
小分子调节剂可以是包含在小分子文库中的任何化合物或衍生于包含在小分子文库中的化合物的修饰的化合物。几种小分子文库可从包括但不限于BIOMOL INTERNATIONAL(现称Enzo Life Sciences)的商业来源供应，并包括但不限于：生物活性脂质文库、内源性大麻素文库、脂肪酸文库、ICCB已知的生物活性体文库、离子通道配体文库、激酶抑制剂文库、激酶/磷酸酶抑制剂文库、神经递质文库、天然产物文库、核受体文库、孤儿配体文库、蛋白酶抑制剂文库、磷酸酶抑制剂文库、和稀有天然产物文库。
小分子抑制剂能够用于抑制参与阻抑转录的任何蛋白，包括但不限于：组蛋白脱乙酰酶(HDAC)、甲基结合结构域蛋白(MBD)、甲基腺苷基转移酶(MAT)、DNA甲基转移酶(DNMT)、组蛋白甲基转移酶和甲基循环酶。
优选地，这样的抑制是特异性的，即，对于DNMT小分子抑制剂，DNMT抑制剂以比产生另一种不相关的生物学效应所需要的抑制剂浓度低的浓度来降低DNA甲基转移酶甲基化特定底物的能力或降低DNA甲基转移酶与甲基化需要的另一种组分相互作用的能力。优选地，DNA甲基转移酶的抑制活性需要的抑制剂的浓度比产生不相关的生物学效应需要的浓度低至少2倍、更优选地低至少5倍、甚至更优选地低至少10倍、且最优选地低至少20倍。
任何数量、任何组合和任何浓度的小分子调节剂能够用于改变参与转录调节的一种蛋白或多于一种蛋白的活性、表达、或活性和表达二者，包括但不限于：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11-15、16-20、21-25、25-50、50-100、100-250和多于250种蛋白。小分子调节剂能够针对一种特定的蛋白或多于一种蛋白、一类具体的蛋白或多于一类蛋白、一个具体的蛋白家族或多于一个蛋白家族或通用转录组分。
小分子调节剂可具有不可逆的作用机制或可逆的作用机制。小分子调节剂能具有任何的结合亲和力，包括但不限于：毫摩(mM)、微摩(μM)、纳摩(nM)、皮摩(pM)和分摩(fM)。小分子调节剂能够与蛋白的调节区或催化区结合。
表I中提供了可被本发明的方法抑制的蛋白的代表性列表。
表I.参与阻抑转录的蛋白的代表性列表
Figure BPA00001272827500151
例如，甲基结合结构域蛋白，例如MeCP2，与甲基化的胞嘧啶结合并募集组蛋白脱乙酰酶，之后将组蛋白脱乙酰基，导致凝聚的染色质结构，而凝聚的染色质结构抑制转录。本发明的方法能够抑制参与阻抑转录的蛋白并藉此诱导复能基因的转录。
因此，基于阻抑复合物的以上代表性描述，小分子抑制剂能够用于抑制MeCP2的活性，藉此显著性降低HDAC募集到染色质结构。这能引起对于细胞为复能或多能的至关重要的基因的上调，并因此增加体细胞中的分化能力。同样地，小分子抑制剂能用于抑制DNMT，这将同样地引起促使细胞为复能或多能的基因的上调。而且，针对DNA甲基转移酶的小分子抑制剂和针对甲基结合蛋白的小分子抑制剂能同时或相继地用于降低包含在阻抑复合物中的至少一种蛋白的活性，这可引起复能基因的诱导，并因此引起细胞的重编程。以上讨论仅是说明性的目的且不应解释为限制本发明的范围。
DNMT小分子抑制剂可与包括但不限于DNMT1、DNMT2、DNMT3A、和DNMT3B、及DNMT3L的任何DNA甲基转移酶相互作用并抑制它们。DNMT1可能是哺乳动物细胞中最丰富的DNA甲基转移酶，并被认为参与维持哺乳动物中的甲基转移酶。DNMT1主要甲基化哺乳动物基因组中半甲基化的CpG二核苷酸。与体外未甲基化的底物相比，DNMT1酶对半甲基化DNA的活性高7-20倍，然而它对从头甲基化比其他DNMT活性还高。DNMT1酶长约1620个氨基酸。前1100个氨基酸构成DNMT1酶的调节结构域，且剩余的残基构成催化结构域。调节结构域和催化结构域由谷氨酸-赖氨酸重复单位连接。DNMT1的催化功能需要这二个结构域。
DNMT2具有与原核细胞和真核细胞二者的5-甲基胞嘧啶甲基转移酶强的序列相似性。DNMT2也已显示将天冬氨酸转运RNA中的第38位点甲基化。
DNMT3是能够以相同的速度将半甲基化的CpG二核苷酸和未甲基化的CpG二核苷酸甲基化的DNA甲基转移酶家族。DNMT3酶的结构类似于DNMT1，具有与催化结构域相连的调节区。DNMT3A和DNMT3B负责在发育期间建立DNA的甲基化模式。DNMT3A蛋白和DNMT3B蛋白在胚胎形成的不同阶段表达。DNMT3B表现为在诸如内层细胞群、外胚层细胞和胚胎外胚层细胞等多能胚胎细胞中表达，而DNMT3A表现为在胚胎10.5天(E10.5)之后同时普遍地表达。
DNMT3L含有DNA甲基转移酶基序并参与建立母体的基因组印迹。DNMT3L也被认为在转录阻抑中发挥作用。
在本发明的方法、组合物和试剂盒中使用的DNMT小分子抑制剂可与DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B或DNMT3L相互作用。DNMT抑制剂可与DNMT的一种类型、DNMT的所有类型、或DNMT的多个类型相互作用，包括但不限于：包括：DNMT1和DNMT2；DNMT1和DNMT3A；DNMT1和DNMT3B；DNMT1和DNMT3L；DNMT2和DNMT3A；DNMT2和DNMT3B；DNMT2和DNMT3L；DNMT3A和DNMT3B；DNMT3A和DNMT3L；DNMT3B和DNMT3L；DNMT1、DNMT2、DNMT3A；DNMT1、DNMT2和DNMT3B；DNMT1、DNMT2和DNMT3L；DNMT2、DNMT3A和DNMT3B；DNMT2、DNMT3A和DNMT3L；DNMT2、DNMT3B和DNMT3L以及DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B。本发明的DNMT抑制剂也可与不落在已知类型之一的DNMT或是仍未归类的DNMT相互作用。
在另一个实施方案中，DNMT抑制剂可通过与DNMT的调节结构域或催化结构域相结合而发挥作用。在另一个实施方案中，DNMT抑制剂可是核苷类似物(掺入DNA或RNA中)或非核苷类似物。在另一个实施方案中，DNMT抑制剂可以是DNMT(包括但不限于：DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B或DNMT3L)的反义寡核苷酸。在又一个实施方案中，DNMT抑制剂也可通过阻断蛋白与蛋白的相互作用而发挥作用。
在另一个实施方案中，为抑制Dnmt的活性和胞嘧啶的甲基化，细胞可在下列培养基中生长：
(a)用Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a和/或3b siRNA(Dharmacon，Inc.)处理的培养基；
(b)用RG108(分析系统实验室，路易斯安那州兽医学校)处理的培养基；
(c)用5-AzadCyd(Sigma)处理的培养基。
表II提供能够抑制DNMT的小分子抑制剂的代表性列表。在本发明的方法、组合物和试剂盒中使用的DNMT抑制剂包括本文提及的DNMT抑制剂的衍生物和类似物。
表II.作为DNMT抑制剂的核苷类似物和非核苷类似物的代表性实例
Figure BPA00001272827500171
表III是能够用于诱导、上调或改变参与重编程的基因的表达的小分子调节剂的代表性列表。小分子调节剂可靶向基本转录结构元件、转录激活元件、染色质重建复合物组分、转录阻抑组分、DNA修复组分、错配修复组分、和参与维持细胞的甲基化状态的组分。小分子调节剂包括但不限于：组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)、组蛋白乙酰转移酶抑制剂(HATi)、组蛋白乙酰转移酶活化剂、赖氨酸甲基转移酶抑制剂(LMTi)、组蛋白甲基转移酶抑制剂(HMTi)、曲古抑菌素A抑制剂(TSAi)、组蛋白脱甲基酶抑制剂(HdeMi)、赖氨酸脱甲基酶抑制剂(LdeMi)、sirtuin抑制剂(SIRTi)和sirtuin活化剂(SIRTa)。
表III.能够用于重编程细胞的小分子调节剂的代表性列表
  小分子调节剂   功能
  HC毒素   HDACi
  山竹子素(Garcinol)   HATi
  BML-210   HDACi
  毛壳素   LMTi/HMTi
  ITSA1   TSAi
  Depudecin   HDACi
  反苯环丙胺   HdeMi/LdeMi
  EX-527   SIRT1i
  白藜芦醇   SIRT1a
  M-344   HDACi
  烟酰胺   SIRTi
  氟-SAHA   HDACi
  云杉鞣酚(Piceatanol)   SIRTa
  BML-266   SIRT2i
  sirtinol   SIRT2i
  valproxam   HDACi
  AGK2   SIRT2i
能够使用起组蛋白乙酰转移酶抑制剂作用的任何小分子调节剂，包括但不限于：漆树酸、山竹子素、姜黄素、异噻唑酮、丁内酯、和MC1626(2-甲基-3-喹啉羧酸乙酯)、聚异戊二烯化二苯甲酮、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)和CPTH2(亚环戊基-[4-(4′-氯苯)噻唑-2-基)腙)。
能够使用起组蛋白脱甲基酶抑制剂作用的任何小分子调节剂，包括但不限于：赖氨酸特异性的脱甲基酶、LSD1(KIAA0601或BHC110)、核黄素-依赖性胺氧化酶和jumonji。
能够使用起sirtuin活化剂作用的任何小分子调节剂，包括但不限于：白藜芦醇、多酚、活化sirtuin的化合物、SIRT1-SIRT7的活化剂、和SRT-1720。
在一种实施方案中，DNA甲基化抑制剂是胞苷类似物或衍生物。胞苷类似物或衍生物的实例包括但不限于：5-氮胞苷和5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-氮杂-CdR或地西他滨(decitabine))。
5-氮杂-CdR是它相关的天然核苷脱氧胞苷的拮抗物。这两种化合物之间唯一的结构差异是与脱氧胞苷的胞嘧啶环第5位上是碳相比，5-氮杂-CdR中该位置上存在氮。5-氮杂-CdR起DNA甲基转移酶的机制依赖性自杀性抑制剂的作用。为了最有效，将5-氮杂-CdR掺入到DNA中，这可能需要通过代谢途径修饰化合物。DNA甲基转移酶将5-氮胞苷识别为天然底物并启动甲基化反应。然而，该类似物阻止共价反应中间体的分辨，并且因而酶变成受限的和降解的。
折布拉林，也称为1-β-呋喃核糖基-1，2-二氢嘧啶-2-酮和1-β-呋喃核糖基-2(1H)-嘧啶酮，特征是具有胞苷脱氨酶抑制活性(参见，例如，Kim等，J.Med.Chem.29：1374-1380，1986；McCormack等，Biochem Pharmacol.29：830-832，1980)。
任何数量、任何组合和任何浓度的DNMT抑制剂能够用于抑制一种蛋白或多于一种蛋白，包括但不限于：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11-15、16-20和21-25种蛋白。
参与染色质重建的其它复合物中的蛋白质也能够被本发明的方法抑制，包括但不限于：SWI/SNF复合物、NuRD复合物、Sin3复合物和INO80。hSWI/SNF复合物是多亚基的蛋白复合物，已知其在染色质可接近性调节中发挥关键作用。hSWI/SNF复合物的任何组分能够被本发明的方法抑制，包括但不限于：SNF5/INI1、BRG1、BRM、BAF155和BAF170。SWI/SNF最早在酵母中被鉴定，为大量基因的活化所需要的。hSWI/SNF复合物已显示对于几种发育特异性基因表达程序的调节是至关重要的。
Sin3复合物的任何组分能够被本发明的方法抑制，包括但不限于：HDAC1、HDAC2、RbAp46、RbAp48、Sin3A、SAP30和SAP18。
NuRD复合物的任何组分能够被本发明的方法抑制，包括但不限于：Mi2、p70和p32。
INO80复合物的任何组分能够被本发明的方法抑制，包括但不限于：Tip49A、Tip49B、SNF2家族解旋酶Ino80、肌动蛋白相关蛋白ARP4、ARP5和Arp8、YEATS结构域家族成员Taf14、HMG-结构域蛋白、Nhp10以及命名为Ies1-6的六种另外的蛋白。
任何数量的小分子调节剂能够用于诱导促使细胞为复能或多能的基因的表达，包括但不限于：1-5种、6-10种、11-15种、16-20种、21-25种、26-30种、31-35种、36-40种、41-45种、46-50种以及多于50种小分子调节剂。
本发明提供在卵、胚胎、胚胎干细胞或体细胞核转移(SCNT)不存在时获得的重编程的细胞。通过本发明的方法产生的重编程的细胞可以是复能的或多能的。通过本发明的方法产生的重编程的细胞能具有大量不同的特征，包括胚胎干细胞样特征。例如，重编程的细胞可以能够以未分化状态增殖至少10代、15代、20代、30代或更多代。换言之，重编程的细胞能够增殖多于一年而不分化。重编程的细胞在增殖和/或分化同时也能够维持正常的核型。一些重编程的细胞也能够是在体外以未分化的状态无限增殖的细胞。一些重编程的细胞也能够通过延长培养来维持正常的核型。一些重编程的细胞即使在延长培养之后也能够维持分化为所有三种胚胎胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物的潜能。一些重编程的细胞能够形成生物体中的任何细胞类型。一些重编程的细胞在某些情况下能够形成胚状体，诸如在不维持未分化的生长的培养基中。一些重编程的细胞能够通过例如与胚泡融合而形成嵌合体。
重编程的细胞能够通过大量标记物来限定。例如，一些重编程的细胞表达碱性磷酸酶。一些重编程的细胞表达SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和/或TRA-1-81。一些重编程的细胞表达Oct 4、Sox2和Nanog。应理解一些重编程的细胞以mRNA水平表达这些标记物，而且另外一些重编程的细胞以蛋白水平在例如细胞表面上或在细胞内表达它们。
重编程的细胞能够具有本文所讨论的任何重编程的细胞的性质或种类、或种类和性质的任何组合。例如，重编程的细胞能够表达碱性磷酸酶，不表达SSEA-1，能够增殖至少20代，并能够分化成任何的细胞类型。另一种重编程的细胞，例如，能够在细胞表面上表达SSEA-1，并能够形成内胚层组织、中胚层组织和外胚层组织并被培养一年以上而不分化。
重编程的细胞能是碱性磷酸酶(AP)阳性、SSEA-1阳性和SSEA-4阴性。重编程的细胞也能是Nanog阳性、Sox2阳性和Oct-4阳性。重编程的细胞也能是Tcl1阳性和Tbx3阳性。重编程的细胞也能是Cripto阳性、Stellar阳性和Daz1阳性。重编程的细胞能表达与具有单克隆抗体TRA-1-60(ATCC HB-4783)和TRA-1-81(ATCC HB-4784)的结合特异性的抗体结合的细胞表面抗原。而且，如本文所公开的，重编程的细胞能在没有饲养层的条件下维持至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20代或持续一年以上。
重编程的细胞可具有分化为包括下列的不同细胞谱系的广泛的细胞类型的潜能：成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌、内皮细胞、间质、平滑肌、心肌、神经细胞、造血细胞、胰岛或体内几乎任何细胞。重编程的细胞可具有分化为所有的细胞谱系的潜能。重编程的细胞可具有分化为任何数量的细胞谱系的潜能，包括1种、2种、3种、4种、5种、6-10种、11-20种、21-30种和多于30种谱系。
可由本发明的方法诱导促使细胞为复能或多能的任何基因和与该基因相关的家族成员，包括但不限于甘氨酸N-甲基转移酶(Gnmt)、八聚体-4(Oct4)、Nanog、GABRB3、LEFTB、NR6A1、PODXL、PTEN、SRY(性决定区Y)-盒2(也称为Sox2)、Myc、REX-1(也称为Zfp-42)、整联蛋白α-6、Rox-1、LIF-R、TDGF1(CRIPTO)、SALL4(sal样4)、白细胞来源的趋化因子1(LECT1)、BUB1、FOXD3、NR5A2、TERT、LIFR、SFRP2、TFCP2L1、LIN28、XIST以及Krüppel样因子(Klf)诸如Klf4和Klf5。促使细胞是复能或多能的任何数量的基因能够被本发明的方法诱导，包括但不限于：1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11-20种、21-30种、31-40种、41-50种及多于50种基因。
而且，Ramalho-Santos等(Science 298，597(2002))，Ivanova等(Science298，601(2002))和Fortunel等(Science 302，393b(2003))(其全部内容以引用方式并入本文)各自比较了三种类型的干细胞并鉴定了通常表达“干(stemness)”基因的列表，认为“干”基因对于赋予干细胞的功能特征是重要的。在上文提及的研究中鉴定的任何基因可用本发明的方法诱导。表IV提供了被认为参与赋予干细胞功能特征的基因列表。除在表IV中列举的基因之外，与已知基因很少同源性或无同源性的93种表达序列标签(EST)集簇也被Ramalho-Santos等和Ivanova等鉴定，并被包括在本发明的方法中。
表IV.参与赋予干细胞特征的基因
Figure BPA00001272827500221
Figure BPA00001272827500241
Figure BPA00001272827500251
本发明的实施方案还包括使用根据本文别处公开的新方法产生的重编程的细胞来治疗多种疾病的方法。本领域技术人员基于本文提供的公开内容将了解到再生医学在治疗大量疾病中的价值和潜力，所述疾病包括但不限于：心脏病、糖尿病、皮肤病和皮肤移植、脊髓损伤、帕金森病、多发性硬化症、阿尔茨海默病及类似疾病。本发明涵盖为了治疗疾病将重编程的细胞施用给动物包括人的方法，其中新的未损伤的细胞的引入将提供某种形式的治疗性减轻。
本领域技术人员将容易理解重编程的细胞能够作为再分化的细胞如神经元施用给动物，并将对于替代动物中患病的或损伤的神经元是有用的。另外，重编程的细胞能够被施用给动物，并且它们在接收到来自周围环境的信号和指令之后能够再分化为邻近的细胞环境要求的期望细胞类型。可选地，细胞能够在体外再分化并且分化的细胞能够被施用给需要它们的哺乳动物。
重编程的细胞能被制备用于移植以确保在体内环境中的长期存活。例如，细胞能够在适于该细胞的生长和维持的培养基诸如祖细胞培育基中繁殖并允许长至汇合。使用例如缓冲液将使细胞从培养基底上离开，所述缓冲液诸如含有0.05％胰蛋白酶的补充有下列物质的磷酸缓冲盐水(PBS)：1mg/ml的葡萄糖；0.1mg/ml MgCl2、0.1mg/ml CaCl2(完全PBS)、加上5％血清以灭活胰蛋白酶。可使用离心法用PBS洗涤细胞，并之后将细胞重悬在无胰蛋白酶的完全PBS中并以为注射所选择的密度。
适合用于腹膜施用的药物组合物的制剂包含与药学上可接受的载体诸如无菌水或无菌等渗盐水相组合的活性成分。这样的制剂可以适合用于推注施用或适合用于连续施用的形式制备、包装或出售。可注射的制剂可以单位剂量的形式诸如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中制备、包装或出售。用于腹膜施用的制剂包括但不限于悬浮液、溶液、在油性或水性媒介物中的乳液、糊剂和可植入的持续释放制剂或生物降解制剂。这样的制剂还可包含一种或多种另外成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。
本发明也涵盖移植重编程的细胞与其它治疗方法相组合以治疗疾病或身体的创伤，包括CNS、PNS、皮肤、肝、肾、心脏、胰腺及类似物的疾病或创伤。因此，本发明的重编程的细胞可与对患者发挥有益效应的遗传修饰的细胞和未遗传修饰的细胞的其它细胞诸如来自肾上腺的嗜铬细胞、胎儿脑组织细胞和胎盘细胞共移植。因此，如本领域技术人员在具有本文提供的教导之后将理解的，本文公开的方法能够与其它治疗方法相组合。
本发明的重编程的细胞能够使用本领域已知的技术诸如在美国专利第5,082,670号和第5,618,531号公开的那些技术(每个都以引用方式并入)，“裸露的”移植至患者，或移植至体内任何其它合适的部位。
重编程的细胞能够作为包含单个细胞的混合物/溶液或作为包含细胞聚集体悬浮液的溶液被移植。这样的聚集体会是直径约10微米-500微米，并且，更优选地，直径约40微米-50微米。重编程的细胞聚集体能够包含每球体约5个-100个细胞，更优选地，每球体约5个-20个细胞。移植的细胞的浓度可从每微升约10,000个至1,000,000个细胞变化，更优选地，从每微升约25,000个至500,000个细胞。
本发明的重编程的细胞的移植能够使用本领域已知的技术以及将来开发的那些技术而实现。本发明包括用于移植(transplanting)、移植(grafting)、输注或用其它方式引入重编程的细胞至动物中，优选地至人中的方法。
重编程的细胞也可根据已知的囊化技术包括微囊化(参见，例如，美国专利第4,352,883号；第4,353,888号；和第5,084,350号，以引用方式并入本文)或巨囊化(参见，例如，美国专利第5,284,761号；第5,158,881号；第4,976,859号；和第4,968,733号；以及国际公布号WO 92/19195；WO 95/05452，它们均以引用方式并入本文)而囊化并用于递送生物活性分子。对于巨囊化，装置中细胞的数量可以变化；优选地，每个装置含有103个-109个细胞，更优选地约105个至107个细胞。几种巨囊化装置可被植入患者体内。用于细胞的巨囊化和植入的方法是本领域已知的，并在例如美国专利第6,498,018号中被描述。
本发明的重编程的细胞为了治疗的目的或用于追踪它们在患者组织中的整合和分化的方法也能够用于表达外来蛋白或外来分子。因此，本发明涵盖用于将外源DNA引入重编程的细胞中，同时在其中表达该外源DNA的表达载体以及方法，诸如，例如在Sambrook等(1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)、和在Ausubel等(1997，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学试验方案)，John Wiley & Sons，New York)中描述的那些。
本发明的实施方案也涉及用于鉴定表观基因组的调节剂的方法，其包括：将细胞与小分子文库相接触，测量基因组的改变；以及鉴定基因组的调节剂。方法还包括鉴定小分子调节剂。在又一个实施方案中，测量基因组的改变包括但不限于乙酰化、脱乙酰、甲基化、脱甲基化、磷酸化、泛素化、苏素化、ADP-核糖基化和脱亚胺化。
本发明的实施方案也涉及包含由本发明的方法产生的细胞的组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含通过使用小分子抑制剂来抑制参与阻抑转录的至少一种蛋白的活性而已被重编程的细胞。在另一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，其包含通过诱导促使细胞为复能或多能的基因的表达而已被重编程的细胞。
本发明的实施方案也涉及通过将细胞与至少一种小分子调节剂相接触而产生的重编程的细胞。在另一个实施方案中，本发明涉及通过将细胞与抑制至少一种DNMT的小分子抑制剂相接触而产生的重编程的细胞，所述小分子抑制剂包括但不限于RG108、5-氮杂-2-脱氧胞苷和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯。
本发明的实施方案也涉及用于制备本发明的方法和组合物的试剂盒。试剂盒能用于，尤其是，产生重编程的细胞并产生ES-样细胞和干细胞样细胞，诱导促使细胞是复能或多能的基因的表达，以及抑制参与阻抑转录的至少一种蛋白的活性。试剂盒可包含至少一种小分子抑制剂。试剂盒可包含多种小分子抑制剂。小分子抑制剂能在单个的容器或在多个的容器中提供。
试剂盒也可包含对于确定细胞是否已被重编程是必需的试剂，包括但不限于：用于检测促使细胞是复能或多能的基因的诱导的试剂、检测DNMT的抑制的试剂、检测CpG二核苷酸的脱甲基化的试剂、以及检测染色质结构的重建的试剂。
试剂盒也可包含能够用于将重编程的细胞分化为特定的细胞谱系或多个细胞谱系的试剂，所述细胞谱系包括但不限于神经元、成骨细胞、肌细胞、上皮细胞和肝细胞。
试剂盒也可含有描述试剂盒中提供的组分的用途的说明材料。如本文所使用的，“说明材料”包括印刷物、记录、图表或能够用于传达试剂盒中尤其用于实现分化的细胞的重编程的本发明方法的有用性的任何其它表达介质。任选地，或可选地，说明材料可描述将本发明的细胞再分化或转分化的一种或多种方法。本发明试剂盒的说明材料可，例如，可附于含有小分子抑制剂的容器中。可选地，为了说明材料和小分子抑制剂或其组分被接受者协调地使用的目的，说明材料可与容器分别地运输。
本发明现在参考下列实施例而被描述。这些实施例仅为说明性目的而被提供，并且本发明不应以任何方式被解释为受这些实施例限制，而应该被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得清楚的任何更改及所有更改。包括但不限于美国专利、容许的美国专利申请或公布的美国专利申请的所有参考文献的全部内容以引用方式并入本说明书。
实施例
下列实施例仅是说明性的，并且不旨在限制如权利要求书所限定的本发明的范围。
实施例1
检测小分子调节剂诱导或上调人的体细胞中复能性基因的能力。在本实施例中，小分子调节剂是抑制至少一种DNMT的活性的小分子抑制剂RG108。然而，本领域普通技术人员将理解，可使用诱导复能基因或多能基因的表达的任何小分子调节剂。
方法
细胞培养  原代人肺成纤维细胞购自Cell Applications(San Diego，CA)，并在37℃下95％湿度和5％CO2中被维持在含有10％胎牛血清(FBS，Hyclone)和0.5％青霉素和链霉素的Dulbecco改良的eagle培养基(DMEM，Hyclone)中。细胞在500μM RG108的存在下生长五天或未处理。
定量RT-PCR  在每种培养基情况下(500μM RG108或未处理)Oct-4和Nanog的表达用实时RT-PCR确定。简言之，根据厂商的试验方案使用Trizol试剂(Life Technologies，Gaithersburg，MD)和RNeasy Mini试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)用DNase I消化而从培养物中制备总RNA。来自每种样品的总RNA(1μg)经历寡聚(dT)-引发的反转录(Invitrogen；Carlsbad，CA)。实时PCR反应以PCR预混合液(master mix)在7300实时PCR系统(Applied Biosystems；Foster City，CA)中进行。对于每种样品，1μl稀释的cDNA(1∶10)作为模板被添加在PCR反应中。将Oct-4和Nanog的表达水平相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPD)标准化。
结果
如在图1中显示的，用500μM RG108处理原代人肺成纤维细胞5天导致Nanog基因表达的显著性(p＜0.03)上调。另外，也观察到增加的Oct4基因表达的趋势(p＜0.07)。复能基因Oct-4和Nanog的上调也从在DNMT抑制剂表没食子儿茶素-3-没食子酸酯的存在下培养的细胞中观察到(p＜0.08；数据未示出)。
这些结果揭示小分子抑制剂能够用于调节表观基因组，例如，DNA甲基化。小分子抑制剂能够用于抑制参与阻抑转录的蛋白的活性。另外，小分子抑制剂能够诱导复能基因的表达并恢复体细胞中的分化潜能。
实施例2
多种小分子调节剂用于诱导或上调几种细胞类型中的复能性基因。在本实施例中，Oct-4是检测的主要基因；但是本领域普通技术人员将理解，小分子调节剂能够用于诱导或上调参与重编程的任何基因的表达。
方法
细胞培养  成人和新生儿的原代人皮肤成纤维细胞购自Cell Applications(San Diego，CA)。人肺成纤维细胞、HSM细胞和BJ成纤维细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。
在37℃下95％湿度和5％CO2中，细胞被维持在含有10％胎牛血清(FBS，Hyclone)和0.5％青霉素和链霉素的Dulbecco改良的eagle培养基(DMEM，Hyclone)中或维持在成纤维细胞生长培养基中(Cell Applications，San Diego，CA)。细胞在小分子调节剂的存在或不存在下生长。在小分子调节剂的存在下每种小分子调节剂的培养时间不同(见表V)。
定量RT-PCR  每种培养条件的感兴趣的基因，例如Oct-4、Nanog或Sox-2的表达用实时RT-PCR确定。简言之，根据厂商的试验方案使用Trizol试剂(Life Technologies，Gaithersburg，MD)和RNeasy Mini试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)用DNase I消化而从培养物中制备总RNA。来自每种样品的总RNA(1μg)经历寡聚(dT)-引发的反转录(Invitrogen；Carlsbad，CA)。实时PCR反应以PCR预混合液(master mix)在7300实时PCR系统(AppliedBiosystems；Foster City，CA)中进行。对于每种样品，1μl稀释的cDNA(1∶10)作为模板被添加在PCR反应中。将感兴趣的基因的表达水平相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPD)标准化。
结果
表V列举了检测的并显示诱导或上调Oct-4的表达的小分子调节剂。小分子抑制剂VPA和RG108也已显示诱导Nanog(参见图1和表V)。在表V中呈现的数据证明，大量的小分子调节剂能够被以多种浓度使用以诱导或上调复能性基因诸如Oct-4的表达。如在表V中所显示的，小分子调节剂以多种浓度并以多种培养时间，能够诱导在成人皮肤成纤维细胞、人新生儿皮肤成纤维细胞、人肺成纤维细胞和BJ成纤维细胞(人包皮)中的Oct-4的表达。
表V.增加复能基因的表达的小分子调节剂
Figure BPA00001272827500331
丙戊酸(VPA)(5mM)诱导成人皮肤成纤维细胞、人新生儿皮肤成纤维细胞、人胎儿皮肤成纤维细胞和BJ成纤维细胞中Oct-4、Nanog和Sox-2的表达(参见图2)。细胞被用VPA处理4-6天。表达的增加对于每种基因和在每种细胞类型中不同；但是数据清楚地显示了在小分子抑制剂(VPA)的存在下复能性基因的上调。持家基因GAPDH用于将mRNA的量标准化。
如在图3中显示的，VPA还增加成人皮肤成纤维细胞和人胎儿皮肤成纤维细胞中HDAC 11的表达。对于HDAC 9，VPA处理的细胞和未处理的细胞之间无统计学差异。可测量效应的缺乏可能归因于由科学设备所致的实验性限制。
表VI呈现了在VPA的存在下复能性基因Oct-4、Nanog、Sox-2和HDAC 11的统计分析。四种细胞类型的信息被呈现：成人皮肤成纤维细胞、人胎儿皮肤成纤维细胞、人新生儿皮肤成纤维细胞和BJ成纤维细胞。在每种细胞类型中，Oct-4、Nanog和Sox-2的表达的变化是统计学显著性的。参与重编程的多个基因的表达在发挥抑制组蛋白脱乙酰酶作用的小分子存在下增加。
表VI.在VPA存在下复能性基因的表达的变化
Figure BPA00001272827500341
如在图4中显示的，当成人皮肤成纤维细胞被用烟酰胺处理四天时，Oct-4的表达增加。检测的所有三个浓度0.028mM、0.28mM和1.4mM，都引起与对照培养基(MC)相比Oct-4的表达增加。这些数据证明，小分子抑制剂，在本实施例中是烟酰胺，增加参与重编程分化的细胞及恢复细胞的分化潜能的基因Oct-4的表达。
如在图5中显示的，当成人皮肤成纤维细胞被用苯基丁酸钠处理时，Oct-4的表达增加。在苯基丁酸钠(2.5mM)存在下，细胞被处理四天。与对照培养基(MC)相比，处理的细胞展现Oct-4表达的增加。这些数据证明，发挥抑制组蛋白脱乙酰酶作用的小分子抑制剂能够用于增加复能基因或多能基因的表达以及用于重编程细胞。
如在图6中显示的，当成人皮肤成纤维细胞被用Valproxam处理四天时，复能基因Oct-4的表达增加。在Valproxam的两个浓度0.05mM和0.5mM下，当与对照培养基(MC)相比时Oct-4的表达增加。在2.5mMValproxam的浓度下，Oct-4的表达表现为返回至基线水平(与对照培养基类似的水平)。这可能反映有活力细胞的数量的减少，或者可能指示由设备所致的实验性限制。
如在图7中显示的，当BJ成纤维细胞被用2-PCPA处理八天时，Oct-4的表达增加。化合物2-PCPA是组蛋白/赖氨酸1脱甲基酶抑制剂。2-PCPA的所有三个浓度0.1mM、0.5mM和1.0mM导致与对照培养基(MC)相比Oct-4的表达增加。
靶向多个靶点的小分子调节剂，包括但不限于组蛋白脱乙酰酶和SIRT，能够用于增加复能基因或多能基因的表达，并能够用于重编程分化的细胞。这些重编程的方法不依赖于卵、胚胎或胚胎干细胞。而且，这些方法不依赖于会具有有害作用的病毒载体。这些方法也不依赖于诸如c-myc和Klf4等致癌基因。
另外，本发明的方法能在不存在体细胞核转移(SCNT)时用于重编程分化的细胞。SCNT是极其低效力的并对于重编程领域造成显著性的限制。本方法减少对于SCNT的需求。
本方法已显示相对于具有强的报道元件的人工载体，内源的Oct-4基因的表达的增加。人工载体不具有与内源基因相同的染色质结构，也不具有其它基因元件和启动子元件以产生基因组环境。人工载体不具有再现天然基因组环境需要的许多天然元件。本文呈现的结果代表从处理人的细胞获得的效应和测量对内源基因的效应。
最后，本文呈现的数据证明，小分子调节剂能够用于改变诸如组蛋白脱乙酰酶等蛋白质复合物的功能。改变染色质的结构是在重编程分化的细胞和恢复分化潜能中的一个步骤。
实施例3
检查了通过暴露于VPA而诱导的形态学变化。胚胎细胞具有明确的形态学特征。因此，检查了用VPA处理的细胞以确定复能性基因表达增加相关的形态学变化是否与胚胎细胞一致。
方法
24-孔板中将成人皮肤成纤维细胞在成纤维细胞生长培养基中用500μM VPA处理5天。在第3天用500μM VPA再处理细胞。在五天结束时，然后将细胞转移至6-孔板中并在mTeSR hES细胞培养基中(可由StemCell Technologies，Vancouver，BC，Canada提供)每天用500μM VPA处理持续另外的16天；每天更换mTeSR培养基。当在悬浮液中观察到细胞集落时，在约第21天，将细胞转移至基质胶平板中并在铺板之后照相。
结果
图8A-图8D是未处理的细胞和用500μM VPA处理的细胞的照片。图8A是成纤维细胞生长培养基中未处理的细胞的照片。图8B是DMEM/F12培养基中未处理的细胞的照片。图8C和图8D是在基质胶上mTeSR hES细胞培养基中VPA-处理的细胞的照片。用VPA处理的细胞类似胚状体集落(图8C)和胚状体(图8D)。但是，未检测到阳性的复能蛋白着色(数据未示出)。这可能是实验误差或实验系统上的限制所致。
用小分子调节剂处理的细胞诱导基因诸如Oct-4和Nanog的表达，Oct-4和Nanog是参与维持细胞的复能性并参与重编程分化的细胞的两个基因。另外，增加这些基因的表达导致细胞的形态学改变，其中形态学改变与胚胎样细胞一致。这些结果清楚地揭示，小分子调节剂诸如组蛋白脱乙酰酶的抑制剂，能够用于将分化的细胞转化为胚胎样细胞。这些结果支持通过将细胞暴露于诸如VPA的小分子抑制剂能够重编程细胞的观念。
虽然本文已阐述并描述了具体的实施方案，但是本领域普通技术人员将意识到为取得相同的目的而计划的任何安排可替代所显示的具体实施方案。本申请旨在包括根据如所描述的本发明的原理而实施的任何改造或变动。因此，本发明旨在仅受权利要求书及其等价物限制。在本申请中引用的专利、参考文献和公开物的公开内容以引用方式并入本文。

Claims (20)

1.一种用于重编程细胞的方法，所述方法包括：将细胞暴露于诱导复能基因表达的小分子调节剂；并且筛选细胞，其中所述细胞已经恢复分化潜能。
2.如权利要求1所述的方法，其中筛选所述细胞包括：将所述细胞暴露于所述小分子调节剂之前和之后的表型相比较，并鉴定具有与恢复的分化潜能一致的表型的细胞。
3.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：将所述筛选的细胞扩增为细胞群。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述小分子调节剂选自由以下组成的组：组蛋白脱乙酰酶抑制剂、甲基结合结构域蛋白抑制剂、甲基腺苷基转移酶抑制剂、DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白甲基转移酶抑制剂、赖氨酸甲基转移酶抑制剂、组蛋白脱甲基酶抑制剂和甲基循环酶抑制剂。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述小分子调节剂是DNA甲基转移酶抑制剂。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述DNA甲基转移酶抑制剂是RG108。
7.如权利要求1所述的方法，其中筛选所述细胞包括：使用针对由复能基因表达的蛋白的抗体或使用针对复能标记物的抗体来分离细胞。
8.如权利要求1所述的方法，其中筛选所述细胞包括：使用由复能基因驱动的报道分子或对选择标记物的抗性来分离细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述复能基因选自由Oct-4、Sox-2和Nanog组成的组。
10.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：将所述细胞暴露于所述小分子调节剂之前复能基因的染色质结构与暴露于所述小分子调节剂之后获得的染色质结构相比较。
11.一种用于重编程细胞的方法，所述方法包括：将具有第一转录模式的细胞暴露于小分子调节剂，其中所述调节剂诱导复能基因的表达；将所述细胞的所述第一转录模式与暴露于所述调节剂之后获得的转录模式相比较；并且筛选细胞，其中所述细胞已经恢复分化潜能。
12.如权利要求11所述的方法，其中暴露于所述调节剂之后的所述转录模式至少50％类似于胚胎干细胞的转录模式。
13.如权利要求11所述的方法，其中比较所述转录模式之前，将所述细胞暴露于所述小分子调节剂之前和之后的表型相比较。
14.如权利要求11所述的方法，所述方法还包括：将所述筛选的细胞扩增为细胞群。
15.如权利要求11所述的方法，其中筛选所述细胞包括：使用针对由复能基因表达的蛋白的抗体或使用针对复能标记物的抗体来分离细胞。
16.如权利要求11所述的方法，其中所述复能基因选自由：Oct-4、Sox-2和Nanog组成的组。
17.一种富集的重编程的细胞群，所述重编程的细胞群根据包括以下步骤的方法产生：将细胞暴露于诱导复能基因表达的小分子调节剂；并且筛选细胞，其中所述细胞已经恢复分化潜能；并培养所述筛选的细胞至产生细胞群。
18.如权利要求17所述的富集的重编程的细胞群，其中所述重编程的细胞表达选自由以下组成的组的细胞表面标记物：SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81。
19.如权利要求17所述的富集的重编程的细胞群，其中所述复能基因选自由：Oct-4、Sox-2和Nanog组成的组。
20.如权利要求17所述的富集的重编程的细胞群，其中所述重编程的细胞占所述群的至少60％。
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