CN110951738B - 猪hdac2基因的表达抑制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了通过使用猪HDAC2基因的表达抑制剂可以有效提高猪克隆重构胚胎的发育率和囊胚时期的胚胎质量，即可以有效提高猪克隆重构胚胎的发育性能，从而可以提高猪体细胞克隆的克隆效率。本发明所述的猪HDAC2基因的表达抑制剂可以选自对猪HDAC2基因表达起抑制作用的siRNA和可以抑制猪HDAC2基因表达的化合物中的至少一种。

Description

猪HDAC2基因的表达抑制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及猪HDAC2基因的表达抑制剂及其在制备具有提高猪克隆重构胚胎发育性能作用的产品中的应用。

背景技术

体细胞核移植技术(Somatic Cell nuclear transfer，SCNT)又称为体细胞克隆技术，是动物细胞工程技术的常用技术，是以体细胞为核供体，通过特殊的人工手段(显微操作、电融合等)将体细胞核移入去核卵母细胞中生成重构胚胎，重构胚胎经体外融合激活培养到一定阶段后，再移植入代孕母体内，使其发育为含有与供体细胞相同的遗传物质的克隆后代的技术。经体细胞核移植技术获得的动物成为克隆动物。

高度分化的体细胞核移入去核卵母细胞后，细胞核需要经过重编程来激活胚胎早期发育的关键基因，并抑制与分化相关的基因的表达，从而获得胚胎发育的全能性。目前研究普遍认为体细胞克隆效率低主要的原因在于卵母细胞对供体核的不完全或异常的重编程。细胞核的重编程主要涉及多种表观遗传修饰，如组蛋白修饰，DNA甲基化、X染色体失活、基因组印记等。

猪的体细胞克隆技术在基础科学研究、畜牧育种以及医学研究有着重要的应用价值，但目前体细胞克隆猪的整体生产效率仍然偏低，猪的克隆效率(相对于重构卵数量的效率)不超过0.3％，极大地限制了体细胞克隆猪的进一步推广和应用。

发明内容

本发明的目的在于提供猪HDAC2基因的表达抑制剂及其在提高猪克隆重构胚胎发育性能中的应用，以提高猪的克隆效率。

根据本发明的一个方面，提供了3个猪HDAC2基因的siRNA，分别为HDAC2-siRNA1、HDAC2-siRNA2和HDAC2-siRNA3；其中，HDAC2-siRNA1的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列；HDAC2-siRNA2的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列；HDAC2-siRNA3的核苷酸序列包括SEQ ID NO:5-6所示的核苷酸序列。

根据本发明的另一个方面，提供了猪HDAC2基因的表达抑制剂在制备具有提高猪克隆重构胚胎发育性能作用的产品中的应用。

在一些实施方式中，猪HDAC2基因的表达抑制剂可以选自对猪HDAC2基因表达起抑制作用的siRNA、化合物中的至少一种。

在一些实施方式中，对猪HDAC2基因表达起抑制作用的siRNA可以选自HDAC2-siRNA1、HDAC2-siRNA2、HDAC2-siRNA3中的至少一种。

在一些实施方式中，对猪HDAC2基因表达起抑制作用的化合物优选为可以特异性抑制猪HDAC2基因表达的化合物，可以为CAY10683(SantacruzamateA，CAS：1477949-42-0)。

根据本发明的又一个方面，提供了提高猪克隆重构胚胎发育性能的试剂盒，包括对猪HDAC2基因表达起抑制作用的siRNA。

在一些实施方式中，试剂盒可以包括独立包装的对猪HDAC2基因表达起抑制作用的siRNA和独立包装的对猪HDAC2基因表达起抑制作用的化合物。使用时，siRNA可以使用无菌、DNase&RNase free的胚胎注射级水配制成注射剂对激活后的猪克隆重构胚胎进行注射；化合物溶解后可以用培养液逐级稀释，然后添加到培养基中对1cell期的猪克隆重构胚胎进行孵育培养。

在一些实施方式中，试剂盒中对猪HDAC2基因表达起抑制作用的siRNA可以选自HDAC2-siRNA1、HDAC2-siRNA2、HDAC2-siRNA3中的至少一种。

在一些实施方式中，试剂盒中对猪HDAC2基因表达起抑制作用的siRNA可以由等摩尔的HDAC2-siRNA1、HDAC2-siRNA2、HDAC2-siRNA3组成。

在一些实施方式中，试剂盒中对猪HDAC2基因表达起抑制作用的化合物可以为CAY10683。CAY10683是一种可以特异性抑制猪HDAC2基因表达的小分子化合物，在一些实施方式中，利用CAY10683处理猪克隆重构胚胎以提高猪克隆重构胚胎发育性能时，CAY10683的浓度可以为0.1-200nM，优选地，为20nM。

本发明的有益效果在于：通过设计和使用靶向猪HDAC2基因的小干扰RNA(siRNA)和/或使用可以特异性抑制猪HDAC2基因表达的小分子化合物CAY10683，特异性地对组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)家族中与克隆重构胚胎发育失败相关的HDAC2基因的表达进行抑制，可以显著提高猪克隆重构胚胎的发育性能，即可以提高猪克隆重构胚胎的囊胚率和囊胚内细胞数，并且可以减少其他非特异性组蛋白去乙酰化酶抑制剂由于对HDAC家族中其他非异常基因进行表达抑制从而导致的负面效应。

通过向化学辅助激活后的猪克隆重构胚胎注射HDAC2-siRNA和/或通过将CAY10683添加到培养基中对1cell期猪克隆重构胚胎进行孵育培养，可以显著提高胚胎的发育率和提高囊胚时期的胚胎质量，具体表现为，可以显著提高猪克隆重构胚胎的囊胚率和囊胚细胞数，显著下调猪克隆重构胚胎HDAC2 mRNA的表达量，显著增加激活性标记组蛋白乙酰化的水平以及促进猪克隆重构胚胎甲基化。

附图说明

图1为转染HDAC2-siRNA对猪成体成纤维细胞HDAC2 mRNA水平的影响结果；差异分析使用多重比较的LSD方法，同样的字母表示差异不显著(P>0.05)，不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图2为荧光定量PCR检测注射HDAC2-siRNA的猪克隆重构胚胎4cell时期HDAC2的表达量；差异分析使用t检验，同样的字母表示差异不显著(P>0.05)，不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图3为注射HDAC2-siRNA后24h检测猪克隆重构胚胎2cell时期的H3K9ac的荧光强度；

图4为注射HDAC2-siRNA后24h检测猪克隆重构胚胎2cell时期H3K9ac的平均荧光强度统计；差异分析使用多重比较的LSD方法，同样的字母表示差异不显著(P>0.05)，不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图5为为注射HDAC2-siRNA后48h检测猪克隆重构胚胎4cell时期的H3K9ac的荧光强度；

图6为注射HDAC2-siRNA后48h检测猪克隆重构胚胎4cell时期H3K9ac的平均荧光强度统计；差异分析使用多重比较的LSD方法，同样的字母表示差异不显著(P>0.05)，不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图7为注射HDAC2-siRNA的猪克隆重构胚胎2cell时期LINE位点DNA甲基化串珠图；图中每行代表一个克隆测序结果，一个圈代表一个CpG，其中，黑色实心圆圈代表甲基化的CpG，白色空心圆圈表示未甲基化的CpG，竖线代表突变，本发明中其他甲基化结果表示方法同本图；

图8为注射HDAC2-siRNA的猪克隆重构胚胎4cell时期LINE位点DNA甲基化串珠图；

图9为CAY10683处理的猪克隆重构胚胎2cell时期的H3K9ac的荧光强度；

图10为CAY10683处理的猪克隆重构胚胎2cell时期H3K9ac的平均荧光强度统计；差异分析使用多重比较的LSD方法，同样的字母表示差异不显著(P>0.05)，不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图11为为CAY10683处理的猪克隆重构胚胎4cell时期的H3K9ac的荧光强度；

图12为CAY10683处理的猪克隆重构胚胎4cell时期H3K9ac的平均荧光强度统计；差异分析使用多重比较的LSD方法，同样的字母表示差异不显著(P>0.05)，不同的字母表示差异显著(P<0.05)；

图13为CAY10683处理的猪克隆重构胚胎2cell时期LINE位点DNA甲基化串珠图；

图14为CAY10683处理的猪克隆重构胚胎4cell时期LINE位点DNA甲基化串珠图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。如无特殊说明，实施例中所用试剂均为市售，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

组蛋白乙酰化酶的增加，会导致组蛋白的乙酰化水平下调，降低基因组的转录水平。在早期胚胎的发育中，伴随着大量的基因的激活，基因的异常未激活也被认为是克隆胚胎发育失败的很大原因之一，并把这种原因归结于比如H3K9me3这类抑制性修饰的不能擦除。在小鼠的体细胞克隆中，H3K9me3已被确认是供体细胞基因组重编程的一个主要障碍，异位表达H3K9me3去甲基化酶Kdm4d除去H3K9me3修饰，可以有效提高小鼠克隆胚胎的囊胚率。但发明人在研究猪克隆胚胎重编程异常的过程中发现，H3K9me3这类抑制性修饰在猪克隆胚胎中并不富集，组蛋白甲基转移酶的过表达也并没有大幅度的提高克隆效率；但研究过程中发现HDAC2和SIRT1是猪克隆胚胎2-细胞期发育停滞显著正相关表达的基因，基于上述发现，发明人推测HDAC2和SIRT1的异常表达导致组蛋白乙酰化水平的低下引起的基因激活失败很有可能是猪克隆胚胎的发育失败的一个重要的原因，并通过设计合成以及向化学辅助激活后的猪克隆重构胚胎注射猪HDAC2基因的小干扰RNA和通过将可以特异性抑制猪HDAC2基因表达的小分子化合物CAY10683添加到培养基中对1cell期猪克隆重构胚胎进行孵育培养，证实了HDAC2基因的表达抑制剂可以显著提高猪克隆重构胚胎的发育性能。

实施例1

1、猪HDAC2基因和猪HDAC2基因的siRNA的设计合成

根据猪HDAC2基因序列(序列号：XM_001925318.6)，参考siRNA设计原理，以猪HDAC2基因的相应靶位点由上海吉玛制药技术有限公司设计和合成3对siRNA，分别记为HDAC2-siRNA1、HDAC2-siRNA2、HDAC2-siRNA3，其序列如下表1所示：

表1 siRNA序列

2、siRNA对基因的抑制效果

2.1 siRNA溶液配制

将装有siRNA干粉的管子离心，然后在每管中加入150μL无菌、DNase&RNase free的胚胎注射级水(胚胎级无菌无核酸酶水购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)配置为20mM的浓度，盖紧瓶盖后震荡溶解，离心后以5μL/管分装到无菌、DNase&RNase free的PCR管中于-80℃保存备用。

2.2 siRNA转染猪成体成纤维细胞

根据Lipofectamine^TM RNAiMAX转染试剂(购自英潍捷基(上海)贸易有限公司)推荐的转染细胞融合度，待24孔板中的细胞富集到70％开始转染。使用50μL

I和1μL RNAMAXi配置预混液1，50μL

I和0.5μL 20mM的siRNA溶液配置预混液2。将预混液1和预混液2轻轻混匀，静置10-20min。将100μL siRNA和转染试剂混合溶液加入500μL含细胞的24孔板，前后摇晃培养板混匀。4-6h后换液。具体转染操作参考Lipofectamine^TMRNAiMAX转染试剂说明书。其中，NC组(对照组)猪成体成纤维细胞转染NC-siRNA。

2.3 实时荧光定量PCR检测siRNA对基因的抑制效果

siRNA转染猪成纤维细胞24h后用抽提RNA的裂解液收集细胞，抽提RNA(Total RNAKit II，OMEGA)、逆转录(QuantiTect Reverse Transcription Kit，Qiagen)合成cDNA后，通过实时荧光定量PCR观察siRNA对基因的抑制效果。

实时荧光定量PCR采用Qiagen公司的定量反应试剂盒(QuantiFast SYBR GreenPCRKit)，以β-Actin为内参基因，采用10μLPCR反应体系，每个样品设置3～4个复孔。PCR反应参数为：95℃变性、热启动5min；45～50轮PCR循环(95℃、10s，60℃、15s，72℃、20s)；溶解曲线(95℃、15s，55℃、15s，95℃、15s)。所用引物如下：

结果如图1所示。图1表示转染3种HDAC2-siRNA及3种HDAC2-siRNA等摩尔比混合物对猪成体成纤维细胞HDAC2 mRNA表达水平的影响。为了确认HDAC2-siRNA对HDAC2抑制的有效性，首先在体外培养的猪成纤维细胞上进行细胞转染实验。通过实时荧光定量PCR的方法检测了3种小干扰RNA及3种小干扰RNA等比例混合物对HDAC2的干扰效果，图1结果表明，无论是单独的HDAC2-siRNA还是3种HDAC2-siRNA联合的共转染均能显著的下调HDAC2的mRNA表达水平(P<0.05)，其中HDAC2-siRNA1和共转染3个HDAC2-siRNA的干扰效果优于其余两个HDAC2-siRNA。

3、注射HDAC2-siRNA对猪克隆重构胚胎体外发育的影响

通过常规方法制得猪克隆重构胚胎，其中，核移植的供核细胞为公猪成纤维细胞，卵母细胞取自于广州白云屠宰场。

猪克隆重构胚胎在化学辅助激活后2小时注射HDAC2-siRNA1、HDAC2-siRNA2、HDAC2-siRNA3按摩尔比1：1：1等比例混合得到HDAC2-siRNA混合物溶液。注射体积约10pL(内半径5μm的注射针，1个猪卵母细胞直径的注射体积约为10pL)。NC组猪克隆重构胚胎注射等量的NC-siRNA溶液。在培养的第二天观察卵裂率，第二、三天收集部分2细胞和4细胞胚胎做定量PCR观察干扰效果，第七天收集囊胚记录胚胎发育效率，并对囊胚细胞进行细胞核荧光染色，观察囊胚细胞数。

3.1 注射HDAC2-siRNA对猪克隆重构胚胎发育性能的影响

如表2所示，相比于对照组(NC组)，注射HDAC2-siRNA后，猪克隆重构胚胎的卵裂率无显著变化(P>0.05)，囊胚率和囊胚细胞数均有显著提高(P<0.05)。

表2 注射HDAC2-siRNA对猪克隆重构胚胎发育性能的影响

注：“％Cleavage”为胚胎激活两天后发生卵裂的比例，n为胚胎个数，分母为重构胚个数，分子为卵裂胚胎个数。“％Blastocyst”为激活后第七天发育到囊胚的比例，n为胚胎个数，分母为重构胚个数，分子为囊胚个数。“Total cells”为平均的囊胚细胞数。利用多重比较的LSD方法进行差异检验。同样的字母表示差异不显著(P>0.05)，不同的字母表示差异显著(P<0.05)。NC为对照组。

3.2 注射HDAC2-siRNA对猪克隆重构胚胎靶基因表达的影响

在猪的克隆重构胚胎1cell注射了抗HDAC2的siRNA之后，为了验证是否是成功干扰了猪克隆重构胚胎的HDAC2的表达，通过实时荧光定量PCR的对4cell时期的胚胎进行表达量检测。结果如图2所示，图2结果表明，HDAC2-siRNA的注射可以持续的维持克隆重构胚胎中的HDAC2的表达量在一个较低的水平到4cell(P<0.05)。由表2和图2的结果可知，注射了HDAC2-siRNA的猪克隆重构胚胎HDAC2的mRNA的有效下调，显著的提高了胚胎的发育率和囊胚时期的胚胎质量。

3.3 注射HDAC2-siRNA对猪克隆重构胚胎表观状态的影响

如图3-6所示，在2cell检测H3K9ac修饰的荧光强度发现，HDAC2的下调可以显著的提高H3K9ac的水平(P<0.05)(见图3)，提高幅度达到79.4％(见图4)。在4cell时期检测H3K9ac修饰的荧光强度也发现同样的结果，H3K9ac在HDAC2-siRNA干扰组中显著的提高(见图5)，提高幅度达到175.3％(见图6)。由图3-6的结果可知，注射了HDAC2-siRNA的猪克隆重构胚胎HDAC2的mRNA的有效下调增加了激活性标记组蛋白乙酰化的水平。

基因的表达受到激活性表观修饰的促进，同时也受到抑制性修饰的抑制。DNA甲基化就是其中一种抑制性修饰。如图7-8所示，通过对2cell和4cell时期的注射了HDAC2-siRNA的猪克隆重构胚胎的DNA重复序列LINE的甲基化检测发现，2cell时期猪克隆重构胚胎的DNA甲基化水平下调了13.3％(见图7)，在4cell时期，也达到了促进去甲基化的功能，DNA甲基化水平下调了10％(见图8)。由图7-8的的结果可知，注射HDAC2-siRNA可以促进猪克隆重构胚胎甲基化。

实施例2

1、CAY10683对猪体细胞克隆重构胚胎发育性能的影响

将特异性抑制HDAC2的小分子CAY10683添加到培养基中对1cell期猪克隆重构胚胎进行孵育培养24h，然后更换为正常培养基继续培养。NC组添加等量的未经处理的正常培养基。观察试验组第2天克隆重构胚胎卵裂率和第7天囊胚发育率，并对囊胚细胞进行了细胞核荧光染色，统计细胞总数。结果如表3所示。

表3 不同浓度CAY10683处理对猪体细胞克隆重构胚胎发育性能的影响

由表3的结果可知，3个浓度的CAY10683处理组相较于NC组，20nM处理时卵裂率获得显著提高(P<0.05)，100nM和200nM时无显著变化(P>0.05),囊胚率和囊胚细胞数在20nM和100nM处理时有显著提高(P<0.05)，200nM处理时无显著变化(P>0.05)。使用低浓度的CAY10683对猪体细胞克隆重构胚胎处理24h可以显著的提高胚胎的发育率和囊胚时期的胚胎质量。

2、CAY10683对猪克隆重构胚胎表观状态的影响

如图9-12所示，在2cell检测H3K9ac修饰的荧光强度发现，HDAC2的抑制可以显著的提高H3K27ac的水平(P<0.05)(见图9)，提高幅度达到138.7％(见图10)。在4cell时期检测H3K9ac修饰的荧光强度也发现同样的结果，H3K9ac在处理组中显著的提高(见图11)，提高幅度达到96.8％(见图12)。

为了验证特异性小分子CAY10683对克隆重构胚胎是否具备促进去甲基化功能，对CAY10683处理24h后发育到2cell的胚胎进行基因组重复序列LINE的DNA甲基化水平进行检测。结果如图13-14所示，在处理中，CAY10683处理组明显的提高了去甲基化的水平，达到了20％(见图13)，并且这种促进作用直接影响到4cell时期，促进水平达到了15％(见图14)。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 猪HDAC2基因的表达抑制剂及其应用

<130> 2019

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gcuugccauc cuugaguuat t 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 2

uaacucaagg auggcaagct t 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gcaaauacua ugcugucaat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 4

uugacagcau aguauuugct t 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ggaggaggug gauacacaat t 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 6

uuguguaucc accuccucct t 21

Claims (3)

1.猪HDAC2基因的表达抑制剂在制备具有提高猪克隆重构胚胎发育性能作用的产品中的应用，其特征在于，所述猪HDAC2基因的表达抑制剂选自核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示的HDAC2-siRNA1、核苷酸序列如SEQ ID NO:3-4所示的HDAC2-siRNA2、核苷酸序列如SEQID NO:5-6所示的HDAC2-siRNA3、CAY10683中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述具有提高猪克隆重构胚胎发育性能作用的产品为试剂盒，其中，所述试剂盒包括独立包装的对猪HDAC2基因表达起抑制作用的siRNA和/或独立包装的CAY10683；所述对猪HDAC2基因表达起抑制作用的siRNA选自核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示的HDAC2-siRNA1、核苷酸序列如SEQ ID NO:3-4所示的HDAC2-siRNA2、核苷酸序列如SEQ ID NO:5-6所示的HDAC2-siRNA3中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述对猪HDAC2基因表达起抑制作用的siRNA由等摩尔的HDAC2-siRNA1、HDAC2-siRNA2和HDAC2-siRNA3组成。

Images