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KR102219743B1 - 신규 연골 세포 유도 방법 - Google Patents

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KR102219743B1
KR102219743B1 KR1020167014549A KR20167014549A KR102219743B1 KR 102219743 B1 KR102219743 B1 KR 102219743B1 KR 1020167014549 A KR1020167014549 A KR 1020167014549A KR 20167014549 A KR20167014549 A KR 20167014549A KR 102219743 B1 KR102219743 B1 KR 102219743B1
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고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠
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Abstract

다음의 공정을 포함하는 다능성 줄기세포로부터 연골 세포를 제조하는 방법: (i) 다능성 줄기세포를 접착 배양함으로써 중배엽 세포를 유도하는 공정, (ii) 상기 공정 (i)에서 얻어진 세포를 BMP2, TGFβ 및 GDF5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 포함하는 배양액 중에서 접착 배양하는 공정, 및 (iii) 상기 공정 (ii)에서 얻어진 세포를 BMP2, TGFβ 및 GDF5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 포함하는 배양액 중에서 부유 배양하는 공정. 또한, 이 방법으로 얻어진 연골 세포를 포함하는 의약품을 제공한다.

Description

신규 연골 세포 유도 방법{NOVEL CHONDROCYTE INDUCTION METHOD}
본 발명은, 다능성 줄기세포(幹細胞)로부터 연골 세포를 분화 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 그와 같이 하여 얻어진 연골 세포를 포함하는 치료제에 관한 것이다.
코, 귀 및 관절은 연골 조직으로 형성되어 있고, 연골 조직은, 연골 세포와 I형 콜라겐을 포함하지 않고, II형 콜라겐, IX형 콜라겐, XI형 콜라겐 및 프로테오글리칸을 포함하는 특정한 세포외 매트릭스로 형성되어 있다. 관절 손상 등으로 손실된 연골 조직은 자연치유되는 일이 없기 때문에, 이식 등의 수복 치료를 행하지 않으면 악화되어 버린다. 그러나, 손상 부위에 이식하기 위한 연골 조직의 입수가 필요하며, 환자 자체의 다른 부위의 연골을 사용하기에는 그 손상 부위의 크기가 한정된다. 이 때문에, 시험관내(in vitro)에서 취출한 연골 세포의 확대 배양을 행하면 세포가 섬유화되어 버려, 이식에는 적합하지 않다(비특허 문헌 1). 이 외에도, 간엽계 줄기세포를 투여하는 방법이 제안되어 있지만, 간엽계 줄기세포는 다수의 종류의 세포로 분화되기 때문에, I형 콜라겐을 발현하는 섬유 조직이나 X형 콜라겐을 발현하는 비대화 조직을 이식하는 것이 되어 버린다(비특허 문헌 2).
그래서, 최근, iPS세포나 ES세포라는 다능성 줄기세포로부터 연골 세포로 유도하고, 이것을 사용하는 방법이 제안되어 있다(비특허 문헌 3∼7). 그러나, 섬유 연골의 형성이나 테라토마의 형성 등 문제가 제기되고 있다. 따라서, 이들 다능성 줄기세포로부터 생체내(in vivo)에서 암을 형성하지 않고, 상질의 연골 조직을 제조하는 방법이 필요해진다.
비특허 문헌 1 : Roberts, S., et al. Knee 16, 398-404 (2009). 비특허 문헌 2 : Mithoefer, K., et al. Am. J. Sports Med. 37, 2053-2063 (2009). 비특허 문헌 3 : Koyama, N. et al. Stem cells and development 22, 102-113 (2013). 비특허 문헌 4 : Hwang, N. S., et al. PLoS ONE 3, e2498 (2008). 비특허 문헌 5 : Oldershaw, R. A. et al. Nat. Biotechnol. 28, 1187-1194 (2010). 비특허 문헌 6 : Bai, H. Y., et al. Journal of biomedical materials research. Part A 94, 539-546 (2010). 비특허 문헌 7 : Yamashita, A. et al. Scientific Reports 3 (2013).
본 발명의 과제는, 다능성 줄기세포로부터 연골 세포를 분화 유도하는 방법을 제공하는 것이다. 보다 구체적으로는, 다능성 줄기세포로부터 중배엽 세포를 유도하고, 또한, 아스코르브산, BMP2, TGFβ 및 GDF5를 포함하는 배양액 중에서 접착 배양과 부유 배양을 조합시켜 분화하는 공정을 포함하는, 연골 세포를 분화 유도하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하기 위해 예의(銳意) 검토를 행한 결과, 중배엽 세포를 유도하는 공정을 포함함으로써, 연골 세포의 유도 효율이 높아지는 것, 및 아스코르브산, BMP2, TGFβ 및 GDF5를 포함하는 배양액 중에서 접착 배양과 부유 배양을 조합함으로써, 연골 세포의 순도가 높아지는 것을 발견하고, 다능성 줄기세포로부터 양질의 연골 세포를 분화 유도할 수 있는 것을 처음으로 발견하였다. 또한, 이와 같이 얻어진 연골 세포를 동물 모델에게 이식함으로써 생착시킬 수 있는 것을 발견하였다. 본 발명은 그와 같은 지견을 기초로 하여 완성된 것이다.
즉, 본 발명은 이하의 특징을 갖는다:
[1] 다음의 공정을 포함하는 다능성 줄기세포로부터 연골 세포를 제조하는 방법:
(i) 다능성 줄기세포를 접착 배양함으로써 중배엽 세포를 유도하는 공정,
(ii) 상기 공정 (i)에서 얻어진 세포를 BMP2, TGFβ 및 GDF5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 포함하는 배양액 중에서 접착 배양하는 공정, 및
(iii) 상기 공정 (ii)에서 얻어진 세포를 BMP2, TGFβ 및 GDF5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질 포함하는 배양액 중에서 부유 배양하는 공정.
[2] 상기 공정 (iii)에서 얻어진 세포를 혈청을 함유하는 배양액 중에서 배양하는 공정을 더 포함하는, [1]에 기재된 방법.
[3] 상기 공정 (i), (ii) 및 (iii)의 공정에서 사용하는 배양액이, 1%FBS를 더 포함하는 배양액인, [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[4] 상기 공정 (iii)이, 상기 공정 (ii)으로 얻어진 세포를 분리 용액을 이용하지 않고, 부유 배양을 행하는 공정인, [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[5] 상기 공정 (i)의 중배엽 세포를 유도하는 공정이, Wnt3a 및 액티빈A를 포함하는 배양액 중에서 배양하는 공정인, [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[6] 상기 공정 (i)이, 5일 이하인, [1] 내지 [5] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[7] 상기 공정 (ii)가, 15일 이하인, [1] 내지 [6] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[8] 상기 공정 (iii)이, 10일 이상 30일 이하인, [1] 내지 [7] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[9] 상기 공정 (i)이, 3일인, [6]에 기재된 방법.
[10] 상기 공정 (ii)가, 11일인, [7]에 기재된 방법.
[11] 상기 공정 (iii)이, 14일 이상 28일 이하인, [8]에 기재된 방법.
[12] [1] 내지 [11]에 기재된 방법으로 제조된 연골 세포를 포함하는, 의약품.
[13] 상기 연골 세포가, 연골 세포와 세포외 매트릭스를 포함하는 덩어리인, [12]에 기재된 의약품.
[14] 관절 연골 손상 치료용인, [12] 또는 [13]에 기재된 의약품.
[15] 다능성 줄기세포로부터 유도된 유도 연골 세포로서,
(1) 상기 연골 세포는, COL2A1 유전자의 발현량이, 다능성 줄기세포에서의 대응하는 유전자의 발현량과 비교하여, 적어도 100배이며,
(2) 상기 연골 세포는, SOX9 유전자의 발현량이, 다능성 줄기세포에서의 대응하는 유전자의 발현량과 비교하여, 적어도 250배이며, 및
(3) 상기 연골 세포는, 외래 유전자가 도입되어 있지 않은(단, iPS세포의 제조에 사용한 유전자는 제외하고), 상기 유도 연골 세포.
[16] 입체 구조를 가지는 연골상조직(chondroid tissue)으로서,
상기 연골상조직은, 외막 및 상기 외막에 내포된 내용물로 구성되어 있고,
상기 외막은, COL1 선유를 포함하지만, COL2 선유를 포함하지 않고,
상기 외막의 두께가, 10㎛ 이상 50㎛ 이하이며,
상기 내용물이, COL11 선유, COL2 선유, 프로테오글리칸 및 제15항에 기재된 세포를 포함하는, 상기 연골상조직.
본 발명에 의해 다능성 줄기세포(예를 들면, iPS세포)로부터 양질인 연골 세포로 효율적으로 유도하는 것이 처음으로 가능하게 되었다. 본 발명의 방법으로 제조된 연골 세포는, 연골의 재생 의료에 사용될 수 있다.
도 1은, Col11A2의 프로모터 활성에 의해 EGFP를 발현시키는 Col11a2-EGFP-IRES-Puro의 컨스트럭트의 모식도를 나타낸다.
도 2는, iPS세포주에 Col11a2-EGFP-IRES-Puro를 도입한 Col11a2 유전자 리포터 iPS세포를 SCID 마우스의 피하에 주입했을 때 얻어진 테라토마의 조직 염색상을 나타낸다.
도 3은, 다능성 줄기세포로부터 연골 세포를 유도하는 프로토콜의 모식도를 나타낸다.
도 4의 a는, Col11a2 유전자 리포터 iPS세포 및 야생형 iPS세포를 각 조건(A, ABT 및 ABTG)을 이용하여 유도한 day14의 위상차 현미경상(위쪽 이미지) 및 형광 현미경상(아랫쪽 이미지)을 나타낸다. 도 4의 b는, Col11a2 유전자 리포터 iPS세포를 각 조건(A, ABT 및 ABTG)을 이용하여 유도한 day28에서의 세포의 SOX9, AGGRECAN, COL2A1 및 COL11A2의 발현량을 RT-PCR로 계측한 결과를 나타낸다. 도면 중 연골세포(Chondrocyte)는 양성 대조로서 Cell Applications, Inc로부터 구입한 사람 연골 세포(402RD-R10f)의 결과를 나타낸다. 도 4의 c는, 각 조건(A, ABT 및 ABTG)을 이용하여 유도한 day42에서의 HE 염색 및 사프라닌 O 염색상을 나타낸다.
도 5는, 종래의 방법(Micromass) 및 본 발명의 프로토콜에 따라 유도한 day28의 세포에서의 SOX9, AGGRECAN, COL2A1 및 COL11A2에 대한 RT-PCR의 결과를 나타낸다.
도 6의 a는, 본 발명의 프로토콜에 따라 유도한 day28의 미립자의 HE 염색 및 사프라닌 O 염색상을 나타낸다. 도 6의 b는, 본 발명의 프로토콜에 따라 유도한 day42의 미립자의 HE 염색, 사프라닌 O 염색, II형 콜라겐의 염색 및 I형 콜라겐의 염색상을 나타낸다. 도 6의 c는, 본 발명의 프로토콜(day42로부터 혈청 함유 배지로 교환)에 따라 유도한 day70의 미립자의 HE 염색, 사프라닌 O 염색, II형 콜라겐의 염색 및 I형 콜라겐의 염색상을 나타낸다. 도 6의 d는, 본 발명의 프로토콜(day42로부터 혈청 함유 배지로 교환)에 따라 유도한 day56 및 day70의 미립자의 SOX9의 염색상을 나타낸다. 도 6의 e는, 본 발명의 프로토콜(day42로부터 혈청 함유 배지로 교환)에 따라 유도한 day56의 미립자의 GFP의 형광 현미경상을 나타낸다. 도 6의 f는, 본 발명의 프로토콜(day42로부터 혈청 함유 배지로 교환)에 따라 유도한 경우의 전체 세포수에 대한 SOX9 양성 세포수의 함유율을 계시적으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 7의 a는, 본 발명의 프로토콜 중 day42로부터 연골 배지인 채로 변경된 배양 프로토콜에 따라 유도한 day70의 미립자의 HE 염색, 사프라닌 O 염색, II형 콜라겐의 염색 및 I형 콜라겐의 염색상을 나타낸다. 도 7의 b는, 본 발명의 프로토콜 중 day42로부터 연골 배지인 채로 변경된 배양 프로토콜에 따라 유도한 day140의 미립자의 HE 염색, 사프라닌 O 염색, II형 콜라겐의 염색 및 I형 콜라겐의 염색상을 나타낸다.
도 8은, 본 발명의 프로토콜 중 day14로부터 day42에 있어서 접착 배양한 변경 프로토콜에 따라 유도한 day42의 미립자의 HE 염색, 사프라닌 O 염색상을 나타낸다.
도 9의 a는, day42에서의 배양 접시의 바닥면에 접착한 세포의 위상차 현미경상(좌측 이미지) 및 형광 현미경상(우측 도면)을 나타낸다. 도 9의 b는, day42에서의 본 발명의 프로토콜에 따라 유도한 미립자 및 배양 접시의 바닥면에 접착한 세포에서의 SOX9, AGGRECAN, COL2A1 및 COL11A2에 대한 RT-PCR의 결과를 나타낸다. 각 유전자의 발현량은, 베타-액티빈(ACTB)의 발현량에 의해 표준화하고, 재분화된 연골 세포 또는 섬유아세포(Fibroblast)의 값을 대조로 하여 산출하였다.
도 10의 a는, 본 발명의 프로토콜에 따라 유도한 연골 세포(day0으로부터 day70), 사람 연골 세포(Cartilage) 및 종래의 방법에 따라 유도한 연골 세포(differ 2W 또는 HDF 또는 Bone)에서 각 유전자의 RT-PCR 결과를 나타낸다. 결과는, 베타-액티빈(ACTB)의 발현량에 의해 표준화하고, HDF, 분화 2주째의 세포, 정상(正常) 관절 연골 세포, 또는 정상 골세포의 값을 대조로 하여 산출하였다. 값은, n=3의 평균값을 나타낸다. 도 10의 b는, 본 발명의 프로토콜에 따라 유도한 각각의 시기(day0으로부터 day70)에서의 생세포수(마름모꼴) 및 세포 생존률(원)의 그래프를 나타낸다.
도 11의 a는, 본 발명의 프로토콜에 따라 유도한 day42의 미립자를 SCID 마우스의 피하에 투여한지 12주 후의 미립자의 HE 염색, 사프라닌 O 염색, II형 콜라겐의 염색 및 I형 콜라겐의 염색상을 나타낸다. 도 11의 b는, 본 발명의 프로토콜에 따라 유도한 day42의 미립자를 SCID 마우스의 피하에 투여한지 12주 후의 미립자의 SOX9의 염색상을 나타낸다. 도 11의 c는, 본 발명의 프로토콜에 따라 유도한 day42의 미립자를 SCID 마우스의 피하에 투여한지 12주 후의 미립자의 사람 VIMENTIN 및 DAPI의 염색상 및 위상차 현미경상을 나타낸다. 도 11의 d는, 본 발명의 프로토콜에 따라 유도한 day42의 미립자를 SCID 마우스의 피하에 투여한지 4주 후 및 12주 후의 각각의 조직에서의 사람 베타-액티빈(ACTB) 및 마우스 베타-액티빈(Actb)의 발현량을 RT-PCR로 측정한 결과 나타낸다.
도 12는, iPS세포 유래의 세포를 피하 이식한 후의 조직에서, HE 염색(위쪽 이미지), 사프라닌 O 염색(중앙 이미지) 및 X형 콜라겐 항체에서의 면역 염색(아랫쪽 이미지) 결과를 나타낸다. 우측 이미지는, 좌측 이미지의 프레임 내의 확대도이며, 스케일 바는 좌측 이미지에서는 500㎜, 중앙 및 우측 이미지에서는 50㎜를 나타낸다.
도 13의 a는, 본 발명의 프로토콜에 따라 유도한 day28 미립자를 SCID 래트의 관절에 투여한지 1주 후(좌측 이미지) 및 4주 후(우측 이미지)의 HE 염색 및 사람 VIMENTIN 면역 염색상 및 톨루이딘블루 염색 및 II형 콜라겐의 면역 염색상을 나타낸다. 도 13의 b는, 본 발명의 프로토콜에 따라 유도한 day28 미립자를 SCID 래트의 관절에 투여한지 1주 후(좌측 이미지) 및 4주 후(우측 이미지)의 HE 염색 및 II형 콜라겐의 면역 염색상을 나타낸다. 도 13의 c는, 본 발명의 프로토콜에 따라 유도한 day28 미립자를 SCID 래트의 관절에 투여한지 4주 후 및 12주 후의 각각의 조직에서의 사람 베타-액티빈 (ACTB) 및 래트 베타-액티빈(Actb)의 발현량을 RT-PCR로 측정한 결과를 나타낸다.
본 발명을 이하에 상세하게 설명한다.
본 발명은, 다음의 공정을 포함하는 다능성 줄기세포로부터 연골 세포를 제조하는 방법을 제공한다;
(i) 다능성 줄기세포를 접착 배양함으로써 중배엽 세포를 유도하는 공정,
(ii) 상기 공정 (i)에서 얻어진 세포를 BMP2, TGFβ 및 GDF5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 포함하는 배양액 중에서 접착 배양하는 공정, 및
(iii) 상기 공정 (ii)에서 얻어진 세포를 BMP2, TGFβ 및 GDF5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 포함하는 배양액 중에서 부유 배양하는 공정.
본 발명에서 사용 가능한 다능성 줄기세포는, 생체에 존재하는 모든 세포로 분화 가능한 다능성을 가지고, 또한 증식능도 겸비한 줄기세포이며, 이것에, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 배아줄기(ES)세포, 핵이식에 의해 얻어지는 클론배아 유래의 배아줄기(ntES)세포, 정자줄기세포(「GS세포」), 배아성생식세포(「EG세포」), 인공 다능성 줄기(iPS)세포, 배양 섬유아세포나 골수줄기세포 유래의 다능성 세포(Muse세포) 등이 포함된다. 바람직한 다능성 줄기세포는, ES세포, ntES세포, 및 iPS세포이다.
(A) 배아성줄기세포
ES세포는, 사람이나 마우스 등의 포유동물의 초기 배아(예를 들면, 척추 동물의 배반포)의 내부 세포괴(細胞塊)로부터 수립된, 다능성과 자기 복제에 의한 증식능을 가지는 줄기세포이다.
ES세포는, 수정란의 8세포기, 상실배(桑實胚) 후의 배아인 배반포의 내부 세포괴에서 유래한 배아 유래의 줄기세포이며, 성체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화하는 능력, 이른바 분화 다능성과, 자기 복제에 의한 증식능을 가지고 있다. ES세포는, 마우스에서 1981년에 발견되었고[M. J. Evans and M. H. Kaufman(1981), Nature 292 : 154-156], 그 후, 사람, 원숭이 등의 영장류에서도 ES세포주가 수립되었다[J. A. Thomson et al. (1998), Science 282 : 1145-1147; J. A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92 : 7844-7848; J. A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55 : 254-259; J. A. Thomson and V. S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38: 133-165].
ES세포는, 대상 동물의 수정란의 배반포로부터 내부 세포괴를 취출하고, 내부 세포괴를 섬유아세포의 피더 상에서 배양함으로써 수립할 수 있다. 또한, 계대배양에 의한 세포의 유지는, 백혈병 억제 인자[leukemia inhibitory factor (LIF)], 염기성 섬유아세포 성장 인자[basic fibroblast growth factor (bFGF)] 등의 물질을 첨가한 배양액을 사용하여 행할 수 있다. 사람 및 원숭이의 ES세포의 수립과 유지 방법에 대해서는, 예를 들면, USP5, 843, 780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92: 7844-7848; Thomson JA, et al. (1998), Science. 282: 1145-1147; H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., 345: 926-932; M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 9554-9559; H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222: 273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 1580-1585; Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444: 481-485 등에 기재되어 있다.
ES세포 제작을 위한 배양액으로서, 예를 들면, 0.1mM 2-메르캅토에탄올, 0.1mM 비필수 아미노산, 2mM L-글루타민산, 20% KSR 및 4ng/ml bFGF를 보충한 DMEM/F-12 배양액을 사용하고, 37℃, 2% CO2/98% 공기의 습윤 분위기 하에서 사람 ES세포를 유지할 수 있다[O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 215-224]. 또한, ES세포는, 3∼4일 간격으로 계대할 필요가 있고, 이 때, 계대는, 예를 들면, 1mM CaCl2 및 20% KSR를 함유하는 PBS 중의 0.25% 트립신 및 0.1mg/ml 콜라게나아제 IV를 사용하여 행할 수 있다.
ES세포의 선택은, 일반적으로, 알칼리포스파타아제, Oct-3/4, Nanog 등의 유전자 마커의 발현을 지표(指標)로 하여 Real-Time PCR법으로 행할 수 있다. 특히, 사람 ES세포의 선택에서는, OCT-3/4, NANOG, ECAD 등의 유전자 마커의 발현을 지표로 할 수 있다[E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 443-452].
사람 ES세포주는, 예를 들면, WA01(H1) 및 WA09(H9)는, WiCell Research Institute로부터, KhES-1, KhES-2 및 KhES-3은, 쿄토 대학 재생 의과학 연구소(쿄토, 일본)로부터 입수 가능하다.
(B) 정자줄기세포
정자줄기세포는, 정소 유래의 다능성 줄기세포이며, 정자 형성을 위한 기원이 되는 세포이다. 이 세포는, ES세포와 마찬가지로, 각종 계열의 세포로 분화 유도 가능하며, 예를 들면, 마우스 배반포에 이식하면 키메라 마우스(chimera mouse)를 만들어 낼 수 있는 등의 성질을 갖는다[M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69: 612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119: 1001-1012). 신경교세포계 유래 신경 영양 인자[glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)]를 포함하는 배양액에서 자기 복제 가능하고, 또한 ES세포와 동일한 배양 조건 하에서 계대를 반복함으로써, 정자줄기세포를 얻을 수 있다[타케바야시 마사노리 (2008), 실험 의학, 26권, 5호(증간), 41∼46페이지, 요도샤(도쿄, 일본)].
(C) 배성 생식세포
배성 생식세포는, 태생기의 시원(始原) 생식세포로부터 수립되는, ES세포와 같은 다능성를 가지는 세포이며, LIF, bFGF, 줄기세포 인자(stem cell factor) 등의 물질의 존재 하에서 시원 생식세포를 배양함으로써 수립할 수 있다[Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70: 841-847; J. L. Resnick et al. (1992), Nature, 359: 550-551].
(D) 인공 다능성 줄기세포
인공 다능성 줄기(iPS)세포는, 특정한 초기화 인자를, DNA 또는 단백질의 형태로 체세포에 도입함으로써 제작할 수 있는, ES세포와 대략 동등한 특성, 예를 들면, 분화 다능성과 자기 복제에 의한 증식능을 가지는 체세포 유래의 인공의 줄기세포이다[K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. 외, Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008);국제 공개 WO 2007/069666]. 초기화 인자는, ES세포에 특이적으로 발현하고 있는 유전자, 그 유전자 산물 또는 비암호화(non-cording) RNA 또는 ES세포의 미분화 유지에 중요한 역할을 행하는 유전자, 그 유전자 산물 또는 비암호화 RNA, 또는 저분자 화합물로 구성해도 된다. 초기화 인자에 포함되는 유전자로서, 예를 들면, Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, 베타-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 또는 Glis1 등이 예시되고, 이들의 초기화 인자는, 단독으로 사용해도 되고, 조합시켜 사용해도 된다. 초기화 인자의 조합으로서는, WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/101084, WO2009/101407, WO2009/102983, WO2009/114949, WO2009/117439, WO2009/126250, WO2009/126251, WO2009/126655, WO2009/157593, WO2010/009015, WO2010/033906, WO2010/033920, WO2010/042800, WO2010/050626, WO 2010/056831, WO2010/068955, WO2010/098419, WO2010/102267, WO 2010/111409, WO 2010/111422, WO2010/115050, WO2010/124290, WO2010/147395, WO2010/147612, Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528, Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26: 2467-2474, Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26: 1269-1275, Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574, Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3: 475-479, Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135, Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11: 197-203, R. L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27: 459-461, Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106: 8912-8917, Kim JB, et al. (2009), Nature. 461: 649-643, Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 491-503, Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6: 167-74, Han J, et al. (2010), Nature. 463: 1096-100, Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28: 713-720, Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474: 225-9.에 기재된 조합이 예시된다.
상기 초기화 인자에는, 히스톤 디아세틸라제(HDAC) 저해제[예를 들면, 발프로산(VPA), 트리코스타틴(A), 부티르산 나트륨, MC 1293, M344 등의 저분자 저해제, HDAC에 대한 siRNA 및 shRNA(예, HDAC1 siRNA Smartpool((Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene) 등) 등의 핵산성 발현 저해제 등], MEK 저해제(예를 들면, PD184352, PD98059, U0126, SL327 및 PD0325901), 글리코겐 신타제 키나아제-3 저해제(예를 들면, Bio 및 CHIR99021), DNA 메틸트랜스퍼라아제 저해제(예를 들면, 5-아자시티딘), 히스톤 메틸트랜스퍼라아제 저해제(예를 들면, BIX-01294 등의 저분자 저해제, Suv39hl, Suv39h2, SetDBl 및 G9a에 대한 siRNA 및 shRNA 등의 핵산성 발현 저해제 등), L-채널 칼슘 작용제(예를 들면, Bayk8644), 부티르산, TGFβ 저해제 또는 ALK5 저해제(예를 들면, LY364947, SB431542, 616453 및 A-83-01), p53 저해제(예를 들면, p53에 대한 siRNA 및 shRNA), ARID3A 저해제(예를 들면, ARID3A에 대한 siRNA 및 shRNA), miR-291-3 p, miR-294, miR-295 및 mir-302 등의 miRNA, Wnt Signaling(예를 들면, soluble Wnt3a), 신경 펩티드 Y, 프로스타그란딘류(예를 들면, 프로스타그란딘 E2 및 프로스타그란딘 J2), hTERT, SV40LT, UTF1, IRX6, GLISl, PITX2, DMRTBl 등의 수립 효율을 높이는 것을 목적으로 이용되는 인자도 포함되어 있고, 본 명세서에 있어서는, 이들의 수립 효율의 개선 목적에 의해 이용된 인자에 대해서도 초기화 인자와 특별한 구별을 하지 않는 것으로 한다.
초기화 인자는, 단백질 형태의 경우, 예를 들면, 리포펙션, 세포막 투과성 펩티드(예를 들면, HIV 유래의 TAT 및 폴리아르기닌)와의 융합, 마이크로인젝션 등의 방법에 의해 체세포 내에 도입해도 된다.
한편, DNA의 형태의 경우, 예를 들면, 바이러스, 플라스미드, 인공 염색체 등의 벡터, 리포펙션, 리포솜, 마이크로인젝션 등의 방법에 의해 체세포 내에 도입할 수 있다. 바이러스 벡터로서는, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터(이상, Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007), 아데노바이러스 벡터(Science, 322, 945-949, 2008), 아데노수반바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터(WO 2010/008054) 등이 예시된다. 또한, 인공 염색체 벡터로서는, 예를 들면, 사람 인공 염색체(HAC), 효모 인공 염색체(YAC), 세균 인공 염색체(BAC, PAC) 등이 포함된다. 플라스미드로서는, 포유동물 세포용 플라스미드를 사용할 수 있다(Science, 322: 949-953, 2008). 벡터에는, 핵초기화 물질이 발현 가능하도록, 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 서열, 터미네이터, 폴리아데닐화 사이트 등의 제어 서열을 포함할 수 있고, 또한 필요에 따라, 약제 내성 유전자(예를 들면, 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자 등), 티미딘키나아제 유전자, 디프테리아톡신 유전자 등의 선택 마커 서열, 녹색 형광 단백질(GFP), β-글루쿠로니다아제(GUS), FLAG 등의 리포터 유전자 서열 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 벡터에는, 체세포로의 도입 후, 초기화 인자를 코딩하는 유전자 또는 프로모터와 거기에 결합하는 초기화 인자를 코딩하는 유전자를 함께 절제하기 위하여, 이들의 전후에 LoxP 서열을 가져도 된다.
또한, RNA 형태의 경우, 예를 들면, 리포펙션, 마이크로인젝션 등의 방법에 의해 체세포 내에 도입해도 되고, 분해를 억제하기 위하여, 5-메틸시티딘 및 슈도우리딘(pseudouridine)(TriLink Biotechnologies)를 도입한 RNA를 사용해도 된다[Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7: 618-630].
iPS세포 유도를 위한 배양액로서는, 예를 들면, 10∼15%FBS를 함유하는 DMEM, DMEM/F12 또는 DME 배양액(이들 배양액에는, LIF, 페니실린/스트렙토마이신, 퓨로마이신, L-글루타민, 비필수 아미노산류, β-메르캅토에탄올 등을 적절히 더 포함할 수 있음) 또는 시판 중인 배양액[예를 들면, 마우스 ES세포 배양용 배양액(TX-WES 배양액, 트론보X사), 영장류 ES세포 배양용 배양액(영장류 ES/iPS세포용 배양액, 리프로셀사), 무혈청 배지(mTeSR, Stemcell Technology사)]등이 포함된다.
배양법의 예로서는, 예를 들면, 37℃, 5% CO2 존재 하에서, 10% FBS함유 DMEM 또는 DMEM/F12 배양액 상에서 체세포와 초기화 인자를 접촉시켜 약 4∼7일간 배양하고, 그 후, 세포를 피더 세포(예를 들면, 마이트마이신C 처리 STO 세포, SNL 세포 등) 상에 다시 뿌리고, 체세포와 초기화 인자의 접촉으로부터 약 10일 후부터 bFGF 함유 영장류 ES세포 배양용 배양액에서 배양하고, 상기 접촉으로부터 약 30일∼약 45일 또는 그 이상 후에 iPS모양 콜로니를 생기게 할 수 있다.
또는, 37℃, 5% CO2 존재 하에서, 피더 세포(예를 들면, 마이트마이신C 처리 STO 세포, SNL 세포 등) 상에서 10% FBS함유 DMEM 배양액(여기에는 LIF, 페니실린/스트렙토마이신, 퓨로마이신, L-글루타민, 비필수 아미노산류, β-메르캅토에탄올 등을 적절히 더 포함할 수 있음)에서 배양하고, 약 25일∼약 30일 또는 그 이상 이후에 ES 모양 콜로니를 생기게 할 수 있다. 바람직하게는, 피더 세포 대신에, 초기화된 체세포 자체를 이용하거나(Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4: e8067 또는 WO2010/137746), 또는 세포외 기질[예를 들면, 라미닌(Laminin)-5(WO2009/123349) 및 마트리겔(BD사)]을 이용하는 방법이 예시된다.
이 외에도, 혈청을 함유하지 않은 배지를 이용하여 배양하는 방법도 예시된다(Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106: 15720-15725). 또한, 수립 효율을 올리기 위하여, 저산소 조건(0.1% 이상, 15% 이하의 산소 농도)에 의해 iPS 세포를 수립해도 된다(Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 237-241 또는 WO2010/013845).
상기 배양 동안에는, 배양 개시 2일째 이후부터 매일 1회 신선한 배양액으로 배양액 교환을 행한다. 또한, 핵초기화에 사용하는 체세포의 세포수는, 한정되지 않지만, 배양 디쉬 100cm2당 약 5×103∼약 5×106 세포의 범위이다.
iPS세포는, 형성한 콜로니의 형상에 따라 선택할 수 있다. 한편, 체세포가 초기화된 경우에 발현하는 유전자(예를 들면, Oct3/4, Nanog)와 연동하여 발현하는 약제 내성 유전자를 마커 유전자로서 도입한 경우에는, 대응하는 약제를 포함하는 배양액(선택 배양액)에서 배양을 행함으로써 수립한 iPS세포를 선택할 수 있다. 또한, 마커 유전자가 형광 단백질 유전자인 경우에는 형광 현미경으로 관찰함으로써, 발광 효소 유전자인 경우에는 발광 기질을 가함으로써, 또한, 발색 효소 유전자인 경우에는 발색 기질을 가함으로써, iPS세포를 선택할 수 있다.
본 명세서 중에서 사용하는 「체세포」라는 용어는, 난자, 난모세포, ES세포 등의 생식 계열 세포 또는 분화 전능성 세포를 제외한 모든 종류의 동물세포(바람직하게는, 사람을 포함하는 포유동물 세포)를 말한다. 체세포에는, 비한정적으로, 태아(새끼)의 체세포, 신생아(새끼)의 체세포, 및 성숙한 건전한 체세포 또는 질환성의 체세포 중 어느 것이라도 포함되고, 또한, 초대 배양 세포, 계대 세포, 및 주화(株化) 세포 중 어느 것이라도 포함된다. 구체적으로는, 체세포는, 예를 들면 (1) 신경줄기세포, 조혈줄기세포, 간엽계 줄기세포, 치수(齒隨)줄기세포 등의 조직 줄기세포[체성(體性)줄기세포], (2) 조직 전구세포, (3) 임파구, 표피세포, 내피세포, 근육세포, 섬유아세포(피부세포 등), 모세포, 줄기세포, 위점막세포, 장세포, 비세포(脾細胞), 췌장세포(췌장외분비세포 등), 뇌세포, 폐세포, 신장세포(腎細胞) 및 지방세포 등의 분화한 세포 등이 예시된다.
또한, iPS세포를 이식용 세포의 재료로서 사용하는 경우, 거부 반응이 일어나지 않는다는 관점에서, 이식 전의 개체의 HLA 유전자형이 동일 또는 실질적으로 동일한 체세포를 사용하는 것이 바람직하다. 여기서, 「실질적으로 동일」이란, 이식한 세포에 대하여 면역 억제제에 의해 면역 반응을 억제할 수 있을 정도로 HLA 유전자형이 일치하고 있는 것이며, 예를 들면, HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 3가지 유전자좌 또는 HLA-C를 부가한 4가지 유전자좌가 일치하는 HLA형을 가지는 체세포이다.
(E) 핵이식에 의해 얻어진 클론배아 유래의 ES세포
ntES 세포는, 핵이식 기술에 의해 제작된 클론배아 유래의 ES세포이며, 수정란 유래의 ES세포와 거의 동일한 특성을 가지고 있다[T. Wakayama et al. (2001), Science, 292: 740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72: 932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450: 497-502]. 즉, 미수정란의 핵을 체세포의 핵으로 치환함으로써 얻어진 클론배아 유래의 배반포의 내부 세포괴로부터 수립된 ES세포가 ntES(nuclear transfer ES)세포이다. ntES 세포의 제작을 위해서는, 핵이식 기술(J. B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16: 642-646)과 ES세포 제작 기술(상기)의 조합이 이용된다[와카야마 사야카 외(2008), 실험 의학, 26권, 5호(증간), 47∼52페이지]. 핵이식에 있어서는, 포유동물의 핵을 제거한 미수정란에, 체세포의 핵을 주입하고, 수시간 배양함으로써 초기화할 수 있다.
(F) 다계통-분화 스트레스 내성 세포(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells), (Muse 세포)
Muse 세포는, WO2011/007900에 기재된 방법에 의해 제조된 다능성 줄기세포이며, 상세하게는, 섬유아세포 또는 골수간질세포를 장시간 트립신 처리, 바람직하게는 8시간 또는 16시간 트립신 처리한 후, 부유 배양함으로써 얻어지는 다능성을 가진 세포이며, SSEA-3 및 CD105가 양성이다.
본 발명에 있어서, 연골 세포란, 콜라겐 등 연골을 구성하는 세포외 매트릭스를 생성하는 세포, 또는 이와 같은 세포로 되는 전구세포를 의미한다. 또한, 이와 같은 연골 세포는, 연골 세포 마커를 발현하는 세포이어도 되고, 연골 세포 마커로서 II형 콜라겐(COL2A1) 또는 SOX9가 예시된다. 본 발명에 있어서, COL2A1에는, NCBI의 수탁 번호(accession number)로서, 사람의 경우, NM_001844 또는 NM_033150, 마우스의 경우, NM_001113515 또는 NM_031163에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가지는 유전자 및 상기 유전자로 코딩되는 단백질, 및 이들의 기능을 가지는 천연에 존재하는 변이체가 포함된다. 본 발명에 있어서, SOX9에는, NCBI의 수탁 번호로서, 사람의 경우, NM_000346, 마우스의 경우, NM_011448에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가지는 유전자 및 상기 유전자에 코딩되는 단백질, 및 이들의 기능을 가지는 천연에 존재하는 변이체가 포함된다.
(i) 다능성 줄기세포를 접착 배양에 의해 중배엽 세포를 유도하는 공정
본 발명에 있어서, 중배엽 세포란, 동물의 발생기의 원장배기(原腸胚期)에 있어서, 내배엽과 외배엽 사이에 발생하는 세포를 의미하고, 바람직하게는, BRACHYURY가 양성인 세포를 의미한다. 본 발명에 있어서, BRACHYURY에는, NCBI의 수탁 번호로서, 사람의 경우, NM_001270484 또는 NM_003181, 마우스의 경우, NM_009309에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가지는 유전자 및 상기 유전자에 코딩되는 단백질, 및 이들의 기능을 가지는 천연에 존재하는 변이체가 포함된다.
본 발명에 있어서, 다능성 줄기세포로부터 중배엽 세포를 유도하는 방법은, 특별히 한정되지 않지만, 액티빈 A 및 GSK-3β 저해제를 함유하는 배양액에서 배양하는 방법이 예시된다.
본 공정 (i)에서는, 바람직하게는, 다능성 줄기세포를 피더 세포를 포함하지 않는 조건 하에서 접착 배양하고, 적절한 크기(1∼ 2×105 세포를 함유하는 세포괴)로 된 시점에서, 액티빈 A 및 GSK-3β 저해제를 함유하는 배양액으로 교환하여 배양하는 방법이다.
본 발명에 있어서, 접착 배양이란, 세포외 기질에 의해 코팅 처리된 배양 용기를 사용하여 배양함으로써 행할 수 있다. 코팅 처리는, 세포외 기질을 함유하는 용액을 배양 용기에 넣은 후, 상기 용액을 적절히 제거함으로써 행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 세포외 기질이란, 세포 밖에 존재하는 초분자 구조체이며, 천연 유래이어도 되고, 인공물(재조합체)이어도 된다. 예를 들면, 콜라겐, 프로테오글리칸, 피브로넥틴, 히알루론산, 테나신, 엔탁틴, 엘라스틴, 피브릴린, 라미닌과 같은 물질 또는 이들의 단편(斷片)을 들 수 있다. 이들의 세포외 기질은, 조합하여 이용해도 되고, 예를 들면, BD Matrigel(TM) 등의 세포로부터의 조제물(調製物)이어도 된다. 인공물로서는, 라미닌의 단편이 예시된다. 본 발명에 있어서, 라미닌이란, α사슬, β사슬, γ사슬을 각각 하나씩 가지는 헤테로 3량체 구조를 가지는 단백질이며, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, α사슬은, α1, α2, α3, α4 또는 α5이며, β사슬은, β1, β2 또는 β3이며, 및 γ사슬은, γ1, γ2 또는 γ3이 예시된다. 본 발명에 있어서, 라미닌의 단편이란, 인테그린 결합 활성을 가지고 있는 라미닌의 단편이면, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 엘라스타제에 의해 소화하여 얻어지는 단편인 E8 프래그먼트가 예시된다.
본 공정 (i)에 있어서 이용되는 배양액은, 동물세포의 배양에 사용되는 기초 배지에 액티빈 A 및 GSK-3β 저해제를 첨가하여 조제할 수 있다. 기초 배지로서는, 예를 들면, IMDM 배지, Medium 199배지, Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM) 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 및 이들의 혼합 배지 등을 들 수 있다. 배지에는, 혈청(예를 들면, FBS)이 함유되어 있어도 되고, 또는 무혈청이어도 된다. 필요에 따라, 예를 들면, 알부민, 트랜스페린, KnockOut Serum Replacement(KSR)(ES세포 배양시의 FBS의 혈청 대체물)(Invitrogen), N2 서플리먼트(Invitrogen), B27 서플리먼트(Invitrogen), 지방산, 인슐린, 아셀렌산나트륨, 콜라겐 전구체(前驅體), 미량 원소, 2-메르캅토에탄올, 3'-티올글리세롤 등의 하나 이상의 혈청 대체물을 포함해도 되고, 지질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산(NEAA), 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염 류 등의 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. 본 공정의 한 실시 형태에 있어서, 기초 배지는, 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, 및 1% 혈청을 포함하는 DMEM/F12이다.
본 공정 (i)에 있어서, 액티빈(Activin) A에는, 사람 및 다른 동물 유래의 액티빈 A, 및 이들의 기능적 개변체(改變體)가 포함되고, 예를 들면, R&D systems사 등에서 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 액티빈 A의 농도는, 0.1ng/ml로부터 1000ng/ml, 바람직하게는, 1ng/ml로부터 100ng/ml, 더욱 바람직하게는, 5ng/ml로부터 50ng/ml, 10ng/ml이다.
본 공정 (i)에 있어서, GSK-3β 저해제는, GSK-3β의 기능, 예를 들면, 키나아제 활성을 직접 또는 간접적으로 저해할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, Wnt3a, 인디루빈 유도체인 BIO(별명, GSK-3β 저해제 IX; 6-브로모인디루빈-3'-옥심), 말레이미드 유도체인 SB216763(3-(2, 4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온), 페닐α브로모메틸케톤 화합물인 GSK-3β 저해제 VII(4-디브로모아세트페논), 세포막 투과형 인산화 펩티드인 L803-mts(별명, GSK-3β 펩티드 저해제; Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2) 및 높은 선택성을 가지는 CHIR99021(Nature (2008) 453: 519-523)을 들 수 있다. 이들 화합물은, 예를 들면, Stemgent, Calbiochem나 Biomol사 등으로부터 입수 가능하며, 또한 자체 제작해도 된다. 본 공정에서 사용하는 바람직한 GSK-3β 저해제로서는, Wnt3a를 들 수 있다. Wnt3a에는, 사람 및 다른 동물 유래의 Wnt3a, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되고, 예를 들면, R&D systems사 등에서 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 GSK-3β 저해제의 농도는, 사용하는 GSK-3β 저해제에 따라, 당업자가 적절히 선택 가능하지만, 예를 들면, GSK-3β 저해제로서 Wnt3a를 사용하는 경우, 0.1ng/ml로부터 1000ng/ml, 바람직하게는, 1ng/ml로부터 100ng/ml, 더욱 바람직하게는, 5ng/ml로부터 50ng/ml, 10ng/ml이다.
본 공정 (i)에 있어서, 배양 온도는 특별히 한정되지 않지만, 약 30∼40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO2 함유 공기의 분위기 하에서 배양이 행해진다. CO2 농도는, 약 2∼5%, 바람직하게는 약 5%이다. 본 공정의 배양 시간은, 예를 들면, 5일 이하의 배양이며, 바람직하게는 3일이다.
(ii) 상기 공정 (i)에서 얻어진 세포를 BMP2 , TGFβ 및 GDF5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 포함하는 배양액 중에서 접착 배양하는 공정
본 공정 (ii)에서는, 상기 공정 (i)에서 얻어진 세포 배양물의 배양액을 제거하고, BMP2, TGFβ 및 GDF5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 함유하는 배양액을 첨가하여 행할 수 있다. 따라서, 상기 공정 (i)에 있어서 세포 배양물은, 배양 접시에 접착하고 있기 때문에, 본 공정 (ii)은 접착 배양에 의해 행할 수 있다.
본 공정 (ii)에 있어서 이용되는 배양액은, 동물세포의 배양에 사용되는 기초 배지에 BMP2, TGFβ 및 GDF5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 첨가하여 조제할 수 있다. 바람직하게는, 적어도 TGFβ를 포함하는 배양액, BMP2 및 TGFβ를 포함하는 배양액, 아스코르브산, BMP2 및 TGFβ를 포함하는 배양액, GDF5, BMP2 및 TGFβ를 포함하는 배양액, 또는 아스코르브산, BMP2, TGFβ 및 GDF5를 포함하는 배양액이며, 더욱 바람직하게는, bFGF, 아스코르브산, BMP2, TGFβ 및 GDF5를 포함하는 배양액이다. 기초 배지로서는, 예를 들면, IMDM 배지, Medium 199배지, Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지, αMEM 배지, Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM) 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640배지, Fischer's 배지, 및 이들의 혼합 배지 등을 들 수 있다. 배지에는, 혈청(예를 들면, FBS)이 함유되어 있어 도 되고, 또는 무혈청이어도 된다. 필요에 따라, 예를 들면, 알부민, 트랜스페린, KSR(KnockOut Serum Replacement)(ES세포 배양 시의 FBS의 혈청 대체물)(Invitrogen), N2 서플리먼트(Invitrogen), B27 서플리먼트(Invitrogen), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올, 3'-티올글리세롤 등의 하나 이상의 혈청 대체물을 포함해도 되고, 지질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산(NEAA), 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 등의 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. 본 공정의 하나의 실시 형태에 있어서, 기초 배지는, 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, 및 1% 혈청을 포함하는 DMEM이다.
본 공정 (ii)에 있어서, bFGF에는, 사람 및 다른 동물 유래의 bFGF, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되고, 예를 들면, WAKO사 등의 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 bFGF의 농도는, 0.1ng/ml로부터 1000ng/ml, 바람직하게는, 1ng/ml로부터 100ng/ml, 더욱 바람직하게는, 5ng/ml로부터 50ng/ml, 10ng/ml이다.
본 공정 (ii)에 있어서, 아스코르브산은, 예를 들면, Nakarai사 등의 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 아스코르브산의 농도는, 5㎍/ml로부터 500㎍/ml, 바람직하게는, 10㎍/ml로부터 100㎍/ml, 더욱 바람직하게는, 50㎍/ml이다.
본 공정 (ii)에 있어서, BMP2에는, 사람 및 다른 동물 유래의 BMP2, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되고, 예를 들면, Osteopharma사 등의 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 BMP2의 농도는, 0.1ng/ml로부터 1000ng/ml, 바람직하게는, 1ng/ml로부터 100ng/ml, 더욱 바람직하게는, 5ng/ml로부터 50ng/ml, 10ng/ml이다. 본 발명에 있어서, BMP2는, BMP4로 치환해도 된다.
본 공정 (ii)에 있어서, TGFβ에는, 사람 및 다른 동물 유래의 TGFβ, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되고, 예를 들면, PeproTech사 등의 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 TGFβ의 농도는, 0.1ng/ml로부터 1000ng/ml, 바람직하게는, 1ng/ml로부터 100ng/ml, 더욱 바람직하게는, 5ng/ml로부터 50ng/ml, 10ng/ml이다.
본 공정 (ii)에 있어서, GDF5에는, 사람 및 다른 동물 유래의 GDF5, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되고, 예를 들면, PeproTech사 등의 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 GDF5의 농도는, 0.1ng/ml로부터 1000ng/ml, 바람직하게는, 1ng/ml로부터 100ng/ml, 더욱 바람직하게는, 5ng/ml로부터 50ng/ml, 10ng/ml이다.
본 공정 (ii)에 있어서, 배양 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 약 30∼40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO2함유 공기의 분위기 하에서 배양이 행해진다. CO2 농도는, 약 2∼5%, 바람직하게는 약 5%이다. 본 공정의 배양 시간은, 예를 들면, 15일 이하의 배양이며, 바람직하게는 11일이다.
(iii) 상기 공정 (ii)에서 얻어진 세포를 BMP2 , TGFβ 및 GDF5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 포함하는 배양액 중에서 부유 배양하는 공정
본 공정 (iii)은, 상기 공정 (ii)에서 얻어진 세포 배양물을 배양 용기로부터 박리시켜, 부유 배양함으로써 행할 수 있다. 본 공정 (iii)에 있어서, 세포 배양물을 박리하는 방법은, 역학적 분리 방법(피펫팅 등)에 의해 행하는 것이 바람직하고, 프로테아제 활성 및/또는 콜라게나아제 활성을 가지는 분리 용액[예를 들면, 트립신과 콜라게나아제의 함유 용액 Accutase(TM) 및 Accumax(TM)(Innovative Cell Technologies, Inc)를 들 수 있음]을 사용하지 않는 방법이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서 사용되는 부유 배양이란, 세포를 배양 접시에 비접착의 상태로 배양하는 것이며, 특별히 한정은 되지 않지만, 세포와의 접착성을 향상시킬 목적으로 인공적으로 처리(예를 들면, 세포외 매트릭스 등에 의한 코팅 처리)되어 있지 않은 배양 용기, 또는 인공적으로 접착을 억제하는 처리를[예를 들면, 폴리하이드록시에틸메타크릴산(poly-HEMA)에 의한 코팅 처리] 한 배양 용기를 사용하여 행하는 것이 바람직하다.
본 공정 (iii)에 있어서 사용되는 배양액은, 동물세포의 배양에 사용되는 기초 배지에 BMP2, TGFβ 및 GDF5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 첨가하여 조제할 수 있다. 바람직하게는, 적어도 TGFβ를 포함하는 배양액, BMP2 및 TGFβ를 포함하는 배양액, 아스코르브산, BMP2 및 TGFβ를 포함하는 배양액, GDF5, BMP2 및 TGFβ를 포함하는 배양액, 또는 아스코르브산, BMP2, TGFβ 및 GDF5를 포함하는 배양액이며, 더욱 바람직하게는, 아스코르브산, BMP2, TGFβ 및 GDF5를 포함하는 배양액이다. 기초 배지로서는, 예를 들면, IMDM 배지, Medium 199배지, EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium) 배지, αMEM 배지, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium) 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640배지, Fischer's 배지, 및 이들의 혼합 배지 등을 들 수 있다. 배지에는, 혈청(예를 들면, FBS)이 함유되어 있어도 되고, 또는 무혈청이어도 된다. 필요에 따라, 예를 들면, 알부민, 트랜스페린, KSR(KnockOut Serum Replacement)(ES세포 배양 시의 FBS의 혈청 대체물)(Invitrogen), N2 서플리먼트(Invitrogen), B27 서플리먼트(Invitrogen), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올, 3'-티올글리세롤 등의 하나 이상의 혈청 대체물을 포함해도 되고, 지질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산(NEAA), 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 등의 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. 본 공정의 하나의 실시 형태에 있어서, 기초 배지는, 인슐린, 트랜스페린, 아셀렌산나트륨, 및 1% 혈청을 포함하는 DMEM이다.
본 공정 (iii)에 있어서, 아스코르브산은, 예를 들면, Nakarai사 등의 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 아스코르브산의 농도는, 5㎍/ml로부터 500㎍/ml, 바람직하게는, 10㎍/ml로부터 100㎍/ml, 더욱 바람직하게는, 50㎍/ml이다.
본 공정 (iii)에 있어서, BMP2에는, 사람 및 다른 동물 유래의 BMP2, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되고, 예를 들면, Osteopharma사 등의 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 BMP2의 농도는, 0.1ng/ml로부터 1000ng/ml, 바람직하게는, 1ng/ml로부터 100ng/ml, 더욱 바람직하게는, 5ng/ml로부터 50ng/ml, 10ng/ml이다.
본 공정 (iii)에 있어서, TGFβ에는, 사람 및 다른 동물 유래의 TGFβ, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되고, 예를 들면, PeproTech사 등의 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 TGFβ의 농도는, 0.1ng/ml로부터 1000ng/ml, 바람직하게는, 1ng/ml로부터 100ng/ml, 더욱 바람직하게는, 5ng/ml로부터 50ng/ml, 10ng/ml이다.
본 공정 (iii)에 있어서, GDF5에는, 사람 및 다른 동물 유래의 GDF5, 및 이들의 기능적 개변체가 포함되고, 예를 들면, PeproTech사 등의 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 본 공정에서 사용하는 GDF5의 농도는, 0.1ng/ml로부터 1000ng/ml, 바람직하게는, 1ng/ml로부터 100ng/ml, 더욱 바람직하게는, 5ng/ml로부터 50ng/ml, 10ng/ml이다.
본 공정 (iii)에 있어서, 배양 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 약 30∼40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO2 함유 공기의 분위기 하에서 배양이 행해진다. CO2 농도는, 약 2∼5%, 바람직하게는 약 5%이다. 본 공정의 배양 시간은, 예를 들면, 10일 이상 30일 이하의 배양이며, 바람직하게는 14일 이상 28일 이하이다.
(iv) 상기 공정 (iii)에서 얻어진 세포를 더 부유 배양하는 공정
상기 공정 (iii)에 의하여, 연골 세포를 제조하는 것이 가능하지만, 보다 성숙한 연골 세포를 얻기 위하여, 상기 공정 (iii)에서 얻어진 세포 배양물을 더 부유 배양해도 된다.
본 공정 (iv)에 있어서 사용되는 배양액은, 동물세포의 배양에 사용되는 기초 배지이다. 기초 배지로서는, 예를 들면, IMDM 배지, Medium 199 배지, EMEM(Eagle's Minimum Essential Medium) 배지, αMEM 배지, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium) 배지, Ham's F12 배지, RPMI 1640 배지, Fischer's 배지, 및 이들의 혼합 배지 등을 들 수 있다. 배지에는, 혈청(예를 들면, FBS)이 함유되어 있어도 되고, 또는 무혈청이어도 된다. 필요에 따라, 예를 들면, 알부민, 트랜스페린, KSR(KnockOut Serum Replacement)(ES세포 배양 시의 FBS의 혈청 대체물)(Invitrogen), N2 서플리먼트(Invitrogen), B27 서플리먼트(Invitrogen), 지질, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올, 3'-티올글리세롤 등의 하나 이상의 혈청 대체물을 포함해도 되고, 지방질, 아미노산, L-글루타민, GlutaMAX(Invitrogen), 비필수 아미노산(NEAA), 비타민, 증식 인자, 저분자 화합물, 항생 물질, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염류 등의 하나 이상의 물질도 함유할 수 있다. 본 공정의 하나의 실시 형태에 있어서, 기초 배지는, 10% 혈청을 포함하는 DMEM이다.
본 공정 (iv)에 있어서, 배양 온도는, 특별히 한정되지 않지만, 약 30∼40℃, 바람직하게는 약 37℃이며, CO2함유 공기의 분위기 하에서 배양이 행해진다. CO2 농도는, 약 2∼5%, 바람직하게는 약 5%이다. 본 공정의 배양 시간은, 특히 장기간에 걸쳐서 연골 세포의 제조에 문제가 발생하지 않기 때문에, 예를 들면, 20일 이상의 배양 기간이 예시되고, 바람직하게는 28일 이상이다.
본 발명은, 전술한 바와 같이 다능성 줄기세포로부터 유도된 유도 연골 세포를 제공한다. 상기 유도 연골 세포는, 이하의 (1)로부터 (3)의 특징을 가지는 세포이다;
(1) 상기 연골 세포는, COL2A1 유전자의 발현량이, 다능성 줄기세포에서의 대응하는 유전자의 발현량과 비교하여, 적어도 100배이며,
(2) 상기 연골 세포는, SOX9 유전자의 발현량이, 다능성 줄기세포에서의 대응하는 유전자의 발현량과 비교하여, 적어도 250배이며, 및
(3) 상기 연골 세포는, 외래 유전자가 도입되어 있지 않다(단, iPS세포의 제조에 사용한 외래 유전자는 제외함).
본 발명에 있어서, COL2A1 유전자의 발현량 및 SOX9 유전자의 발현량은, 단위 세포당 mRNA의 양으로서, 당업자에게 주지의 방법에 의해 측정될 수 있다. 측정 방법으로서는, RT-PCR법, 노던 블로팅(northern blotting)법 등이 예시되고, PCR법은 후술하는 실시예에서 상세하게 나타낸다.
본 발명에서 제공하는 유도 연골 세포에서의 COL2A1 유전자 발현량은, 다능성 줄기세포의 상기 유전자의 발현량과 비교하여, 적어도 50배 이상, 100배 이상, 150배 이상, 200배 이상, 250배 이상, 260배 이상, 270배 이상, 280배 이상, 290배 이상, 300배 이상, 400배 이상, 500배 이상, 600배 이상, 700배 이상, 800배 이상, 900배 이상, 또는 1000배 이상인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 280배 이상이다.
본 발명에서 제공하는 유도 연골 세포에서의 SOX9 유전자 발현량은, 다능성 줄기세포의 상기 유전자의 발현량과 비교하여, 적어도 50배 이상, 100배 이상, 150배 이상, 200배 이상, 250배 이상, 260배 이상, 270배 이상, 280배 이상, 290배 이상, 300배 이상, 400배 이상, 500배 이상, 600배 이상, 700배 이상, 800배 이상, 900배 이상, 또는 1000배 이상인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 500배 이상이다.
본 발명에서 제공하는 유도 연골 세포는, 상기 공정 (iv)에서 사용하는 배양액에서 배양할 수 있다. 배양 온도 이외의 조건도 또한, 상기 공정 (iv)와 동일하다.
본 발명은, 상기한 유도 연골 세포를 배양함으로써 얻어지는 입체 구조를 가지는 연골상조직을 제공한다. 상기 연골상조직은, 외막 및 상기 외막에 내포된 내용물로 구성되어 있고, 상기 외막은, COL1 선유(線維)를 포함하지만, COL2 선유를 포함하지 않고, 상기 외막의 두께가, 10㎛ 이상 50㎛ 이하이며, 상기 내용물이 Col11 선유, Col2 선유, 프로테오글리칸 및 상기 유도 연골 세포를 포함한다.
본 발명이 제공하는 연골상조직은, 직경이 0.5㎜ 이상, 5㎜ 이하의 구형(球形)의 물질이지만, 상기 구형의 물질을 융합하는 것이 가능하므로, 장축(長徑)이 적어도 0.5㎜ 이상이면, 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 외막의 두께는, 연골상조직이 생체 내의 관절에 의해 허용할 수 있는 역학적 강도를 가지고 있고, 생체 내로 이식했을 때, 상기 이식부의 조직과 유합할 수 있는 한 특별히 두께는 한정되지 않지만, 예를 들면, 10㎛ 이상 50㎛ 이하, 15㎛ 이상 40㎛ 이하, 20㎛ 이상 30㎛ 이하를 들 수 있다. 외막의 두께는, 연골상조직의 절편을 준비하고, COL1에 대한 항체로 염색한 후, 상기 염색 부분의 현미경상으로부터 측정할 수 있다. 측정에 사용하는 절편은, 바람직하게는, 상기 연골상조직의 면적이 최대가 되도록 절단된 절편이다. 외막의 두께는, 하나의 연골상조직의 절편에 있어서 균일하지 않은 경우, 상기 절편에서의 최대값을 외막의 두께로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, COL1 선유란, COL1 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 3중 나선 구조를 형성하고 있는 선유이다.
본 발명에 있어서, COL2 선유란, COL2 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 3중 나선 구조를 형성하고 있는 선유이다.
본 발명에 있어서, COL11 선유란, COL11 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 3중 나선 구조를 형성하고 있는 선유이다.
본 발명에 있어서, 프로테오글리칸이란, 코어 단백질의 아미노산인 세린과 당질(자일로스, 갈락토오스, 글루쿠론산)이 결합하고, 콘드로이틴황산 등의 이당 단위로 연속하는 다당체가 결합한 화합물이다.
본 발명에서는, 전술한 방법에 의해 얻어진 연골 세포를 포함하는 의약품을 제공한다. 환자에 대한 의약품의 투여 방법으로서는, 예를 들면, 전술한 방법에 의해 얻어진 연골 세포로 생성된 세포외 매트릭스로 이루어지는 배양물(미립자)을 피브린 글루(fibrin glue)로 고정하여, 투여 부위에 적절한 크기의 연골 세포로 생성된 세포외 매트릭스로 이루어지는 배양물로 하고, 환자의 연골 결손(缺損) 부위에 투여하는 방법이 있다. 이 외에도, 미립자를 젤라틴 겔 및/또는 콜라겐 겔 및/또는 히알루론산 겔 등과 혼합하여, 환부에 투여하는 방법, 미립자를 간부(幹部)에 투여하고, 골막 등으로 고정시키는 방법 등이 예시된다.
본 의약품에 의해 치료되는 질환으로서, 비연골·이개연골 등의 안면 연골 및 관절 연골의 결손이 예시되고, 바람직하게는, 관절 연골 손상이다.
본 발명에 있어서, 본 의약품에 포함되는 미립자의 수는, 이식편이 투여 후에 생착 가능하면 특별히 한정되지 않고, 환부의 크기나 체구의 크기에 맞추어 적절히 증감하여 조제되어도 된다.
이하에 실시예를 들어 본 발명를 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들에 한정되지 않는 것은 아니다.
[실시예]
사람 iPS세포
Nature Methods 8, 409-412 (2011)에 기재된 에피솜 벡터(episomal vector) 에 의한 초기화 인자 도입법을 이용하여 사람 피부 선유아세포로부터 수립한 409 B2주, HDF-11주, KF4009-1주, 및 사람 말초혈로부터 수립한 604B1주의 합계 4주의 사람 iPS세포를 이후의 실험에 사용하였다. 그리고, 409B2주[Nat Methods. 8, 409-412(2011)] 및 604B1주[Stem Cells. 31, 458-466(2013)]는, 쿄토 대학 iPS세포 연구소로부터 수령했다. 수립한 iPS세포는, 피더 세포(마이트마이신 C 처리를 행한 SNL 세포) 상에 다시 접종하고, 사람 ES세포 유지 배지를 첨가한 후에 유지 배양을 행하였다. 사람 ES세포 유지 배지는, DMEM/F12(Sigma), 20% KSR(Invitrogen), 2mML-글루타민(Invitrogen), 1×10-4M 비필수 아미노산(Invitrogen), 1×10-4M 2-메르캅토에탄올(Invitrogen), 50units/ml 페니실린(Invitrogen), 50mg/ml 스트렙토마이신(Invitrogen), 4ng/ml bFGF(WAKO)를 혼합함으로써 조제하였다. 그 후, iPS세포를 마트리겔(Invitrogen) 코트 디쉬 상에 접종하고, Essential 8배지(Life Technologies)에 50 units/ml 페니실린 및 50 mg/ml 스트렙토마이신을 첨가한 배지를 가하여, 피더 프리 환경 하에서 유지 배양을 행하였다. 피더 프리 유지 배양을 개시하여 10∼15일째에, 1∼2×105 세포로 이루어지는 콜로니를 사용하여 이하에 상세하게 설명하는 연골 세포로의 분화 유도를 행하였다.
RNA의 단리와 정량 리얼타임 RT- PCR
RT-PCR를 실시하기 위한 RNA는, 원하는 세포로부터 RNeasy Mini Kit (Qiagen)을 사용하여, 컬럼 내에서 DNaeI에서의 소화하는 조건 하에서 제조업자의 프로토콜에 따라 회수되었다. 미립자 내의 세포로부터 RNA를 회수하는 경우, 모르타르 처리에 의해 동질화한 후에 회수하였다. 템플레이트로서 사용하므로, 전체 RNA 중 500ng를 ReverTra Ace(TOYOBO)을 사용하여 cDNA로 변환하였다. 리얼타임 PCR는, KAPA SYBR FAST qPCR kit Master Mix ABI prism (KAPA BIOSYSTEMS)을 사용하여 Step One system (ABI)에 의해 행해졌다. PCR에 사용한 프라이머(primer)를, 이하에 나타낸다.
프라이머명 서열
ACTB F TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC(서열 번호: 1)
ACTB R GCACAGCTTCTCCTTAATGTCACGC(서열 번호: 2)
OCT3/4 FGACAACAATGAGAACCTTCA(서열 번호: 3)
OCT3/4 R TTCTGGCGCCGGTTACAGAA(서열 번호: 4)
NANOG F CAAAGGCAAACAACCCACTT(서열 번호: 5)
NANOG R CTGGATGTTCTGGGTCTGGT(서열 번호: 6)
BRACHYURY F TATGAGCCTCGAATCCACATAGT(서열 번호: 7)
BRACHYURY R CCTCGTTCTGATAAGCAGTCAC(서열 번호: 8)
KDR F GGCCCAATAATCAGAGTGGCA(서열 번호: 9)
KDR R CCAGTGTCATTTCCGATCACTTT(서열 번호: 10)
SOX5 F CAGCCAGAGTTAGCACAATAGG(서열 번호: 11)
SOX5 R CTGTTGTTCCCGTCGGAGTT(서열 번호: 12)
SOX6 F GGATGCAATGACCCAGGATTT(서열 번호: 13)
SOX6 R TGAATGGTACTGACAAGTGTTGG(서열 번호: 14)
SOX9 F AGACCTTTGGGCTGCCTTAT(서열 번호: 15)
SOX9 R TAGCCTCCCTCACTCCAAGA(서열 번호: 16)
AGGRECAN F TGAGGAGGGCTGGAACAAGTACC(서열 번호: 17)
AGGRECAN R GGAGGTGGTAATTGCAGGGAACA(서열 번호: 18)
COL2A1 F TTTCCCAGGTCAAGATGGTC(서열 번호: 19)
COL2A1 R CTTCAGCACCTGTCTCACCA(서열 번호: 20)
COL11A2 F TGTGATGACTACGGGGACAA(서열 번호: 21)
COL11A2 R CCATATTCCTCTGCCTGGAA(서열 번호: 22)
LUBRICIN F AAAGTCAGCACATCTCCCAAG(서열 번호: 23)
LUBRICIN R GTGTCTCTTTAGCGGAAGTAGTC(서열 번호: 24)
IHH F AACTCGCTGGCTATCTCGGT(서열 번호: 25)
IHH R GCCCTCATAATGCAGGGACT(서열 번호: 26)
COL10A1 F ATGCTGCCACAAATACCCTTT(서열 번호: 27)
COL10A1 R GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT(서열 번호: 28)
COL1A1 F GTCGAGGGCCAAGACGAAG(서열 번호: 29)
COL1A1 R CAGATCACGTCATCGCACAAC(서열 번호: 30)
COL1A2 F AATTGGAGCTGTTGGTAACGC(서열 번호: 31)
COL1A2 R CACCAGTAAGGCCGTTTGC(서열 번호: 32)
OSTEOCALCIN F CACTCCTCGCCCTATTGGC(서열 번호: 33)
OSTEOCALCIN R CCCTCCTGCTTGGACACAAAG(서열 번호: 34)
Taqman human ACTB Hs01060665-gl
Taqman mouse Actb Mn00607939-sl
Taqman rat Actb Rn00667869-ml
eGFP COL11A2 F CATACAATGGGGTACCTTCTGG(서열 번호: 35)
eGFP COL11A2 R GCATGGACGAGCTGTACAAGTAA(서열 번호: 36)
연골 세포 특이적으로 GFP 발현을 행하는 iPS세포의 제작
연골 세포 특이적 Col11a2 유전자(XI형 콜라겐 α2사슬 유전자)의 프로모터/인핸서에 결합한 트랜스진의 컨스트럭트(Col11a2-EGFP-IRES-Puro, 도 1 참조)를 포함하는 piggyBac 벡터를 사람 iPS세포에 도입하였다. 도입으로부터 10일 후에, Col11a2 유전자 특이적으로 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 리포터 iPS세포주를 선별했다. 선별된 iPS세포주로의 리포터 유전자의 도입은, RT-PCR에 의해 확인하였다. 선별된 Col11a2 유전자 리포터 iPS세포를 SCID 마우스의 피하에 주입함으로써 형성된 테라토마를 채취하여 조직 염색을 행한 바, 연골, 장관(腸管), 신경 조직의 형성이 확인되었으나, 특히 연골 세포 특이적인 발현을 나타내는 것도 함께 확인되었다(도 2).
연골 세포로의 분화 유도의 최적화
전술한 피더 프리 유지 배양을 개시하고 10∼15일째의 Col11a2 유전자 리포터 iPS세포의 배지를 중배엽 배지[DMEM/F12에 대하여 10ng/ml Wnt3A(R&D), 10ng/ml 액티빈A(R&D), 1% 인슐린-트랜스페린-아셀렌산나트륨(Invitrogen), 1% 우태아 혈청, 50 units/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신을 혼합하여 조제]로 교환하여 3일간 배양을 행하였다(day3). 그 후, DMEM/F12에 대하여 1% 인슐린-트랜스페린-아셀렌산나트륨, 1% FBS, 50units/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신을 혼합한 조제 용액에 이하 (1)∼(3)으로 나타낸 각각의 조성의 연골 유도용 첨가제를 가하여, 분화 유도 개시로부터 14일째(day14)까지 배양을 행하였다. 그리고, 이 14일간의 배양 공정은, 모두 접착 배양법에 의해 행하였다. 또한, day3∼day14에 증식을 촉진하기 위해 10ng/ml bFGF를 부가하였다.
(1) A: 50㎍/ml 아스코르브산(Nakarai)
(2) ABT: 50㎍/ml 아스코르브산, 10ng/ml BMP2(Osteopharma) 및 10ng/ml TGFβ(Pepro Tech)의 혼합 용액
(3) ABTG: 50㎍/ml 아스코르브산, 10ng/ml BMP2(Osteopharma), 10ng/ml TGFβ(Pepro Tech) 및 10ng/ml GDF5의 혼합 용액
day14에 있어서, 위상차 현미경에 의해 관찰한 바(도 4의 a), 첨가제 ABT 및 첨가제 ABTG를 부가한 세포 분화 배양의 경우에는 세포가 적층한 구조를 이루는 세포 소괴(小塊)의 형성이 인지되었지만, (1)의 조건 하인 아스코르브산만을 부가한 경우에는 소괴의 형성은 인지되지 않았다.
그리고, 본 명세서에 있어서, 분화 유도 공정에서 배양 기간을 나타내기 위해 사용되는 「day0」, 「day3」, 「day10」, 「day14」, 「day15」, 「day21」, 「day28」, 「day42」, 「day52」, 「day56」, 「day70」, 「day140」는 각각, 「분화 유도의 개시일」, 「분화 유도의 개시로부터 3일째」, 「분화 유도의 개시로부터 10일째」, 「분화 유도의 개시로부터 14일째」, 「분화 유도의 개시로부터 15일째」, 「분화 유도의 개시로부터 21일째」, 「분화 유도의 개시로부터 28일째」, 「분화 유도의 개시로부터 42일째」, 「분화 유도의 개시로부터 52일째」, 「분화 유도의 개시로부터 56일째」, 「분화 유도의 개시로부터 70일째」, 「분화 유도의 개시로부터 140일째」를 의미한다.
분화 유도 개시로부터 14일째(day14)에, 디쉬 상의 세포 소괴를 피펫팅에 의해 박리하고, 페트리 디쉬 상에 옮겨, 같은 배지에서 부유 배양을 행하였다. 세포 소괴는, 연골 세포외 기질(ECM)의 작용에 의한 접착능 저하에 의해 쉽게 박리가 가능했다. 이 때 배지 교환은 2∼7일 간격으로 행하였다. 분화 유도 개시로부터 28일째(day28)에, 얻어진 미립자의 RNA를 추출하고, 리얼타임 PCR를 사용하여 연골 세포 마커 유전자의 발현량을 계측하였다(도 4의 b). 그 결과, 연골 세포 마커 유전자가 유의(有意)하게 상승하고 있던 점에서, ABTG를 첨가한 연골 배지를 사용하는 것이 연골 세포 유도에 유효한 것으로 확인되었다. 분화 유도 개시로부터 42일째(day42)에 얻어진 미립자를 연골 기질을 염색하는 사프라닌 O에 의해 염색하고, 광학 현미경으로 관찰했다(도 4의 c). 그 결과, ABTG 첨가 배지를 사용하여 배양을 행한 세포 미립자가 가장 강하게 사프라닌 O에 의해 염색되었다.
이들의 결과로부터, day3∼day14에서의 접착 배양 공정, 및 day14∼day42에서의 부유 배양 공정에 있어서, ABTG를 첨가제로서 사용한 배양액이 연골 세포를 얻는 데에 가장 효율적인 것이 판명되었기 때문에, 이후의 실험에서 ABTG를 첨가제로서 사용하는 것으로 했다.
다른 사람 iPS세포주(409B2주, HDF-11주, KF4009-1주, 및 604B1주)에 있어서도 동일한 프로토콜에 의해 연골 세포의 유도가 가능한 것을 확인하였다(day42).
또한, 종래 기술인 부유 배양 공정(Micromass 형성)에서 연골 세포를 유도하는 방법[Sci Rep. 3, 1978(2013)]과 배양 day0∼day3의 중배엽의 유도 공정(Wnt3A 및 액티빈A를 첨가한 배지에서 접착 배양하는 공정)을 포함하는 본 발명의 프로토콜의 방법에 의해 얻어진 연골 세포를 RT-PCR에 의해, 연골 세포 마커 유전자를 비교한 바, 중배엽 유도 공정을 포함하는 프로토콜 쪽이 유의하게 이들의 마커 유전자의 발현량이 많았다(도 5). 이 결과로부터, iPS세포로부터 중배엽으로의 유도 공정은, 연골 세포 유도에 유용한 것으로 나타났다.
미립자의 평가
도 3에 기재된 세포 분화 배양 프로토콜에 의하여, iPS세포를 유도하고, day28, day42, day70 및 day140에서 얻어진 미립자를 조직 염색에 의해 평가했다(도 6). 그리고, day3∼day42에 사용한 연골 배지에는, DMEM/F12에 대하여 1% 인슐린-트랜스페린-아셀렌산나트륨, 1% 우태아 혈청, 50units/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신 및 ABTG를 첨가한 조제 용액을 사용하였다. 그 결과, day28의 미립자는, 사프라닌 O으로 약간 염색되는 ECM에 의해 둘러싸여 있는 것이 확인되었다(도 6의 a). day42에서의 미립자는, 사프라닌 O에 의해 강하게 염색된 점에서, ECM도 성숙 상태에 있는 것을 알 수 있었다. 단, I형 콜라겐과 II형 콜라겐 모두가 ECM에 함유되어 있었다. 한편, day42까지 사용한 연골 배지를 사용하여 배양을 계속한 바, day70 또는 day140에서는, I형 콜라겐의 발현이 유지되고 있었지만(도 7의 a 및 도 7의 b), day42 이후에, 연골 배지를 DMEM 및 10% 우태아 혈청만으로 조성된 통상 배지로 교환하여, 배양을 계속한 바, day70에서 I형 콜라겐의 발현이 저하되고, II형 콜라겐의 발현이 증대하였다(도 6의 b 및 도 6의 c). 단, X형 콜라겐의 발현은 검출 한계 이하였다. 또한, 미립자의 표층부는, I형 콜라겐의 발현량의 증대가 확인되었다. 이와 같은 변화는, 연골 배지에서 배양을 계속했을 때는 관찰되지 않았다. 이것은, 표층부에 의해, 미립자의 내부에서의 유리 연골로의 성숙에 기여하기 때문으로 생각된다. 연골 세포에 특이적으로 발현하는 SOX9를 지표로서 day56 및 day70에서의, 표층부를 제외한 미립자 내의 SOX9 양성의 세포수를 조사한 바(도 6의 d), 미립자 내의 연골 세포 밀도는 각각 91.8%±0.91% 및 99.7%±0.2%로 시간 경과와 함께 증가하는 것이 확인되었다(도 6의 f). 또한, day56에서의 COLIIA2-EGFP는 거의 모든 세포에서 양성인 것이 확인되었다(도 6의 e). 이들의 결과로부터, 미립자의 3차원 구조는, 연골 배지에서의 계속 배양을 필요로 하지 않는 유리 연골의 성숙화에 중요하며 효과적인 것이 시사되었다.
부유 배양에 의한 효과
본 발명의 프로토콜에 있어서, day14 이후는 부유 배양에 의해 행해졌으나, day14 이후에도 접착 배양을 계속하였더니, day42에서도 거의 연골 형성이 확인되지 않았다(도 8). 이 결과로부터, 부유 배양은 연골의 성숙화를 촉진시키는 것이 시사되었다. 그런데, day14에서 부유 배양하기 위해 세포를 배양 접시로 옮겨 배양을 계속 하면, 배양 접시의 바닥면은 접착한 세포로 덮인다. 이 배양 접시 바닥면의 세포는, 방추형(紡錘形)의 형상을 하고 있고, COL11A2-EGFP는 음성이었다(도 9의 a). 이들의 세포를 RT-PCR로 측정한 바, 연골 세포 마커 유전자의 발현은 거의 확인할 수 없었다(도 9의 b). 따라서, 원하는 연골 세포 이외의 세포가 배양 접시에 접착함으로써, 부유 배양에 의해 연골 세포가 농축된다고 생각된다.
연골 세포의 분화 유도 공정에서의 경시적 관측
본 프로토콜은, 세포 분화 배양의 당초부터 연골 배지를 사용하지 않고, 생체 내에서 중배엽으로부터 연골 세포로의 발생계를 모방하기 위하여, day0∼day3에 서는 연골 배지가 아니라 중배엽 배지를 사용하는 점을 장점으로 하였다. 그래서, 배지의 교환과 함께, 분화 배양 중의 사람 iPS세포에 어떠한 변화가 관찰되는지, 다능성 마커, 중배엽 마커 및 연골 세포 마커를 사용하여, 분화 유도 개시로부터 특정 일수마다 세포의 경시적 관측을 행하였다. 관측 결과를 도 10의 a에 나타낸다.
day0에서의 관측 후, 중배엽 배지로 하여 Wnt3a 및 액티빈A를 가하였더니, day3의 세포에 있어서 다능성 마커의 발현량이 감소하고, 초기 단계의 중배엽 상태에 고유의 마커인 BRACHYURY의 발현량이 일과(一過)적으로 증가하였다. 이어서, day3에 중배엽 배지를 연골 배지로 전환한 바, day7∼day14에 걸쳐 다능성 마커의 발현량이 더 감소하고, 중배엽에 고유의 마커인 KDR의 발현량이 day7에서 일과적으로 증가하였다. 또한, 배양을 계속된 미립자에서는, 연골 세포 또는 세포외 매트릭스에 특이적인 지표인 AGGRECAN, COL2A1, LUBRICIN 등의 발현량이, 포지티브 컨트롤로서 사용한 관절 연골의 발현량을 상회하는 현상이 관찰되었다. 한편, 연골 비대와 관련된 지표인 IHH 및 COL10A1의 발현은, 포지티브 컨트롤로서 사용한 관절 연골과는 다르게 거의 관측되지 않았다.
한편, 각 시기에 있어서, 생세포수를 측정하고, 시간 경과에 따른 변화를 계측하였다(도 10의 b). 생세포는, 트리판 블루 염색에 의해 계측하였다. 그 결과, day0∼day3까지의 사이에, 배양에 의해 세포 분열이 개시하고 있음에도 불구하고, 세포수가 증가하지 않고, 생세포의 감소가 확인되는 것으로부터, 이 조건 하에서는, 비중배엽 세포는 사멸하여, 중배엽 세포가 농축된다는 점이 시사되었다. 그 후 세포수는 14일까지 증가를 계속하였다. day14에 있어서, 접착 배양으로부터 부유 배양으로 변경하였지만, 본 실시예에서는, 부유하고 있는 미립자의 세포수를 계측했기 때문에, day14에서 세포수의 감소가 관찰되었다. 전체 배양 공정 종료 후의 생세포수는, day0에서의 사람 iPS세포의 세포수의 약 7배였다. day0에서의 사람 iPS세포의 평균 세포수는 1.6±0.1×105/35㎜디쉬, day14에서의 평균 생존 세포수는 9.0±0.72×105/35㎜디쉬였다. 그 중, 미립자를 구성하게 된 평균 세포수는 4.06±0.04×105였다. 이 세포수는 day42에는 10.4±0.2×105에 도달하였다.
1디쉬당 평균 미립자 수는 14.6±3.96이었다. 또한, 미립자의 평균 직경은, day21에 있어서 0.69±0.2㎜, day28에 있어서 0.8±0.16㎜, day42에 있어서 1.13±0.18㎜, day70에 있어서 1.4±0.47㎜였다.
그리고, 본 프로토콜에 있어서 사용한 FBS량은, 연골 세포가 생존 유지하기 위한 최저량의 성장 인자를 공급하는 양이므로, 본 조건 하에서는 비연골 세포가 사멸하고, 미립자로부터 사멸한 비연골 세포가 이탈한 것으로 생각된다. 또한, 비연골 세포는 배양 접시의 바닥면에 축적되기 때문에, 부유하고 있는 미립자만을 추출하면, 별도 선별(sorting)을 행하지 않고 양호한 순도로 연골 세포를 얻을 수 있게 된다. 또한, 접착 배양으로부터 부유 배양으로 이행할 때도, 연골 세포는 윤활성이 있어 용이하게 박리할 수 있는 데에 대하여, 비연골 세포는 배양 접시 바닥면에 접착도가 높기 때문에, 동일 공정에 있어서도 연골 세포와 비연골 세포의 접착력의 차이에 기초하여 양호한 순도로 연골 세포를 선별하는 것이 가능해진다.
마우스에서의 종양 형성의 확인
상기에 의해 얻어진 사람 iPS세포 유래의 연골 세포의 생체내(in vivo) 환경 하에서의 기능 해석을 위하여, SCID 마우스의 피하에 day42에서의 연골 세포를 주입하였다. 주입으로부터 12주 후에 조직 화학 분석을 행한 바, 전체 6개소의 주입 개소 중 4개소에서, 연골 조직의 형성이 확인되었다(도 11의 a). 이 연골 조직 중, 96.4±0.84%가 SOX9 양성 세포였다(도 11의 b). 또한, SOX9 발현에 의해 유리 연골의 형성이 확인된 연골 조직은, I형 콜라겐의 발현에 의해 표층의 형성이 인지되는 것이었다. 또한, 비사람 유래의 비멘틴 항체를 사용하여 면역 염색을 행한 바, 피하 형성 조직 중 유리 연골 부위에 대해서는 사람 iPS세포 유래이고, 주위의 막층에 대해서는 마우스 유래인 것을 알 수 있었다(도 11의 c). 연골 세포를 이식한 모든 부위에 있어서도, 종양의 형성은 확인되지 않고, 또한 종양 형성의 징조가 되는 조직 변화 도 관찰할 수 없었다. 이들의 결과로부터, 사람 iPS세포 유래의 연골 세포는, 생체내(in vivo) 환경에 있어서 유리 연골을 조직 형성하고, 적어도 12주간은 동일 조직 형태를 유지할 수 있는 것을 알 수 있었다.
또한, SCID 마우스의 경부, 복강, 겨드랑이 림프절, 서혜부(鼠蹊部) 림프절을 포함하는 각 조직 및 림프절에 있어서 사람 β엑틴 mRNA는 검출되지 않았기 때문에, 조직 전이의 가능성도 부정되었다(도 11의 d). 따라서, day42에서의 사람 iPS세포 유래의 연골 세포는 이식 용도에 적절한 세포인 것이 시사되었다.
생체내(in vivo)에서의 장기 평가
전술한 바와 마찬가지로 SCID 마우스의 피하에 day42에서의 연골 세포를 주입하고, 12개월 후에 이식 부위를 취출하고, 조직 화학 분석을 행하였다. 그 결과, 여섯 예 전부에 있어서, X형 콜라겐의 발현에 의하여, 연골의 일부가 비대화되고 있는 것이 확인되었다(도 12). 다섯 예에 있어서, 연골의 대부분은 골단연골 모양의 형태를 유지하면서, 연골의 일부가 골 모양 조직으로 치환되어 있는 것이 확인되었다. 이들 결과에 의해, 본 발명으로 얻어진 사람 iPS세포 유래의 세포는, 느리기는 하지만, 비대화되고 있는 것이 시사되었다. 이것은, 관절 연골 결손에 이식한 경우에, 연골내 골화에 기여할 가능성이 상정된다. 또한, 이식 부위에는, 12개월 후에도 테라토마나 그 외에 종양 형성은 관찰할 수 없었다.
사람 iPS세포 유래 연골 세포의 이식
SCID 래트의 관절 연골에 미리 얕은 결손 부위를 형성해 두고, day42에서의 사람 iPS세포 유래의 연골 세포를 상기 결손 부위에 이식했다. 래트의 관절 연골에 형성된 얕은 결손 부위에 이식하기 위해서는, day42에서의 윤활성을 보이는 성숙한 연골 세포 미립자는 적합하지 않았기 때문에, day28에서의 연골 세포 미립자를 사용하였다. 그 결과, 이식을 행한 전체 4개소의 무릎 부위 관절 중 3개소에 있어서, 4주간 후에도 이식 세포가 사멸하지 않고 유지되고 있었던 것을 조직 염색에 의해 확인할 수 있었다(도 13의 a). 또한, 이식 전의 관절 연골과 이식 세포가 서로 강한 친밀도로 결합되어 있는 것도 확인되었다(도 13의 b). 또한, 이식으로부터 4주 후 및 12주 후의 시점에서, 전체 4개소의 이식 개소 전부에서 종양 형성이 인지되지 않고, 또한, 전이의 흔적이 관찰되지 않은 것을 확인하였다(도 13의 c). 이로부터, day28에서의 사람 iPS세포 유래의 연골 세포는 이식에 적절한 세포인 것이 시사되었다. 한편, 결손이 깊은 경우에는, 성숙한 day42를 사용할 수 있는 것으로 생각된다.
SEQUENCE LISTING <110> KYOTO UNIVERSITY <120> NOVEL METHOD FOR INDUCING CHONDROCYTE <130> K29F5105 <150> JP 2013-228822 <151> 2013-11-01 <150> JP 2014-104162 <151> 2014-05-20 <160> 36 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 tggcaccaca ccttctacaa tgagc 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gcacagcttc tccttaatgt cacgc 25 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gacaacaatg agaaccttca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ttctggcgcc ggttacagaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 caaaggcaaa caacccactt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ctggatgttc tgggtctggt 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 tatgagcctc gaatccacat agt 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 cctcgttctg ataagcagtc ac 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 ggcccaataa tcagagtggc a 21 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 ccagtgtcat ttccgatcac ttt 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 cagccagagt tagcacaata gg 22 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 ctgttgttcc cgtcggagtt 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 ggatgcaatg acccaggatt t 21 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 tgaatggtac tgacaagtgt tgg 23 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 agacctttgg gctgccttat 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 tagcctccct cactccaaga 20 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 tgaggagggc tggaacaagt acc 23 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 ggaggtggta attgcaggga aca 23 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 tttcccaggt caagatggtc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 cttcagcacc tgtctcacca 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 tgtgatgact acggggacaa 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 ccatattcct ctgcctggaa 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 aaagtcagca catctcccaa g 21 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 gtgtctcttt agcggaagta gtc 23 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 aactcgctgg ctatctcggt 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 gccctcataa tgcagggact 20 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 atgctgccac aaataccctt t 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 ggtagtgggc cttttatgcc t 21 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 gtcgagggcc aagacgaag 19 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 cagatcacgt catcgcacaa c 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 aattggagct gttggtaacg c 21 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 caccagtaag gccgtttgc 19 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 cactcctcgc cctattggc 19 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 ccctcctgct tggacacaaa g 21 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 catacaatgg ggtaccttct gg 22 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 gcatggacga gctgtacaag taa 23

Claims (16)

  1. 하기 공정:
    (i) 다능성 줄기세포를 접착 배양함으로써 중배엽 세포를 유도하는 공정,
    (ii) 상기 공정 (i)에서 얻어진 세포를 아스코르빈산, BMP2, TGFβ 및 GDF5를 포함하는 배양액 중에서 접착 배양하는 공정, 및
    (iii) 상기 공정 (ii)에서 얻어진 세포를 아스코르빈산, BMP2, TGFβ 및 GDF5를 포함하는 배양액 중에서 부유 배양하는 공정
    을 포함하는, 다능성 줄기세포(幹細胞)로부터 연골 세포를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 공정 (iii)에서 얻어진 세포를 혈청을 함유하는 배양액 중에서 배양하는 공정을 더 포함하는, 다능성 줄기세포로부터 연골 세포를 제조하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 공정 (i), (ii) 및 (iii)의 공정에서 사용하는 배양액이, 1%FBS를 더 포함하는 배양액인, 다능성 줄기세포로부터 연골 세포를 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 공정 (iii)이, 상기 공정 (ii)에서 얻어진 세포를 분리 용액을 사용하지 않고, 부유 배양을 행하는 공정인, 다능성 줄기세포로부터 연골 세포를 제조하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 공정 (i)의 중배엽 세포를 유도하는 공정이, Wnt3a 및 액티빈A를 포함하는 배양액 중에서 배양하는 공정인, 다능성 줄기세포로부터 연골 세포를 제조하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 공정 (i)이 5일 이하로 행해지는, 다능성 줄기세포로부터 연골 세포를 제조하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 공정 (ii)가 15일 이하로 행해지는, 다능성 줄기세포로부터 연골 세포를 제조하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 공정 (iii)이 10일 이상 30일 이하로 행해지는, 다능성 줄기세포로부터 연골 세포를 제조하는 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 공정 (i)이 3일간 행해지는, 다능성 줄기세포로부터 연골 세포를 제조하는 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 공정 (ii)가 11일간 행해지는, 다능성 줄기세포로부터 연골 세포를 제조하는 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 공정 (iii)이 14일 이상 28일 이하로 행해지는, 다능성 줄기세포로부터 연골 세포를 제조하는 방법.
  12. 삭제
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102219743B1 (ko) * 2013-11-01 2021-02-23 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 신규 연골 세포 유도 방법
EP3260536B1 (en) * 2015-02-19 2022-10-26 Kyoto University Novel method for inducing chondrocyte
CN105039247B (zh) * 2015-07-13 2018-07-20 暨南大学 一种用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂及制备方法与应用
GB201621594D0 (en) * 2016-12-19 2017-02-01 Univ Leuven Kath Novel cell based methods for healing of bone, cartilage and joint disorders
CA3079500A1 (en) * 2017-10-17 2019-04-25 Hiroshima University Pluripotent stem cells inducing osteochondral repair
CN112218942A (zh) 2018-06-25 2021-01-12 赛斯特姆公司 从人诱导多能干细胞制备软骨细胞颗粒的方法及其用途
WO2020017575A1 (ja) 2018-07-19 2020-01-23 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞由来の板状軟骨およびその製造方法
JP7224001B2 (ja) * 2018-12-21 2023-02-17 国立大学法人京都大学 ルブリシン局在軟骨様組織、その製造方法及びそれを含む関節軟骨損傷治療用組成物
US20220193143A1 (en) * 2019-02-08 2022-06-23 University Of Southampton Cartilage tissue
WO2020235319A1 (ja) * 2019-05-20 2020-11-26 味の素株式会社 軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養方法
EP3872168A1 (en) 2020-02-28 2021-09-01 Cline Scientific AB Chondrocyte differentiation
CN115806933A (zh) * 2022-12-05 2023-03-17 北京大学口腔医学院 组蛋白修饰酶基因kdm3a和g9a在调控牙髓间充质干细胞成软骨及软骨修复中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011041472A (ja) * 2009-08-19 2011-03-03 Tokai Univ 細胞混合物からなる細胞移植治療用スフェロイド及びその作製方法
WO2011066403A1 (en) 2009-11-24 2011-06-03 University Of Connecticut Differentiation of human embryonic and induced pluripotents stem cells
WO2012013969A1 (en) 2010-07-26 2012-02-02 The University Of Manchester Targeted differentiation of stem cells
JP2012107035A (ja) 1999-08-05 2012-06-07 Abt Holding Co 多能性成体幹細胞およびそれを単離する方法
JP2013216661A (ja) 2006-10-23 2013-10-24 Anthrogenesis Corp 胎盤細胞集団で骨欠損を治療するための方法及び組成物

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
WO2003050250A2 (en) * 2001-12-07 2003-06-19 Geron Corporation Chondrocyte precursors derived from human embryonic stem cells
US9453219B2 (en) 2003-05-15 2016-09-27 Mello Biotech Taiwan Co., Ltd. Cosmetic designs and products using intronic RNA
US20080070303A1 (en) 2005-11-21 2008-03-20 West Michael D Methods to accelerate the isolation of novel cell strains from pluripotent stem cells and cells obtained thereby
BRPI0619794B8 (pt) 2005-12-13 2022-06-14 Univ Kyoto Uso de um fator de reprogramação, agente para a preparação de uma célula-tronco pluripotente induzida a partir de uma célula somática e métodos para preparar uma célula- tronco pluripotente induzida método e para preparar uma célula somática e uso de células-tronco pluripotentes induzidas
US20140178994A1 (en) 2006-11-21 2014-06-26 Biotime, Inc. Methods and Compositions for In Vitro and In Vivo Chondrogenesis
US8440461B2 (en) 2007-03-23 2013-05-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Reprogramming somatic cells using retroviral vectors comprising Oct-4 and Sox2 genes
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
US9102919B2 (en) 2007-08-31 2015-08-11 Whitehead Institute For Biomedical Research WNT pathway stimulation in reprogramming somatic cells with nuclear reprogramming factors
EP2096169B1 (en) 2007-10-31 2020-11-18 Kyoto University Nuclear reprogramming method
KR101532442B1 (ko) 2007-12-10 2015-06-29 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 효율적인 핵 초기화 방법
AU2008338989A1 (en) 2007-12-17 2009-06-25 Gliamed, Inc. Stem-like cells and method for reprogramming adult mammalian somatic cells
JP5945385B2 (ja) 2008-01-16 2016-07-05 リン、シー−ランLIN, Shi−Lung 誘導性組換えｒｎａ因子を用いた腫瘍のない多能性胚性幹様細胞の生成
WO2009101407A2 (en) 2008-02-11 2009-08-20 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
EP2090649A1 (en) 2008-02-13 2009-08-19 Fondazione Telethon Method for reprogramming differentiated cells
US20110014164A1 (en) 2008-02-15 2011-01-20 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
EP2955222B1 (en) 2008-03-17 2018-09-12 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
WO2009114949A1 (en) 2008-03-20 2009-09-24 UNIVERSITé LAVAL Methods for deprogramming somatic cells and uses thereof
WO2009123349A1 (ja) 2008-03-31 2009-10-08 オリエンタル酵母工業株式会社 多能性幹細胞を増殖させる方法
WO2009126655A2 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of a small molecule modulator
CN101835890B (zh) 2008-06-27 2013-07-24 国立大学法人京都大学 有效建立诱导的多能干细胞的方法
EP2313494A2 (en) 2008-07-14 2011-04-27 Oklahoma Medical Research Foundation Production of pluripotent cells through inhibition of bright/arid3a function
US20100184033A1 (en) 2008-07-16 2010-07-22 West Michael D Methods to accelerate the isolation of novel cell strains from pluripotent stem cells and cells obtained thereby
US20130115673A1 (en) 2008-07-16 2013-05-09 Biotime, Inc. Methods of Screening Embryonic Progenitor Cell Lines
CN102159710B (zh) 2008-07-16 2015-09-02 生物载体株式会社 使用染色体非整合型病毒载体制造经初始化的细胞的方法
WO2010013845A1 (en) 2008-07-30 2010-02-04 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
WO2010147612A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Lixte Biotechnology, Inc. Methods of modulating cell regulation by inhibiting p53
US20120021519A1 (en) 2008-09-19 2012-01-26 Presidents And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
US20120034192A1 (en) 2008-09-19 2012-02-09 Young Richard A Compositions and methods for enhancing cell reprogramming
WO2010042800A1 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Nevada Cancer Institute Methods of reprogramming somatic cells and methods of use for such cells
EP2342333A4 (en) 2008-10-30 2013-05-08 Univ Kyoto Method for producing induced pluripotent stem cells
WO2010056831A2 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of an hdac modulator
WO2010068955A2 (en) 2008-12-13 2010-06-17 Dna Microarray MICROENVIRONMENT NICHE ASSAY FOR CiPS SCREENING
WO2010098419A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Kyoto University Novel nuclear reprogramming substance
WO2010102267A2 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Ipierian, Inc. Tgf-beta pathway inhibitors for enhancement of cellular reprogramming of human cells
US20120076762A1 (en) 2009-03-25 2012-03-29 The Salk Institute For Biological Studies Induced pluripotent stem cell generation using two factors and p53 inactivation
WO2010111409A2 (en) 2009-03-25 2010-09-30 The Salk Institute For Biological Studies Pluripotent stem cells
WO2010115050A2 (en) 2009-04-01 2010-10-07 The Regents Of The University Of California Embryonic stem cell specific micrornas promote induced pluripotency
US20110088107A1 (en) 2009-04-24 2011-04-14 Yaqub Hanna Compositions and methods for deriving or culturing pluripotent cells
EP2438161B1 (en) 2009-05-29 2017-08-30 Univ Kyoto Method for producing induced pluripotent stem cells and method for culturing the same
WO2010147395A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Medium composition comprising neuropeptide y for the generation, maintenance, prologned undifferentiated growth of pluripotent stem cells and method of culturing pluripotent stem cell using the same
US9550975B2 (en) 2009-07-15 2017-01-24 Mari Dezawa SSEA-3 pluripotent stem cell isolated from body tissue
KR101704666B1 (ko) 2009-07-16 2017-02-08 바이오타임, 인코포레이티드 시험관내 및 생체내 연골형성을 위한 방법 및 조성물
CN103068969A (zh) * 2010-06-17 2013-04-24 思迪公司 化学成分确定的无血清细胞培养基
KR102219743B1 (ko) * 2013-11-01 2021-02-23 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 신규 연골 세포 유도 방법

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012107035A (ja) 1999-08-05 2012-06-07 Abt Holding Co 多能性成体幹細胞およびそれを単離する方法
JP2013216661A (ja) 2006-10-23 2013-10-24 Anthrogenesis Corp 胎盤細胞集団で骨欠損を治療するための方法及び組成物
JP2011041472A (ja) * 2009-08-19 2011-03-03 Tokai Univ 細胞混合物からなる細胞移植治療用スフェロイド及びその作製方法
WO2011066403A1 (en) 2009-11-24 2011-06-03 University Of Connecticut Differentiation of human embryonic and induced pluripotents stem cells
JP2013511987A (ja) 2009-11-24 2013-04-11 ユニバーシティ オブ コネチカット ヒト胚性および人工多能性幹細胞の分化
WO2012013969A1 (en) 2010-07-26 2012-02-02 The University Of Manchester Targeted differentiation of stem cells

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nat Biotechnol. 28(11):1187-94 (2010.11.)*

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