CN105039247B - 一种用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂及制备方法与应用。该制剂包括小分子多肽、TGF‑β、地塞米松和维生素C；其中小分子多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该制剂还可包括IGFs和BMPs中的一种或两种。将前述成分混合，即得到该制剂。该制剂能直接诱导干细胞特别是人脐带间充质干细胞向软骨分化，也能诱导人类诱导多能干细胞特别是诱导多能间充质干细胞向软骨细胞的定向诱导分化，并取得了较好的效果。因此，可将该制剂用于诱导干细胞转化为软骨细胞，进而形成软骨组织。

Description

一种用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂及制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术和医疗领域，特别涉及一种诱导干细胞向成软骨分化的制剂及制备方法与应用。

背景技术

干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem cell，TSC)、多能干细胞(pluripotent stemcell)和单能干细胞(unipotent stem cell)(专能干细胞)。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。

胚胎干细胞具有万能分化性(pluripotency)功能，特点是可以细胞分化(Cellular differentiation)成多种组织的能力，但无法独自发育成一个个体。它可以差转成为外胚层、中胚层及内胚层三种胚层的成员，然后再差转成为人体的220多种细胞种类。

万能分化性是胚胎干细胞与在成年人体内可找到的多功能干细胞的主要分别：多功能干细胞只能差转成为某几种特定的细胞种类。在无外界提供差转的刺激之下(即可在实验环境下生长)，胚胎干细胞在经过多重细胞分裂之后，仍然能保有万能分化性。成人干细胞能否保有万能分化性，直到现在仍然有争议。不过，有研究已示范了万能干细胞可以从成纤维细胞集丛产生出来。

由于胚胎干细胞的“全能”性，仅从技术角度来说，用胚胎干细胞来培养人体组织和器官用以治疗疾病是最理想的。但胚胎干细胞要从胚胎中提取，有关研究在一些国家遇到伦理方面的反对，进行得不太顺利。而成年动物体内也有一些干细胞，称为成体干细胞。它们具有一定的分化潜力，但分化方向比较固定，比如造血干细胞通常只发展成血液细胞。成体干细胞不涉及伦理问题，研究比较便利，然而其分化能力有限。2007年11月，美国和日本科学家分别宣布独立发现将普通皮肤细胞转化为干细胞的方法，这样得到的干细胞称为诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells iPS)，又名iPS细胞。iPS细胞具有和胚胎干细胞类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍，因此在医疗领域的应用前景非常广阔。随后日本科学家仅用两个移植基因培育成了人类诱导多功能干细胞(iPS细胞)，日本庆应大学教授冈野荣之的研究小组，仅用先前培育iPS细胞所用4个诱导基因中的两个，即“0ct3/4”基因和“Klf4k”基因，也成功培育出了iPS细胞。目前，国际上关于iPS细胞的研究可谓日新月异，是干细胞研究的热点领域之一。

软骨退化疾病，特别是退行性关节炎，是在中老年人群中发病率很高的一种消耗性慢性疾病。基于种子细胞，生物材料及细胞生长因子的软骨组织工程的发展为临床修复软骨退化和缺损提供了可能。通过软骨组织工程构建软骨的首要条件是能够获得足够量的种子细胞。目前，用于软骨组织工程的种子细胞主要有：成体软骨细胞、成体干细胞和胚胎干细胞。而诱导多能干细胞具有与胚胎干细胞同样的体外培养无限增值，自我更新，和多能分化潜能的特点；同时由于诱导多能干细胞来源于成体细胞，避免了伦理道德方面问题；而且诱导多能干细胞可以从患者的皮肤成纤维或其他种类成体细胞诱导产生，克服了软骨组织工程中宿主对异体移植物产生免疫排斥的障碍。因此诱导多能干细胞在软骨组织工程中细胞来源是一个长远时期的最佳选择。

发明内容

本发明的首要的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂。

本发明的另一目的在于提供所述用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂，包括小分子多肽、转化生长因子-β(TGF-β)、地塞米松和维生素C；

所述的小分子多肽的氨基酸序列如下所示：DPKRLWCKN。

所述的用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂，还包括胰岛素样生长因子(IGFs)和骨形态发生蛋白(BMPs)中的一种或两种。

所述的IGFs为IGF-1和IGF-2中的一种或两种。

所述的BMPs为BMP-2、BMP-4和BMP-6中的一种以上。

所述的小分子多肽的浓度为5～50μM，优选为15～25μM，更优选为20μM。

所述的TGF-β的浓度为1～100ng/ml，优选为5～15ng/ml，更优选为10ng/ml。

所述的地塞米松的浓度为1～100μM，优选为5～15μM，更优选为10μM。

所述的维生素C的浓度为5～100mg/L，优选为40～60mg/L，更优选为50mg/L。

所述的IGFs的浓度为1～100μg/ml，优选为5～15ng/ml，更优选为10μg/ml。

所述的BMPs的浓度为1～500ng/ml，优选为90～110ng/ml，更优选为100ng/ml。

所述的用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂，优选由如下物质组成：小分子多肽20μM、TGF-β10ng/ml、地塞米松10μM和维生素C50mg/L，溶剂为培养基。

所述的培养基优选为HG-DMEM培养基。

所述的用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂的制备方法，包括如下步骤：将小分子多肽、TGF-β、地塞米松和维生素混合后得到。

所述的用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂的制备方法，包括如下步骤：将IGFs和BMPs中的一种或两种、小分子多肽、TGF-β、地塞米松和维生素混合后得到。

所述的用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂的应用，是将该制剂用于诱导干细胞转化为软骨细胞，进而形成软骨组织。

所述的干细胞包括人脐带间充质干细胞和人iPS细胞。

所述的用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂的应用，包括如下步骤：用干细胞生长培养基将干细胞培养至完全融合，接着加入用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂培养，3～4天换液一次，诱导培养至得到软骨细胞。

所述的诱导培养的时间优选为2～3周。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的制剂，能直接诱导干细胞特别是人脐带间充质干细胞向软骨分化，也能诱导人类诱导多能干细胞特别是诱导多能间充质干细胞向软骨细胞的定向诱导分化，并取得了较好的效果

(2)采用该制剂，诱导人脐带间充质干细胞和人iPS细胞，可以发现，细胞从加入诱导用的组合物后，逐渐形态不规则，呈多边形、星形等，紧密排列成“铺路石”状外观，接着细胞逐渐变为长梭形。而对照组的细胞形态不变，仍为纤维样。经甲苯胺蓝染色，细胞基质的糖胺多糖被染上蓝色。

附图说明

图1是软骨诱导分化对照组放大200倍的照片图；其中，图(A)为iPS-MSCs，图(B)为hUC-MSCs。

图2是软骨诱导分化甲苯胺蓝染色放大200倍的照片图；其中，图(A)为iPS-MSCs，图(B)为hUC-MSCs。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一、诱导多能间充质干细胞(iPS-MSC，购自中国科学院上海细胞库，目录号SCSP-1301)和人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs，购自中国科学院上海细胞库，目录号SCSP-403)的培养。DMEM培养基购自美国GIBCO公司。

1、传代：在倒置显微镜中观察，培养瓶中细胞100％融合时可进行传代培养。倒去培养皿(培养瓶)中的液体，轻轻甩干，然后加0.5-1ml 0.25％(w/v)胰酶溶液消化。轻轻摇晃，让胰酶与细胞充分接触，转移到显微镜下观察，待观察到少量细胞脱落，且大部分细胞逐渐变回圆型细胞时，即可加含10％胎牛血清DMEM培养基(两种干细胞所用的培养基是一样的)终止消化。将细胞吹打分散，培养瓶需用无菌滴管吹打。按计量，将细胞液转移到一次性培养瓶中，添加适量的培养基、血清和双抗。放入培养箱(37℃、5％CO₂)中培养。

2、冻存：前一天将培养至100％融合的细胞换液(可换为2ml体系)。倒去培养瓶中的液体，轻轻甩干，然后加0.5-1ml 0.25％(w/v)胰酶溶液消化。轻轻摇晃，让胰酶与细胞充分接触，转移到显微镜下观察，待观察到少量细胞脱落，且大部分细胞逐渐变回圆型细胞时，即可加含10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化。将细胞吹打分散，4℃、800rpm离心5min，重复2次(无EDTA则1次足以)清洗细胞，除掉胰酶。配制冻存液(DMSO：胎牛血清：含胎牛血清的DMEM培养基＝1:2:7(v:v:v))。用1-1.5ml的冻存液重悬细胞，然后移入冻存管中。将冻存管放入程序性降温盒中放入-80℃冰箱中过夜，第二天将冻存管从盒子里取出，置于液氮中长期保存。

3、复苏：从液氮中取出冻存管，立刻置于37℃-40℃温水中，迅速晃动，在2min内使冻存细胞速融。将解冻的细胞悬液移至离心管中，加入3ml培养基，轻轻吹打混匀。4℃、1000rpm离心5min，弃上清；再加入3ml培养基轻轻吹打混匀，离心，弃上清，如此重复操作2-3次以除掉DMSO。向细胞沉淀加入适量培养基，轻轻吹打使细胞分散，再移至培养瓶内，补足含双抗(青霉素和链霉素)和10％胎牛血清的培养基，放入培养箱中培养。

4、细胞爬片的制作

将处理好的盖玻片(浓酸中浸泡过夜，无水酒精浸泡6h，单蒸水冲洗5遍，双蒸水冲洗3遍，高压灭菌)用眼科镊轻轻夹入一次性6孔细胞培养板的每个孔中备用。加入5％(w/v)的多聚赖氨酸孵育2个小时，之后用移液枪把多聚赖氨酸吸走，取iPS-MSC和hUC-MSCs，分别将两种细胞按实验所需浓度接种于一次性6孔细胞培养板中的盖玻片上面，接种时注意不要让细胞悬液溢出玻片外。将细胞培养板置于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养，待细胞贴壁时(约8h)，可弃上清，加入实验所需的培养液。

二、分别诱导多能间充质干细胞和人脐带间充质干细胞向软骨细胞诱导分化及鉴定

1、诱导多能间充质干细胞向软骨细胞诱导分化及鉴定

(1)将iPS-MSC用0.25％的胰酶溶液消化，制成6×10⁴/孔的单细胞悬液接种于6孔板的爬片上(步骤见一3)，用含10％FBS的HG-DMEM培养液(购自美国GIBCO公司)培养至＞﹦100％融合。换成软骨细胞分化诱导液(即诱导干细胞向成软骨分化的制剂，含小分子多肽20μM、TGF-β10ng/ml、地塞米松10μM和维生素C50mg/L的HG-DMEM培养液)培养，每周换液2次，诱导2-3周。甲苯胺蓝染色法检测软骨细胞。

同时设立如下待测组：(1)不含TGF-β的诱导液(即含小分子多肽20μM、地塞米松10μM和维生素C50mg/L的HG-DMEM培养液)和(2)含高剂量TGF-β的诱导液(即TGF-β50ng/ml、地塞米松10μM和维生素C50mg/L的HG-DMEM培养液)。

(2)甲苯胺蓝染色原理：酸性糖胺多糖是软骨细胞的特征性分泌产物。甲苯胺蓝染色显示软骨细胞周围异染性基质。甲苯胺蓝是一种蓝色的碱性染料，可将细胞内、外的某些物质染成紫红色，而不是蓝色，这种染色现象称为异染性基质。

(3)甲苯胺蓝染色步骤：将取出的细胞爬片用0.01M、pH7.2的PBS冲洗3次，4％(v/v)多聚甲醛固定10min；在爬片固定的同时，配制1％(w/v)的甲苯胺蓝染色液，过滤之后备用；取出细胞爬片，滴加适量的甲苯胺蓝染色液染色2h；用PBS冲洗干净，自然晾干，中性树脂封固，荧光倒置显微镜下观察细胞形态特点以及生长状态，采集图片。

2、人脐带间充质干细胞向软骨细胞诱导分化及鉴定

操作步骤同步骤1。

三、向软骨细胞诱导及其鉴定

取P3，P6和P10代的诱导多能间充质干细胞和人脐带间充质干细胞分别进行向软骨细胞定向诱导分化。在软骨定向诱导分化体系中培养过程中，在倒置显微镜下观察，发现加入诱导干细胞向成软骨分化的制剂后细胞形态不规则，呈多边形、星形等，紧密排列成“铺路石”状外观，接着细胞逐渐变为长梭形。而对照组的细胞形态不变，仍为纤维样(见图1)。经甲苯胺蓝染色，细胞外基质的酸性糖胺多糖被染上紫红色(见图2)，证实诱导多能间充质干细胞和人脐带间充质干细胞已经成功定向分化为软骨细胞。而对照组细胞没有分泌糖胺多糖，因而甲苯胺蓝没有着色在细胞基质上。

待测组(1)结果显示与对照组没有显著性差异，说明没有TGF-β的协调下，小分子多肽促进干细胞向成软骨分化的作用是有限的。待测组(2)结果显示也有成软骨分化，说明高剂量的TGF-β可以促进干细胞向成软骨分化的作用。综上所述该小分子多肽能够协同TGF-β促进成软骨分化，不用该小子分多肽，要的TGF的量要增加很多。从商业化的成本而已，该药物组合物具有更好的应用价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂，其特征在于：是含小分子多肽20μM、TGF-β10ng/ml、地塞米松10μM和维生素C50mg/L的HG-DMEM培养液；

所述的小分子多肽的氨基酸序列如下所示：DPKRLWCKN。

2.权利要求1所述的用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将小分子多肽、TGF-β、地塞米松、维生素C和HG-DMEM培养基混合后得到。

3.权利要求1所述的用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂的应用，其特征在于包括如下步骤：用干细胞生长培养基将干细胞培养至完全融合，接着加入用于诱导干细胞向成软骨分化的制剂培养，3～4天换液一次，诱导培养至得到软骨细胞。