CN102021137A - 利用甘草毛状根及其培养液制备甘草总黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了甘草毛状根的培养方法以及利用甘草毛状根及其培养液制备甘草总黄酮的方法，其包括将甘草毛状根在不含吐温的液体培养基中培养至旺盛生长期，并将得到的旺盛生长期的甘草毛状根在含有吐温的液体培养基中培养5天以上。通过聚酰胺层析注用不同浓度的乙醇进行洗脱，对培养液中总黄酮进行分离，甘草总黄酮的转移率为97.23％，甘草查尔酮A的转移率为98.14％，光甘草定的转移率为97.54％。本发明还提供了一种由上述制备方法得到的甘草总黄酮及其医药应用。

Description

利用甘草毛状根及其培养液制备甘草总黄酮的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及甘草毛状根的培养方法以及利用甘草毛状根及其培养液制备甘草总黄酮的方法。另外，本发明还涉及一种由上述制备方法得到的甘草总黄酮及其医药应用。

背景技术

甘草是我国重要的传统中药，具有清热解毒、润肺祛痰、缓急止痛、补气益脾胃、调和诸药等功效，被誉为“百草之王”。近年来人们发现甘草中含有的各种黄酮是除了甘草酸外的另一类活性物质，甘草总黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗艾滋、抗炎、抗溃疡、抗衰老等药理作用，需求强劲，目前已应用到医药、食品、保健品以及化妆品等各个领域。

随着甘草的不断开发利用，野生资源采挖过度，给自然环境和生态资源造成了巨大的破坏。2001年9月我国为了保护日益匮乏的甘草资源，限制了对野生甘草的采挖，并且禁止使用野生甘草及其产品作为保健食品成分，甘草供需矛盾更加突出。甘草资源的匮乏及其应用的限制成为限制甘草应用的瓶颈，迫切需要开发甘草活性成分的新来源、新途径。

利用甘草毛状根生产甘草总黄酮是一条具有良好前景的有效途径，且有许多适应工业化生产的特点，如成本低，生长快，生产能力稳定等。但是甘草毛状根中的黄酮含量远低于生药根的含量，影响了甘草毛状根的进一步发展放大和工业化，如张荫麟等报道乌拉尔甘草毛状根的总黄酮含量为干重的0.39％，远低于生药根中的黄酮含量。目前对影响毛状根中黄酮含量的因素研究较多，如杨睿等报道了茉莉酸甲酯和水杨酸对水母雪莲毛状根中黄酮类化合物含量的影响，在毛状根接种后第10d添加浓度为0.02mmol/L的茉莉酸甲酯，黄酮类化合物比对照提高34.1％；在毛状根接种后第15d添加浓度为0.03mmol/L的水杨酸时，黄酮类化合物比对照提高52.9％。但是目前对于毛状根培养液中黄酮的含量、影响因素及如何利用研究的较少，尽管于树宏等报道了吐温-80对野葛毛状根中异黄酮(isoflavone)含量的影响，但是不涉及对甘草的研究，更不涉及对甘草毛状根及其培养液中黄酮(flavone)含量的研究和启示。另外，吐温作为常用的药用辅剂，在中药复方制剂中作为辅料可以与甘草或其提取物等活性成分配制在一起构成药物组合物，如中国专利95108283、02100222、和200610035831等，但是在这些药物中吐温仅仅是作为药用辅剂而存在的。

为此，本发明人经过长期研究，令人意外地发现了，利用含吐温的液体培养基培养5天以上的长时间，能够显著提高甘草毛状根组织培养得到的毛状根及其培养液中黄酮类化合物的含量，尤其是能够促使总黄酮从甘草的毛状根释放到培养液中，大大提高培养液中活性成分的含量；另外，本发明人还发现利用简单的乙醇梯度洗脱聚酰胺层析柱，即可制备高纯度的甘草总黄酮。这样从毛状根及其培养液中获取甘草总黄酮，能够有效避免资源的浪费，更为令人意想不到的是，本发明的甘草总黄酮的诸如体外肿瘤杀伤等效果甚至优于现有文献报道的甘草总黄酮。

发明内容

本发明的目的在于，为解决甘草资源短缺与甘草需求的矛盾，以达到产业化生产甘草黄酮，替代甘草资源的目标，提供了利用组织培养的甘草毛状根及其培养液制备甘草总黄酮的方法，提高了其中甘草总黄酮的含量，并进一步提供了制备或提纯这些甘草总黄酮的方法。因此，本发明提供了甘草毛状根的培养方法、制备提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根和/或提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根培养液的应用、制备甘草总黄酮的方法以及由其制备得到的甘草总黄酮产品。

具体而言，在第一方面，本发明提供了培养能提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根和/或甘草毛状根培养液的方法，其包括：

(1)将甘草毛状根在不含吐温的液体培养基中培养至旺盛生长期；

(2)将步骤(1)得到的旺盛生长期的甘草毛状根在含有吐温的液体培养基中培养5天以上。

甘草总黄酮(total flavonoids of Glycyrrhiza)是提取自甘草的富集了甘草中黄酮类化合物(即，黄酮类成分)的提取物，其具有抗氧化、抗肿瘤、抗艾滋、抗炎、抗溃疡、以及抗衰老等药理作用，常作为药物活性成分或活性成分之一而使用(参见：邢国秀等.甘草中黄酮类化学成分的研究进展.中国中药杂志，2003，28(7)：593)。甘草总黄酮可以提取自甘草的各个部分，通常提取自甘草的根部；在现有甘草组织培养时，由于培养液中的甘草总黄酮含量低，不太值得在产业化回收，因此未见报道从其培养液中回收总黄酮。但是，本发明人发现，经过在含有吐温的液体培养基中培养后，甘草毛状根和其培养液中的总黄酮含量都得到了显著的提升，都可以在产业上加以利用。因此，优选本发明第一方面还提供了培养甘草毛状根以提高甘草毛状根培养液中甘草总黄酮含量的方法，其包括：

(1)将甘草毛状根在不含吐温的液体培养基中培养至旺盛生长期；

(2)将步骤(1)得到的旺盛生长期的甘草毛状根在含有吐温的液体培养基中培养5天以上。

甘草总黄酮中成分很多，即使其中黄酮类化合物的种类也有许多，但是可以通过其中的特定成分来表征。在本发明中，本发明获得的甘草总黄酮这一混合物可以通过其中的黄酮类化合物、甘草查尔酮A和/或光甘草定的含量来表征。因此，本发明第一方面的方法能提高黄酮类化合物、甘草查尔酮A和/或光甘草定的含量。如上文所述，本发明尤其能提高甘草毛状根培养液中的甘草总黄酮的含量，提高的黄酮类化合物、甘草查尔酮A和/或光甘草定的含量不仅体现在甘草毛状根中，也体现在其培养液中，因此优选本发明第一方面的方法能提高甘草毛状根培养液中黄酮类化合物、甘草查尔酮A和/或光甘草定的含量5倍以上，优选能提高10倍以上，如10-60倍。

在本发明第一方面的方法中，还可以进一步包括收集产物的步骤，包括收集步骤(2)得到的甘草毛状根或其培养液，更优选本发明第一方面的方法还进一步包括：

(3)收集步骤(2)得到的甘草毛状根和其培养液。这样，回收甘草毛状根和其培养液，分别可以提取其中的总黄酮，可以更有效地利用培养得到的总黄酮，避免浪费；同时，由于培养液中的总黄酮含量较高，使得提取培养液中总黄酮的成本较低，尤其可以利用本发明第四方面的方法进行，通过乙醇的梯度洗脱就可以从培养液中提纯获得甘草总黄酮。

在本发明第一方面的方法中，甘草可以先在固体培养基上培养，然后再转接入不含吐温的液体培养基中培养至旺盛生长期。通常可以将健康的甘草毛状根以0.5％～2％的接种量接种于培养基中培养5～10天，从而达到旺盛生长期。在本发明的一个具体实施方式中，将湿重为1g的无褐化死亡部分的毛状根接种于100mL MS液体培养基中于25℃避光摇床培养7天，达到旺盛生长期。

优选在本发明第一方面的方法中，吐温可以是经如本申请实施例所述测试证实能诱导甘草提高总黄酮含量的吐温种类，在本发明的具体实施方式中，该种类是吐温-80。另外，优选液体培养基中吐温的质量百分比浓度为1～5％(w/w)，更优选为2％(w/w)，具体而言，优选液体培养基中吐温-80的质量百分比浓度为1～5％(w/w)，更优选为2％(w/w)。

优选在本发明第一方面的方法中，优选液体培养基为MS液体培养基。甘草毛状根可以在液体培养基中以合适条件被培养，优选其中培养的条件为20～30℃避光摇床培养5天以上，如7～21天，优选如10～20天，更优选其中培养的条件为25℃、黑暗、在100rpm转速的摇床上培养15天。

在第二方面，本发明提供了本发明第一方面的方法在制备提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根和/或提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根培养液的方法中的应用；另外，本发明还提供了提供了制备提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根和/或提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根培养液的方法，其中包括本发明第一方面的方法的步骤。

本发明的第二方面提供了本发明第一方面的方法在制备提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根的方法中的应用，其中可以不收集本发明第一方面的方法中步骤(2)得到的甘草毛状根培养液，而只收集本发明第一方面的方法中步骤(2)得到的甘草毛状根。

本发明的第二方面还提供了本发明第一方面的方法在制备提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根培养液的方法中的应用，其中可以不收集本发明第一方面的方法中步骤(2)得到的甘草毛状根，而只收集本发明第一方面的方法中步骤(2)得到的甘草毛状根培养液。

本发明第二方面的方法中的各个优选特征可以优选本发明第一方面的方法中各个相应的优选特征。

在第三方面，本发明提供了制备甘草总黄酮的方法，其包括：

(1)进行本发明第一方面的方法，获得甘草毛状根；

(2)干燥步骤(1)得到的甘草毛状根，用其重量10-20倍的水于60℃-100℃提取2-8小时，保留固体部分并将固体部分于烘箱中以30℃-60℃干燥；

(3)干燥步骤(2)得到的固体部分，并用50-95％(v/v)乙醇于60℃-100℃提取1-2次，洗涤提取的残渣，合并提取液及洗涤液，保留液体部分并浓缩和/或干燥。这样，可以提取甘草毛状根中的甘草总黄酮。

优选在本发明第三方面的方法中，步骤(1)得到的甘草毛状根在干燥前可以用水提取从而去除水溶性杂质，例如，可以用甘草毛状根重量10-20倍的水提取2-8小时。在本发明第三方面的方法中，干燥可以在30℃-60℃的温度下干燥，优选在50℃-60℃的温度下干燥。

同样，为了提供提取甘草毛状根培养液中的甘草总黄酮，在第四方面，本发明提供了制备甘草总黄酮的方法，其包括：

(1)进行本发明第一方面的方法，获得甘草毛状根培养液；

(2)将任选经浓缩的步骤(1)得到的培养液上样于聚酰胺层析柱，用至少两种0～85％(v/v)乙醇水溶液按乙醇浓度由低到高的顺序依次进行洗脱，收集用浓度不小于60％(v/v)乙醇洗脱的洗脱液并浓缩和/或干燥。

在本发明第四方面的方法中，浓缩可以在50℃-80℃的温度下减压浓缩，可以浓缩至原体积的1/10-1/2；干燥可以在30℃-60℃的温度下干燥，优选在40℃-60℃的温度下干燥。另外优选在本发明第四方面的方法中，聚酰胺在装入层析柱前要将聚酰胺树脂用95％(v/v)乙醇回流2～5小时(如3小时)，然后经滤布过滤，再在95％(v/v)乙醇中回流2～5小时(如3小时)，滤布过滤后收集树脂；其中，聚酰胺树脂优选是粉碎成30-200目的聚酰胺树脂，如30-60目，60-100目，80-120目或100-200目的聚酰胺树脂。另外，在本发明第四方面的方法中，上样于聚酰胺层析柱培养液优选是经浓缩的，如将1/2-1/5柱体积的经浓缩的步骤(1)得到的培养液上样于聚酰胺层析柱。

我们发现，在聚酰胺层析柱上，通过乙醇梯度洗脱即可提纯培养液中的甘草总黄酮。因此，优选在本发明第四方面的方法中，在步骤(2)中，依次用水、10～50％(v/v)乙醇和60～95％(v/v)乙醇洗脱聚酰胺层析柱。另外，在本发明第四方面的方法中，优选乙醇洗脱时控制流出液流速为每小时1～3柱体积。

我们发现，70％(v/v)乙醇洗脱的洗脱液中保留了绝大多数甘草总黄酮，而之前用水、30％(v/v)乙醇和50％(v/v)乙醇依次洗脱就能去除绝大多数诸如吐温等的杂志，从而实现了甘草总黄酮的提纯；而进一步用更高浓度(如，90％(v/v))乙醇洗脱，并不能显著提升提纯效果。因此，更优选在本发明第四方面的方法中，在步骤(2)中，依次分别用2-7倍柱床体积的水、30％(v/v)乙醇、50％(v/v)乙醇和70％(v/v)乙醇洗脱聚酰胺层析柱，收集用70％(v/v)乙醇洗脱的洗脱液。

本发明第三和第四方面的方法可以组合成优选的制备甘草总黄酮的方法，其包括：

(1)进行本发明第一方面的方法，获得甘草毛状根及其培养液；

(2)干燥步骤(1)得到的甘草毛状根，用其重量10-20倍的水于60℃-100℃提取2-8小时，保留固体部分并将固体部分于烘箱中以30℃-60℃干燥；

(3)干燥步骤(2)得到的固体部分，并用50-95％(v/v)乙醇于60℃-100℃提取1-2次，洗涤提取的残渣，合并提取液及洗涤液，保留液体部分并浓缩和/或干燥。这样，可以提取甘草毛状根中的甘草总黄酮；

(4)将任选经浓缩的步骤(1)得到的培养液上样于聚酰胺层析柱，用至少两种0～85％(v/v)乙醇水溶液按乙醇浓度由低到高的顺序依次进行洗脱，收集用浓度不小于60％(v/v)乙醇洗脱的洗脱液并浓缩和/或干燥。其中，可以优选本发明第三和第四方面的方法所述的各个相应的优选特征。

在第五方面，本发明提供了本发明第三和/或第四方面的方法制备的甘草总黄酮，其中黄酮类化合物含量大于24％，更优选其中黄酮类化合物含量大于60％，更优选其中还富含甘草查尔酮A和光甘草定。例如，所述甘草总黄酮的HPLC图谱可以如图1、2或3的70％乙醇洗脱液的图谱所示，其中HPLC的条件如本申请实施例所述。

我们通过本发明第四方面的方法制备后发现，其中活性成分损失量非常少。因此，优选在本发明第五方面的甘草总黄酮中，所述甘草总黄酮中的甘草查尔酮A和光甘草定的量相较本发明第四方面的方法中步骤(1)得到的培养液中的甘草查尔酮A和光甘草定的量，基本没有减少，优选前者的量是后者的90％以上，如90％-99％，更优选95％以上，如95％-99％或者97％-99％。

由于纯度的提高以及可能存在的有效成分配比等方面的改善，本发明第五方面的甘草总黄酮可以更有效地杀伤肿瘤，因此，本发明还提供了药物组合物，其包含本发明第五方面的甘草总黄酮和药学上可接受的载体，优选所述药物组合物用于抗肿瘤，尤其用于抗胃腺癌；本发明还提供了本发明第五方面的甘草总黄酮在制备用于抗肿瘤(尤其用于抗胃腺癌)的药物的方法中的应用；另外，本发明还提供了用于抗肿瘤(尤其用于抗胃腺癌)的方法，其包括给予患者有效治疗量的本发明第五方面的甘草总黄酮。

药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂(如水等)，填充剂(如淀粉、蔗糖等)、粘合剂(如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮)、湿润剂(如甘油)、崩解剂(如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠)、吸收促进剂(如季铵化合物)、吸附载体(如高岭土和皂粘土)、润滑剂(如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等)。另外还可以在药物组合物中加入其它辅剂，如香味剂、甜味剂等。

药物组合物可以通过口服，鼻吸入、直肠或者肠胃外给药等方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。给药剂量可以由医师根据患者的情况(如，病情、体重、年龄、性别)来确定，通常在1μg/kg-100mg/kg患者体重之间。

本发明与传统的甘草总黄酮获得方法相比具有以下优势：以生物工程技术获得的甘草毛状根产生的甘草黄酮为来源，有成本低、生长快、生产能力稳定等许多适应工业化生产的特点；以吐温-80对甘草毛状根进行诱导处理，使毛状根中的黄酮类化合物含量提高了44％-55％，同时使其培养液中的黄酮类化合物含量提高了10-50倍；不仅利用了毛状根中的黄酮类化合物，还利用了其培养液中的黄酮类化合物，使综合获得的黄酮类化合物总量提高了10-50倍；其中甘草查尔酮A总量提高10-60倍，光甘草定总量提高10-60倍。本方法获得的甘草黄酮来源稳定，不受应用领域的限制，填补了甘草药材受限制领域的空白，保护了有限的甘草野生资源及其生态环境；同时本方法工艺简单，经济价值可观，是甘草黄酮产业化的新途径。

为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明

图1显示了实施例4中各步骤洗脱液中黄酮的高效液相色谱法检测结果。

图2显示了实施例4中各步骤洗脱液中甘草查尔酮A的高效液相色谱法检测结果。

图3显示了实施例4中各步骤洗脱液中光甘草定的高效液相色谱法检测结果。

具体实施方式

实施例1、甘草毛状根的培养

将新鲜乌拉尔甘草种子(可购自亳州市药材总公司公司)用70％(v/v)乙醇浸泡10秒，用无菌水冲洗3次，然后用2％(w/w)次氯酸钠溶液浸泡10分钟，用无菌水冲洗3次，然后将种子接种于MS固体培养基(即，MS液体培养基中添加1％(w/w)琼脂)，于25℃、黑暗培养4天，将其根中部切成0.5cm长的小段。

将小段转接到添加有2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)(终浓度为2mg/L)和激动素(KT)(终浓度为0.2mg/L)的MS固体培养基中，于25℃、黑暗培养40天，得到绒毛状的不定根(即，毛状根)。

然后，将毛状根转接于MS液体培养基中，于25℃、黑暗、在100rpm转速的摇床上培养20天。之后，除去褐化死亡的毛状根，其余毛状根接种于含100mL MS液体培养基的300mL培养瓶里，每瓶毛状根湿重为1g，于25℃、黑暗、在100rpm转速的摇床上培养7天。然后，将每瓶中培养的毛状根再转移到100mL含有2％(w/w)吐温-80的MS液体培养基里，于25℃、黑暗、在100rpm转速的摇床上培养15天，然后离心，分别收获甘草毛状根及其培养液；相应地，对照组是在MS液体培养基(不含2％(w/w)吐温-80)中培养。

其中，MS液体培养基的配方为：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L，碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素(VB1)0.1mg/L，盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg/L，维生素B5 0.5mg/L，蔗糖30g/L，余量为水。

实施例2、甘草毛状根中总黄酮的制备

取根据实施例1制备的吐温诱导培养的甘草毛状根150g，置于烘箱中，60℃干燥12小时，得干燥的毛状根10g。将毛状根置于500mL的圆底烧瓶中，加入水200mL，于85℃浸泡7小时，冷却至室温，滤纸过滤，弃去滤液，再用60℃温水洗涤3次，每次200mL，然后将过滤截留的毛状根残渣置于烘箱中，60℃干燥12小时。将干燥的甘草毛状根残渣置于500mL的圆底烧瓶中，加入95％(v/v)的乙醇200mL，85℃回流提取2小时，冷却置室温，滤纸过滤，保留滤液。滤渣用10mL95％(v/v)的乙醇洗涤2次，保留洗涤液，残渣再加入95％(v/v)的乙醇200mL，85℃回流提取2小时，冷却置室温，滤纸过滤，保留滤液。合并两次滤液和洗涤液，60℃减压浓缩至20mL，将浓缩液置于烘箱中60℃干燥，得黄酮类化合物含量为24.22％(w/w，根据HPLC测量)的甘草总黄酮0.5g。

相应地，用对照组的甘草毛状根重复以上过程，获得黄酮类化合物含量为20.56％(w/w，根据HPLC测量)的甘草总黄酮0.51g。

由此可见，本发明的培养方法能够培养出高黄酮类化合物含量的毛状根并适于提取制备。

实施例3、甘草毛状根培养液中总黄酮的制备

(1)甘草毛状根培养液的浓缩：取根据实施例1制备的吐温-80诱导培养的甘草毛状根培养液60mL，60℃浓缩至原体积的1/2(即30mL)。

(2)聚酰胺树脂的预处理：将柱层析用的聚酰胺树脂(可购自国药集团化学试剂公司)100g用95％(v/v)乙醇500ml于85℃回流3小时，滤布过滤，再加入95％(v/v)乙醇500mL于85℃回流1次，滤布过滤，以除去聚酰胺树脂中残留的醇溶性杂质。将处理后的聚酰胺树脂装柱，使柱体积为60mL，依次各以300mL70％(v/v)乙醇、50％(v/v)乙醇和30％(v/v)乙醇冲洗层析柱，再用去离子水冲洗层析柱至流出液无乙醇味。

(3)上样：将经步骤(1)浓缩好的毛状根培养液30mL上到柱体积为60mL的层析柱柱顶，控制流出液流速为60mL/h，至提取液完全上样进入树脂床，静止0.5-1h，让其充分吸附。

(4)洗脱：以120mL去离子水冲洗树脂床，控制流出液流速为60mL/h。再依次各用120mL 30％(v/v)乙醇和50％(v/v乙醇)冲洗层析柱，控制流出液流速为60mL/h。再用180mL70％(v/v)乙醇洗脱层析柱，控制流出液流速为60mL/h，收集该部分洗脱液，60℃减压浓缩至10mL，然后将浓缩液置于烘箱中60℃干燥，获得黄酮类化合物含量为61.49％(w/w，根据HPLC测量)的甘草总黄酮94.0mg。

层析柱最后可以再用120mL 95％(v/v)乙醇冲洗，控制流出液流速为60mL/h，以供研究之用。

相应地，根据上述方法，用对照组的甘草毛状根重复以上过程，获得黄酮类化合物含量仅为18.52％(w/w，根据HPLC测量)的甘草总黄酮。

由此可见，本发明的培养方法能够培养出高黄酮类化合物含量的甘草毛状根培养液并适于提取制备。

实施例4、制备甘草毛状根培养液中总黄酮的方法中各步骤杂质和有效产物检测

由于某些杂质将影响到甘草总黄酮的质量，而过分严格的纯化将大大增加产物的损失，因此以下对实施例3中各步骤洗脱(冲洗)出的产物进行杂质和有效产物的检测。

(1)各步骤洗脱液的杂质检测

由于采用了聚酰胺树脂为吸附剂，根据其吸附原理知道培养基中的大部分杂质在用水为洗脱溶剂除杂时能被洗脱，但是吐温-80却不能被水洗脱完全除去，故各步骤洗脱液主要检测吐温-80的有无。具体而言，分别取120mL各步骤的洗脱液，于60℃减压浓缩至5mL，将浓缩液用该步骤的洗脱(冲洗)溶剂溶解并定容至10mL。取定容的溶液1.0mL置于烘箱中60℃烘干，然后加入水1ml，超声溶解，离心，取上清液并加入0.1M氢氧化钠溶液1mL，煮沸3分钟，冷却至室温，用10％(w/w)稀盐酸酸化，如产生白色浑浊则含有吐温-80。具体结果见表1，可见实施例3的步骤中使用50～70％(v/v)乙醇洗脱，就能够有效除去吐温-80等杂质。

表1.洗脱液中吐温-80检测结果

样品名称	是否有白色浑浊	是否有吐温
			诱导后液体培养基	有	有
水洗脱液	有	有
			30％乙醇洗脱液	有	有
50％乙醇洗脱液	有	有
			70％乙醇洗脱液	无	无
95％乙醇洗脱液	无	无

(2)高效液相色谱法检测各步骤洗脱液中的黄酮。

取上述步骤(1)中浓缩后定容至10ml的各步骤洗脱液，于0.45μm滤膜过滤后进行高效液相色谱。其中，高效液相色谱法条件为：Kromasil C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；

检测波长：365nm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；流动相(梯度洗脱)如下：

0-30min     乙腈∶水(含0.05％磷酸)体积比18∶82

30-50min    乙腈∶水(含0.05％磷酸)体积比18∶82→40∶60

50-90min    乙腈∶水(含0.05％磷酸)体积比40∶60

90-115min   乙腈∶水(含0.05％磷酸)体积比40∶60→55∶45

115-135min  乙腈∶水(含0.05％磷酸)体积比55∶45→65∶35

135-150min  乙腈∶水(含0.05％磷酸)体积比65∶35

结果如图1所示，吐温-80处理后的甘草毛状根培养液中含有的甘草总黄酮，经聚酰胺吸附、不同浓度的乙醇洗脱后，在70％乙醇洗脱液中得到了有效地富集和浓缩，其他洗脱步骤损失的甘草总黄酮量很少。

(3)高效液相色谱法检测各步骤洗脱液中的甘草查尔酮A。

取上述步骤(1)中浓缩后定容至10ml的各步骤洗脱液，于0.45μm滤膜过滤后进行高效液相色谱。其中，高效液相色谱条件为：Kromasil C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；检测波长：377nm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；流动相为：甲醇-四氢呋喃-1％冰醋酸＝50∶10∶40。

结果如图2所示，参考甘草查尔酮A标准样品的峰，吐温-80处理后的甘草毛状根培养液中含有的甘草查尔酮A，经聚酰胺吸附、不同浓度的乙醇洗脱后，在70％乙醇洗脱液中得到了富集和浓缩，其他洗脱步骤损失的甘草查尔酮A几乎没有。

(4)高效液相色谱法检测各步骤洗脱液中的光甘草定含量。

取上述步骤(1)中浓缩后定容至10ml的各步骤洗脱液，于0.45μm滤膜过滤后进行高效液相色谱。其中，高效液相色谱法条件为：Kromasil C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；检测波长：280nm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；流动相(梯度洗脱)如下：

0-30min     乙腈∶水(含0.05％磷酸)体积比18∶82

30-50min    乙腈∶水(含0.05％磷酸)体积比18∶82→40∶60

50-90min    乙腈∶水(含0.05％磷酸)体积比40∶60

90-115min   乙腈∶水(含0.05％磷酸)体积比40∶60→55∶45

115-135min  乙腈∶水(含0.05％磷酸)体积比55∶45→65∶35

135-150min  乙腈∶水(含0.05％磷酸)体积比65∶35

结果如图3所示，参考光甘草定标准样品的峰，吐温-80处理后的甘草毛状根培养液中含有的光甘草定，经聚酰胺吸附、不同浓度的乙醇洗脱后，在70％乙醇洗脱液中得到了富集和浓缩，其他洗脱步骤损失的光甘草定几乎没有。

根据HPLC方法比较吐温-80处理后的甘草毛状根培养液(提取前)和提取后的各成分，发现，甘草总黄酮的转移率为97.23％，甘草查尔酮A的转移率为98.14％，光甘草定的转移率为97.54％。

实施例5、本发明甘草黄酮提取物的体外肿瘤杀伤实验

参照陶文沂，聂小华，尹光耀，等的文献(甘草有效成分体外抗肿瘤活性和免疫活性的研究〔J〕.中药材，2003，26(7)：507)报道的方法，测定本发明实施例3的甘草总黄酮的体外肿瘤杀伤活性。简而言之，用0.25％胰酶消化处理胃腺癌SGC-7901细胞后，于1000rpm离心5分钟，弃上清用添加10％FBS的1640培养基重悬，取100μl加入900μlPBS内混匀并取出10μl进行镜检计数。镜检结果如下：得浓度为2×10⁴的细胞液。取100μl细胞液加入96孔板上，于37℃、5％二氧化碳培养箱内培养24小时。用DMSO分别溶解黄酮样品用1640+FBS稀释至1mg/ml，在用1％DMSO稀释使药物终浓度为10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml。留4孔作对照100μl/孔。37℃5％二氧化碳培养箱内培养72小时。清洗板孔，弃上清，用PBS清洗板孔；加入MTS：加入100μl的1640 20μl的MTS培养2h。490nm处测OD值，通过以下公式计算抑瘤率：

抑瘤率＝(药物空白-药物试验)/药物空白-细胞空白×100％

通过软件计算药物的IC50值，得本发明的甘草总黄酮对胃腺癌细胞株SGC-7901的IC50值为19.66μg/ml；而陶文沂，聂小华，尹光耀，等的文献中报道的甘草总黄酮对胃腺癌细胞株SGC-7901虽具有明显的抑制作用，IC50却高达290.6μg/ml。由此可见，本发明得到的甘草总黄酮的体外肿瘤杀伤效果优于文献报道的甘草总黄酮。

Claims (13)

1.培养能提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根和/或甘草毛状根培养液的方法，其包括：

(1)将甘草毛状根在不含吐温的液体培养基中培养至旺盛生长期；

(2)将步骤(1)得到的旺盛生长期的甘草毛状根在含有吐温的液体培养基中培养5天以上。

2.权利要求1所述的方法，其进一步包括：

(3)收集步骤(2)得到的甘草毛状根和其培养液。

3.权利要求1或2所述的方法，其中吐温是吐温-80，优选液体培养基中吐温-80的质量百分比浓度为1～5％(w/w)，更优选为2％(w/w)。

4.权利要求1或2所述的方法，其中液体培养基为MS液体培养基，优选其中培养的条件为20～30℃避光摇床培养10～20天，更优选为25℃、黑暗、在100rpm转速的摇床上培养15天.。

5.权利要求1或2所述的方法，其能提高黄酮、甘草查尔酮A和/或光甘草定的含量，尤其能提高甘草毛状根培养液中黄酮、甘草查尔酮A和/或光甘草定的含量5倍以上，优选能提高10倍以上。

6.权利要求1至5之任一所述的方法在制备提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根和/或提高甘草总黄酮含量的甘草毛状根培养液的方法中的应用。

7.制备甘草总黄酮的方法，其包括：

(1)进行权利要求1至5之任一所述的方法，获得甘草毛状根；

(2)干燥步骤(1)得到的甘草毛状根，用其重量10-20倍的水于60℃-100℃提取2-8小时，保留固体部分并将固体部分于烘箱中以30℃-60℃干燥；

(3)干燥步骤(2)得到的固体部分，并用50-95％(v/v)乙醇于60℃-100℃提取1-2次，洗涤提取的残渣，合并提取液及洗涤液，保留液体部分并浓缩和/或干燥。

8.制备甘草总黄酮的方法，其包括：

(1)进行权利要求1至4之任一所述的方法，获得甘草毛状根培养液；

(2)将任选经浓缩的步骤(1)得到的培养液上样于聚酰胺层析柱，用至少两种0～85％(v/v)乙醇水溶液按乙醇浓度由低到高的顺序依次进行洗脱，收集用浓度不小于60％(v/v)乙醇洗脱的洗脱液并浓缩和/或干燥。

9.权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，依次用水、10～50％(v/v)乙醇和60～95％(v/v)乙醇洗脱聚酰胺层析柱。

10.权利要求9或8所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，依次分别用2-7倍柱床体积的水、30％(v/v)乙醇、50％(v/v)乙醇和70％(v/v)乙醇洗脱聚酰胺层析柱，收集用70％(v/v)乙醇洗脱的洗脱液。

11.权利要求7至10之任一所述的方法制备的甘草总黄酮，其中黄酮含量大于24％，更优选其中黄酮含量大于60％，也优选其中还包括甘草查尔酮A和光甘草定，例如，所述甘草总黄酮的HPLC图谱可以如图1、2或3的70％乙醇洗脱液的图谱所示。

12.权利要求11所述的甘草总黄酮，其中甘草查尔酮A和光甘草定的量相较权利要求7至9之任一所述的方法中步骤(1)得到的培养液中的甘草查尔酮A和光甘草定的量，基本没有减少，优选前者的量是后者的90％以上，更优选95％以上。

13.根据权利要求1-12，本发明包含一种植物毛状根培养及经含有吐温的诱导剂共培养体系以提高植物黄酮类目标物合成并释放到液体培养基中的植物黄酮类物质的生产方法。所述方法包含但不限于甘草。

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