CN101969994B - 能够稳定地长期保存的日本脑炎疫苗的制造方法及该疫苗的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及能够稳定地长期保存的日本脑炎疫苗的制造方法及该疫苗的用途。本发明人等改良了日本脑炎病毒疫苗的灭活处理方法并对将多种疫苗混合而制造的疫苗的安全性进行了研究。结果成功制造了与现有的日本脑炎疫苗相比能够稳定地长期保存且通过细胞培养制造的安全性高的日本脑炎疫苗。另外还可期待，即使对其他的病毒疫苗，通过同样的制造方法，也能够制造保存稳定性良好的疫苗。

Description

能够稳定地长期保存的日本脑炎疫苗的 制造方法及该疫苗的用途

技术领域

本发明涉及具有即使长期保存滴度也实质上得以保持的特征的日本脑炎疫苗的制造方法。另外，还涉及通过该制造方法制造的日本脑炎疫苗、以及由日本脑炎疫苗与其他种类的抗原疫苗构成的混合疫苗。此外，还涉及一种预防对象者由细菌和/或病毒引起的疾病的方法，该方法包含将所述疫苗向对象者给药的工序。

背景技术

日本脑炎是由三带喙库蚊等蚊子传播的日本脑炎病毒的感染所引起的传染病，从生后的早期即可罹患。病毒感染所引起的脑病死亡率高，后遗症重。为了预防，从婴儿期的早期进行疫苗免疫是有效的。日本脑炎病毒属于黄病毒。用于预防日本脑炎的疫苗已经制造销售，在日本已被纳入常规接种。日本脑炎疫苗根据制法进行分类，有通过小鼠脑法制造的疫苗和通过细胞培养法制造的疫苗。另外，还有灭活日本脑炎疫苗和减毒活日本脑炎疫苗。另外，根据剂型，液态疫苗和冷冻干燥疫苗也在制造销售中。以下，对有关通过小鼠脑法制造的灭活日本脑炎疫苗的现有学说进行简单地说明。

最早的日本脑炎疫苗即小鼠脑来源的疫苗已在1954年得到了实际应用，但是其纯度低，被指出存在诱发过敏性的中枢神经损害的危险性。随后通过对其进行了反复的改良，在1965年病毒纯化得到发展、品质提高了的改良日本脑炎疫苗得到了实际应用，直到现在都一直沿袭着该制造技术。

通过小鼠脑法制造的灭活日本脑炎疫苗如前所述是纯度高、有效性也高的疫苗。但是，该灭活日本脑炎疫苗被指出在安全性和保存稳定性方面存在问题。

关于安全性，由于采用在未得到充分管理的环境下喂养的小鼠，因此当从目前所要求的安全性标准来看，可发现存在无法排除外源因子(adventitious agent)混入疫苗制品的可能性的问题。这个问题通过采用细胞培养法的制造方法得到了基本解决。最近，通过细胞培养法制造的疫苗受到了世界范围的关注，无论是发达国家还是发展中国家，在世界范围内需求都很高。关于保存稳定性，在疫苗中添加明胶作为稳定剂。但是，明胶被指出存在诱发过敏反应的危险性，因而无法再作为稳定剂使用。作为确保保存稳定性的其他的方法，通过制造冷冻干燥制品，能够在冷藏保存下长期保存。但是，冷冻干燥制品的制造成本高，为了进行冷藏保存或冷冻保存，需要用于保存的设施、冰箱等设备，因此存在需要保存费用的缺点。

综上所述，关于灭活日本脑炎疫苗的有效性、安全性、保存稳定性整理如下。首先，有效性比较满意。安全性的问题通过开发细胞培养制造法获得改良的可能性高。但是，保存稳定性的问题虽然有通过冷冻干燥法来进行解决的方法，但存在制造成本高的缺点，并且无法确保液态制品的保存稳定性。也就是说，还需要寻求能够稳定地长期保存的新的日本脑炎疫苗。

另外，基于其他理由，也需要提高液态制品的保存稳定性。液态制品通常通过注射法来接种。但是，在没有充分的医疗设施或医疗专家不足的地区，为了经鼻接种或经皮接种地使用，期望提供稳定的液态日本脑炎疫苗制品。

与日本脑炎疫苗同样，即使对于其他的病毒疫苗，也需要寻求开发既维持低廉的制造费用，又在保存稳定性方面优异的疫苗。

另外，本申请的发明相关的现有技术文献情报如下所示。

专利文献1：CA2390995

专利文献2：US6841374

专利文献3：EP841942

专利文献4：US5891705

非专利文献1：TF Tsai et al(1999)：In，Vaccines(3rd Ed.)(ed.by S A Plotkin and WA Orenstein，1999)，pp 672-710：Japanese Encephaitisvaccine.

非专利文献2：K Sugawara et al(2002)：Biologicals，30，303-314：Development of Vero cell-derived Inactivated Japanese Encephalitis vaccine.

非专利文献3：SC Wu，G Y-L Huang(2002)：Biotechnol.Prog.18，124-128：Stationary and microcarrier cell culture processes for propagatingJapanese Encephalitis virus.

非专利文献4：AK Srivastava et al(2001)：Vaccine 19，4557-75：Apurified inactivated Japanese Encephalitis vaccine made in vero cells.

非专利文献5：A Lyons et al.(2007)：Vaccine 25，3445-53：A phase2 study of a purified inactivated virus vaccine to prevent Japanese Encephalitis.

非专利文献6：SJ Barteling，R.Woortmeyer(1984)：Arch Virol.80(2-3)，103-17：Formaldehyde inactivation of foot-and-mouth disease virus：Conditions for the preparation of safe vaccine.

非专利文献7：B Metz et al.(2004)：J.Biol.Chem.，279(8)，6235-6243：Identification of Formaldehyde-induced Modifications in Proteins：reactionswith model peptides.

非专利文献8：C Marquie et al.(1998)：Nahrung/Food(3/4)，42，264-265：How to monitor the protein cross-linking by formaldehyde，glutaraldehyde or glyoxal in cotton-seed protein protein-based films？(shortcommunication)

非专利文献9：WM McClurg et al.(1996)：J Heart Valve Dis.5(3)，343-7：Formaldehyde replaces glutaraldehyde in porcine bioprosthetic heartvalves.

发明内容

本发明是鉴于上述情况而完成的发明，本发明的目的在于解决采用小鼠脑法制造的灭活日本脑炎疫苗的问题。更详细而言，本发明的目的在于提供即使在室温附近也能够长期稳定地保存、有效并且安全的液态灭活日本脑炎疫苗的制造方法，其包含对通过细胞培养法获得的日本脑炎病毒组合进行多个灭活处理的工序。另外，本发明的目的还在于提供通过该制造方法制造的日本脑炎疫苗，或者将该稳定的日本脑炎疫苗与其他种类的抗原疫苗混合而得到的混合疫苗。另外，本发明的目的还在于提供它们的使用方法。

为了解决上述课题，本发明人等对通过细胞培养法获得的日本脑炎病毒的灭活处理方法进行了研究。另外，还研究了将多种疫苗混合而制造的混合疫苗的保存稳定性。

首先，对日本脑炎病毒的灭活处理条件进行了研究。其结果发现了通过在氨基酸等的存在下进行灭活处理，能够制造在室温附近能够稳定地长期(例如2年(24个月)以上)保存的液态灭活日本脑炎疫苗。其次还发现，通过将在氨基酸等的存在下进行利用物理化学处理的追加的灭活处理工序、或在加热的同时进行福尔马林灭活的工序等组合，能够制造在室温附近能够稳定地长期保存的液态灭活日本脑炎疫苗。接着，还将通过上述方法得到的保存稳定性得到改善的液态灭活日本脑炎疫苗与其他疫苗混合、并对混合疫苗进行了评价。其结果发现，即使在混合疫苗中，日本脑炎疫苗也能够稳定地长期保存。此外还弄清楚了，除了在灭活时添加氨基酸外，通过进一步在纯化后添加氨基酸等稳定剂，能够保持日本脑炎疫苗的稳定性。

即，本发明人等通过将多个灭活处理工序组合从而成功地以低廉的价格制造了与现有的通过小鼠脑法制造的灭活日本脑炎疫苗相比，安全性与保存稳定性二者得到改善的日本脑炎疫苗，从而完成了本发明。

更具体地，本发明提供以下的(1)～(20)。

(1)一种灭活全颗粒日本脑炎疫苗的制造方法，其包含对日本脑炎病毒进行下述(a)和/或(b)中所述的灭活处理的工序；

(a)在氨基酸、胺类、酰胺类和/或有机酸的存在下，利用化学技术进行灭活处理的工序；

(b)利用物理化学技术进行灭活处理的工序。

(2)根据(1)所述的日本脑炎疫苗的制造方法，其中，(1)的(a)中所述的氨基酸为选自天冬氨酸、γ-氨基丁酸、丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸中的至少一种氨基酸。

(3)根据(1)或(2)所述的日本脑炎疫苗的制造方法，其中(1)的(a)中所述的胺类为选自乙胺、乙醇胺和丙醇胺中的至少一种胺类，或者(a)中所述的酰胺类为选自尿素、甘氨酰胺和β-丙氨酰胺中的至少一种酰胺类，或者(a)中所述的有机酸为选自琥珀酸、酒石酸、葡萄糖酸、油酸、乳糖酸中的至少一种有机酸。

(4)根据(1)～(3)任一项所述的日本脑炎疫苗的制造方法，其中，(1)的(b)中所述的灭活处理为选自加热、γ射线照射、电子射线照射、和激光照射中的至少一种处理方法。

(5)根据(4)所述的日本脑炎疫苗的制造方法，其特征在于，采用加热的灭活处理是在24℃以上进行的。

(6)根据(1)～(5)任一项所述的日本脑炎疫苗的制造方法，其中，日本脑炎病毒是临床分离株(野生株)、人工突变株、基因重组株或通过反向遗传学获得的回收株中的任一种。

(7)根据(1)～(6)任一项所述的日本脑炎疫苗的制造方法，其特征在于，使用通过细胞培养法制造的日本脑炎病毒。

(8)根据(1)～(6)任一项所述的日本脑炎疫苗的制造方法，其特征在于，使用通过无血清培养法制造的日本脑炎病毒。

(9)根据(7)或(8)所述的日本脑炎疫苗的制造方法，其特征在于，在细胞培养的播种中使用通过无血清培养法制造的主细胞库(master cellbank)。

(10)一种灭活全颗粒日本脑炎疫苗，其特征在于，其是通过(1)～(9)任一项所述的制造方法制造的，且能够在保持滴度的情况下长期保存。

(11)根据(10)所述的日本脑炎疫苗，其特征在于，在15℃～40℃的保存温度下，能够在保持滴度的情况下长期保存。

(12)根据(10)所述的日本脑炎疫苗，其中，含有氨基酸、胺类和/或酰胺类作为稳定剂。

(13)根据(10)所述的日本脑炎疫苗，其特征在于，能够在1年以上且低于4年的保存期间稳定。

(14)根据(10)所述的日本脑炎疫苗，其中，进一步含有佐剂。

(15)根据(14)所述的疫苗，其特征在于，添加佐剂的疫苗的单位剂量的抗原量比未添加佐剂的疫苗时少。

(16)根据(10)～(15)任一项所述的疫苗，其特征在于，剂型为液态。

(17)一种混合疫苗，其是由(10)～(16)任一项所述的日本脑炎疫苗与其他种类的抗原构成的。

(18)根据(17)的混合疫苗，其他种类的抗原是选自白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳疫苗、流感嗜血杆菌疫苗、脑膜炎奈瑟菌疫苗、口服脊髓灰质炎疫苗、灭活脊髓灰质炎疫苗或肝炎疫苗中的至少一种抗原。

(19)一种预防对象者由细菌和/或病毒引起的疾病的方法，其包含将(10)所述的日本脑炎疫苗或(17)所述的混合疫苗向对象者给药的工序。

(20)根据(19)所述的方法，其特征在于，疾病为由日本脑炎病毒引起的疾病。

下面，对通过细胞培养法制造的液态灭活日本脑炎疫苗进行说明。

具体实施方式

本发明提供一种即使在室温附近也能够长期稳定地保存、有效并且安全的液态灭活日本脑炎疫苗的制造方法，其包含对通过细胞培养法获得的日本脑炎病毒组合进行多个灭活处理的工序。另外，本发明的目的还在于提供通过该制造方法制造的日本脑炎疫苗、或将该稳定的日本脑炎疫苗与其他种类的抗原疫苗混合而得到的混合疫苗。另外，本发明的目的还在于提供它们的使用方法。

在下文中，“保存稳定性”是指在将日本脑炎疫苗在室温附近保存的情况下剩余滴度得以保持。只要没有特别说明，通过本发明的制造方法制造的疫苗是指液态制品。室温附近是指15℃～40℃的温度。在本发明中，作为保存期间，优选为1年以上的期间、更优选为2年以上且低于4年的期间。在将本发明的疫苗制成冷冻干燥品的情况下，能够如现有的那样在冷藏下长期、稳定地保存是显而易见的。

本发明的日本脑炎疫苗的制造中使用的病毒株只要具有抗原性，则临床分离株、野生株、人工突变株、减毒活疫苗株、基因重组株均可以使用。基因重组株中包括通过反向遗传学技术回收的病毒株。另外，作为获得病毒的方法，小鼠脑法和细胞培养法均可，但优选细胞培养法。

病毒株的细胞培养中使用的细胞只要是对日本脑炎病毒具有敏感性的细胞则均可。例如可列举出Vero细胞、MDCK细胞(游离细胞)、Per.C6等细胞。

用于制造疫苗的日本脑炎病毒的细胞培养通常是在添加有血清的培养基中进行的。但是，从疫苗的安全性的观点出发，更优选使用通过无血清培养得到的病毒。用于播种到细胞培养中的主细胞库(master cell bank)、工作细胞库(working cell bank)只要没有特别说明，通常是通过添加血清的培养制备的。但是，更优选使用通过无血清培养法制备得到的主细胞库、工作细胞库。由此，能够提高所制造的疫苗的安全性。

在本发明中，采用发明人等使用的细胞培养法获得液态灭活日本脑炎疫苗的制造方法的大致情况如下。

从ATCC购得Vero细胞(ATCC CCL-81)后，在无血清培养基中进行驯化，制备主细胞库和工作细胞库。关于病毒，将小鼠脑来源的日本脑炎疫苗制造用株北京-1株用Vero细胞进行多代传代来制备主病毒库以及工作病毒库。

将Vero细胞在微载体(Cytodex-1或3、GE healthcare公司制)上用无血清培养基培养5～7天，在细胞数达到1x10⁶cells/ml的浓度时，接种日本脑炎病毒，培养约3天，然后回收培养上清液，得到病毒悬液。

在用福尔马林灭活后，通过蔗糖密度梯度离心对病毒悬液进行纯化，制得疫苗。此时，也就是说在纯化后也可以加入稳定剂。作为稳定剂，可列举出氨基酸、胺类、酰胺类或有机酸等。

本发明的液态灭活日本脑炎疫苗在室温附近进行长期保存时的稳定性得到显著改善。本发明的改良灭活日本脑炎疫苗的制造方法是现有的灭活处理方法的改良方法。本发明中进行的改良是在灭活时进行下述2种处理中的任一种或它们的组合。

作为本发明中的灭活处理方法的第1个改良之处，可列举出在灭活处理时，添加氨基酸等。本发明中在日本脑炎病毒的灭活处理时，在缓冲液中与灭活剂(例如福尔马林)一起还添加氨基酸、胺类、酰胺类或有机酸。由此，能够制备即使在室温附近长期保存，滴度也实质上得以保持的灭活日本脑炎疫苗。

在细菌、全颗粒病毒或蛋白毒素的灭活时，通过添加氨基酸、氨或胺类等来控制灭活进度的方法是公知的(参照非专利文献6)。作为被广泛地接受的一个例子，赖氨酸具有下述效果：其与福尔马林反应以捕获过剩的福尔马林、中和福尔马林的作用，从而控制灭活以免过度进行，或者使灭活事实上停止。另外还证明了，在福尔马林与赖氨酸的末端氨基的反应中形成了Schiff’s碱(参照非专利文献7～9)。

以往，在灭活日本脑炎疫苗的制造中，考虑优选使灭活处理尽可能地完全进行，也就是说使病毒完全地灭活。因此，至今为止还没有添加被认为在日本脑炎病毒利用福尔马林进行灭活处理时有妨碍病毒灭活效果的氨基酸。本发明人等在灭活疫苗的制造中，通过改变福尔马林浓度和处理时间，对它们与灭活程度的相关性进行了研究。其中，将添加氨基酸作为控制灭活的一个方法，结果发现了预料不到的新的效果，即保存稳定性得到了改善，从而成功地开发了即使在室温附近长期保存也稳定的灭活日本脑炎疫苗。

在灭活日本脑炎疫苗时，通过添加氨基酸、胺类、酰胺类或有机酸能够带来改善保存稳定性的效果是本发明人等获得的新的有用的认识。

本发明的灭活处理时使用的氨基酸的种类只要是能够获得的氨基酸则均可，尤其优选构成蛋白质的氨基酸。另外，更优选碱性氨基酸。进一步优选水溶性氨基酸，但缬氨酸等非水溶性氨基酸有时也是高效的。天然型(L-型)、非天然型(D-型)均可使用。作为更优选的氨基酸，可列举出天冬氨酸、γ-氨基丁酸、丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、含有它们的肽以及氨基酸寡聚物等，但并不限定于这些。

作为合适的胺类、酰胺类，可列举出乙胺、乙醇胺、丙醇胺等烷基胺类，尿素，甘氨酰胺、β-丙氨酰胺等酰胺类，氨和上述物质的无机盐类等，但并不限定于这些。

酸性氨基酸、碱性氨基酸或胺类可以以盐的形式使用，另外，也可使用氨基酸的甲基酯、和乙基酯等简单的酯。

作为合适的有机酸，包括琥珀酸、酒石酸、葡萄糖酸、油酸、乳糖酸、和它们的无机盐等，但并不限定于这些。另外，也可以使用其他医药上可容许的酸和其盐。例如包括马来酸、苹果酸、硬脂酸、亚油酸、葡庚糖酸、羧基乙烯聚合物等和它们的无机盐，但并不限定于这些。

关于本发明中使用的氨基酸、胺类、酰胺类或有机酸的浓度，从实用的角度出发可使用0.005M～0.5M的范围，优选为0.02M～0.2M的范围。其中，最适浓度根据日本脑炎病毒的浓度、缓冲液的pH、灭活反应液的温度等的不同而不同。对于疫苗从业人员来说，确定最适浓度的方法是公知。

关于本处理中的氨基酸、胺类、酰胺类或有机酸的添加方法，可以在开始时一次性添加，也可以每周以1～2次左右的间隔分次添加。

对于适于制造本发明的日本脑炎疫苗的日本脑炎病毒株，没有特别限定。即，只要在用于疫苗制造时具有显示出抗原性的能力，则临床分离株(即野生株)、人工突变株、减毒株、基因重组株(包括通过反向遗传学得到的回收株)均可使用。

通过本发明制造的日本脑炎病毒疫苗制品的保存稳定性可以通过测定保存中的剩余滴度来进行确定。作为日本脑炎疫苗的滴度测定方法，可列举出中和抗体效价法、HI法、ELISA法等免疫学测定法等。其中，中和抗体效价法由于简便且可靠性高而被日本生物制剂标准采用，因此优选。中和抗体效价测定法也被称为另外的名字、“50％空斑减少法”。其是这样的方法：将免疫抗血清稀释得到的试样与已知量的日本脑炎病毒液混合，采用与Vero细胞接触后生成的空斑数来测定剩余病毒量，将空斑数减少50％的稀释度作为中和抗体效价。该方法对于处理疫苗的专家来说是公知的。

在本发明的处理方法中，考虑通过在灭活时添加氨基酸、胺类、酰胺类或有机酸从而带来稳定化效果的机制如下。以甘氨酸和赖氨酸等在末端具有氨基的氨基酸为例进行说明。简要地概括而言，推测是由于随着在氨基酸存在下的灭活中病毒表层的多糖及其他的结构物的立体结构发生变化而成为更稳定的结构，从而福尔马林灭活得以更完全地进行。即，在日本脑炎病毒表层中与包膜蛋白一起混杂存在着大的多糖结构物和其他的高分子量的酸性分子。因此认为，病毒表层上能够与福尔马林反应的部位的一部分部位被遮蔽。因此，福尔马林分子难以到达病毒表层蛋白质分子的游离氨基的一部分。

即考虑，在现有方法的无氨基酸存在下的灭活中，福尔马林虽然能够灭活病毒表面上露出部分的蛋白，但无法灭活隐藏部分的蛋白，一部分病毒蛋白在保持活性的情况下隐藏而得以残存。其属于半灭活产品。

这里，如本发明所述，当添加有甘氨酸或赖氨酸等在末端具有氨基的氨基酸时，氨基酸具有与酸性物质形成盐的性质，能够与病毒的大的结构物的某些部位结合。当氨基酸新结合于某些部位时，病毒表层上混杂的多糖分子的高次结构发生变化，由此隐藏部分的氨基暴露出来。此时，与附近存在的游离福尔马林结合。经过这样的过程，福尔马林与病毒表层蛋白质的结合更加完全地进行，可以想像在该过程中灭活病毒颗粒表层的蛋白质变为更稳定的高次结构。或者，利用福尔马林的灭活进行得更完全的结果是，可能增加了对疫苗制品中微量混合存在的蛋白分解酶的攻击的抵抗性。如此考虑，能够说明通过在氨基酸等存在下进行福尔马林处理能够制造可稳定地长期保存的日本脑炎病毒疫苗的结果。

作为本发明中灭活处理方法的第2个改良之处，可列举出对病毒实施利用物理化学技术的第二灭活处理。第2次灭活可以在化学性灭活剂的存在下也可在未存在下进行。

以往，在全颗粒病毒或蛋白质的灭活处理中，一直使用化学处理法和物理化学处理法这两者。但是，在利用福尔马林或戊二醛的化学灭活处理或利用γ射线处理或紫外线处理等物理化学方法的灭活处理中，仅实施1种处理，没有将多个方法组合来进行灭活。至今，若在全颗粒病毒的灭活处理中能够确认病毒的灭活，并且在游离蛋白质的灭活中能够确认功能活性的消失，则可理解为灭活结束。因此认为，组合实施多个灭活处理是无用的，因此并未进行尝试。本发明人等考虑通过使用化学方法的灭活制备的日本脑炎病毒疫苗在保存中品质发生劣化的一个原因在于不完全的灭活，并对日本脑炎病毒的灭活方法进行了研究。其结果，在化学灭活处理之外再追加实施利用物理化学方法的第2次灭活对疫苗的保存稳定化是有效的。

第2次灭活可以通过各种物理化学处理方法来实施。以下给出例子，但并不限定于这些。另外，同时示出可使用的条件的一个例子，但并不限定于此。

<物理化学处理法及其条件>

加热处理(温度：15～40℃；加热时间：10～120分钟)、γ射线照射(射线源：钴60；5～50kGy(千戈瑞))、激光照射(光源：各种激光照射装置；波长为500～700nm；光量：0.01-1J(焦耳)/cm²)、电子射线照射(微波炉)、超声照射。

另外，通过将全颗粒病毒制成微胶囊能够防止品质劣化。可以使用这些方法中的1种或组合使用多种方法。也可以同一方法多次反复实施。处理条件不是固定的，可通过改变悬浮病毒量、温度、缓冲液的pH、处理时间等来设定适宜条件。上述物理化学处理在无菌条件下操作。

在第1次和第2次灭活中，根据处理条件的不同，处理可能导致抗原蛋白质发生过度变性从而失去抗原性。因此，可以研究处理后的免疫原性、其他性质，并综合考虑最适的手段和最适的处理条件来进行选择。

本发明的第2次灭活是进行物理化学灭活处理中的至少一种处理。当组合多个处理来进行灭活时，可以在化学灭活处理之后进行物理化学灭活处理，也可以在物理化学灭活处理之后进行化学灭活处理。

关于本发明的第2次灭活效果的机制，以加热下的灭活为例考虑如下。可以假设与在氨基酸存在下利用福尔马林进行灭活的情况具有同样的机制。即，简要地概括而言，推测当在实施温和的物理化学处理例如温和的加热处理的同时利用福尔马林进行灭活时，病毒表层的多糖及其他的结构物的立体结构发生变化，福尔马林在病毒表面的结合更完全地进行，其结果稳定性增加。作为利用在氨基酸存在下的化学灭活处理和利用物理化学方法的第二灭活处理的组合，例如包括在氨基酸存在下进行缓慢的加热，同时利用福尔马林进行灭活。

作为支持上述机制的事实，处理效果得到认可的加热处理、γ射线处理、超声处理等在温和的条件下均具有改变多糖或复合蛋白质等高分子结构物的立体结构的效果，它们在这点上是共通的。

上述的稳定的日本脑炎疫苗的制造方法也可适用于属于其他的黄病毒的病毒的全颗粒疫苗的制造。其他的黄病毒包括登革病毒、黄热病病毒、森林脑炎病毒(TBE)、西尼罗病毒、圣·路易斯病毒等。也可用于其他全颗粒流感疫苗的制造。

本发明的稳定的日本脑炎疫苗可以用于与其他种类的抗原疫苗混合而成的混合疫苗的制造中。例如可用来制造将混合有破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳疫苗这三种的DTP三联疫苗与本发明的日本脑炎疫苗混合而成的4联疫苗。作为其他的细菌疫苗抗原，可列举出B型流感嗜血杆菌疫苗(Haemophilus influenza type B)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、伤寒沙门菌(Salmonella typhi)、产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichiacoli)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)。作为病毒抗原，可列举出口服脊髓灰质炎疫苗、灭活脊髓灰质炎疫苗、肝炎疫苗和流感疫苗，但并不限定于这些。

通过在疫苗中添加有效的佐剂来使疫苗的效果增强是公知的。因此，也可在本发明的疫苗(包括混合疫苗)中添加适当的佐剂。作为本发明的疫苗中可使用的佐剂，可列举出氢氧化铝及其无机盐类、角鲨烯或油等烃类、霍乱毒素等细菌毒素、菊糖等多糖类以及它们的组合，但并不限定于这些。通常对增强某种疫苗抗原的免疫作用有效的佐剂的种类并没有规律性。另外，有效的佐剂的种类也因给药方法的不同而不同。但是，对于本领域技术人员来说，可通过公知的反复试验来确定对疫苗有效的佐剂的种类和浓度。

作为疫苗的通常的例子，本发明的疫苗制品除了抗原以外，可以含有稳定剂(例如明胶)、保存剂(例如硫柳汞、苯氧乙醇)、着色剂(例如酚红)等。

此外，本发明还涉及预防对象者由细菌和/或病毒引起的疾病的方法，其包括将本发明的疫苗向对象者给药的工序。在本发明中，作为疾病，可列举出由日本脑炎病毒引起的疾病。

在本发明中，“给药”包括经口地或非经口地给药。作为经口的给药，可列举出以经口制剂这样的形式给药，作为经口制剂，可选择片剂、胶囊剂、溶剂或悬浮剂等剂型。此外也可以选择适当的剂型经鼻接种、经皮接种。

作为非经口的给药，可列举出以注射剂这样的形式给药。

给药量、给药方法根据对象者的体重、年龄、症状等的不同而变化，本领域技术人员可以适当地进行选择。

以下举出实施例来进行说明，但这并不是为了限定本发明。

另外，在本说明书中引用的全部现有技术文献作为参照引入本说明书中。

实施例

(实施例1)灭活时添加氨基酸使疫苗具有保存稳定性的效果

将在氨基酸的存在下利用福尔马林对病毒进行灭活处理获得的改良日本脑炎病毒疫苗保存，研究其保存稳定性。实施方法如下。

日本脑炎病毒株使用北京-1株。培养基使用细胞培养用无血清培养基VP-SFM(Invitorogen公司制)。培养是在80L容量的发酵罐中加入50L培养基来实施细胞培养的。

在从ATCC购买Vero细胞(ATCC CCL-81)后，用无血清培养基进行驯化，制备主细胞库和工作细胞库。病毒通过将小鼠脑来源的日本脑炎疫苗制造用株北京-1株用Vero细胞进行数代传代来制备主病毒库以及工作病毒库。

在无血清培养基中，将Vero细胞在微载体(Cytodex-1或3)上培养5～7天，当细胞数达到1x10⁶cells/ml的浓度时，接种日本脑炎病毒，培养约3天后，从培养上清液回收病毒，按照北里研究所的日本脑炎病毒疫苗制造方法进行纯化后，悬浮于磷酸缓冲盐水(PBS)中，制成病毒悬液。

之后，通过在0.05％(v/v)福尔马林存在下、在4℃下放置3个月来进行灭活。此时，将0.5％氨基酸或其他试验物质分别一种一种地或多种地添加到病毒悬液中(表1)。

在灭活处理后，通过蔗糖密度梯度离心法除去杂质以及福尔马林和添加物质，在PBS中调节病毒浓度。之后，每个0.7mL地分注到小瓶中制成日本脑炎疫苗。

将各小瓶在4℃的冷藏下保存。从保存开始直至9个月后，每3个月打开小瓶一次，将在相同条件下制作的试样的5个小瓶合并作为1个样品。使用5个样品，按照日本生物制剂标准、通过滴度测定法测定各保存期间后的剩余滴度。表1中以中和抗体效价示出各保存期间的剩余滴度。

[表1]

从表1的保存6个月后与9个月后的结果可知，当利用福尔马林进行日本脑炎病毒的灭活处理时，当添加甘氨酸、谷氨酰胺等氨基酸时(试验编号1-4)、以及与氨基酸一起添加糖醇(试验编号2-4)制作时的日本脑炎疫苗制品与无添加条件下进行灭活的现有方法的制品(试验编号5)相比，剩余滴度更高。即可知，即使在长期保存的情况下，当在添加上述添加物的基础上进行灭活处理时与无添加时相比保存稳定性增加。在氨基酸和糖醇这两者均无添加地进行灭活处理得到的现有方法的制品(对照)中，滴度明显低。

(实施例2)液体日本脑炎疫苗制品在长期保存时的氨基酸类的添加效果

按照与实施例1同样的方法得到病毒悬液。使用该病毒悬液，在添加0.5％甘氨酸的条件下或在无添加的条件下中，利用福尔马林对日本脑炎病毒进行灭活。之后，用蔗糖密度梯度离心进行纯化以除去杂质。然后，取病毒蛋白量10μg/ml用PBS进行再悬浮制成疫苗，每个0.7mL地分注到小瓶中。此时，向小瓶中的疫苗中添加作为稳定剂的氨基酸和糖醇。然后在4℃和28℃下保存，研究其保存稳定性。具体而言，隔3个月采用生物学制剂标准中规定的方法测定小瓶中的剩余滴度。以上结果示于表2中。滴度用中和抗体效价表示。

从表2所示的结果可清楚下述内容。

1、从试验编号1与3的比较以及试验编号2与4的比较可知，在添加了氨基酸的条件下对病毒进行灭活而制造的日本脑炎疫苗的液体制品在保存15个月后，比在无添加条件下灭活得到的制品保持有更高的滴度。也就是说，灭活处理中添加氨基酸是用于制造稳定的日本脑炎疫苗的有效的方法。

2、在试验编号3与4的比较中，在疫苗中添加作为稳定剂的氨基酸和糖醇的情况下，从保存开始到15个月后一直保持着比无添加更高的滴度。但是，在试验编号1与2的比较中，在氨基酸存在下利用福尔马林进行灭活得到的本发明的日本脑炎疫苗获得了充分的稳定性，在保持12个月后，追加氨基酸和糖醇的稳定化效果并不明显。在保存15个月后，试验编号1有剩余滴度更高的倾向。

3、在试验编号1中，在4℃下的保存和28℃下的保存均比无添加对照(试验编号3)保持着更高的滴度，但在28℃下的保存中更明显。在试验编号2中也可见同样的倾向。

4.、在第24个月可知，在28℃保存中，试验编号1比无添加对象(试验编号3)保持有更高的滴度。即可知，灭活处理中的氨基酸添加是用于制造稳定的日本脑炎疫苗的有效的方法。

[表2]

(实施例3)疫苗在保存2年后的抗感染效果

与实施例1同样地在无血清培养基中实施细胞培养得到病毒悬液。与实施例2同样地在添加0.5％甘氨酸的条件下在4℃下进行福尔马林灭活处理3个月，用蔗糖密度梯度进行纯化以除去杂质，然后每个0.7mL地分注到小瓶中制成疫苗。将疫苗在4℃或28℃下保存25个月。为了确认保存疫苗的有效性，用病毒攻击经保存疫苗免疫的小鼠，研究其抗感染能力。对ddY小鼠(4周龄)以3天间隔用保存疫苗免疫4次。在其2周后将日本脑炎病毒0.03ml(50LD50)接种到脑内，观察2周小鼠的生存情况。将生存小鼠的数量和生存率示于表3。作为对照，使用在灭活处理时没有添加任何物质作为疫苗中的稳定剂而制造的细胞培养来源的疫苗。另外，作为滴度测定用标准疫苗(参照疫苗)，将国家检验中使用的小鼠脑来源的疫苗(从感染疾病研究所购得，冷冻干燥制品)采用测定时的规定的方法溶解于PBS后使用。

在表3的试验编号1中，将在0.5％甘氨酸存在下进行灭活、纯化后的制品和在疫苗制品中没有氨基酸添加的产品在28℃下保存25个月，病毒攻击后的小鼠的生存率为83％(试验编号1、28℃保存)。另一方面，使用参照疫苗同样地进行处理，其生存率为80％(试验编号4)。由以上的结果可以确认，本发明的疫苗能够以液态在28℃下稳定地保存2年以上。

在4℃的保存下，生存率为67％(试验编号1、4℃保存)。

当在氨基酸存在下进行灭活处理、并在疫苗保存中添加氨基酸和糖醇作为保存剂时，与试验编号1相比，疫苗的剩余有效性较低(试验编号2)，但显示比无添加对照(试验编号3)高。现有制品由于滴度降低显著而无法稳定地保存。

[表3]

(实施例4)纯化后的氨基酸添加对疫苗的保存稳定性的效果

通过与实施例1同样的方法得到病毒悬液。使用该病毒悬液，在添加0.5％甘氨酸和1％山梨糖醇的条件下利用福尔马林对日本脑炎病毒进行灭活。之后，用蔗糖密度梯度离心进行纯化以除去杂质。然后，按照病毒蛋白质为10μg/ml用PBS进行再悬浮制成疫苗，向其中添加1％山梨糖醇和各种氨基酸作为稳定剂进行保存，与实施例2同样地每隔3个月测定剩余滴度直至6个月。以上的结果示于表4。

[表4]

从表4所示的结果可知以下内容。

与试验编号7的无添加(28℃保存)相比，试验编号1通过添加甘氨酸、试验编号2通过添加丙氨酸和试验编号4通过添加精氨酸，得到了较高的滴度。除了在灭活时添加氨基酸外，通过进一步在纯化后添加氨基酸，28℃保存下的日本脑炎疫苗的稳定性得以保持。

(实施例5)DTP三联疫苗与改良日本脑炎疫苗的混合疫苗

与实施例2同样地进行灭活处理，得到病毒悬液。当用福尔马林进行灭活处理时，通过添加0.5％甘氨酸、并在24℃下放置10天来进行灭活处理，制成日本脑炎疫苗。另一方面，将北里研究所制的DTP三联疫苗与本发明的稳定的日本脑炎疫苗等量混合制成混合疫苗。

采用日本生物制剂标准的方法测定各个成分抗原的滴度。结果示于表5中。在试验的滴度试验中，所有项目都符合日本生物制剂标准。

[表5]

通过本发明的制造方法制造的日本脑炎疫苗与现有的利用小鼠脑法制造的液态灭活日本脑炎疫苗具有同等或同等以上的有效性，并且与该现有的疫苗制品相比，安全性和保存稳定性得到改良。

关于安全性，在灭活处理的前阶段中，将通过无血清培养法制备的主细胞库在细胞培养的播种中使用，且由于通过无血清细胞培养法培养制造病毒，因此例如BSE(疯牛病)或肝炎病毒等血清来源的外源因子混入疫苗的危险性低。因此，通过本发明的制造方法制造的日本脑炎疫苗与现有的疫苗制品或通过添加血清的培养制造的细胞培养法日本脑炎疫苗相比更安全。

疫苗的滴度在长期的保存中维持稳定是重要且有利的。特别是液体制品在室温附近也能够长期保存，这在制造管理方面、流通方面以及在医疗现场的保存方面是非常便利的。为了利用疫苗防止在从亚热带到热带地区长期肆虐的日本脑炎病毒的感染，需要在简便的温度管理条件下长期保存各种疫苗。本发明的疫苗在这样的需要长期保存的情况下是有效的。

Claims (12)

1.一种灭活全颗粒日本脑炎疫苗的制造方法，其特征在于，包含对日本脑炎病毒进行下述工序，并使用通过细胞培养法制造的日本脑炎病毒：

(1)进行以下的(a)或者(a)和(b)所述的灭活处理的工序，

(a)在选自天冬氨酸、γ-氨基丁酸、丙氨酸、β-丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、和缬氨酸中的至少一种氨基酸的存在下，利用化学技术进行灭活处理的工序，

(b)利用物理化学技术进行灭活处理的工序；

(2)通过蔗糖密度梯度离心进行纯化的工序；

(3)纯化后在稳定剂的无添加下、在15℃～40℃的温度下保存1年以上的工序。

2.根据权利要求1所述的日本脑炎疫苗的制造方法，其中，权利要求1的(a)中所述的氨基酸为甘氨酸。

3.根据权利要求1或2所述的日本脑炎疫苗的制造方法，其中，权利要求1的(b)中所述的灭活处理为选自加热、γ射线照射、电子射线照射和激光照射中的至少一种处理方法。

4.根据权利要求3所述的日本脑炎疫苗的制造方法，其特征在于，利用加热的灭活处理是在24℃以上进行的。

5.根据权利要求1或2所述的日本脑炎疫苗的制造方法，其中，日本脑炎病毒是临床分离株即野生株、人工突变株、基因重组株或通过反向遗传学得到的回收株中的任一种。

6.根据权利要求1或2所述的日本脑炎疫苗的制造方法，其特征在于，使用通过无血清培养法制造的日本脑炎病毒。

7.根据权利要求6所述的日本脑炎疫苗的制造方法，其特征在于，在细胞培养的播种中使用通过无血清培养法制造的主细胞库。

8.一种灭活全颗粒日本脑炎疫苗，其是通过权利要求1或2所述的制造方法制造的。

9.根据权利要求8所述的日本脑炎疫苗，其中，进一步含有佐剂。

10.根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于，剂型为液态。

11.一种混合疫苗，其是由权利要求8所述的日本脑炎疫苗与其他种类的抗原构成的。

12.根据权利要求11所述的混合疫苗，其中，其他种类的抗原是选自白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳疫苗、流感嗜血杆菌疫苗、脑膜炎奈瑟菌疫苗、口服脊髓灰质炎疫苗、灭活脊髓灰质炎疫苗或肝炎疫苗中的至少一种抗原。