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CN101952727A - 微生物捕获用组合物和方法 - Google Patents

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CN101952727A
CN101952727A CN2008801269554A CN200880126955A CN101952727A CN 101952727 A CN101952727 A CN 101952727A CN 2008801269554 A CN2008801269554 A CN 2008801269554A CN 200880126955 A CN200880126955 A CN 200880126955A CN 101952727 A CN101952727 A CN 101952727A
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albumen
support thing
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斯里达尔·V·达萨拉塔
马尔科·G·博马里托
图沙尔·A·克希尔萨加尔
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3M Innovative Properties Co
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Abstract

本发明涉及用于非特异性分离细菌细胞的组合物、方法、装置和试剂盒。所述组合物包含以下组分：固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及1)多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞或者2)甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷中的至少一者。所述方法、装置和试剂盒包括这些组合物中的至少一个。

Description

微生物捕获用组合物和方法
相关专利申请的交叉引用
本发明要求2007年12月31日提交的美国临时申请序列号61/018011的优先权，该临时申请以引用方式并入本文。
政府权利
按照美国国防部核准的第DAAD-13-03-C-0047号(项目编号2640)和第W81XWH-07-01-0354号(项目编号2750)合同的条款，美国政府可拥有本发明的某些权利。
背景技术
用于确定多种样品(包括食品样品、临床样品、环境样品和实验样品在内)中微生物的存在的测定法越来越重要。这类测定法可指示微生物负荷和/或鉴定所存在的微生物。
现有的定性和定量确定微生物的存在的技术通常涉及鉴定特定的微生物，如病原菌。样品中具体微生物(如细菌)的存在的成功检测依赖于样品中的细菌浓度。通常，将细菌样品进行培养，目的是评估存活力和增加样品中的细菌数目以确保有足够的水平供检测。培养步骤需要很多时间，这会延迟获得检测结果。
通过浓缩样品中的细菌，可用较短的培养步骤或者甚至不用培养步骤就可进行检测。已开发出通过使用特定细菌菌株的特异性抗体来分离从而浓缩该菌株的方法。
已提出了其他的非菌株特异性的浓缩方法，这种方法将使得可以对所存在的微生物进行更全面的采样。菌株混合物当中的某种特定菌株或某几种特定菌株一旦得到分离，可用已知的检测方法(包括例如核酸扩增方法)来进行鉴定和/或定量。
已提出了用碳水化合物和凝集素蛋白的相互作用来非特异性分离微生物。存在于细菌表面上的凝集素被提出作为连接到聚丙烯酰胺的某些碳水化合物的捕获靶标。充当微生物营养物的物质也已被提出用作配体以供非特异性捕获微生物。这种营养物配体包括碳水化合物、维生素、铁螯合化合物和铁载体(sidorophore)。支撑物支持的壳聚糖也已被提出用于以非菌株特异性方式浓缩微生物，使得可以更容易和更快速地测定微生物。
虽然一些微生物分离方法已得到了描述，但对于改进的用于分离微生物的材料和方法仍继续存在着兴趣和需求。
发明内容
现已发现，生物素结合蛋白通过碳水化合物连接到固相支撑物，这样所得的组合对于非特异性结合细菌细胞是有效的。固相支撑物上有碳水化合物但没有生物素结合蛋白，这样所得的组合物被发现对于非特异性结合细菌细胞不太有效。此外，固相支撑物上有生物素结合蛋白但没有碳水化合物，这样所得的组合物也被发现对于非特异性结合细菌细胞不太有效。在一些实施例中，通过碳水化合物连接到固相支撑物的生物素结合蛋白，在甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷存在下，对于非特异性结合细菌细胞更加有效。
因此，本发明提供用于非特异性结合细菌细胞的新组合物。
在一个实施例中，提供包含以下组分的组合物：固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及1)多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞或者2)甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷中的至少一者。
在另一个实施例中，提供包含以下组分的组合物：
固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及
多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞。
在另一个实施例中，提供包含以下组分的组合物：
固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及
甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷。
在另一个方面，提供分离细菌细胞的方法，所述方法包括：
提供固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；
提供怀疑具有多个细菌细胞的样品；
使具有包含该碳水化合物和该生物素结合蛋白的组合的表面的该固相支撑物与该样品接触；其中来自该样品的多个细菌细胞中的至少一部分非特异性结合于该固相支撑物的表面；以及
在来自该样品的多个细菌细胞中的该至少一部分非特异性结合于该固相支撑物的表面后，使该固相支撑物与该样品的其余部分分离。
在另一个方面，提供用于检测细菌细胞的装置，该装置包括：
一种组合物，该组合物包含：
固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及
多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞；以及
用于检测细菌细胞的工具。
在另一个实施例中，提供用于检测细菌细胞的装置，该装置包括：
一种组合物，该组合物包含：
固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及
甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷；以及
用于检测细菌细胞的工具。
在另一个方面，提供试剂盒，该试剂盒包括：
固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及
甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷。
定义
术语“甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷”指通过糖苷键与糖连接的甾族化合物或三萜烯，所得的物质具有两亲性特性即表面活性剂特性，该物质既有亲水性，也有亲脂性。
术语“生物素结合蛋白”指结合生物素的亲和力和选择性高的蛋白。本文所用的“生物素结合蛋白”不包括被结合的生物素。
术语“磁性颗粒”意指由铁磁性、顺磁性或超顺磁性粒子构成的颗粒、颗粒聚集物或珠子(bead)，包括所述粒子在聚合物珠子中的分散体在内。
本文所用的“一种”、“该”、“至少一种”和“一种或多种”可互换使用。
术语“包括”和其变型形式在说明书和权利要求书中出现这些术语的地方不具有限制的含义。
以上“发明内容”并非意图描述本发明的每个公开的实施例或每种实施方式。以下“具体实施方式”更为具体地举例说明示例性的实施例。在“具体实施方式”中的几个地方，通过实例的列表来提供指导，这些实例可以以各种组合来使用。在每种情况中，所述及的列表只是用作代表性的群组，不应被解释为是排他性的列表。
具体实施方式
本发明提供用于非特异性结合细菌细胞的新组合物。“非特异性结合”细菌细胞意指该结合对于任何类型的细菌细胞来说都不是特异性的。因此，样品中的所有细菌都可与样品中的其他成分分离，而不是靶向例如一种细菌菌株。革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌都可以结合。所得的分离细菌然后可进行已知的检测方法，如细菌负荷检测。
在一个实施例中，提供包含以下组分的组合物：固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；和多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞。
在另一个实施例中，提供包含以下组分的组合物：固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；和甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷。对于某些实施例，这个组合物还包含多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞。
这些组合物可通过将上述的具有碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的固相支撑物与多个细菌细胞或者甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷中的至少一者组合在一起来制备。具有碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的固相支撑物可如下所述来提供。可通过将固相支撑物悬浮或沉浸于缓冲液中，并加入同样悬浮于缓冲液中的细菌细胞和/或溶解于缓冲液中的两亲性糖苷，来便利地将固相支撑物与细菌细胞和/或两亲性糖苷组合在一起。两亲性糖苷缓冲溶液优选含有约0.2至约10重量/体积百分比(％w/v)的两亲性糖苷，更优选约0.5至约5％w/v。
在另一个实施例中，提供分离细菌细胞的方法，所述方法包括：提供固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；提供怀疑具有多个细菌细胞的样品；使具有包含该碳水化合物和该生物素结合蛋白的组合的表面的该固相支撑物与该样品接触；其中来自该样品的多个细菌细胞中的至少一部分非特异性结合于该固相支撑物的表面；和在来自该样品的多个细菌细胞中的该至少一部分非特异性结合于该固相支撑物的表面后，使该固相支撑物与该样品的其余部分分离。
怀疑具有多个细菌细胞的样品可用已知的方法从多种来源提供。来源的例子包括生理流体，例如血液、唾液、眼睛晶状体流体、滑液、脑脊髓液、脓、汗液、渗出物、尿液、黏液、粘膜组织(例如口腔、齿龈、鼻、眼、气管、支气管、胃肠道、直肠、尿道(urethral)、尿道(ureteral)、阴道、子宫颈和子宫的粘膜)、乳汁等。样品来源的更多例子包括获自例如以下身体部位的样品：伤口、皮肤、鼻孔、鼻咽腔、鼻腔、鼻前庭、头皮、指甲、外耳、中耳、嘴巴、直肠或其他部位。样品来源的另外例子包括工艺液流、水、食品、土壤、植被、空气(例如受污染的空气)、表面(如食品制作表面)等。
已知的采样技术可用于从来源采集样品。例如，可从来源抽取一定体积的液体样品，或者可用药签或擦拭物从生理表面或环境表面收集样品。有很多种药签或其他的样品收集装置可市售获得。
样品可以直接原样从收集装置提供用于上述方法，例如在含水液体的情况中。或者，可以使用例如水、生理盐水、pH缓冲溶液或者任何其他可将样品从收集装置移除并将样品配成悬浮液的溶液或溶液组合，将样品从收集装置中洗脱、释放或洗涤下来，来提供样品。洗脱缓冲液的一个例子是磷酸缓冲盐水(PBS)，其可以与表面活性剂如聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯或聚(氧乙烯-co-氧丙烯)嵌段共聚物组合使用。其他的提取溶液可起到在从样品收集场所传送到样品分析场所的过程中保持样本稳定性的作用。这些类型的提取溶液的例子包括Amies和Stuart传送介质。
样品在与固相支撑物接触之前可以进行处理，如粘稠流体稀释、浓缩、过滤、蒸馏、透析、稀释、天然成分失活、添加试剂、化学处理等。
可通过将固相支撑物悬浮或沉浸于缓冲液中，并加入同样悬浮于缓冲液中的样品，来便利地使具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面的固相支撑物与怀疑具有多个细菌细胞的样品接触。合适的缓冲液包括PBS及PBS加非离子型表面活性剂。可将所得的混合物搅拌一段时间，该时间足以让细菌细胞结合于固相支撑物上的碳水化合物和生物素结合蛋白的组合。该结合可便利地在室温下进行。
可用公知的方法，进行固相支撑物与样品的其余部分的分离。例如，可以使样品的其余部分从固相支撑物流出、倾析出、吸出、离心出、移取出(用移液管)和/或过滤出。当固相支撑物是磁性粒子时，可用磁体将固相支撑物固定于容器的一个区域中，以方便地除去样品的其余部分，例如通过倾析、移液管移取或者用压差或重力(g-force)迫使上清液流出容器来除去样品的其余部分。或者，可例如用缓冲液洗涤固相支撑物，以除去任何剩余的未结合的样品材料。
对于某些实施例，分离细菌细胞的方法还包括检测该多个细菌细胞中的该至少一部分。对于某些这些实施例，检测是通过选自以下的检测方法来进行：通过生物发光进行的腺苷三磷酸(ATP)检测、聚二乙炔(PDA)比色检测、核酸检测、免疫学检测、基于生长的检测、表面声波检测等。
ATP检测可用作细菌负荷的非特异性指标。在将具有非特异性结合的细菌细胞的固相支撑物与样品的其余部分(其可能含有干扰性成分如胞外ATP)之后，可将细胞裂解并与萤光素和萤光素酶接触。然后可例如用发光计测量所产生的生物发光，该生物发光的强度与被捕获的细菌细胞的数量成比例。
PDA比色检测可用于通过使比色传感器与细菌接触来检测特定细菌或一批细菌。比色传感器包含受体和聚合组合物，该聚合组合物包括联乙炔化合物或聚二乙炔。当细菌细胞被受体结合时，所产生的传感器构象变化引起可测量的颜色变化。该颜色变化可例如目视测量或用比色计测量。使用能结合该受体的探针对细菌细胞进行间接检测，这也可以采用。使用这种比色传感器的PDA比色检测是公知的，在例如美国专利申请公布号2006/0134796A1、国际公布号WO 2004/057331A1和WO 2007/016633A1中以及在本受让人的共同待审美国专利申请序列号60/989298中有描述。
检测核酸(包括DNA和RNA)的方法常常包括使核酸扩增或杂交。将被捕获的细菌细胞裂解以使细胞核酸可供检测。裂解可用酶法、化学法和/或机械法进行。用于裂解的酶包括例如溶葡球菌酶、溶菌酶、变溶菌素或者其他的酶。化学裂解可用表面活性剂、碱、热或其他手段进行。当用碱进行裂解时，可用中和试剂来中和裂解后的溶液或混合物。机械裂解可通过用固体颗粒或微颗粒如珠子或微珠混合或剪切来进行。超声处理也可用于进行裂解。裂解试剂可包括表面活性剂或去污剂如十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸锂(LLS)、TRITON系列、TWEEN系列、BRIJ系列、NP系列、CHAPS、N-甲基-N-(1-氧代十二烷基)甘氨酸钠盐等，按需进行缓冲；离液剂如盐酸胍、硫氰酸胍、碘化钠等；裂解酶，如溶菌酶、溶葡球菌酶、变溶菌素、蛋白酶、链霉蛋白酶、纤维素酶或任何其他市售裂解酶；碱性裂解试剂；固体颗粒如珠子，或者它们的组合。
扩增方法的例子包括聚合酶链反应(PCR)；靶标多核苷酸扩增方法如自动维持序列扩增(3SR)和链置换扩增(SDA)；基于连接到靶标多核苷酸的信号的扩增的方法，如“支链”DNA扩增；基于探针DNA的扩增的方法，如连接酶链式反应(LCR)和QB复制酶扩增(QBR)；基于转录的方法，如连接激活的转录(LAT)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、商品名称为INVADER的扩增和转录介导的扩增(TMA)；和各种其他的扩增方法，如修复链式反应(RCR)和循环探针反应(CPR)。
引物指导的核酸扩增方法，其包括例如热循环方法如PCR、LCR和SDA，可有利地用于通过选择能与来自一批细菌的核酸杂交的探针来检测该批细菌。
核酸杂交检测方法也是公知的。在这种方法中，使单链核酸探针与来自细菌细胞的单链核酸杂交，以提供包含探针链的双链核酸。然后可进行定量和检测的核酸探针(探针标记)如荧光标记、化学发光标记和放射性标记是已知的。此外，可使用菌种特异性探针或菌种特异性探针的组合来检测特定细菌或多种不同的细菌。
免疫学检测包括检测在细菌表面上充当标志物的生物分子，如蛋白、蛋白聚糖或其他具有抗原活性的物质，抗原物质的检测通常是通过抗体、从诸如噬菌体展示的过程选择的多肽或得自筛选过程的适体来进行。免疫学检测方法是已知的，其例子包括免疫沉淀和酶联免疫吸附测定(ELISA)。可通过几种方式检测抗体结合，包括通过用荧光染料、量子点(quantum dot)或能产生化学发光或颜色变化的酶对第一抗体或第二抗体进行标记。读板机和侧向流动装置已被用于检测和定量结合事件。
基于生长的检测方法是公知的，通常包括将细菌平板接种，在特定条件下培养细菌以增加细菌细胞的数量和计数细菌细胞。PETRIFILM好氧细菌计数板(3M公司，美国明尼苏达州St.Paul市)可用于此目的。
表面声波检测，例如在国际公告号WO 2005/071416中所述的，也已知可用于检测细菌细胞。例如，已将本体声波-阻抗传感器用于检测固体介质表面上的细菌细胞的生长和数量。此方法可检测的细菌浓度范围为3.4×102至6.7×106个细胞/ml。参见Le Deng等人，J.Microbiological Methods，Vol.26，Iss.10-2，197-203(1997)。
对于某些实施例(包括任一个上述的分离细菌细胞的方法实施例在内)，使固相支撑物与样品接触是在甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷存在下进行。
如上所指出，使固相支撑物与样品接触也可以在可提供合适介质以使细菌细胞有效结合固相支撑物的缓冲液存在下进行。可在与固相支撑物接触之前、接触的同时或接触之后，将具有适当的电荷、同渗容摩(osmolarity)或其他特性的缓冲液加到样品中。PBS缓冲液和PBS-L64缓冲液是这种细胞结合缓冲液的例子。
在另一个实施例中，提供用于检测细菌细胞的装置，该装置包括：组合物，该组合物包含具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面的固相支撑物及多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及用于检测细菌细胞的工具。
在另一个实施例中，提供用于检测细菌细胞的装置，该装置包括：组合物，该组合物包含具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面的固相支撑物及甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及用于检测细菌细胞的工具。对于某些实施例，该组合物还包含多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞。
该装置可包括一个或多个容纳该组合物和该用于检测细菌细胞的工具的结构部件。该装置可为固相支撑物捕获细菌细胞、剩余样品与固相支撑物分离和检测细菌细胞提供位置(一个或多个)和条件。可将样品定位在一个或多个位置或贮存器中。该装置可提供对一个或多个位置或贮存器的均匀和准确的温度控制。该装置可例如提供位于各位置或贮存器之间的通道，使得细菌细胞结合可在一个或多个位置或贮存器中发生，而细菌细胞检测可在一个或多个其他的位置或贮存器中进行。对于某些实施例(包括任一个上述的包括该用于检测细菌细胞的装置的实施例在内)，该装置是侧向流动装置、垂直流动装置或者它们的组合。这种装置的一些例子在本受让人的共同待审美国专利申请序列号60/989291中有描述。对于某些实施例，该装置是微流控装置。微流控装置的一些例子在美国专利公告号2002/0064885(Bedingham等人)；US2002/0048533(Bedingham等人)；US2002/0047003(Bedingham等人)；和US2003/138779(Parthasarathy等人)；美国专利第6,627,159号；第6,720,187号；第6,734,401号；第6,814,935号；第6,987,253号；第7,026,168号和第7,164,107号；以及国际公告号WO 2005/061084 A1(Bedingham等人)中有描述。
对于某些包括多个细菌细胞的实施例(包括任一个上述的组合物实施例、方法实施例或装置实施例在内)，该多个细菌细胞包括两种或更多种不同类型的细菌。一种类型的细菌或一种类型的细菌细胞指该细菌或细菌细胞的菌株、菌种、菌属、菌科、菌目或菌部(part)。
对于某些包括多个细菌细胞的实施例(包括任一个上述的组合物实施例、方法实施例或装置实施例在内)，细菌选自革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。对于某些这些实施例，细菌选自芽孢杆菌属(Bacillus)、博德特氏杆菌属(Bordetella)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacteria)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、李斯特氏菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)和耶尔森氏菌属(Yersinia)。对于某些实施例，细菌选自金黄色葡萄球菌(S.aureus)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、粪肠球菌(E.faecalis)、无乳链球菌(Strep agalatiae)、停乳链球菌(Strep dysgalatiae)、大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌属(Salmonella)和B组链球菌(Group B Strep)。
在另一个实施例中，提供试剂盒，该试剂盒包含具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面的固相支撑物，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷。对于某些这些实施例，该试剂盒还包含用于检测细菌细胞的工具。
对于某些实施例(包含任一个上述的装置或试剂盒实施例在内)，用于检测细菌细胞的工具选自：用于通过生物发光检测腺苷三磷酸(ATP)的试剂、PDA比色传感器、用于核酸检测的试剂、用于免疫学检测的试剂、用于平板接种和计数细菌细胞的培养基、表面声波传感器等。
用于检测ATP的试剂包括萤光素、萤光素酶和任选包括裂解剂。用于核酸检测的试剂包括例如引物、探针、用于延伸该引物的酶或者它们的组合。用于免疫学检测的试剂包括例如至少一种抗体。
对于某些包括甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷的实施例(包括任一个上述的组合物实施例、方法实施例、装置实施例或试剂盒实施例在内)，该甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷是皂苷。皂苷是27个碳原子的甾族化合物或30个碳原子的三萜烯通过糖苷键与糖连接所成。对于某些实施例，糖选自己糖、戊糖、糖二酸和它们的组合。皂苷已被用作温和的去污剂和用于裂解红细胞。但是，出乎意料的是，现已发现这类物质可与生物素结合蛋白和碳水化合物(生物素结合蛋白通过碳水化合物连接到固相支撑物)的组合一起存在，而不损失非特异性结合细菌细胞的有效性。此外，对于某些实施例，生物素结合蛋白和碳水化合物(生物素结合蛋白通过碳水化合物连接到固相支撑物)的组合与甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷组合在一起，或以上所述的其实施例，对于非特异性结合细菌细胞更加有效。
对于某些实施例(包括任一个上述的组合物实施例、方法实施例、装置实施例或试剂盒实施例在内)，生物素结合蛋白是这样的蛋白，如果生物素与其一起存在的话，其可每蛋白分子结合四个生物素分子。虽然本发明的实施例包括生物素结合蛋白，但所包括的该生物素结合蛋白没有结合于其上的生物素(或与另一物质连接的生物素)。对于某些这些实施例，生物素结合蛋白选自亲和素、链亲和素、中和亲和素(neutravidin)和经选择性硝化的亲和素。亲和素是质量为约66kDa、等电点为10至10.5的糖蛋白。亲和素约10％的总质量是碳水化合物。亲和素可市售获得，例如获自Sigma-Aldrich公司。链亲和素是质量为约60kDa、等电点为约5的四聚蛋白。链亲和素(其缺乏亲和素中存在的碳水化合物组分)可市售获得，例如获自Pierce公司。中和亲和素为去糖基化的亲和素，质量为约60kDa，等电点为约6.3。中和亲和素可市售获自Pierce公司。经选择性硝化的亲和素是亲和素的四个生物素结合位点中的酪氨酸残基被硝化，其可获自Molecular Probes，Inc公司，商品名为CAPTAVIDIN。对于某些这些实施例，生物素结合蛋白是链亲和素。
对于某些实施例(包括任一个上述的组合物实施例、方法实施例、装置实施例或试剂盒实施例在内)，碳水化合物选自单糖、寡糖、多糖和它们的组合。合适的单糖包括例如甘露糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、岩藻糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、鼠李糖、半乳糖胺、葡糖胺、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、N-乙酰神经胺酸、甲基-D-吡喃甘露糖苷、α-甲基葡萄糖苷、半乳糖苷、核糖、木糖、阿拉伯糖、糖二酸盐、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、甘油、这些单糖中的任何一种的衍生物、以及它们的组合。合适的寡糖包括那些具有2-12个可相同或不同的单糖单元的寡糖。例子包括具有2-6个单元的寡甘露糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖、水杨苷、这些寡糖中的任何一种的衍生物、以及它们的组合。合适的多糖包括那些超过12个可相同或不同的单糖单元的多糖。例子包括诸如以下的多糖：阿拉伯树胶(金合欢树胶)，其据认为是半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和葡糖醛酸(作为钙盐、镁盐和钾盐)的分支聚合物；半乳甘露聚糖多糖(刺槐豆胶)，其据认为是甘露糖的直链聚合物，在每四个甘露糖上有一个半乳糖分支；瓜尔豆胶，其据认为是甘露糖的直链聚合物，每两个单元上有一个半乳糖分支；和刺梧桐胶，其据认为包括半乳糖、鼠李糖和葡糖醛酸的部分乙酰化聚合物。对于某些这些实施例，碳水化合物包括至少一个羧基基团。任何一种包括至少一个羧基基团的上述单糖、寡糖、多糖和它们的组合都可使用。此外，任何一种被衍生化以包括至少一个羧基基团的上述单糖、寡糖、多糖和它们的组合都可使用。对于某些这些实施例，碳水化合物是多糖。对于某些这些实施例，碳水化合物包含阿拉伯酸。
可通过生物素结合蛋白上的官能团与碳水化合物上的官能团之间的反应，使生物素结合蛋白与碳水化合物共价键合。对于某些实施例(包括任一个上述的组合物实施例、方法实施例、装置实施例或试剂盒实施例在内)，碳水化合物包括至少一个羧基基团，生物素结合蛋白通过连接基团与碳水化合物共价键合，该连接基团是该蛋白和该碳水化合物的至少一个羧基基团的反应产物。生物素结合蛋白通过公知的相互作用与碳水化合物发生共价键合。例如，生物素结合蛋白的氨基与碳水化合物的羧基基团反应以提供连接基团，在这个情况中是酰胺基团。在另一个例子中，生物素结合蛋白的羟基与碳水化合物的羧基基团反应以提供连接基团，在这个情况中是酯基团。这些连接基团任一者或两者可提供该蛋白和该碳水化合物之间的键，不过作为另外一种选择或除此之外，也可使用其他已知的键合途径和连接基团。
固相支撑物可部分或完全由碳水化合物构成。固相支撑物被构造成在其表面具有碳水化合物，使得该碳水化合物可供与生物素结合蛋白反应。该生物素结合蛋白于是与该碳水化合物键合，而该碳水化合物是与该固相支撑物连接，或者就是该固相支撑物。
固相支撑物可以是任何已知的目前被用于进行分离或固定化的支撑物或基质。对于某些实施例(包括任一个上述的组合物实施例、方法实施例、装置实施例或试剂盒实施例在内)，固相支撑物选自珠子、凝胶、薄膜、薄片、颗粒、过滤器、膜、板、带、管、孔、纤维、毛细管、以及它们的组合。固相支撑物可包含玻璃、二氧化硅、陶瓷、金属、聚合物或它们的组合。合适的聚合物包括例如乳胶、纤维素、多糖、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚烯烃(如聚乙烯、聚丙烯和聚(4-甲基丁烯))、聚烯烃共聚物、聚烯烃离子聚合物、聚烯烃共混物、聚苯乙烯、聚酰胺(如尼龙)、聚(丁酸乙烯酯)、聚酯(如聚(对苯二甲酸乙二醇酯))、聚氯乙烯、聚(乙烯醇)和聚碳酸酯。对于某些实施例，固相支撑物包含多糖。
固相支撑物可用碳水化合物(如一种或多种以上所述的那些碳水化合物)进行包覆。包覆的碳水化合物可通过已知的键合方法和结构结合于固相支撑物。例如，固相支撑物表面可首先用异氰酸基团进行官能化，然后用碳水化合物进行包覆。碳水化合物上的羟基基团(和氨基基团，如果存在的话)与异氰酸基团反应，从而使碳水化合物键合到固相支撑物。
对于某些实施例(包括任一个上述的组合物实施例、方法实施例、装置实施例或试剂盒实施例在内)，固相支撑物是磁性颗粒。有多种磁性颗粒可市售获得，包括例如其中包入了磁性胶体的聚(乙烯醇)基聚合物颗粒(Chemagen AG，德国)、包含磁赤铁矿(γ-Fe2O3)和磁铁矿(Fe3O4)混合物与聚苯乙烯壳的分散体的聚苯乙烯球(Dynal Biotech ASA，挪威奥斯陆)、具有多糖基质的磁性颗粒(Chemicell GmbH，德国柏林)和具有多糖芯并包覆有链亲和素的磁性颗粒(Chemicell GmbH)。那些不包含可供与生物素结合蛋白键合的碳水化合物的磁性珠子或颗粒，可例如如上所述进行修饰以连接上碳水化合物，该碳水化合物然后就可与生物素结合蛋白键合。具有多糖芯或基质的磁性颗粒可与生物素结合蛋白反应，以提供上述的碳水化合物与蛋白的组合。已经包覆有链亲和素的具有多糖芯或基质的磁性颗粒不经修饰即可使用。
对于某些实施例(包括任一个上述的包括磁性珠子或颗粒的实施例在内)，磁性珠子或颗粒的直径为约0.02至约5微米。对于非球形的珠子或颗粒，这个直径指珠子或颗粒的至少一个维度。这个直径范围为细菌细胞的有效非特异性捕获提供合适的表面积。
通过以下的实例进一步说明本发明的目标和优点，但不应当将这些实例中例举的具体材料及其量以及其它的条件和细节理解成对本发明的不当限制。
实例
实例中以及说明书通篇中的所有份量、百分数、比例等均以摩尔计，除非另外指明。所有没有指出供应商的溶剂和试剂均购自Aldrich Chemical(美国威斯康星州Milwaukee市)。水是用电阻系数为18.2Mohms/cm的U-V Milli-Q纯水器(Millipore，美国马萨诸塞州Bedford市)进行纯化。
缩写表
Figure BPA00001205076200171
制备实例1-含PLURONIC L64的磷酸缓冲盐水(PBS-L64缓冲 液)的制备
通过将获自EMD Biosciences(美国加州San Diego市)的10x PBS浓缩液稀释十倍，制备磷酸盐缓冲液(PBS)溶液。这得到具有以下盐组成的PBS缓冲溶液：10mM磷酸钠、137mM氯化钠、2.7mM氯化钾。该PBS缓冲溶液在25℃下pH为7.5。将PLURONIC L64表面活性剂以0.2％(w/v)的量加入到该PBS缓冲溶液中，以提供25℃下pH为7.5的含PLURONIC L64的磷酸缓冲盐水(PBS-L64缓冲液)。
制备实例2-抗体官能化的磁性珠子的制备
所有抗体制品均用EZ-Link NHS-PEO4-生物素(获自美国伊利诺伊州Rockford市Pierce公司，货号21330)按照厂商说明书进行生物素酰化。使用链亲和素包被的磁性颗粒(100nm FLUIDMAG珠子，获自Chemicell GmbH(德国柏林))。所有的反应和洗涤均在PBS L-64缓冲液中进行，除非另外指明。洗涤步骤包括三次连续的洗涤，除非另外指明。洗涤过程包括将磁体靠近管子放置，以将颗粒吸到管子靠近磁体的一侧，将液体从有磁体靠近的管子中移除，然后加入等体积的新鲜缓冲液代替被移除的液体。移去磁体，让颗粒重悬和混合。
将浓度为2.5毫克/毫升(mg/ml)的链亲和素包被磁性颗粒与生物素酰化的抗体制品在500μl PBS L-64缓冲液中混合。抗体与缀合颗粒的质量比为40μg抗体/mg颗粒。将所得的混合物在37℃下温育1小时。随后，将颗粒在PBS L-64缓冲液中洗涤，以除去未结合的抗体。最后一次洗涤后，将颗粒重悬成2.5mg/ml的颗粒浓度。
制备实例3-将链亲和素或中和亲和素连接到在表面上具有羧基 官能团的多糖或聚苯乙烯珠子
如下制备链亲和素储备液：首先将5mg的ImmunoPure链亲和素(Pierce，美国伊利诺伊州Rockford市)溶于0.5ml的水中(最终溶液浓度为10mg/ml)，随后将75μl的所得溶液加入到425μl的MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液中，获得1.5mg/ml的最终链亲和素溶液浓度。
如下制备中和亲和素储备液：首先将10mg的中和亲和素(Pierce，美国伊利诺伊州Rockford市)溶于1.0ml的水中(最终溶液浓度为10mg/ml)，随后将75μl的所得溶液加入到425μl的MES缓冲液中，获得1.5mg/ml的最终中和亲和素溶液浓度。
在即将对珠子进行官能化之前，如下制备EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺)储备溶液：将20mg EDC加入到0.5ml MES缓冲液中，得到40mg/ml的最终EDC溶液浓度。
应用以下程序，用链亲和素或中和亲和素对FLUIDMAG ARA珠子(100nm，获自Chemicell GmbH，德国柏林)进行官能化：
1.将100μl珠子储备溶液在1ml MES缓冲液中洗涤两次，除去上清液。
2.将珠子重悬于0.2ml的如上制备的EDC溶液。
3.将悬浮液在室温下混合10分钟。
4.用1ml MES缓冲液洗涤珠子两次。
5.将珠子与如上制备的链亲和素或中和亲和素储备液重悬于0.2ml MES缓冲液中，所得的混合物在室温下在搅拌下温育2小时。
6.将所得的珠子在PBS L-64缓冲液中洗涤三次。
7.将珠子重悬于1.2ml PBS L-64缓冲液中，得到2.5mg/ml的最终珠子溶液浓度。
应用同上所述的程序，但以300μl的珠子储备溶液而不是上述的100μl开始，用链亲和素或中和亲和素对DYNAL C1珠子(获自Invitrogen Inc.，美国加州Carlsbad市)进行官能化。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus，ATCCC 25923)和绿脓杆 菌(Pseudomonas.aeruginosa，ATCCC 10662)细胞的捕获和检测程序
用在胰酶大豆肉汤中于37℃下生长的过夜培养物制备细菌悬浮液。将培养物离心收获细胞，细胞沉淀重悬于无菌磷酸缓冲盐水中，至大约5×108cfu/mL的最终浓度。实验前，将细菌在PBS L-64缓冲液中洗涤三次，并稀释至大约5×103至5×106cfu/mL。任选地，然后将人血清白蛋白(HSA)加到所得溶液中，以达到蛋白的目标浓度(通常300μg/ml)。将所需数量的链亲和素包被颗粒悬浮液(10mg/mL)(FLUIDMAG珠子，获自Chemicell GmbH，德国柏林)与细菌悬浮液在2ml聚丙烯小瓶中混合至500微升(μl)的总体积。手工摇动小瓶30秒以混合细菌和颗粒，然后在设定在大约0.3圈/秒的摇动平台(往复式BARNSTEAD/THERMOLYNE VARIMIX(美国爱荷华州Dubuque市))上摇动15分钟。用磁体将颗粒吸到小瓶的一侧5分钟。移取含有不被颗粒吸附的细菌细胞的上清液，并在无菌PBS L-64缓冲液中稀释10倍。然后如下进行任选的洗涤步骤：将小瓶从磁体移开，加入500μl无菌PBS L-64缓冲液，手工摇动小瓶30秒以使颗粒重悬。将小瓶靠近磁体放置5分钟，吸取洗涤溶液，在PBS L-64缓冲液中稀释10倍。将小瓶从磁体移开，加入500μl缓冲液，手工摇动小瓶30秒以使颗粒重悬。
各个溶液(上清液、洗涤液和重悬颗粒)中的活细菌数通过将每个悬浮液的系列稀释液平板接种在PETRIFILM好氧细菌计数板(3M公司，美国明尼苏达州St.Paul市)上进行测定。
实例1
金黄色葡萄球菌(ATCCC 25923))捕获
应用上述的“捕获和检测程序”，用具有多糖芯且经链亲和素官能化的FLUIDMAG颗粒(100nm，获自Chemicell GmbH，德国柏林)非特异性捕获金黄色葡萄球菌25923。将10μl的颗粒与490μl的大约5×103cfu/ml的细菌进行组合。实验中包括洗涤步骤。
颗粒显示出高的细菌捕获百分率。当用对细胞表面上存在的任何抗原没有特异性的抗体(如制备实例2所制备)包被相同的颗粒，并重复相同的实验时，捕获情况差。因此，抗体的存在显著降低了非特异性细菌捕获。结果如表1所示。
表1.用具有多糖芯且经链亲和素官能化的100nm珠子捕获金黄 色葡萄球菌
  颗粒   捕获百分率
  链亲和素/多糖   96.7
  PBP2A抗体-生物素连接于链亲和素/多糖   11.9
对于PBP2A抗体，参见本受让人的共同待审美国专利申请序列号60/867089。
实例2
链亲和素官能化珠子与无链亲和素的羧基官能化珠子之间的比较
按照上述的“捕获和检测程序”，用具有多糖芯且经链亲和素官能化的FLUIDMAG磁性颗粒(100nm，Chemicell GmbH)非特异性捕获细菌。另外，还试验了具有多糖芯和表面羧基表面基团的FLUIDMAGARA磁性颗粒(100nm，Chemicell GmbH)。对绿脓杆菌(ATCCC 10662)(表2)和金黄色葡萄球菌(ATCCC 25923)(表3)进行了捕获。捕获是在存在和不存在300μg/ml人血清白蛋白下进行。对于所有实验，将颗粒(30μl)与470μl的大约5×106cfu/ml的细菌进行组合(颗粒浓度为0.6mg/ml)。结果在表2和3中显示。
表2.链亲和素/多糖捕获绿脓杆菌(10662)与无链亲和素的羧基/多 糖捕获绿脓杆菌的比较
  颗粒表面   血清白蛋白(μg/ml)   重复1   重复2
  链亲和素/多糖   0   47.51   47.70
  链亲和素/多糖   300   43.44   33.66
  羧基/多糖   0   26.21   24.11
  羧基/多糖   300   9.97   9.42
如表2中所示，链亲和素珠子显示出对绿脓杆菌的捕获在血清白蛋白存在下捕获率稍低。但是，羧基珠子显示出捕获率显著降低，特别是在血清白蛋白存在下。尽管两种颗粒都具有相同的多糖芯化学组成，但具有链亲和素的颗粒与经羧基基团官能化但没有链亲和素的颗粒表面相比，显示出捕获情况好得多。
表3.链亲和素/多糖捕获金黄色葡萄球菌(25923)与无链亲和素的 羧基/多糖捕获金黄色葡萄球菌的比较
  颗粒表面   血清白蛋白(μg/ml)   重复1   重复2
  链亲和素/多糖   0   99.78   99.91
  链亲和素/多糖   300   99.58   95.95
  羧基/多糖   0   4.21   9.15
  羧基/多糖   300   6.20   3.30
如表3中所示，链亲和素/多糖珠子在血清白蛋白存在和不存在下都显示出极好的金黄色葡萄球菌捕获。但是，无链亲和素的羧基珠子在两种情况下都显示出较差的捕获。尽管两种颗粒都具有相同的多糖芯，但在表面上具有链亲和素的颗粒表现得明显更好。
实例3
链亲和素/多糖在红细胞和蛋白存在下的捕获
按照上述的“捕获和检测程序”，用具有多糖芯且经链亲和素官能化的FLUIDMAG磁性颗粒(100nm，Chemicell GmbH)非特异性捕获细菌。对绿脓杆菌(ATCCC 10662)(表4)和金黄色葡萄球菌(ATCCC 25923)(表5)进行了捕获。捕获是在样品中存在不同浓度的血液(1∶1000、1∶10000和1∶100000全血稀释液)情况下进行。还试验了无血液的对照样品。对于所有实验，将颗粒(30μl)与470μl的大约5×106cfu/ml的细菌进行组合(颗粒浓度为0.6mg/ml)。结果在表4和5中显示。
表4.链亲和素/多糖在血细胞存在和不存在下对绿脓杆菌(10662) 的捕获
  血液稀释度   重复1   重复2   重复3
  1∶1000   69.59   72.43   72.32
  1∶10000   88.41   92.96   91.84
  1∶100000   90.91   96.49   96.50
  对照(无血液)   98.71   98.42   99.95
极好的绿脓杆菌捕获见于对照样品。虽然随着血液水平的增高捕获下降，但即使在最高的受试血液水平(1∶1000稀释度)下捕获水平也是令人满意的。
表5.链亲和素/多糖在血细胞存在和不存在下对金黄色葡萄球菌 (25923)的捕获
  血液稀释度   重复1   重复2   重复3
  1∶1000   73.9   81.4   82.1
  1∶10000   60.4   90.7   91.6
  1∶100000   98.0   97.3   97.9
  对照(无血液)   99.2   99.5   99.9
对于金黄色葡萄球菌，极好的捕获见于对照样品。虽然随着血液水平的增高捕获下降，但即使在最高的受试血液水平(1∶1000稀释度)下捕获水平也是令人满意的。
实例4
链亲和素/多糖珠子捕获金黄色葡萄球菌(ATCCC 25923)与链亲和 素/聚苯乙烯-羧基珠子捕获金黄色葡萄球菌的比较
如制备实例3，将链亲和素连接到聚苯乙烯-羧基珠子(DYNAL C1)和多糖-羧基珠子(FLUIDMAG ARA，Chemicell GmbH，德国柏林)，并按照上述的“捕获和检测程序”捕获金黄色葡萄球菌(ATCCC 25923)(将32μl的如制备实例3中所制备的珠子储备溶液加到468μl的细菌储备样品，以获得0.16mg/ml的最终珠子溶液浓度)。另外，用未经修饰的聚苯乙烯-羧基(DYNAL C1)珠子和多糖-羧基(FLUIDMAG ARA)珠子进行捕获实验。结果如表6所示。
表6.链亲和素/多糖珠子、多糖-羧基珠子、链亲和素/聚苯乙烯- 羧基珠子和聚苯乙烯-羧基珠子对金黄色葡萄球菌(ATCCC 25923)的捕 获(细菌储备液浓度为44000cfu/ml)
  珠子类型   珠子上细菌计数   珠子上细菌计数   平均珠子上细菌计数
  聚苯乙烯-羧基   12000   11500   11750
  多糖-羧基   950   1000   975
  聚苯乙烯-链亲和素   2300   2550   2425
  多糖-链亲和素   29500   31250   30375
参见表6，链亲和素官能化的聚苯乙烯珠子的捕获效率比未经修饰的聚苯乙烯珠子低大约5倍。另一方面，对于经链亲和素修饰的多糖珠子，捕获效率比未经修饰的多糖珠子或经链亲和素官能化的聚苯乙烯珠子好大约10倍。
实例5
链亲和素/多糖珠子捕获绿脓杆菌(ATCCC 35032)与链亲和素/聚 苯乙烯-羧基珠子捕获绿脓杆菌的比较
采用绿脓杆菌(ATCCC 35032)而不是金黄色葡萄球菌，实质上重复实例4，结果总结于下表7中。总的来讲，经链亲和素修饰的多糖珠子得到最好的非特异性细菌捕获性能。
表7.链亲和素/多糖珠子、多糖-羧基珠子、链亲和素/聚苯乙烯- 羧基珠子和聚苯乙烯-羧基珠子对绿脓杆菌的捕获(细菌储备液浓度为 12000cfu/ml)
  珠子类型   珠子上细菌计数   珠子上细菌计数   平均珠子上细菌计数
  聚苯乙烯-羧基   1300   800   1050
  多糖-羧基   4450   5100   4775
  聚苯乙烯-链亲和素   3500   3750   3625
  多糖-链亲和素   5250   5150   5200
实例6
中和亲和素/多糖珠子捕获金黄色葡萄球菌(ATCCC 25923)与中和 亲和素/聚苯乙烯-羧基珠子捕获金黄色葡萄球菌的比较
按制备实例3，将中和亲和素连接到聚苯乙烯-羧基(DYNAL C1)珠子和多糖-羧基(FLUIDMAG ARA，Chemicell GmbH)珠子，并按照上述“捕获和检测程序”捕获金黄色葡萄球菌(ATCCC 25923)(将32μl的如制备实例3中所制备的珠子储备溶液加到468μl的细菌储备样品，以获得0.16mg/ml的最终珠子溶液浓度)。结果如表8示。
表8.中和亲和素/多糖珠子捕获金黄色葡萄球菌与中和亲和素/聚 苯乙烯珠子捕获金黄色葡萄球菌的比较(细菌储备液浓度为 88000cfu/ml)
  珠子类型   珠子上细菌计数   珠子上细菌计数   平均珠子上细菌计数
  聚苯乙烯-中和亲和素   700   600   650
  多糖-中和亲和素   47000   57000   52000
参见表8，经中和亲和素修饰的多糖珠子显示出比经中和亲和素修饰的聚苯乙烯珠子好十倍的捕获效率。
实例7
中和亲和素/多糖珠子捕获绿脓杆菌(ATCCC 35032)与中和亲和素 /聚苯乙烯-羧基珠子捕获绿脓杆菌的比较
用绿脓杆菌(ATCCC 35032)代替金黄色葡萄球菌，实质上重复实例6，结果总结于下表9中。具有中和亲和素的多糖珠子所提供的非特异性细菌捕获比具有中和亲和素的聚苯乙烯珠子显著大得多。
表9.中和亲和素/多糖珠子捕获绿脓杆菌与中和亲和素/聚苯乙烯 珠子捕获绿脓杆菌的比较(细菌储备液浓度为18000cfu/ml)
  珠子类型   珠子上细菌计数   珠子上细菌计数   平均珠子上细菌计数
  聚苯乙烯-中和亲和素   1600   650   1125
  多糖-中和亲和素   4850   3300   4075
实例8
用经链亲和素官能化的多糖珠子非特异性捕获各种细菌
按制备实例3，将链亲和素连接到多糖-羧基珠子(FLUIDMAG ARA，Chemicell GmbH)，并按照上述“捕获和检测程序”捕获各种细菌菌株(来自临床分离物)(将32μl的如制备实例3中所制备的珠子储备溶液加到468μl的细菌储备样品，以获得0.16mg/ml的最终珠子溶液浓度)。结果总结于下表10中。
表10.用经链亲和素官能化的多糖珠子非特异性捕获各种细菌
  细菌   珠子上细菌计数   珠子上细菌计数   初始储备液浓度
  金黄色葡萄球菌ATCCC 25923   14000   16000   25000
  金黄色葡萄球菌(S.aureus 050)   9000   8600   32000
  金黄色葡萄球菌(S.aureus 27A)   5900   7600   33000
  表皮葡萄球菌(S.epidermidis 31A)   23000   27000   28000
  粪肠球菌(E.faecalis 32A)   3600   2400   19000
  绿脓杆菌(P.aeruginosa 4A)   11000   10000   28000
  绿脓杆菌(P.aeruginosa 26A)   2100   1700   20000
表10的结果显示，多糖-链亲和素珠子可用来非特异性捕获多种微生物。
实例9
用经链亲和素官能化的多糖珠子非特异性捕获链球菌属细菌菌株
用具有多糖芯且经链亲和素官能化的FLUIDMAG磁性颗粒(100nm，Chemicell GmbH)非特异性捕获无乳链球菌(Strep agalatiae)39B和停乳链球菌(Strep dysgalatiae)1E(临床分离物)。使用0.6mg/ml的珠子溶液浓度，遵循上述的“捕获和检测程序”。结果(在表11中显示)表明无乳链球菌和停乳链球菌都得到有效捕获。
表11.用FLUIDMAG珠子(Chemicell GmbH)非特异性捕获链球菌 细菌菌株
  细菌   珠子上细菌计数   珠子上细菌计数   储备液浓度
  无乳链球菌39B   3300   3400   5600
  停乳链球菌1E   7600   8800   9400
实例10
皂苷对用经链亲和素官能化的多糖珠子非特异性捕获细菌的影响
通过使大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌属(Salmonella)和B组链球菌(Group B Streptococcus)在血液琼脂平板上生长过夜，制备这些细菌的溶液。然后按MacFarland浊度标准，在PBS L-64缓冲液中制备各细菌悬浮液至大约1×108cfu/mL的浓度。将各悬浮液在PBS L-64缓冲液中稀释至大约1×106cfu/mL的工作浓度。
通过将32μl的经链亲和素官能化的多糖-羧基珠子(用制备实例3中的FLUIDMAG ARA珠子制作)(2.5mg/mL)加到234μl的细菌样品，进行捕获实验。制备皂苷(货号47036，Sigma-Aldrich)于PBS缓冲液中的2％储备溶液。对于在皂苷存在下进行的捕获实验，将234μl的皂苷储备溶液加到珠子-细菌混合物，在捕获过程中导致0.9％的皂苷浓度。对于在皂苷不存在下进行的捕获实验，将234μl的PBS L-64缓冲液加到珠子-细菌混合物。在捕获实验过程中珠子浓度为0.16mg/ml，捕获实验是从这一点往后按上述的“捕获和检测程序”进行。表12所示的结果表明，对于所有受试细菌，皂苷的存在都增加了细菌捕获。
表12.皂苷对用经链亲和素官能化的多糖珠子非特异性捕获大肠 杆菌、沙门氏菌属和B组链球菌的影响
Figure BPA00001205076200281
实例11-22和比较例1-4
细菌的捕获和ATP检测
应用上述的“捕获和检测程序”，用具有多糖芯并经链亲和素或中和亲和素官能化的FLUIDMAG ARA珠子(100nm，获自Chemicell GmbH，德国柏林)(如制备实例3中所制备)非特异性捕获金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)和大肠杆菌(ATCC 25922)。对于每个实例，用聚丙烯微量离心管(获自VWR Scientific，美国宾夕法尼亚州West Chester市)将10μl的珠子悬浮液与以下两个浓度的490μl细菌悬浮液进行组合：～1×106cfu/ml和～1×105cfu/ml。还用上述的“捕获和检测程序”制备0cfu/ml的样品和阳性对照样品(细菌浓度为1×106cfu/ml或1×105cfu/ml，不含任何捕获珠子)。
然后通过将微量离心管放在DYNAL磁性固定装置(获自Invitrogen，Inc.美国加州Carlsbad市)至少5分钟，对珠子进行分离和集中。用微量移液器吸取上清液并弃去，不要破坏聚集的珠子。
然后通过向管中加入0.5ml PBS-L64缓冲液并以摇动运动搅动5分钟，将珠子进行洗涤。然后将微量离心管放在DYNAL磁性固定装置中至少5分钟，对珠子再次进行分离和集中。用微量移液器吸取洗涤溶液并弃去，不要破坏聚集的珠子。再一次重复这个洗涤步骤。
将100μl的经DEPC(焦碳酸二乙酯，获自Aldrich Chemicals，美国威斯康星州Milwaukee市)处理的水和100μl的提取剂XM(获自Biotrace International BioProducts Inc.，美国华盛顿州Bothell市)加到珠子。将小瓶从磁性固定装置取出，手工搅动以使颗粒重悬。还采用漩涡混合(vortexing)确保颗粒悬浮，不存在任何可见的聚集。将悬浮的颗粒与经DEPC处理的水和提取剂XM一起温育最少60秒钟。
接着将微量离心管放在DYNAL磁性固定装置中至少5分钟，对珠子再次进行分离和集中。然后，在去除药签和装有粒状裂解剂的用箔密封的室之后，用微量移液器将上清液吸取到Biotrace AQUA-TRACE试验装置(获自Biotrace International BioProducts Inc.，美国华盛顿州Bothell市)的底室。Biotrace装置的底室装有通过萤光素酶生物发光测定ATP的存在所需的所有干燥试剂。将样品漩涡混合10秒，并在将上清液加到Biotrace AQUA-TRACE试验装置的底室后30秒内放入Biotrace发光计(UNI-LITE NG，获自Biotrace International BioProducts Inc.，美国华盛顿州Bothell市)中。每个样品的生物发光响应以相对发光单位(RLU)在表13中报道。表13中报道了三个重复试验的平均RLU。表13中还显示了所报道的RLU值的1δ标准偏差。
表13.用ATP检测法对捕获的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的检测
Figure BPA00001205076200301
C1、C2、C3和C4是比较例1、2、3和4。
在两个受试浓度下都检测到金黄色葡萄球菌，而大肠杆菌仅在最高的受试浓度下检测到。当将阳性对照信号强度(C1-C4)与用顺磁性珠子捕获的样品的信号强度比较时，发现被捕获的样品的强度较低，这是由样品制品的捕获效率低于100％且测定过程中样品ATP损失(由被提取的ATP非特异性结合在珠子上所致)引起的。
实例23-27
在裂解血液细胞存在下进行的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌捕获和 ATP检测
如同实例11-22中所述重复进行检测细菌的测定法，例外的是初始样品组成为：234μl的1∶10,000稀释的(用PBS缓冲液)和裂解的(用0.9％皂苷货号47036，Sigma-Aldrich)人全血样本，以及234μl的含有0、1×105或1×106cfu/ml细菌的PBS缓冲液，和32μl的具有多糖芯且经链亲和素官能化的FLUIDMAG颗粒(100nm，获自Chemicell GmbH，德国柏林)。每个样品的生物发光响应以相对发光单位(RLU)在表14中报道。表14中报道了三个重复试验的平均RLU。表14中还显示了所报道的RLU值的1δ标准偏差。表14中显示的数据表明在两种受试浓度下都观察到两种细菌被检测出。
表14.在裂解血液细胞存在下进行的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌 的ATP检测
本文所引述的专利、专利文献和出版物的全部公开内容以引用方式全文并入本文，如同每个专利、专利文献和出版物单独并入本文。在不背离本发明的范围和实质的前提下，对本发明所进行的各种修改和变动对本领域技术人员来说将是显而易见的。应该理解的是，并非意图将本发明不当地限制为本文中给出的示例性实施例及实例，这种实例及实施例只是作为例子给出，而本发明的范围只由本文中以下给出的权利要求所限定。

Claims (48)

1.一种组合物，其包含：
固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及
多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞。
2.一种组合物，其包含：
固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及
甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷。
3.根据权利要求2所述的组合物，其还包含多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞。
4.根据权利要求1或权利要求3所述的组合物，其中所述多个细菌细胞包括两种或更多种不同类型的细菌。
5.根据权利要求1、3和4中任一项所述的组合物，其中所述细菌选自芽孢杆菌属(Bacillus)、博德特氏杆菌属(Bordetella)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacteria)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、李斯特氏菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)和耶尔森氏菌属(Yersinia)。
6.根据权利要求2、3和作为权利要求3的从属权利要求的权利要求4或5中任一项所述的组合物，其中所述甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷是皂苷。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述生物素结合蛋白选自亲和素、链亲和素、中和亲和素和经选择性硝化的亲和素。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述碳水化合物选自单糖、寡糖、多糖、以及它们的组合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述碳水化合物包括至少一个羧基基团，且其中所述生物素结合蛋白通过连接基团与所述碳水化合物共价键合，该连接基团是所述蛋白和所述碳水化合物的该至少一个羧基基团的反应产物。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述固相支撑物选自珠子、凝胶、薄膜、薄片、颗粒、过滤器、膜、板、带、管、孔、纤维、毛细管、以及它们的组合。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述固相支撑物是磁性颗粒。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述磁性颗粒的直径为约0.02至约5微米。
13.一种分离细菌细胞的方法，其包括：
提供固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；
提供怀疑具有多个细菌细胞的样品；
使具有包含该碳水化合物和该生物素结合蛋白的组合的表面的该固相支撑物与该样品接触；其中来自该样品的多个细菌细胞中的至少一部分非特异性结合于该固相支撑物的表面；以及
在来自该样品的多个细菌细胞中的该至少一部分非特异性结合于该固相支撑物的表面后，使该固相支撑物与该样品的其余部分分离。
14.根据权利要求13所述的方法，其还包括检测所述多个细菌细胞中的所述至少一部分。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述检测是通过选自以下的检测方法来进行：通过生物发光进行的腺苷三磷酸(ATP)检测、聚二乙炔(PDA)比色检测、核酸检测、免疫学检测、基于生长的检测和表面声波检测。
16.根据权利要求13、14和15中任一项所述的方法，其中使该固相支撑物与该样品接触是在甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷存在下进行。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷是皂苷。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述生物素结合蛋白选自亲和素、链亲和素、中和亲和素和经选择性硝化的亲和素。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物选自单糖、寡糖、多糖、以及它们的组合。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物包括至少一个羧基基团，且其中所述生物素结合蛋白通过连接基团与所述碳水化合物共价键合，该连接基团是所述蛋白和所述碳水化合物的该至少一个羧基基团的反应产物。
21.根据权利要求13至20中任一项所述的方法，其中所述固相支撑物选自珠子、凝胶、薄膜、薄片、颗粒、过滤器、膜、板、带、管、孔、纤维、毛细管、以及它们的组合。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述固相支撑物是磁性颗粒。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述磁性颗粒的直径为约0.02至约5微米。
24.根据权利要求13至23中任一项所述的方法，其中所述多个细菌细胞包括两种或更多种不同类型的细菌。
25.根据权利要求13至24中任一项所述的方法，其中所述细菌选自芽孢杆菌属(Bacillus)、博德特氏杆菌属(Bordetella)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacteria)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、李斯特氏菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)和耶尔森氏菌属(Yersinia)。
26.一种用于检测细菌细胞的装置，其包括：
一种组合物，所述组合物包含：
固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及
多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞；以及
用于检测细菌细胞的工具。
27.一种用于检测细菌细胞的装置，其包括：
一种组合物，所述组合物包含：
固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及
甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷；以及
用于检测细菌细胞的工具。
28.根据权利要求27所述的装置，其中所述组合物还包含多个非特异性结合于该碳水化合物和该蛋白的组合的细菌细胞。
29.根据权利要求26或权利要求28所述的装置，其中所述多个细菌细胞包括两种或更多种不同类型的细菌。
30.根据权利要求26、28和29中任一项所述的装置，其中所述细菌选自芽孢杆菌属(Bacillus)、博德特氏杆菌属(Bordetella)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacteria)、肠杆菌属(Enterobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、李斯特氏菌属(Listeria)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)和耶尔森氏菌属(Yersinia)。
31.根据权利要求26至30中任一项所述的装置，其中所述用于检测细菌细胞的工具选自：用于通过生物发光检测腺苷三磷酸(ATP)的试剂、PDA比色传感器、用于核酸检测的试剂、用于免疫学检测的试剂、用于平板接种和计数细菌细胞的培养基和表面声波传感器。
32.根据权利要求27，28，作为权利要求28的从属权利要求的权利要求29，作为权利要求28的从属权利要求或作为权利要求28的从属权利要求的权利要求29的从属权利要求的权利要求30，和作为权利要求27、权利要求28、作为权利要求28的从属权利要求的权利要求29或者作为权利要求28的从属权利要求或作为权利要求28的从属权利要求的权利要求29的从属权利要求的权利要求30的从属权利要求的权利要求31中任一项所述的装置，其中所述甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷是皂苷。
33.根据权利要求26至32中任一项所述的装置，其中所述生物素结合蛋白选自亲和素、链亲和素、中和亲和素和经选择性硝化的亲和素。
34.根据权利要求26至33中任一项所述的装置，其中所述碳水化合物选自单糖、寡糖、多糖、以及它们的组合。
35.根据权利要求26至34中任一项所述的装置，其中所述碳水化合物包括至少一个羧基基团，且其中所述生物素结合蛋白通过连接基团与所述碳水化合物共价键合，该连接基团是所述蛋白和所述碳水化合物的该至少一个羧基基团的反应产物。
36.根据权利要求26至35中任一项所述的装置，其中所述固相支撑物选自珠子、凝胶、薄膜、薄片、颗粒、过滤器、膜、板、带、管、孔、纤维、毛细管、以及它们的组合。
37.根据权利要求36所述的装置，其中所述固相支撑物是磁性颗粒。
38.根据权利要求37所述的装置，其中所述磁性颗粒的直径为约0.02至约5微米。
39.一种试剂盒，其包括：
固相支撑物，该固相支撑物具有包含碳水化合物和生物素结合蛋白的组合的表面，其中该蛋白与该碳水化合物共价键合，且其中该蛋白通过该碳水化合物与该固相支撑物连接；以及
甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷。
40.根据权利要求39所述的试剂盒，其还包括用于检测细菌细胞的工具。
41.根据权利要求40所述的试剂盒，其中所述用于检测细菌细胞的工具选自：用于通过生物发光检测腺苷三磷酸(ATP)的试剂、PDA比色传感器、用于核酸检测的试剂、用于免疫学检测的试剂、用于平板接种和计数细菌细胞的培养基和表面声波传感器。
42.根据权利要求39、40和41中任一项所述的试剂盒，其中所述甾族化合物或三萜烯的两亲性糖苷是皂苷。
43.根据权利要求39至42中任一项所述的试剂盒，其中所述生物素结合蛋白选自亲和素、链亲和素、中和亲和素和经选择性硝化的亲和素。
44.根据权利要求39至43中任一项所述的试剂盒，其中所述碳水化合物选自单糖、寡糖、多糖、以及它们的组合。
45.根据权利要求39至44中任一项所述的试剂盒，其中所述碳水化合物包括至少一个羧基基团，且其中所述蛋白通过连接基团与所述碳水化合物共价键合，该连接基团是所述蛋白和所述碳水化合物的该至少一个羧基基团的反应产物。
46.根据权利要求39至45中任一项所述的试剂盒，其中所述固相支撑物选自珠子、凝胶、薄膜、薄片、颗粒、过滤器、膜、板、带、管、孔、纤维、毛细管、以及它们的组合。
47.根据权利要求46所述的试剂盒，其中所述固相支撑物是磁性颗粒。
48.根据权利要求47所述的试剂盒，其中所述磁性颗粒的直径为约0.02至约5微米。
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