CN101952318A

CN101952318A - 抗nr10抗体及其应用

Info

Publication number: CN101952318A
Application number: CN2009801061762A
Authority: CN
Inventors: 仓持太一; 糟谷惠子; 大山创平; 角田浩行; 井川智之; 橘达彦; 白岩宙丈; 江崎圭子
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2007-12-05
Filing date: 2009-12-04
Publication date: 2011-01-19
Anticipated expiration: 2029-12-04
Also published as: US20150175704A1; EP2236604A1; HRP20151215T1; US20200002429A1; AU2009323249B2; ES2585480T3; DK2236604T3; TW201634479A; CN101939424B; CA2708532C; BRPI0821110B1; WO2009072604A1; KR20160074019A; US20110129459A1; BRPI0821110A2; KR20170122860A; EP2236604B1; EP3095862A1; US20140039165A1; TWI548418B

Abstract

本发明人等成功地获得了对NR10具有有效的中和活性的抗NR10抗体。本发明所提供的抗NR10抗体例如作为用于治疗或预防炎症性疾病的药物是有效的。

Description

抗NR10抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗NR10抗体、以及含有抗NR10抗体的药物组合物。

背景技术

作为参与各种细胞的增殖分化或分化成熟的细胞的功能激活的体液因素，已知存在多种细胞因子。在机体内，接受了细胞因子刺激的细胞产生其他细胞因子，由多个细胞因子形成网络。机体的恒定性通过该网络的相互调节而保持微妙的平衡。认为多种免疫炎症性疾病是由这些细胞因子、网络的破绽产生的，利用单克隆抗体进行的抗细胞因子疗法受到关注。例如，抗TNF抗体及抗IL-6受体抗体在临床上显示出高疗效。但另一方面，在实际病情中是补偿途径在起作用，仅凭阻断IL-4等单一的细胞因子，无法取得治疗效果，失败的例子颇多。

本发明人等成功地分离了与IL-6的信号传递受体gp130的同源性高的新型细胞因子受体NR10(专利文献1)。NR10与制癌蛋白M受体(OSMR)形成异源二聚体，发挥IL-31的受体的功能(非专利文献1)。关于IL-31，有报道称：过剩表达IL-31的转基因小鼠自然发生搔痒性皮炎(专利文献2)。

虽然认为与NR10结合、且阻碍IL-31与NR10结合的抗体对治疗炎症性疾病有效，但为了在临床上使用抗NR10抗体，免疫原性低的抗体是必需的。另外，为了发挥好的治疗效果，人们希望开发与NR10的结合活性或中和活性高的抗体。

需要说明的是，本发明的在先技术文献如下。

专利文献1：WO00/75314

专利文献2：WO03/060090

非专利文献1：IL-31 is associated with cutaneous lymphocyteantigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis.，JAllergy Clin Immunol.2006Feb；117(2)：418-25.

发明内容

发明所要解决的课题

本发明鉴于上述背景而设，其课题在于：提供抗NR10抗体以及含有抗NR10抗体的药物组合物。

解决课题的方法

本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究。本发明人等成功地获得了对NR10具有有效的中和活性的抗NR10抗体。并且，本发明人等成功地在维持抗体活性不变的情况下将抗体人源化。本发明人等还成功地制作了药物动力学提高、与抗原的结合活性增强、稳定性提高和/或免疫原性风险降低的抗体。该抗体作为炎症性疾病治疗药有效。

本发明涉及抗NR10抗体、以及含有抗NR10抗体的药物组合物，更具体而言，本发明包含以下[1]～[15]的发明。

[1]抗体，该抗体识别NR10的结构域1。

[2][1]所述的抗体，其特征在于：该抗体具有中和活性。

[3][1]或[2]所述的抗体，该抗体是人源化抗体。

[4]以下(1)～(8)中任一项所述的抗NR10抗体：

(1)抗体，该抗体具有重链可变区，所述重链可变区包括：具有SEQ IDNO：1记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：2记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：3记载的氨基酸序列的CDR3；

(2)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：4记载的重链可变区；

(3)抗体，该抗体具有轻链可变区，所述轻链可变区包括：具有SEQ IDNO：5记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：6记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：7记载的氨基酸序列的CDR3；

(4)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：8记载的轻链可变区；

(5)抗体，该抗体具有(1)的重链可变区和(3)的轻链可变区；

(6)抗体，该抗体具有(2)的重链可变区和(4)的轻链可变区；

(7)抗体，该抗体是在(1)～(6)中任一项所述的抗体中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(1)～(6)中任一项所述的抗体具有同等活性；

(8)抗体，该抗体与表位结合，所述表位与(1)～(7)中任一项所述的抗体所结合的表位相同。

[5]以下(1)～(8)中任一项所述的抗NR10抗体：

(1)抗体，该抗体具有重链可变区，所述重链可变区包括：具有SEQ IDNO：9记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：10记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：11记载的氨基酸序列的CDR3；

(2)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：12记载的重链可变区；

(3)抗体，该抗体具有轻链可变区，所述轻链可变区包括：具有SEQ IDNO：13记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：14记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：15记载的氨基酸序列的CDR3；

(4)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：16记载的轻链可变区；

(5)抗体，该抗体具有(1)的重链可变区和(3)的轻链可变区；

(6)抗体，该抗体具有(2)的重链可变区和(4)的轻链可变区；

[6]以下(1)～(8)中任一项所述的抗NR10抗体：

(1)抗体，该抗体具有重链可变区，所述重链可变区包括：具有SEQ IDNO：17记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：18记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：19记载的氨基酸序列的CDR3；

(2)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：20记载的重链可变区；

(3)抗体，该抗体具有轻链可变区，所述轻链可变区包括：具有SEQ IDNO：21记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：22记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：23记载的氨基酸序列的CDR3；

(4)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：24记载的轻链可变区；

(5)抗体，该抗体具有(1)的重链可变区和(3)的轻链可变区；

(6)抗体，该抗体具有(2)的重链可变区和(4)的轻链可变区；

[7]以下(1)～(8)中任一项所述的抗NR10抗体：

(1)抗体，该抗体具有重链可变区，所述重链可变区包括：具有SEQ IDNO：25记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：26记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：27记载的氨基酸序列的CDR3；

(2)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：28记载的重链可变区；

(3)抗体，该抗体具有轻链可变区，所述轻链可变区包括：具有SEQ IDNO：29记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：30记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：31记载的氨基酸序列的CDR3；

(4)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：32记载的轻链可变区；

(5)抗体，该抗体具有(1)的重链可变区和(3)的轻链可变区；

(6)抗体，该抗体具有(2)的重链可变区和(4)的轻链可变区；

[8]以下(1)～(20)中任一项所述的抗体可变区或抗体：

(1)重链可变区(H17)，其中包含SEQ ID NO：196记载的CDR1、SEQID NO：197记载的CDR2、SEQ ID NO：11记载的CDR3；

(2)重链可变区(H19)，其中包含SEQ ID NO：176记载的CDR1、SEQID NO：197记载的CDR2、SEQ ID NO：11记载的CDR3；

(3)重链可变区(H28、H42)，其中包含SEQ ID NO：196记载的CDR1、SEQ ID NO：197记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(4)重链可变区(H30、H44)，其中包含SEQ ID NO：9记载的CDR1、SEQ ID NO：197记载的CDRR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(5)重链可变区(H34、H46)，其中包含SEQ ID NO：176记载的CDR1、SEQ ID NO：197记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(6)重链可变区(H57、H78)，其中包含SEQ ID NO：9记载的CDR1、SEQ ID NO：198记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(7)重链可变区(H71、H92)，其中包含SEQ ID NO：176记载的CDR1、SEQ ID NO：198记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(8)重链可变区(H97、H98)，其中包含SEQ ID NO：9记载的CDR1、SEQ ID NO：199记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(9)轻链可变区(L11)，其中包含SEQ ID NO：200记载的CDR1、SEQID NO：170记载的CDR2、SEQ ID NO：193记载的CDR3；

(10)轻链可变区(L12)，其中包含SEQ ID NO：201记载的CDR1、SEQID NO：170记载的CDR2、SEQ ID NO：193记载的CDR3；

(11)轻链可变区(L17)，其中包含SEQ ID NO：202记载的CDR1、SEQID NO：170记载的CDR2、SEQ ID NO：193记载的CDR3；

(12)轻链可变区(L50)，其中包含SEQ ID NO：203记载的CDR1、SEQID NO：170记载的CDR2、SEQ ID NO：193记载的CDR3；

(13)抗体，该抗体包含(3)的重链可变区和(11)的轻链可变区；

(14)抗体，该抗体包含(4)的重链可变区和(11)的轻链可变区；

(15)抗体，该抗体包含(5)的重链可变区和(11)的轻链可变区；

(16)抗体，该抗体包含(6)的重链可变区和(11)的轻链可变区；

(17)抗体，该抗体包含(7)的重链可变区和(11)的轻链可变区；

(18)抗体，该抗体包含(8)的重链可变区和(12)的轻链可变区；

(19)抗体，该抗体是在(13)～(18)中任一项所述的抗体中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(13)～(18)中任一项所述的抗体具有同等活性；

(20)抗体，该抗体与表位结合，所述表位与(13)～(18)中任一项所述的抗体所结合的表位相同。

[9]以下(1)～(32)中任一项所述的抗体可变区或抗体：

(1)重链可变区(H17)，其中具有SEQ ID NO：204记载的氨基酸序列；

(2)重链可变区(H19)，其中具有SEQ ID NO：205记载的氨基酸序列；

(3)重链可变区(H28)，其中具有SEQ ID NO：206记载的氨基酸序列；

(4)重链可变区(H30)，其中具有SEQ ID NO：207记载的氨基酸序列；

(5)重链可变区(H34)，其中具有SEQ ID NO：208记载的氨基酸序列；

(6)重链可变区(H42)，其中具有SEQ ID NO：209记载的氨基酸序列；

(7)重链可变区(H44)，其中具有SEQ ID NO：210记载的氨基酸序列；

(8)重链可变区(H46)，其中具有SEQ ID NO：211记载的氨基酸序列；

(9)重链可变区(H57)，其中具有SEQ ID NO：212记载的氨基酸序列；

(10)重链可变区(H71)，其中具有SEQ ID NO：213记载的氨基酸序列；

(11)重链可变区(H78)，其中具有SEQ ID NO：214记载的氨基酸序列；

(12)重链可变区(H92)，其中具有SEQ ID NO：215记载的氨基酸序列；

(13)重链可变区(H97)，其中具有SEQ ID NO：216记载的氨基酸序列；

(14)重链可变区(H98)，其中具有SEQ ID NO：217记载的氨基酸序列；

(15)轻链可变区(L11)，其中具有SEQ ID NO：218记载的氨基酸序列；

(16)轻链可变区(L12)，其中具有SEQ ID NO：219记载的氨基酸序列；

(17)轻链可变区(L17)，其中具有SEQ ID NO：220记载的氨基酸序列；

(18)轻链可变区(L50)，其中具有SEQ ID NO：221记载的氨基酸序列；

(19)抗体(H28L17)，该抗体含有(3)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(20)抗体(H30L17)，该抗体含有(4)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(21)抗体(H34L17)，该抗体含有(5)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(22)抗体(H42L17)，该抗体含有(6)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(23)抗体(H44L17)，该抗体含有(7)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(24)抗体(H46L17)，该抗体含有(8)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(25)抗体(H57L17)，该抗体含有(9)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(26)抗体(H71L17)，该抗体含有(10)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(27)抗体(H78L17)，该抗体含有(11)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(28)抗体(H92L17)，该抗体含有(12)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(29)抗体(H97L50)，该抗体含有(13)的重链可变区和(18)的轻链可变区；

(30)抗体(H98L50)，该抗体含有(14)的重链可变区和(18)的轻链可变区；

(31)抗体，该抗体是在(19)～(30)中任一项所述的抗体中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入而得到的抗体，所得抗体与(19)～(30)中任一项所述的抗体具有同等活性；

(32)抗体，该抗体与表位结合，所述表位与(19)～(30)中任一项所述的抗体所结合的表位相同。

[10][4]～[9]中任一项所述的抗NR10抗体，该抗体是人源化抗体。

[11]以下(1)～(32)中任一项所述的抗体重链、抗体轻链或抗体：

(1)重链(H17)，其中具有SEQ ID NO：222记载的氨基酸序列；

(2)重链(H19)，其中具有SEQ ID NO：223记载的氨基酸序列；

(3)重链(H28)，其中具有SEQ ID NO：224记载的氨基酸序列；

(4)重链(H30)，其中具有SEQ ID NO：225记载的氨基酸序列；

(5)重链(H34)，其中具有SEQ ID NO：226记载的氨基酸序列；

(6)重链(H42)，其中具有SEQ ID NO：227记载的氨基酸序列；

(7)重链(H44)，其中具有SEQ ID NO：228记载的氨基酸序列；

(8)重链(H46)，其中具有SEQ ID NO：229记载的氨基酸序列；

(9)重链(H57)，其中具有SEQ ID NO：230记载的氨基酸序列；

(10)重链(H71)，其中具有SEQ ID NO：231记载的氨基酸序列；

(11)重链(H78)，其中具有SEQ ID NO：232记载的氨基酸序列；

(12)重链(H92)，其中具有SEQ ID NO：233记载的氨基酸序列；

(13)重链(H97)，其中具有SEQ ID NO：234记载的氨基酸序列；

(14)重链(H98)，其中具有SEQ ID NO：235记载的氨基酸序列；

(15)轻链(L11)，其中具有SEQ ID NO：236记载的氨基酸序列；

(16)轻链(L12)，其中具有SEQ ID NO：237记载的氨基酸序列；

(17)轻链(L17)，其中具有SEQ ID NO：238记载的氨基酸序列；

(18)轻链(L50)，其中具有SEQ ID NO：239记载的氨基酸序列；

(19)抗体(H28L17)，该抗体包含(3)的重链和(17)的轻链；

(20)抗体(H30L17)，该抗体包含(4)的重链和(17)的轻链；

(21)抗体(H34L17)，该抗体包含(5)的重链和(17)的轻链；

(22)抗体(H42L17)，该抗体包含(6)的重链和(17)的轻链；

(23)抗体(H44L17)，该抗体包含(7)的重链和(17)的轻链；

(24)抗体(H46L17)，该抗体包含(8)的重链和(17)的轻链；

(25)抗体(H57L17)，该抗体包含(9)的重链和(17)的轻链；

(26)抗体(H71L17)，该抗体包含(10)的重链和(17)的轻链；

(27)抗体(H78L17)，该抗体包含(11)的重链和(17)的轻链；

(28)抗体(H92L17)，该抗体包含(12)的重链和(17)的轻链；

(29)抗体(H97L50)，该抗体包含(13)的重链和(18)的轻链；

(30)抗体(H98L50)，该抗体包含(14)的重链和(18)的轻链；

[12]药物组合物，其中含有[1]～[11]中任一项所述的抗体。

[13][12]所述的药物组合物，该药物组合物是炎症性疾病治疗药。

[14]炎症性疾病的治疗或预防方法，该方法包括：给予[1]～[11]中任一项所述的抗体的步骤。

[15][1]～[11]中任一项所述的抗体在炎症性疾病治疗药的制造中的应用。

附图说明

图1是显示小鼠抗体NS18、NS22、NS23、NS33的重链可变区的氨基酸序列的图。

图2是显示小鼠抗体NS18、NS22、NS23、NS33的轻链可变区的氨基酸序列的图。

图3是显示杂交瘤培养上清对hNR10/hOSMR/BaF3细胞增殖的抑制的曲线图。

图4是显示杂交瘤培养上清对cynNR10/cynOSMR/BaF3细胞增殖的抑制的曲线图。

图5是显示嵌合NS22的活性评价(BaF)的曲线图。

图6是显示嵌合NS22的活性评价(DU-145)的曲线图。

图7是显示嵌合NS22的IL-31竞争活性评价的曲线图。

图8是显示抗NR10抗体的NR10结合竞争活性的曲线图。

图9是显示人源化NS22(H0L0)的IL-31竞争活性的曲线图。

图10是利用阳离子交换色谱评价人源化抗NR10抗体H0L0的恒定区对异质性的影响的图。

图11是显示在不大幅降低人源化抗NR10抗体与NR10的结合的情况下可以降低可变区的等电点的突变体的IL-31竞争活性评价的曲线图。

图12是利用阳离子交换色谱评价抗IL-6受体抗体恒定区对异质性的影响的图。

图13是通过DSC评价抗IL-6受体抗体恒定区对变性峰的影响的图。

图14是利用阳离子交换色谱评价抗IL-6受体抗体中新型恒定区M14对异质性的影响的图。

图15是利用阳离子交换色谱评价抗IL-6受体抗体中新型恒定区M58对异质性的影响的图。

图16是通过DSC评价抗IL-6受体抗体中新型恒定区M58对变性峰的影响的图。

图17是显示huPM1-IgG1和huPM1-M58在人FcRn转基因小鼠体内的血浆中滞留性的评价结果的图。

图18是显示各抗体的使用了BaF/NR10的生物活性的曲线图。

图19是利用阳离子交换色谱分析所得的各修饰抗体的热加速品(点线)和未加速品(实线)，并比较在热加速前后分解物生成的图。箭头显示确认发生变化的基本组分(basic component)峰位置。

图20是显示各变体的活性评价(BaF)的曲线图。

图21是显示Ha401La402、H0L0的活性评价(BaF)的曲线图。

图22是显示H17L11、H0L0的活性评价(BaF)的曲线图。

图23是显示H19L12、H0L0的活性评价(BaF)的曲线图。

图24是显示H0L12和H0L17的使用了BaF/NR10的生物活性的曲线图。

图25-1是显示各变体的活性评价(BaF)的曲线图。

图25-2是图25-1的续图。

图26是人/小鼠野生型和嵌合NR10-ECD的模式图。

图27是利用蛋白质印迹法检测结合结构域的照片。A是显示利用人源化抗人NR10抗体检测到的结果的照片，B是显示利用小鼠抗人NR10抗体检测到的结果的照片，C是显示利用抗Myc抗体检测到的结果的照片。利用抗人NR10抗体只在hhh、hhm、hmm中检测到结合抗原，mmm、mmh、mhm中无法确认到结合。

图28-1是显示H0(SEQ ID NO：50)的各变体的氨基酸序列的图。

图28-2是图28-1的续图。

图28-3是图28-2的续图。

图29-1是显示L0(SEQ ID NO：52)的各变体的氨基酸序列的图。

图29-2是图29-1的续图。

具体实施方式

NR10

NR10是与制癌蛋白M受体(OSMR)形成异源二聚体、发挥IL-31的受体作用的蛋白。还以glm-r(J Biol Chem 277，16831-6，2002)、GPL(J Biol Chem 278，49850-9，2003)、IL31RA(Nat Immunol 5，752-60，2004)等名称而已知，本发明的NR10还包括以上述名称命名的蛋白。

对本发明的NR10(也称作IL31RA、GPL或glm-r)的来源没有特别限定，包括来自人、小鼠、猴、其他哺乳动物的NR10，但优选为来自人、小鼠或猴的NR10，特别优选为来自人的NR10。

作为来自人的NR10，已知有多个剪接变体(WO00/075314)。上述剪接变体中，NR10.1的特征在于：包括662个氨基酸，具有跨膜区。此外，NR10.2是包括252个氨基酸序列的、不具有跨膜区的可溶性受体样蛋白。另一方面，作为发挥跨膜型受体蛋白作用的NR10剪接变体，已知有NR10.3和IL31RAv3。本发明中的人NR10只要与制癌蛋白M受体(OSMR)形成异源二聚体、且发挥IL-31受体作用即可，没有特别限定，优选的NR10例如有NR10.3(也称作ILRAv4(NatImmunol 5，752-60，2004))和IL31RAv3。NR10.3(IL31RAv4)包括662个氨基酸(WO00/075314，Nat Immunol 5，752-60，2004)，IL31RAv3包括732个氨基酸(GenBank检索号：NM_139017)。IL31RAv4的氨基酸序列见SEQ ID NO：79，IL31RAv3的氨基酸序列见SEQ ID NO：80。另一方面，作为来自小鼠的NR10，例如有包含SEQ ID NO：81记载的氨基酸序列的蛋白。作为来自食蟹猴的NR10，例如有包含SEQ IDNO：66记载的氨基酸序列的蛋白。

抗体(序列)

作为本发明的抗NR10抗体的优选方式，有下述(A)～(D)中的(1)～(8)中任一项所述的抗NR10抗体。

(A)NS18

(1)抗体，该抗体具有重链可变区，所述重链可变区包括：具有SEQ ID NO：1(HCDR1)记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：2(HCDR2)记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：3(HCDR3)记载的氨基酸序列的CDR3；

(2)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：4(VH)记载的重链可变区；

(3)抗体，该抗体具有轻链可变区，所述轻链可变区包括：具有SEQ ID NO：5(LCDR1)记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：6(LCDR2)记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：7(LCDR3)记载的氨基酸序列的CDR3；

(4)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：8(VL)记载的轻链可变区；

(5)抗体，该抗体具有(1)的重链可变区和(3)的轻链可变区；

(6)抗体，该抗体具有(2)的重链可变区和(4)的轻链可变区；

(B)NS22

(1)抗体，该抗体具有重链可变区，所述重链可变区包括：具有SEQ ID NO：9(HCDR1)记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：10(HCDR2)记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：11(HCDR3)记载的氨基酸序列的CDR3；

(2)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：12(VH)记载的重链可变区；

(3)抗体，该抗体具有轻链可变区，所述轻链可变区包括：具有SEQ ID NO：13(LCDR1)记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：14(LCDR2)记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：15(LCDR3)记载的氨基酸序列的CDR3；

(4)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：16(VL)记载的轻链可变区；

(5)抗体，该抗体具有(1)的重链可变区和(3)的轻链可变区；

(6)抗体，该抗体具有(2)的重链可变区和(4)的轻链可变区；

对上述1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的具体例子没有特别限定，可以列举以下的修饰。

将SEQ ID NO：9的重链CDR1中第3位的Ile取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Val。

将SEQ ID NO：9的重链CDR1中第4位的Met取代成其他氨基酸。对对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Ile。

将SEQ ID NO：9的重链CDR1中第4位的Met取代成其他氨基酸。对对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Leu。

将SEQ ID NO：9的重链CDR1中第3位的Ile取代成其他氨基酸。对取代后氨基酸没有特别限定，优选的例子有Ala。

将SEQ ID NO：10的重链CDR2中第1位的Leu取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Glu。

将SEQ ID NO：10的重链CDR2中第3位的Asn取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Asp。

将SEQ ID NO：10的重链CDR2中第13位的Gln取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Asp。

将SEQ ID NO：10的重链CDR2中第14位的Lys取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Gln。

将SEQ ID NO：10的重链CDR2中第16位的Lys取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Gln。

将SEQ ID NO：10的重链CDR2中第17位的Gly取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Asp。

将SEQ ID NO：10的重链CDR2中第16位的Lys和第17位的Gly取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有：第16位的Lys取代成Gln、第17位的Gly取代成Asp。

将SEQ ID NO：10的重链CDR2中第14位的Lys、第16位的Lys和第17位的Gly取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有：第14位的Lys取代成Gln、第16位的Lys取代成Gln、第17位的Gly取代成Asp。

将SEQ ID NO：10的重链CDR2中第13位的Gln、第14位的Lys、第16位的Lys和第17位的Gly取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有：第13位的Gln取代成Asp、第14位的Lys取代成Gln、第16位的Lys取代成Gln、第17位的Gly取代成Asp。

将SEQ ID NO：10的重链CDR2中第10位的Ser取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Asp。

将SEQ ID NO：10的重链CDR2中第13位的Gln取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Pro。

将SEQ ID NO：11的重链CDR3中第3位的Tyr取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Leu。

将SEQ ID NO：11的重链CDR3中第10位的Met取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Leu。

将SEQ ID NO：11的重链CDR3中第11位的Asp取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Glu。

将SEQ ID NO：11的重链CDR3中第12位的Tyr取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Thr或Ser。

将SEQ ID NO：11的重链CDR3中第10位的Met、第11位的Asp和第12位的Tyr取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有：第10位的Met取代成Leu、第11位的Asp取代成Glu、以及第12位的Tyr取代成Thr。

将SEQ ID NO：11的重链CDR3中第11位的Asp和第12位的Tyr取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有：第11位的Asp取代成Glu、以及第12位的Tyr取代成Thr。

将SEQ ID NO：11的重链CDR3中第3位的Tyr、第11位的Asp和第12位的Tyr取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有：第3位的Tyr取代成Leu、第11位的Asp取代成Glu、以及第12位的Tyr取代成Thr或Ser。

将SEQ ID NO：13的轻链CDR1中第1位的Arg取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Gln。

将SEQ ID NO：13的轻链CDR1中第5位的Asn取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Asp。

将SEQ ID NO：13的轻链CDR1中第1位的Arg和第5位的Asn取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有：第1位的Arg取代成Gln、第5位的Asn取代成Asp。

将SEQ ID NO：13的轻链CDR1中第8位的Ser取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Arg。

将SEQ ID NO：13的轻链CDR1中第10位的Leu取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Val。

将SEQ ID NO：13的轻链CDR1中第8位的Ser和第10位的Leu取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有：第8位的Ser取代成Arg、第10位的Leu取代成Val。

将SEQ ID NO：13的轻链CDR1中第2位的Thr取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Ala或Ser。

将SEQ ID NO：14的轻链CDR2中第1位的Asn取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Asp。

将SEQ ID NO：14的轻链CDR2中第3位的Lys取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Gln。

将SEQ ID NO：14的轻链CDR2中第5位的Leu取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Glu。

将SEQ ID NO：14的轻链CDR2中第7位的Lys取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Gln或Asp。

将SEQ ID NO：14的轻链CDR2中第3位的Lys、第5位的Leu和第7位的Lys取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有：第3位的Lys取代成Gln、第5位的Leu取代成Glu、第7位的Lys取代成Gln。

将SEQ ID NO：15的轻链CDR3中第5位的Glu取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Asp。

将SEQ ID NO：15的轻链CDR3中第6位的Ser取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Asp。

将SEQ ID NO：15的轻链CDR3中第9位的Thr取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Phe。

上述取代可以单独进行，也可以将多个取代组合。还可以将上述取代与上述以外的取代组合。利用这些取代，可以使抗体的药物动力学(血浆中滞留性)提高、与抗原的结合活性增强、稳定性提高和/或免疫原性风险降低。

本发明中，组合有上述取代的可变区的具体例子有：具有SEQ IDNO：167的氨基酸序列的重链可变区或具有SEQ ID NO：168的氨基酸序列的轻链可变区。并且，组合有上述取代的抗体的例子有：包含具有SEQ ID NO：167的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：168的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。

组合有上述取代的重链可变区或轻链可变区的具体例子有：以下可变区。

(a)重链可变区(H17)，其中含有SEQ ID NO：196记载的CDR1、SEQ ID NO：197记载的CDR2、SEQ ID NO：11记载的CDR3；

(b)重链可变区(H19)，其中含有SEQ ID NO：176记载的CDR1、SEQ ID NO：197记载的CDR2、SEQ ID NO：11记载的CDR3；

(c)重链可变区(H28、H42)，其中含有SEQ ID NO：196记载的CDR1、SEQ ID NO：197记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(d)重链可变区(H30、H44)，其中含有SEQ ID NO：9记载的CDR1、SEQ ID NO：197记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(e)重链可变区(H34、H46)，其中含有SEQ ID NO：176记载的CDR1、SEQ ID NO：197记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(f)重链可变区(H57、H78)，其中含有SEQ ID NO：9记载的CDR1、SEQ ID NO：198记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(g)重链可变区(H71、H92)，其中含有SEQ ID NO：176记载的CDR1、SEQ ID NO：198记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(h)重链可变区(H97、H98)，其中含有SEQ ID NO：9记载的CDR1、SEQ ID NO：199记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(i)轻链可变区(L11)，其中含有SEQ ID NO：200记载的CDR1、SEQ ID NO：170记载的CDR2、SEQ ID NO：193记载的CDR3；

(j)轻链可变区(L12)，其中含有SEQ ID NO：201记载的CDR1、SEQ ID NO：170记载的CDR2、SEQ ID NO：193记载的CDR3；

(k)轻链可变区(L17)，其中含有SEQ ID NO：202记载的CDR1、SEQ ID NO：170记载的CDR2、SEQ ID NO：193记载的CDR3；

(1)轻链可变区(L50)，其中含有SEQ ID NO：203记载的CDR1、SEQ ID NO：170记载的CDR2、SEQ ID NO：193记载的CDR3。

组合有上述取代的抗体的具体例子还有：以下抗体。

(i)抗体，该抗体含有(c)的重链可变区和(k)的轻链可变区；

(ii)抗体，该抗体含有(d)的重链可变区和(k)的轻链可变区；

(iii)抗体，该抗体含有(e)的重链可变区和(k)的轻链可变区；

(iv)抗体，该抗体含有(f)的重链可变区和(k)的轻链可变区；

(v)抗体，该抗体含有(g)的重链可变区和(k)的轻链可变区；

(vi)抗体，该抗体含有(h)的重链可变区和(l)的轻链可变区。

(C)NS23

(1)抗体，该抗体具有重链可变区，所述重链可变区包含：具有SEQ ID NO：17(HCDR1)记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：18(HCDR2)记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：19(HCDR3)记载的氨基酸序列的CDR3；

(2)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：20(VH)记载的重链可变区；

(3)抗体，该抗体具有轻链可变区，所述轻链可变区包含：具有SEQ ID NO：21(LCDR1)记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：22(LCDR2)记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：23(LCDR3)记载的氨基酸序列的CDR3；

(4)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：24(VL)记载的轻链可变区；

(5)抗体，该抗体具有(1)的重链可变区和(3)的轻链可变区；

(6)抗体，该抗体具有(2)的重链可变区和(4)的轻链可变区；

(D)NS33

(1)抗体，该抗体具有重链可变区，所述重链可变区包含：具有SEQ ID NO：25(HCDR1)记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：26(HCDR2)记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：27(HCDR3)记载的氨基酸序列的CDR3；

(2)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：28(VH)记载的重链可变区；

(3)抗体，该抗体具有轻链可变区，所述轻链可变区包含：具有SEQ ID NO：29(LCDR1)记载的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO：30(LCDR2)记载的氨基酸序列的CDR2、具有SEQ ID NO：31(LCDR3)记载的氨基酸序列的CDR3；

(4)抗体，该抗体具有SEQ ID NO：32(VL)记载的轻链可变区；

(5)抗体，该抗体具有(1)的重链可变区和(3)的轻链可变区；

(6)抗体，该抗体具有(2)的重链可变区和(4)的轻链可变区；

在上述(1)或(3)所述的抗体中，可以使用任何构架区(FR)，但优选使用来自人的FR。在上述(1)～(8)所述的抗体中，恒定区可以使用任何恒定区，但优选使用来自人的恒定区。本发明的抗体中使用的FR或恒定区的氨基酸序列，可以直接使用作为来源的原来的FR或恒定区的氨基酸序列，也可以将1个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入等形成不同的氨基酸序列后再使用。

上述NS18的重链的氨基酸序列见SEQ ID NO：34，编码该氨基酸序列的核苷酸序列见SEQ ID NO：33。轻链的氨基酸序列见SEQ IDNO：36，编码该氨基酸序列的核苷酸序列见SEQ ID NO：35。

NS22的重链的氨基酸序列见SEQ ID NO：38，编码该氨基酸序列的核苷酸序列见SEQ ID NO：37。轻链的氨基酸序列见SEQ ID NO：40，编码该氨基酸序列的核苷酸序列见SEQ ID NO：39。

NS23的重链的氨基酸序列见SEQ ID NO：42，编码该氨基酸序列的核苷酸序列见SEQ ID NO：41。轻链的氨基酸序列见SEQ ID NO：44，编码该氨基酸序列的核苷酸序列见SEQ ID NO：43。

NS33的重链的氨基酸序列见SEQ ID NO：46，编码该氨基酸序列的核苷酸序列见SEQ ID NO：45。轻链的氨基酸序列见SEQ ID NO：48，编码该氨基酸序列的核苷酸序列见SEQ ID NO：47。

本发明中，“与(1)～(6)中任一项所述的抗体活性同等”是指，与NR10(例如人NR10)的结合活性和/或中和活性是同等的。本发明中，“同等”未必是指相同程度的活性，可以是活性增强，也可以是活性降低，只要具有活性即可。作为活性降低的抗体，例如有以下抗体：与原始抗体相比，具有30％以上的活性、优选50％以上的活性、更优选80％以上的活性的抗体。

上述(1)～(6)中任一项所述的抗体，只要与NR10具有结合活性和/或中和活性即可，在可变区(CDR序列和/或FR序列)的氨基酸序列中可以有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入。作为用于制备在氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入、且与NR10具有结合活性和/或中和活性的抗体的氨基酸序列的本领域技术人员所熟知的方法，已知有向蛋白中导入突变的方法。例如，本领域技术人员可以采用位点特异性诱变法(Hashimoto-Gotoh，T，Mizuno，T，Ogasahara，Y和Nakagawa，M.(1995)Anoligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directedmutagenesis(寡脱氧核糖核苷酸定向双琥珀色法位点定向诱变).Gene152，271-275；Zoller，MJ和Smith，M.(1983)Oligonucleotide-directedmutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors(DNA片段克隆到M13载体的寡聚核苷酸定向诱变).Methods Enzymol.100，468-500、Kramer，W，Drutsa，V，Jansen，HW，Kramer，B，Pflugfelder，M和Fritz，HJ(1984)The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedmutation construction(带缺口的双链体DNA接近于寡聚核苷酸定向突变结构).Nucleic Acids Res.12，9441-9456、Kramer W和Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplexDNA Methods(经由带缺口的双链体DNA法突变的寡聚核苷酸定向结构).Enzymol.154，350-367、Kunkel，TA(1985)Rapid and efficientsite-specific mutagenesis without phenotypic selection(无表型筛选的迅速及高效的位点特异性诱变法).Proc Natl Acad Sci U S A.82，488-492)等，向与NR10具有结合活性和/或中和活性的抗体的氨基酸序列中导入适当突变，从而可以制备和与NR10具有结合活性和/或中和活性的抗体功能同等的突变体。这样，可变区中有1个或多个氨基酸发生突变、且与NR10具有结合活性和/或中和活性的抗体也包含在本发明的抗体中。

当改变氨基酸残基时，优选突变成保存有氨基酸侧链的性质的其它氨基酸。例如，氨基酸侧链的性质有：疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)；亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)；具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)；具有含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)；具有含硫原子侧链的氨基酸(C、M)；具有含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)；具有含碱性侧链的氨基酸(R、K、H)；以及具有含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)(括号内均表示氨基酸的单字母符号)。将上述各组内的氨基酸的取代称作保守取代。已知具有对某一氨基酸序列通过1个或多个氨基酸残基的缺失、添加和/或用其它氨基酸的取代进行修饰的氨基酸序列的多肽维持其生物学活性(Mark，D.F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81：5662-6；Zoller，M.J.和Smith，M.，Nucleic Acids Res.(1982)10：6487-500；Wang，A.等人，Science(1984)224：1431-3；Dalbadie-McFarland，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79：6409-13)。这样的突变体与本发明的可变区(例如CDR序列、FR序列、可变区整体)的氨基酸序列具有至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、进一步优选至少85％、更进一步优选至少90％、而且最优选至少95％的氨基酸序列的同源性。本说明书中，序列的同源性如下定义：根据需要将序列整列化和导入适当的缺口，使序列同源性达到最大，之后以残基与原始重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列的残基相同的比例来定义。氨基酸序列的同源性可以通过后述方法来确定。

另外，可变区(CDR序列和/或FR序列)的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入、且与NR10具有结合活性和/或中和活性的可变区的氨基酸序列，还可以由在严格条件下与包含编码该可变区的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸杂交的核酸而得到。作为用于分离在严格条件下与包含编码可变区氨基酸序列的核苷酸序列的核酸杂交的核酸的严格的杂交条件，可以例示：6M尿素、0.4％SDS、0.5×SSC、37℃的条件或与其同等的严格的杂交条件。采用更严格的条件、例如6M尿素、0.4％SDS、0.1×SSC的条件、42℃时，有望分离同源性更高的核酸。分离的核酸的序列可以利用后述公知的方法来确定。所分离的核酸的同源性，以核苷酸序列整体计，具有至少50％以上、进一步优选70％以上、更进一步优选90％以上(例如95％、96％、97％、98％、99％以上)的序列同源性。

除利用上述杂交技术的方法以外，还可以利用使用根据编码可变区氨基酸序列的核苷酸序列信息合成的引物的基因扩增法、例如聚合酶链反应(PCR)法，分离在严格条件下与包含编码可变区氨基酸序列的核苷酸序列的核酸杂交的核酸。

核苷酸序列和氨基酸序列的同源性可以根据Karlin和Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：5873-7)来确定。根据该算法，开发了被称作BLASTN和BLASTX的程序(Altschul等人，J.Mol.Biol.(1990)215：403-10)。根据BLAST，通过BLASTN来分析核苷酸序列时，参数例如为：分值(score)＝100、读取词长(wordlength)＝12。此外，根据BLAST，通过BLASTX来分析氨基酸序列时，参数例如为：分值＝50、读取词长＝3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的缺省参数。上述分析方法的具体方法是公知的(参照NCBI(National Center for Biotechnology Information)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)的网址；http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

本发明还提供与表位结合的抗体，所述表位与(1)～(7)中任一项所述的抗体所结合的表位相同。

某抗体是否与其他抗体识别相同的表位，这可以通过两者对表位的竞争来确认。抗体间的竞争可以通过竞争结合测定来评价，其方法有：ELISA、荧光能量转移测定法(FRET)或荧光微量测定技术(FMAT(注册商标))等。与抗原结合的该抗体的量与对相同表位竞争结合的候选竞争抗体(被检抗体)的结合能力间接相关。即，被检抗体与相同表位的结合量或亲和性越大，该抗体与抗原的结合量越降低，被检抗体与抗原的结合量增加。具体而言，向抗原中同时添加进行了适当标记的该抗体和应评价的抗体，利用标记检测结合的该抗体。通过预先标记该抗体，可以容易地测定与抗原结合的该抗体量。对该标记没有特别限定，选择对应于测定技术的标记方法。标记方法具体有：荧光标记、放射标记、酶标记等。

例如，向表达NR10的动物细胞中同时添加进行了荧光标记的该抗体和未标记的该抗体或被检抗体，利用荧光微量测定技术检测被标记的该抗体。

此处所说的“识别相同表位的抗体”是指，相对于IC₅₀，被检抗体以该未标记抗体的IC₅₀的通常100倍、优选80倍、进一步优选50倍、更进一步优选30倍、更优选10倍高的浓度下使该标记抗体的结合量降低至少50％的抗体，所述IC₅₀是指通过未标记的该抗体的结合使该标记抗体的结合量降低50％的浓度。

与上述(1)～(7)中任一项所述的抗体所结合的表位结合的抗体，在具有特别高的中和活性方面有用。

对上述(1)～(8)中任一项所述的抗体没有特别限定，但优选为人源化抗体。

本发明还提供编码上述(A)～(D)中的(1)～(8)中任一项所述的抗NR10抗体的基因。本发明的基因可以是任何基因，例如可以是DNA，也可以是RNA。

抗体(人源化)

本发明中的抗体的优选方式之一为：与NR10结合的人源化抗体。人源化抗体可以利用本领域技术人员已知的方法来制造。

抗体的可变区通常由夹在4个构架区(FR)中的3个互补性决定区(CDR)构成。CDR实质上是决定抗体的结合特异性的区。CDR的氨基酸序列富有多样性。一方面，构成FR的氨基酸序列即使在具有不同结合特异性的抗体之间往往也显示出高度同源性。因此，通常通过移植CDR，可以将某抗体的结合特异性移植到其它抗体中。

人源化抗体也称作重构(reshaped)人抗体，其是将人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体的互补性决定区中的人源化抗体，其常规基因重组方法也是已知的(参照欧州专利申请公开号EP125023号公报、WO96/02576号公报)。

具体而言，例如当CDR来自小鼠抗体时，使用多个制作成在CDR和FR两者的末端区具有重叠部分的寡核苷酸作为引物，通过PCR法合成设计成连接小鼠抗体的CDR和人抗体的构架区(frameworkregion；FR)的DNA序列(参照WO98/13388号公报中所述的方法)。连接所得的DNA和编码人抗体恒定区的DNA，接着插入到表达载体中，再将其导入宿主中，使之产生抗体，从而得到人源化抗体(参照欧州专利申请公开号EP239400、国际专利申请公开号WO96/02576)。

与CDR连接的人抗体的构架区选择互补性决定区形成良好的抗原结合位点的构架区。根据需要，还可以将抗体可变区中的构架区的氨基酸取代、缺失、添加和/或插入等，使重构人抗体的互补性决定区形成适当的抗原结合位点。例如，应用用于向人FR中移植小鼠CDR的PCR法，可以向FR中导入氨基酸序列的突变。具体而言，可以向对FR退火的引物中导入一部分核苷酸序列的突变。利用上述引物合成的FR中，导入了核苷酸序列的突变。通过用上述方法测定并评价取代了氨基酸的突变型抗体与抗原的结合活性，可以选择具有所期望的性质的突变FR序列(Sato，K.等人，Cancer Res，(1993)53，851～856)。

人源化抗体的C区使用人抗体的C区，例如H链中可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε，L链中可以使用Cκ、Cλ。Cκ的氨基酸序列见SEQ ID NO：58、编码该氨基酸序列的核苷酸序列见SEQ ID NO：57。Cγ1的氨基酸序列见SEQ ID NO：60、编码该氨基酸序列的核苷酸序列见SEQ ID NO：59。Cγ2的氨基酸序列见SEQ IDNO：62、编码该氨基酸序列的核苷酸序列见SEQ ID NO：61。Cγ4的氨基酸序列见SEQ ID NO：64、编码该氨基酸序列的核苷酸序列见SEQID NO：63。另外，为了改善抗体或其产生的稳定性，可以对人抗体C区进行修饰。被修饰的人抗体C区的例子有：后述的C区。人源化时使用的人抗体可以是IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等任何同种型的人抗体，但在本发明中优选使用IgG。作为IgG，可以使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。

需要说明的是，制作人源化抗体后，可变区(例如CDR、FR)或恒定区中的氨基酸可以用其他氨基酸取代、缺失、添加和/或插入等，本发明的人源化抗体也包括这样的进行了氨基酸取代等的人源化抗体。

对人源化抗体中的CDR的来源没有特别限定，可以来自任何动物。例如可以使用小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、骆驼抗体等的序列，但优选为小鼠抗体的CDR序列。

在抗体的人源化中，通常难以在维持作为来源的抗体的结合活性或中和活性不变的情况下进行人源化，但在本发明中，成功地获得了与作为来源的小鼠抗体具有同等结合活性和/或中和活性的人源化抗体。由于人源化抗体在人体内的免疫原性降低，所以根据治疗目的等对人给予人源化抗体时也有用。

本发明中，人源化抗NR10抗体的优选例子例如有：以下(a)～(e)中任一项所述的抗体。

(a)人源化抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：50(H0-VH)的氨基酸序列的重链可变区；

(b)人源化抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：112(H1-VH)的氨基酸序列的重链可变区；

(c)人源化抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：52(L0-VL)的氨基酸序列的轻链可变区；

(d)人源化抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：50(H0-VH)的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：52(L0-VL)的氨基酸序列的轻链可变区；

(e)人抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：112的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列的轻链可变区。

需要说明的是，具有SEQ ID NO：50(H0-VH)记载的氨基酸序列的重链可变区、具有SEQ ID NO：112记载的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：52(L0-VL)记载的氨基酸序列的轻链可变区中，有1个或多个氨基酸可以被取代、缺失、添加和/或插入。氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入可以在CDR或FR中进行，也可以在CDR和FR两者中进行。

因此，本发明中，作为人源化抗NR10抗体的其他优选方式，例如有以下(f)～(j)中任一项所述的抗体。

(f)抗体，该抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有在SEQ IDNO：50(H0-VH)的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；

(g)抗体，该抗体包含重链可变区，所述重链可变区具有在SEQ IDNO：112(H1-VH)的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；

(h)抗体，该抗体包含轻链可变区，所述轻链可变区具有在SEQ IDNO：52(L0-VL)的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；

(i)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有在SEQ ID NO：50(H0-VH)的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列，所述轻链可变区具有在SEQ ID NO：52(L0-VL)的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；

(j)抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有在SEQ ID NO：112(H1-VH)的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列，所述轻链可变区具有在SEQ ID NO：52(L0-VL)的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。

虽然没有特别限定，但(f)～(j)中任一项所述的抗体优选与(a)～(e)中任一项所述的抗体具有同样的活性。

对氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入没有特别限定，具体例子有：例如可以进行上述的氨基酸取代。

更具体的例子有：例如以下的氨基酸取代。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR1(SEQ ID NO：9)的第3位的Ile取代成Val(SEQ ID NO：173)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR1被取代成具有SEQ ID NO：173的氨基酸序列的CDR1。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR1(SEQ ID NO：9)的第4位的Met被取代成Ile(SEQ ID NO：174)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR1被取代成具有SEQ ID NO：174的氨基酸序列的CDR1。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR1(SEQ ID NO：9)的第4位的Met被取代成Leu(SEQ ID NO：175)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR1被取代成具有SEQ ID NO：175的氨基酸序列的CDR1。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR1(SEQ ID NO：9)的第3位的Ile被取代成Ala(SEQ ID NO：176)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR1被取代成具有SEQ ID NO：176的氨基酸序列的CDR1。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：10)的第1位的Leu被取代成Glu(SEQ ID NO：113)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：113的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：10)的第3位的Asn被取代成Asp(SEQ ID NO：114)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112の氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：114的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：10)的第13位的Gln被取代成Asp(SEQ ID NO：115)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：115的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：10)的第14位的Lys被取代成Gln(SEQ ID NO：116)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：116的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：10)的第16位的Lys被取代成Gln(SEQ ID NO：117)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：117的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：10)的第17位的Gly被取代成Asp(SEQ ID NO：118)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：118的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：10)的第16位的Lys被取代成Gln、以及第17位的Gly被取代成Asp(SEQ ID NO：119)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ IDNO：119的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：10)的第14位的Lys被取代成Gln、第16位的Lys被取代成Gln、以及第17位的Gly被取代成Asp(SEQ ID NO：167)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：171的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：10)的第13位的Gln被取代成Asp、第14位的Lys被取代成Gln、第16位的Lys被取代成Gln、以及第17位的Gly被取代成Asp(SEQ ID NO：172)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：172的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：10)的第10位的Ser被取代成Asp(SEQ ID NO：177)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：177的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：10)的第13位的Gln被取代成Pro(SEQ ID NO：178)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：178的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR3(SEQ ID NO：11)的第3位的Tyr被取代成Leu(SEQ ID NO：179)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR3被取代成具有SEQ ID NO：179的氨基酸序列的CDR3。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR3(SEQ ID NO：11)的第10位的Met被取代成Leu(SEQ ID NO：180)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR3被取代成具有SEQ ID NO：180的氨基酸序列的CDR3。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR3(SEQ ID NO：11)的第11位的Asp被取代成Glu(SEQ ID NO：181)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR3被取代成具有SEQ ID NO：181的氨基酸序列的CDR3。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR3(SEQ ID NO：11)的第12位的Tyr被取代成Thr(SEQ ID NO：182)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR3被取代成具有SEQ ID NO：182的氨基酸序列的CDR3。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR3(SEQ ID NO：11)的第12位的Tyr被取代成Ser(SEQ ID NO：183)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR3被取代成具有SEQ ID NO：183的氨基酸序列的CDR3。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR3(SEQ ID NO：11)的第10位的Met被取代成Leu、第11位的Asp被取代成Glu、以及第12位的Tyr被取代成Thr(SEQ ID NO：184)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR3被取代成具有SEQ ID NO：184的氨基酸序列的CDR3。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR3(SEQ ID NO：11)的第11位的Asp被取代成Glu、以及第12位的Tyr被取代成Thr(SEQ ID NO：185)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR3被取代成具有SEQ IDNO：185的氨基酸序列的CDR3。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR3(SEQ ID NO：11)的第3位的Tyr被取代成Leu、第11位的Asp被取代成Glu、以及第12位的Tyr被取代成Thr(SEQ ID NO：186)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR3被取代成具有SEQ ID NO：186的氨基酸序列的CDR3。

在SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的重链可变区中，CDR3(SEQ ID NO：11)的第3位的Tyr被取代成Leu、第11位的Asp被取代成Glu、以及第12位的Tyr被取代成Ser(SEQ ID NO：187)。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR3被取代成具有SEQ ID NO：187的氨基酸序列的CDR3。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR1(SEQ ID NO：13)的第1位的Arg被取代成Gln(SEQ ID NO：121)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR1被取代成具有SEQ ID NO：121的氨基酸序列的CDR1。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR1(SEQ ID NO：13)的第5位的Asn被取代成Asp(SEQ ID NO：122)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR1被取代成具有SEQ ID NO：122的氨基酸序列的CDR1。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR1(SEQ ID NO：13)的第8位的Ser被取代成Arg(SEQ ID NO：188)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR1被取代成具有SEQ ID NO：188的氨基酸序列的CDR1。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR1(SEQ ID NO：13)的第10位的Leu被取代成Val(SEQ ID NO：189)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR1被取代成具有SEQ ID NO：189的氨基酸序列的CDR1。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR1(SEQ ID NO：13)的第8位的Ser被取代成Arg、以及第10位的Leu被取代成Val(SEQ ID NO：190)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR1被取代成具有SEQ ID NO：190的氨基酸序列的CDR1。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR1(SEQ ID NO：13)的第2位的Thr被取代成Ala(SEQ ID NO：191)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR1被取代成具有SEQ ID NO：191的氨基酸序列的CDR1。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR1(SEQ ID NO：13)的第2位的Thr被取代成Ser(SEQ ID NO：192)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR1被取代成具有SEQ ID NO：192的氨基酸序列的CDR1。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：14)的第1位的Asn被取代成Asp(SEQ ID NO：123)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：123的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：14)的第3位的Lys被取代成Gln(SEQ ID NO：124)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：124的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：14)的第5位的Leu被取代成Glu(SEQ ID NO：125)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：125的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：14)的第7位的Lys被取代成Gln(SEQ ID NO：126)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：126的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：14)的第7位的Lys被取代成Asp(SEQ ID NO：127)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：127的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR1(SEQ ID NO：13)的第1位的Arg被取代成Gln、以及第5位的Asn被取代成Asp(SEQ ID NO：169)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区具有SEQ ID NO：52的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR1被取代成具有SEQ ID NO：169的氨基酸序列的CDR1。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR2(SEQ ID NO：14)的第3位的Lys被取代成Gln、第5位的Leu被取代成Glu、以及第7位的Lys被取代成Gln(SEQ ID NO：170)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区为：在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，具有SEQ IDNO：14的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：170的氨基酸序列的CDR2。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR3(SEQ ID NO：15)的第5位的Glu被取代成Asp(SEQ ID NO：193)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区为：在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR3被取代成具有SEQ ID NO：193的氨基酸序列的CDR3。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR3(SEQ ID NO：15)的第6位的Ser被取代成Asp(SEQ ID NO：194)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区为：在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR3被取代成具有SEQ ID NO：194的氨基酸序列的CDR3。

在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，CDR3(SEQ ID NO：15)的第9位的Thr被取代成Phe(SEQ ID NO：195)。因此，本发明提供轻链可变区，所述轻链可变区为：在SEQ ID NO：52的轻链可变区中，具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR3被取代成具有SEQ ID NO：195的氨基酸序列的CDR3。

并且，作为上述氨基酸取代以外的取代，可以列举：在具有SEQID NO：97的氨基酸序列的重链FR2中，第3位的Arg被取代成其他氨基酸。对取代后的氨基酸没有特别限定，优选的例子有Gln。并且，将SEQ ID NO：97的第3位的Arg取代成Gln时，还可以将第5位的Ala取代成Ser，以形成人FR2序列。在SEQ ID NO：97的氨基酸序列中，第3位的Arg取代成Gln、且第5位的Ala取代成Ser的氨基酸序列见SEQ ID NO：120。因此，本发明提供重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：112的氨基酸序列，其中具有SEQ ID NO：97的氨基酸序列的FR2被取代成具有SEQ ID NO：120的氨基酸序列的FR2。

上述氨基酸取代可以单独使用，也可以与上述其他氨基酸取代组合。还可以与上述以外的氨基酸取代组合。

进行了上述取代的抗体的具体例子有：包含具有SEQ ID NO：167的氨基酸序列的重链可变区的抗体、包含具有SEQ ID NO：168的氨基酸序列的轻链可变区的抗体、包含具有SEQ ID NO：167的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：168的氨基酸序列的轻链可变区的抗体等。

进行了上述取代的重链可变区的具体例子有：以下的重链可变区。

(14)重链可变区(H98)，其中具有SEQ ID NO：217记载的氨基酸序列。

进行了上述取代的轻链可变区的具体例子有：以下的轻链可变区。

(15)轻链可变区(L11)，其中具有SEQ ID NO：218记载的氨基酸

序列；

(18)轻链可变区(L50)，其中具有SEQ ID NO：221记载的氨基酸序列。

并且，包含上述重链可变区和轻链可变区的抗体的具体例子有：以下的抗体。

(19)抗体(H28L17)，该抗体包含(3)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(20)抗体(H30L17)，该抗体包含(4)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(21)抗体(H34L17)，该抗体包含(5)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(22)抗体(H42L17)，该抗体包含(6)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(23)抗体(H44L17)，该抗体包含(7)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(24)抗体(H46L17)，该抗体包含(8)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(25)抗体(H57L17)，该抗体包含(9)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(26)抗体(H71L17)，该抗体包含(10)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(27)抗体(H78L17)，该抗体包含(11)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(28)抗体(H92L17)，该抗体包含(12)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(29)抗体(H97L50)，该抗体包含(13)的重链可变区和(18)的轻链可变区；

(30)抗体(H98L50)，该抗体包含(14)的重链可变区和(18)的轻链可变区。

本发明的人源化抗体所使用的恒定区可以是来自人抗体的任何恒定区。来自人抗体的恒定区的优选例子有：来自IgG1或IgG2的恒定区。还可以使用：在来自人抗体的恒定区中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的恒定区。

对在来自人抗体的恒定区中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的恒定区没有特别限定，例如有以下的恒定区。

恒定区(M58)，其中具有SEQ ID NO：128记载的氨基酸序列

恒定区(M14)，其中具有SEQ ID NO：129记载的氨基酸序列

恒定区(SKSC)，其中具有SEQ ID NO：62记载的氨基酸序列

使用上述恒定区的重链或抗体的具体例子有：例如以下的重链或抗体。

(1)重链，该重链包含具有SEQ ID NO：167的氨基酸序列的可变区和具有SEQ ID NO：128的氨基酸序列的恒定区；

(2)重链，该重链为：在(1)的重链中，具有SEQ ID NO：171的氨基酸序列的CDR2被取代成具有SEQ ID NO：172的氨基酸序列的CDR2；

(3)抗体，该抗体包含(1)的重链和具有SEQ ID NO：152的氨基酸序列的轻链；

(4)抗体，该抗体包含(2)的重链和具有SEQ ID NO：152的氨基酸序列的轻链。

本发明的人源化抗NR10抗体的更具体的例子有：例如以下的(k)～(o)中任一项所述的抗体。

(k)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：54(H0-VH+恒定区)的氨基酸序列的重链；

(l)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：130(H1-VH+恒定区)的氨基酸序列的重链；

(m)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：56(L0-VL+恒定区)的氨基酸序列的轻链；

(n)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：54(H0-VH+恒定区)的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：56(L0-VL+恒定区)的氨基酸序列的轻链；

(o)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：130(H1-VH+恒定区)的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：56(L0-VL+恒定区)的氨基酸序列的轻链。

需要说明的是，具有SEQ ID NO：54(H0-VH+恒定区)记载的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO：56(L0-VL+恒定区)记载的氨基酸序列的轻链中，可以有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入。氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入可以在可变区或恒定区中进行，也可以在可变区和恒定区两区中进行。

因此，本发明提供以下的(p)～(t)中任一项所述的抗体。

(p)抗体，该抗体包含重链，所述重链具有在SEQ ID NO：54(H0-VH+恒定区)的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；

(q)抗体，该抗体包含重链，所述重链具有在SEQ ID NO：130(H1-VH+恒定区)的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；

(r)抗体，该抗体包含轻链，所述轻链具有在SEQ ID NO：56(L0-VL+恒定区)的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；

(s)抗体，该抗体包含重链和轻链，所述重链具有在SEQ ID NO：54(H0-VH+恒定区)的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列，所述轻链具有在SEQ ID NO：56(L0-VL+恒定区)的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；

(t)抗体，该抗体包含重链和轻链，所述重链具有在SEQ ID NO：130(H1-VH+恒定区)的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列，所述轻链具有在SEQ ID NO：56(L0-VL+恒定区)的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列。

虽然没有特别限定，但(p)～(t)中任一项所述的抗体优选与(k)～(o)中任一项所述的抗体具有同样的活性。

编码上述人源化重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：50)的核苷酸序列见SEQ ID NO：49，编码人源化轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：52)的核苷酸序列见SEQ ID NO：51，编码人源化重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：54)的核苷酸序列见SEQ ID NO：53，编码人源化轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：56)的核苷酸序列见SEQ ID NO：55。

本发明还提供与上述(a)～(t)中任一项所述的抗体所识别的表位识别相同表位的抗体。与相同表位的结合如上所述。

本发明还提供以下的(u)～(w)中任一项所述的抗体。

(u)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：151记载的氨基酸序列的重链；

(v)抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO：152记载的氨基酸序列的轻链；

(w)抗体，该抗体包含(u)的重链和(v)的轻链。

本发明还提供以下的任一项所述的重链、轻链或抗体。

(1)重链(H17)，该重链具有SEQ ID NO：222记载的氨基酸序列；

(2)重链(H19)，该重链具有SEQ ID NO：223记载的氨基酸序列；

(3)重链(H28)，该重链具有SEQ ID NO：224记载的氨基酸序列；

(4)重链(H30)，该重链具有SEQ ID NO：225记载的氨基酸序列；

(5)重链(H34)，该重链具有SEQ ID NO：226记载的氨基酸序列；

(6)重链(H42)，该重链具有SEQ ID NO：227记载的氨基酸序列；

(7)重链(H44)，该重链具有SEQ ID NO：228记载的氨基酸序列；

(8)重链(H46)，该重链具有SEQ ID NO：229记载的氨基酸序列；

(9)重链(H57)，该重链具有SEQ ID NO：230记载的氨基酸序列；

(10)重链(H71)，该重链具有SEQ ID NO：231记载的氨基酸序列；

(11)重链(H78)，该重链具有SEQ ID NO：232记载的氨基酸序列；

(12)重链(H92)，该重链具有SEQ ID NO：233记载的氨基酸序列；

(13)重链(H97)，该重链具有SEQ ID NO：234记载的氨基酸序列；

(14)重链(H98)，该重链具有SEQ ID NO：235记载的氨基酸序列；

(15)轻链(L11)，该轻链具有SEQ ID NO：236记载的氨基酸序列；

(16)轻链(L12)，该轻链具有SEQ ID NO：237记载的氨基酸序列；

(17)轻链(L17)，该轻链具有SEQ ID NO：238记载的氨基酸序列；

(18)轻链(L50)，该轻链具有SEQ ID NO：239记载的氨基酸序列；

(19)抗体(H28L17)，该抗体包含(3)的重链和(17)的轻链；

(20)抗体(H30L17)，该抗体包含(4)的重链和(17)的轻链；

(21)抗体(H34L17)，该抗体包含(5)的重链和(17)的轻链；

(22)抗体(H42L17)，该抗体包含(6)的重链和(17)的轻链；

(23)抗体(H44L17)，该抗体包含(7)的重链和(17)的轻链；

(24)抗体(H46L17)，该抗体包含(8)的重链和(17)的轻链；

(25)抗体(H57L17)，该抗体包含(9)的重链和(17)的轻链；

(26)抗体(H71L17)，该抗体包含(10)的重链和(17)的轻链；

(27)抗体(H78L17)，该抗体包含(11)的重链和(17)的轻链；

(28)抗体(H92L17)，该抗体包含(12)的重链和(17)的轻链；

(29)抗体(H97L50)，该抗体包含(13)的重链和(18)的轻链；

(30)抗体(H98L50)，该抗体包含(14)的重链和(18)的轻链；

(31)重链，该重链具有在(1)～(14)中任一项所述的重链中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；

(32)轻链，该轻链具有在(15)～(18)中任一项所述的轻链中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；

(33)抗体，该抗体具有在(19)～(30)中任一项所述的抗体中有1个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列；

(34)抗体，该抗体与(19)～(33)中任一项所述的抗体所识别的表位识别相同的表位。

氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入如上所述。另外，与某抗体所识别的表位识别相同表位的抗体也如上所述。

本发明还提供编码本发明的可变区、本发明的重链、本发明的轻链或本发明抗体的基因。

本发明还提供携带上述基因的载体。

本发明还提供通过上述载体转化的宿主细胞。

本发明还涉及制造本发明的可变区、本发明的重链、本发明的轻链或本发明的抗体的方法，该方法包括培养上述宿主细胞的步骤。

载体、宿主细胞、宿主细胞的培养如后所述。

识别结构域的抗体

本发明中的抗NR10抗体的优选方式之一为：识别结构域1的抗体、或识别结构域2的抗体。本发明中，结构域1是指，在SEQ ID NO：76记载的人NR10的氨基酸序列中，以包含信号肽的状态下的序号计，第21位氨基酸～第120位氨基酸的区(LPAKP～LENIA)。本发明中，结构域2是指，在SEQ ID NO：76记载的人NR10的氨基酸序列中，以包含信号肽的状态下的序号计，第121位氨基酸～第227位氨基酸的区(KTEPP～EEEAP)。

对这样的抗体没有特别限定，通常为具有中和活性的抗体，优选为人源化抗体。

本发明中，优选的抗体的例子有：识别结构域1的抗体。识别结构域1的抗体具有高中和活性，作为药品特别有用。

抗体(中和活性)

本发明进一步提供具有中和活性的抗NR10抗体。

本发明中，NR10中和活性是指，阻碍NR10与其配体IL-31结合的活性，优选为抑制基于NR10的生理活性的活性。

具有NR10中和活性的抗体的选择可如下进行：例如利用向IL-31依赖性细胞株中添加候选抗体时，观察该IL-31依赖性细胞株的增殖抑制效果的方法来进行。在上述方法中，抑制IL-31依赖性细胞株增殖的抗体被判断是具有NR10中和活性的抗体。

抗体(一般)

本发明的抗体，对其来源没有限定，可以是人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体等来自任何动物的抗体。还可以是嵌合(chimeric)抗体或人源化(humanized)抗体等重组抗体。如上所述，本发明的优选抗体例如有人源化抗体。

嵌合抗体是指包含人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体。嵌合抗体可以利用已知的方法来制备。例如，由杂交瘤克隆抗体基因，将其插入到适当的载体中，再将其导入宿主中，即可制备嵌合抗体(例如参照Carl，A.K.Borrebaeck，James，W.Larrick，THERAPEUTIC MONOCLONALANTIBODIES，Published in the United Kingdom by MACMILLANPUBLISHERS LTD，1990)。具体而言，使用逆转录酶由杂交瘤的mRNA合成抗体可变区(V区)的cDNA。得到编码目标抗体V区的DNA时，连接其与编码所期望的人抗体恒定区(C区)的DNA，再将其插入到表达载体中。或者，可以将编码抗体V区的DNA插入到包含人抗体C区的DNA的表达载体中。将其插入到表达载体中，使之在表达调节区、例如增强子、启动子的调节下表达。接下来，利用该表达载体转化宿主细胞，可以使嵌合抗体表达。

另外，人抗体的获得方法也是已知的。例如，在体外用所需抗原或表达所需抗原的细胞致敏人淋巴细胞，使致敏淋巴细胞与人骨髓瘤细胞、例如U266融合，从而可以获得与抗原具有结合活性的所需人抗体(参照日本特公平1-59878)。另外，通过用所需抗原对具有完全人抗体基因的所有组成成分的转基因动物进行免疫，可以获得所需的人抗体(参照国际专利申请公开号WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO94/25585、WO96/34096、WO96/33735)。

并且，还已知使用人抗体噬菌体文库，通过淘选法获得人抗体的技术。例如，利用噬菌体展示法，使人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)在噬菌体表面表达，可以选择与抗原结合的噬菌体。分析所选择的噬菌体的基因时，可以确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。明确了与抗原结合的scFv的DNA序列后，制作具有该序列的适当的表达载体，可以获得人抗体。这些方法众所周知，可以参考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388等。

本发明的抗体，只要与NR10具有结合活性和/或中和活性即可，不仅包括IgG所代表的二价抗体，还包括一价抗体或IgM所代表的多价抗体、或者可以与不同抗原结合的双特异性(Bispecific)抗体。本发明的多价抗体包括：具有完全相同的抗原结合位点的多价抗体、或具有一部分或完全不同的抗原结合位点的多价抗体。本发明的抗体并不限于抗体的全长分子，只要与NR10蛋白结合即可，可以是低分子抗体或其修饰物。

另外，本发明中的抗体可以是低分子抗体。低分子抗体是包括全长抗体(whole antibody，例如全长IgG等)的一部分缺失的抗体片段的抗体，只要与NR10具有结合活性和/或中和活性即可，没有特别限定。本发明中，低分子抗体只要包含全长抗体的一部分即可，没有特别限定，但优选含有重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)，特别优选为包含VH和VL两者的低分子抗体。此外，本发明的低分子抗体的其他优选例子有：包含抗体的CDR的低分子抗体。低分子抗体中所含的CDR可以包含抗体的全部6个CDR，也可以包含一部分CDR。

本发明中的低分子抗体优选比全长抗体的分子量小，但有时例如形成二聚体、三聚体、四聚体等多聚体等，有时分子量比全长抗体的分子量大。

抗体片段的具体例子例如有：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv等。低分子抗体的具体例子例如有：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv(单链Fv)、双抗体、sc(Fv)2(单链(Fv)2)等。这些抗体的多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体、多聚体)也包含在本发明的低分子抗体中。

抗体片段例如可以通过用酶处理抗体生成抗体片段而得到。作为生成抗体片段的酶，例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或纤溶酶等是公知的。或者，构建编码这些抗体片段的基因，将其导入表达载体中，之后可以在适当的宿主细胞中表达(例如参照Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976、Better，M.& Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Plueckthun，A.& Skerra，A.Methods inEnzymology(1989)178，476-496、Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663、Rousseaux，J.等人，Methods in Enzymology(1989)121，663-669、Bird，R.E.等人，TIBTECH(1991)9，132-137)。

消化酶切断抗体片段的特定位置，产生下述特定结构的抗体片段。对上述酶解得到的抗体片段应用基因工程方法时，可以使抗体的任意部分缺失。

使用上述消化酶时，所得的抗体片段如下。

木瓜蛋白酶消化：F(ab)2或Fab

胃蛋白酶消化：F(ab’)2或Fab’

纤溶酶消化：Facb

本发明中的低分子抗体只要与NR10具有结合活性和/或中和活性即可，可以包括缺失了任意区的抗体片段。

双抗体(Diabody)是指通过基因融合构建的二价抗体片段(HolligerP等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)；EP404,097号；WO93/11161号等)。双抗体是由两条多肽链构成的二聚体。通常，构成二聚体的多肽链，各自在同一条链中VL和VH通过接头连接。双抗体中的接头通常短至VL和VH无法相互连接的程度。具体而言，构成接头的氨基酸残基例如为5个残基左右。因此，编码在同一条多肽链上的VL和VH无法形成单链可变区片段，而是与另一单链可变区片段形成二聚体。其结果，双抗体具有两个抗原结合位点。

scFv抗体是重链可变区([VH])和轻链可变区([VL])通过接头等连接形成单链多肽的抗体(Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883、Plickthun“The Pharmacology of MonoclonalAntibodies”第113卷，Resenburg和Moore编，Springer Verlag，NewYork，第269-315页，(1994))。scFv中的H链V区和L链V区可以来自本说明书中记载的任何抗体。对连接V区的肽接头没有特别限定。例如可以使用包含3～25个残基左右的任意单链肽作为接头。具体而言，例如可以使用后述的肽接头等。

两链的V区例如可以按照上述PCR法进行连接。为了利用PCR法连接V区，首先，在下述DNA中，利用编码全部或所需的部分氨基酸序列的DNA作为模板。

编码抗体H链或H链V区的DNA序列；以及

编码抗体L链或L链V区的DNA序列。

编码H链和L链的V区的DNA分别利用PCR法进行扩增，所述PCR法使用具有与应扩增的DNA两端的序列对应的序列的一对引物。接着，准备编码肽接头部分的DNA。编码肽接头的DNA也可利用PCR来合成。在此时使用的引物的5’侧添加可与另外合成的各V区的扩增产物连接的核苷酸序列。接着，利用[H链V区DNA]-[肽接头DNA]-[L链V区DNA]的各DNA和装配PCR用的引物进行PCR反应。

装配PCR用的引物包含在[H链V区DNA]的5’侧退火的引物和在[L链V区DNA]的3’侧退火的引物的组合。即，装配PCR用引物是指，可以扩增编码应合成的scFv的全长序列的DNA的引物组。一方面，[肽接头DNA]中添加有可与各V区DNA连接的核苷酸序列。其结果，上述DNA被连接在一起，再利用装配PCR用引物，最终以扩增产物的形式生成全长的scFv。暂且制作编码scFv的DNA，按照常规方法可以获取含有上述DNA的表达载体和通过该表达载体转化的重组细胞。其结果，培养所得的重组细胞，使编码该scFv的DNA表达，从而可以获得该scFv。

对所连接的重链可变区和轻链可变区的顺序没有特别限定，可以按照任何顺序进行排列，例如包括以下的排列。

[VH]接头[VL]

[VL]接头[VH]

sc(Fv)2是2个VH和2个VL通过接头等连接形成单链的低分子抗体(Hudson等人，J Immunol.Methods 1999；231：177～189)。sc(Fv)2例如可以通过用接头连接scFv来制备。

优选具有以下特征的抗体，所述特征为：2个VH和2个VL以单链多肽的N末端侧为基点，按照VH、VL、VH、VL([VH]接头[VL]接头[VH]接头[VL])的顺序排列，但2个VH和2个VL的顺序并不特别限于上述排列，可以按照任何顺序进行排列。例如包括以下的排列：

[VL]接头[VH]接头[VH]接头[VL]

[VH]接头[VL]接头[VL]接头[VH]

[VH]接头[VH]接头[VL]接头[VL]

[VL]接头[VL]接头[VH]接头[VH]

[VL]接头[VH]接头[VL]接头[VH]

低分子抗体中的重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列可以被取代、缺失、添加和/或插入。并且，使重链可变区与轻链可变区连接时，只要具有抗原结合活性即可，可以缺失一部分，也可以添加其他多肽。可变区还可以被嵌合化或人源化。

本发明中，连接抗体可变区的接头可以使用能够通过基因工程导入的任意肽接头、或合成接头(synthetic linker)，例如可以使用ProteinEngineering，9(3)，299～305，1996中公开的接头。

本发明中优选的接头为肽接头。对肽接头的长度没有特别限定，本领域技术人员根据目的可以适当选择。通常为1～100个氨基酸，优选3～50个氨基酸，进一步优选5～30个氨基酸，特别优选为12～18个氨基酸(例如15个氨基酸)。

作为肽接头的氨基酸序列，例如有以下的序列。

Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：82)

Ser·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：83)

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：84)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：85)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：86)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：87)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：88)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：89)

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO：84))_n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO：85))_n

[n为1以上的整数]等。

关于肽接头的氨基酸序列，本领域技术人员根据目的可以适当选择。例如，决定上述肽接头长度的n通常为1～5，优选1～3，更优选为1或2。

合成接头(化学交联剂)是通常用于交联肽的交联剂，例如有：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二琥珀酰亚氨基辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3)、二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DTSSP)、双(琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)、双(磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(磺基-EGS)、二琥珀酰亚氨基酒石酸盐(DST)、二磺基琥珀酰亚氨基酒石酸盐(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、以及双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)等，这些交联剂均有销售。

连接4个抗体可变区时，通常需要3个接头。多个接头可以使用相同的接头，也可以使用不同的接头。

本发明的抗体还包括：在本发明抗体的氨基酸序列中添加有1个或多个氨基酸残基的抗体。而且，还包括这些抗体与其他肽或蛋白融合的融合蛋白。关于制作融合蛋白的方法，只要连接编码本发明抗体的多核苷酸和编码其他肽或多肽的多核苷酸使构架一致，再将其导入表达载体中，使之在宿主中表达即可，可以采用本领域技术人员所公知的方法。作为用于与本发明抗体融合的其他肽或多肽，例如可以使用：FLAG(Hopp，T.P.等人，BioTechnology(1988)6，1204-1210)、包含6个His(组氨酸)残基的6×His、10×His、流感血凝素(HA)、人c-myc片段、VSV-GP片段、p18HIV片段、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原片段、lck tag、α-微管蛋白片段、B-tag、蛋白C的片段等公知的肽。作为用于与本发明抗体融合的其他多肽，例如可以使用：GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、HA(流感血凝素)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖结合蛋白)等。使市售的编码这些肽或多肽的多核苷酸与编码本发明抗体的多核苷酸融合，再使由此制备的融合多核苷酸表达，从而可以制备融合多肽。

本发明的抗体可以是与聚乙二醇(PEG)或透明质酸等高分子物质、放射性物质、荧光物质、发光物质、酶、毒素等各种分子结合的缀合抗体。这样的缀合抗体可以通过对所得抗体实施化学修饰而得到。需要说明的是，抗体的修饰方法在该领域已经确立(例如US5057313、US5156840)。本发明中的“抗体”也包括这些缀合抗体。

并且，本发明中使用的抗体可以是双特异性抗体(bispecificantibody)。双特异性抗体是指，在同一抗体分子内具有识别不同表位的可变区的抗体。本发明中，双特异性抗体可以是识别NR10分子上的不同表位的双特异性抗体，也可以是其中一个抗原结合位点识别NR10、另一个抗原结合位点识别其他物质的双特异性抗体。

用于制备双特异性抗体的方法是公知的。例如，使识别不同抗原的两种抗体连接，可以制作双特异性抗体。连接的抗体可以是各自具有H链和L链的1/2分子，也可以是仅包含H链的1/4分子。或者，使产生不同单克隆抗体的杂交瘤融合，也可以制作产生双特异性抗体的融合细胞。并且，利用基因工程方法可以制作双特异性抗体。

本发明的抗体，根据后述的产生抗体的细胞或宿主或纯化方法，其氨基酸序列、分子量、等电点或糖链的有无及形态等可以不同。但只要所得抗体与本发明的抗体具有同等功能，即包含在本发明内。例如，使本发明的抗体在原核细胞、例如大肠杆菌中表达时，在原始抗体的氨基酸序列的N末端添加有甲硫氨酸残基。本发明的抗体也包含这样的抗体。

抗体的制备

本发明的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。与NR10具有结合活性和/或中和活性的单克隆抗体可如下得到：例如以来自人或小鼠等哺乳动物的NR10或其片段肽作为免疫原，利用公知方法制备抗NR10单克隆抗体，之后从所得的抗NR10单克隆抗体中选择具有NR10结合活性和/或中和活性的抗体，即可得到单克隆抗体。即，使用所需的抗原或表达所需抗原的细胞作为致敏抗原，按照常规免疫方法对其进行免疫。按照通常的细胞融合法使所得的免疫细胞与公知的亲本细胞融合，利用通常的筛选法筛选产生单克隆抗体的细胞(杂交瘤)，从而可以制作抗NR10单克隆抗体。被免疫的动物可以使用：例如小鼠、大鼠、兔、绵羊、猴、山羊、驴、牛、马、猪等哺乳动物。抗原的制备可以使用公知NR10基因序列，按照公知方法、例如使用杆状病毒的方法(WO98/46777等)等来进行。

杂交瘤的制作例如可以按照Milstein等人的方法(Kohler.G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73：3-46)等来进行。抗原的免疫原性低时，可以使其与白蛋白等具有免疫原性的巨大分子结合后再进行免疫。

本发明的与NR10具有结合活性和/或中和活性的抗体的一个方式为：与人NR10具有结合活性和/或中和活性的单克隆抗体。作为用于制作与人NR10具有结合活性和/或中和活性的单克隆抗体的免疫原，只要可以制作与人NR10具有结合活性和/或中和活性的抗体即可，没有特别限定。例如已知人NR10中存在多个变体(variant)，但只要可以制作与人NR10具有结合活性和/或中和活性的抗体即可，可以以任一种变体作为免疫原。或者，在同样的条件下，可以以NR10的片段肽或在天然NR10序列中导入了人工突变的蛋白作为免疫原。人NR10.3除了可以制作与本发明的NR10具有结合活性和/或中和活性的抗体，还是优选的免疫原之一。

抗体与NR10的结合活性和/或中和活性的测定，例如可以按照实施例所述的、观察该IL-31依赖性细胞株的增殖抑制效果的方法来进行。

一方面，单克隆抗体还可以通过DNA免疫(DNA Immunization)而得到。所谓DNA免疫，是指将在免疫动物中以编码抗原蛋白的基因能够表达的方式构建的载体DNA给予该免疫动物，使免疫抗原在免疫动物体内表达，从而给予免疫刺激的方法。与给予蛋白抗原的普通免疫方法相比，DNA免疫可期待下述的优势。

-可以维持膜蛋白结构而给予免疫刺激

-不必纯化免疫抗原

但另一方面，在DNA免疫中难以与佐剂等免疫刺激手段组合。

通过DNA免疫获得单克隆抗体时，首先，对免疫动物给予编码NR10的DNA。编码NR10的DNA可以通过PCR等公知方法来合成。将得到的DNA插入适当的表达载体中，之后给予免疫动物。作为表达载体，例如可以使用pcDNA3.1等市售的表达载体。对生物体给予载体的方法也可采用通常所用的方法。例如，用基因枪(gene gun)将吸附有表达载体的金颗粒射入细胞内，从而可以进行DNA免疫。在DNA免疫后利用NR10表达细胞进行追加免疫(加强免疫)，这是获得单克隆抗体的优选方法。

如此地对哺乳动物进行免疫，确认血清中所需抗体量升高后，从哺乳动物中采集免疫细胞用于细胞融合。特别优选使用脾细胞作为免疫细胞。

与上述免疫细胞融合的细胞使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。优选骨髓瘤细胞具备用于筛选的适当的选择标志物。选择标志物是指，可以(或者不可以)在特定的培养条件下生存的特性。选择标志物中，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷(以下简记为HGPRT缺陷)或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷(以下简记为TK缺陷)等是公知的。存在HGPRT或TK缺陷的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷感受性(以下简记为HAT感受性)。HAT感受性的细胞在HAT选择培养基中无法进行DNA合成而死亡，但与正常细胞融合时，利用正常细胞的补救途径可以继续进行DNA的合成，因此在HAT选择培养基中也能够增殖。

HGPRT缺陷或TK缺陷的细胞，各自可以在含有6-硫代鸟嘌呤、8-氮鸟嘌呤(以下简记为8AG)或5’-溴脱氧尿苷的培养基中进行选择。正常细胞由于将上述嘧啶类似物摄入DNA中而死亡，但缺失了上述酶的细胞由于不能摄入上述嘧啶类似物，所以可以在选择培养基中生存。此外，被称作G418耐性的选择标志物通过新霉素耐性基因，提供对2-脱氧链霉胺类抗生素(庆大霉素类似物)的耐性。适于细胞融合的各种骨髓瘤细胞是公知的。

基本上可以按照公知的方法、例如Kohler和Milstein等人的方法(Kohler.G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等，进行免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。

更具体而言，例如在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中，可以实施细胞融合。融合促进剂例如可以使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等。为了进一步提高融合效率，根据需要，还可以添加二甲基亚砜等辅助剂。

免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，优选使免疫细胞为骨髓瘤细胞的1～10倍。用于细胞融合的培养液例如可以使用：适合骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、以及用于该种细胞培养的常规培养液。并且，可以在培养液中添加胎牛血清(FCS)等血清补液。

细胞融合可如下进行：将规定量的免疫细胞和骨髓瘤细胞在培养液中充分混合，再混合预先加热至37℃左右的PEG溶液，从而形成目标融合细胞(杂交瘤)。在细胞融合法中，通常可以以30～60％(w/v)的浓度添加例如平均分子量为1000～6000左右的PEG。接着，依次添加上述列举的适当培养液，离心以除去上清，通过重复该操作，除去不利于杂交瘤生长的细胞融合剂等。

如此操作得到的杂交瘤，可以通过使用选择培养液而进行选择，所述选择培养液对应于用于细胞融合的杂交瘤所具有的选择标志物。例如，具有HGPRT或TK缺陷的细胞，可通过在HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养液)中培养来进行选择。即，将HAT感受性的骨髓瘤细胞用于细胞融合时，在HAT培养液中，成功地与正常细胞进行细胞融合的细胞能够选择性地增殖。为了使目标杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡，使用上述HAT培养液继续培养足够的时间。具体而言，通常通过培养数天至数周，可以选择目标杂交瘤。接着，通过实施常规的极限稀释法，可以实施产生目标抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。或者，还可以按照国际公开WO03/104453中所述的方法制备识别NR10的抗体。

目标抗体的筛选和单克隆可优选按照基于公知的抗原抗体反应的筛选方法来实施。例如，使抗原与用聚苯乙烯等制成的珠或市售的96孔微量滴定板等载体结合，再与杂交瘤的培养上清反应。然后清洗载体，之后与用酶标记的二次抗体等反应。当培养上清中含有与致敏抗原反应的目标抗体时，二次抗体经由该抗体与载体结合。最终，通过检测与载体结合的二次抗体，可以确定培养上清中是否存在目标抗体。利用极限稀释法等可以克隆产生对抗原具有结合能力的所需抗体的杂交瘤。此时，抗原不仅可以使用用于免疫的抗原，还可以适当使用实质上为相同性质的NR10蛋白。例如，可以使用表达NR10的细胞株、NR10的胞外域、或者包含构成该区的部分氨基酸序列的寡肽作为抗原。

除通过用抗原对人以外的动物进行免疫而获得上述杂交瘤的方法外，对人淋巴细胞进行抗原致敏，也可得到目标抗体。具体而言，首先，在体外用NR10蛋白致敏人淋巴细胞。然后，使免疫致敏的淋巴细胞与适当的融合配偶体融合。融合配偶体可以使用例如来自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞(参照日本特公平1-59878号公报)。通过该方法得到的抗体是与NR10蛋白具有结合活性的人抗体。

编码利用上述方法等获得的抗NR10抗体的核苷酸序列、氨基酸序列可以通过本领域技术人员所公知的方法而得到。需要说明的是，本发明所记载的氨基酸序列中所含的氨基酸在翻译后有时还会接受修饰(例如N末端的谷氨酰胺通过焦谷氨酰化而修饰成焦谷氨酸的修饰是本领域技术人员所熟知的修饰)，即使象这样氨基酸翻译后被修饰的情形，当然也包括在本发明所记载的氨基酸序列中。

还可以根据所得的抗NR10抗体的序列，使用本领域技术人员所公知的基因重组技术制作抗NR10抗体。具体而言，根据识别NR10的抗体的序列构建编码抗体的多核苷酸，将其导入表达载体中，之后使之在适当的宿主细胞中表达即可(例如参照Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.和Horwitz，A.H.，MethodsEnzymol.(1989)178，476-496；Pluckthun，A.和Skerra，A.，MethodsEnzymol.(1989)178，497-515；Lamoyi，E.，Methods Enzymol.(1986)121，652-663；Rousseaux，J.等人，Methods Enzymol.(1986)121，663-669；Bird，R.E.和Walker，B.W.，Trends Biotechnol.(1991)9，132-137)。

载体的例子有：M13系载体、pUC系载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。另外，为了亚克隆、切出cDNA时，除上述载体外，例如还有pGEM-T、pDIRECT、pT7等。为了生产本发明的抗体而使用载体时，表达载体特别有用。作为表达载体，例如为了在大肠杆菌中表达时，载体除了具有在大肠杆菌中扩增的上述特征外，当以JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等大肠杆菌作为宿主时，还必需具有可以在大肠杆菌中高效率表达的启动子、例如lacZ启动子(Ward等人，Nature(1989)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)、araB启动子(Better等人，Science(1988)240，1041-1043)、或T7启动子等。作为这样的载体，除上述载体外，还有pGEX-5X-1(Pharmacia制)、“QIAexpress system”(Qiagen制)、pEGFP或pET(此时，宿主优选表达T7RNA聚合酶的BL21)等。

另外，载体中可以包含用于抗体分泌的信号序列。作为用于抗体分泌的信号序列，当其在大肠杆菌的周质中产生时，可以使用pelB信号序列(Lei，S.P.等人，J.Bacteriol.(1987)169，4379)。向宿主细胞中导入载体，例如可以采用氯化钙法、电穿孔法来进行。

除大肠杆菌外，作为用于制备本发明抗体的载体，例如有来自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen社制)或pEF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990，18(17)，第5322页)、pEF、pCDM8)、来自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(Gibco-BRL制)、pBacPAK8)、来自植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)、来自动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、来自逆转录病毒的表达载体(例如pZIPneo)、来自酵母的表达载体(例如“Pichia表达试剂盒”(Invitrogen制)、pNV11、SP-Q01)、来自枯草杆菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)。

为了在CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等动物细胞中表达时，必需具有用于在细胞内表达所必需的启动子、例如SV40启动子(Mulligan等人，Nature(1979)277，108)、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等人，Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)、CMV启动子等，进一步优选具有用于选择转化细胞的基因(例如利用药物(新霉素、G418等)可以判别的耐药基因)。作为具有这样的特性的载体，例如有pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。

并且，为了使基因稳定表达、且扩增细胞内的基因拷贝数时，可以列举：向缺失核酸合成途径的CHO细胞中导入携带补偿该途径的DHFR基因的载体(例如pSV2-dhfr(“Molecular Cloning 2nd edition”Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989))等)，之后利用甲氨蝶呤(MTX)使其扩增的方法；为了实现基因的一过性表达时，使用染色体上具有表达SV40T抗原的基因的COS细胞，利用具有SV40的复制起点的载体(pcD等)进行转化的方法。作为复制起点，还可以使用来自多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点。并且，为了在宿主细胞体系中扩增基因拷贝数，表达载体中可以包含氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标志物。

因此，本发明提供制造本发明的多肽或由编码本发明的多肽的基因编码的多肽的方法，该方法包括：培养宿主细胞的步骤，所述宿主细胞含有导入有编码本发明的多肽的多核苷酸的载体。

更具体而言，本发明提供本发明的多肽的制造方法，该方法包括以下步骤：

(a)培养宿主细胞的步骤，所述宿主细胞含有导入有编码本发明的多肽的基因的载体；

(b)获得由该基因编码的多肽的步骤。

由此得到的本发明的抗体，可以将其从宿主细胞内或细胞外(培养基等)分离，并纯化成实质上纯粹且均匀的抗体。抗体的分离、纯化可以使用通常抗体的纯化中所使用的分离、纯化方法，但对其没有任何限定。例如，可以适当选择、组合层析柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、重结晶等来分离和纯化抗体。

层析例如有：亲合层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterization(蛋白质纯化与鉴定实验指南)：A Laboratory CourseManual.Ed Daniel R.Marshak等人，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1996)。上述层析可以使用液相层析、例如HPLC、FPLC等液相层析来进行。用于亲合层析的柱例如有：蛋白A柱、蛋白G柱。使用蛋白A的柱例如有：Hyper D、POROS、Sepharose FF(GE AmershamBiosciences)等。本发明还包括利用上述纯化方法进行高度纯化的抗体。

所得抗体与NR10的结合活性的测定，可以采用本领域技术人员所公知的方法来进行。例如，作为测定抗体的抗原结合活性的方法，可以使用ELISA(酶联免疫吸附测定法)、EIA(酶免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法)或荧光抗体法。例如，采用酶免疫测定法时，向包被有抗原的板中加入含有抗体的试样、例如抗体产生细胞的培养上清或纯化抗体。添加用碱性磷酸酶等酶标记的二次抗体，将板温育、清洗，之后加入对硝基苯基磷酸等酶底物，测定吸光度，从而可以评价抗原结合活性。

药物组合物

本发明还提供含有上述抗体作为有效成分的药物组合物。本发明进一步提供以上述抗体作为有效成分的炎症性疾病的治疗药。

本发明中，炎症性疾病是指，由于物理、化学或生物学的作用物质所引起的损伤或异常刺激而罹患的血管和相邻组织中发生的、与细胞学、组织学反应相关的伴有病理学表现的疾病(Stedman医学大辞典第5版、株式会社MEDICAL VIEW社、2005年)。通常，炎症性疾病包括：皮炎(特应性皮炎、慢性皮炎等)、炎症性肠疾病(大肠炎等)、哮喘、关节炎(风湿性关节炎、变形性关节病等)、支气管炎、Th-2型自身免疫疾病、全身性红斑狼疮、重症肌无力症、慢性GVHD、Crohn病、变形性脊椎炎、腰痛、痛风、手术外伤后的炎症、肿胀的缓解、神经痛、咽喉炎、膀胱炎、肝炎(非酒精性脂肪肝、酒精性肝炎等)、乙型肝炎、丙型肝炎、动脉硬化、搔痒等。

作为本发明的对象的炎症性疾病的优选例子有：特应性皮炎、慢性皮炎、风湿病、变形性关节病、慢性哮喘、搔痒。

“含有抗NR10抗体作为有效成分”是指，含有抗NR10抗体作为活性成分的至少一种，不限定其含量。此外，本发明的炎症性疾病的治疗药可以在含有上述抗NR10抗体的同时，一并含有其他促进炎症性疾病的治疗的成分。

需要说明的是，本发明的治疗药可以用于预防目的。

本发明的抗NR10抗体可以按照常规方法制成制剂(例如Remington’s Pharmaceutical Science，latest edition，Mark PublishingCompany，Easton，U.S.A)。并且，根据需要，可以同时含有药学上可接受的载体和/或添加剂。例如有：表面活性剂(PEG、Tween等)、赋形剂、抗氧剂(抗坏血酸等)、着色剂、香料、保存剂、稳定剂、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其他有机酸等)、螯合剂(EDTA等)、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等。但本发明的炎症性疾病的预防或治疗药并不限于这些，可以适当含有其它常用的载体。载体具体有：轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露糖醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。还可以含有其他低分子量的多肽、血清白蛋白、明胶和免疫球蛋白等蛋白、以及甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸。制成注射用水溶液时，将抗NR10抗体溶于含有例如生理盐水、葡萄糖或其他辅剂的等渗溶液中。辅剂例如有：D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠，上述注射用水溶液可以和适当的助溶剂、例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非离子性表面活性剂(聚山梨醇酯80、HCO-50)等结合使用。

根据需要，还可以将抗NR10抗体封入微囊(羟甲基纤维素、明胶、聚[甲基丙烯酸]等的微囊)中、或者制成胶体给药系统(脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊等)(参照Remington’s PharmaceuticalScience 16th edition &，Oslo Ed.(1980)等)。并且，将药物制成缓释制剂的方法也是公知的，该方法可适用于抗NR10抗体(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.(1981)15：167-277；Langer，Chem.Tech.(1982)12：98-105；美国专利第3,773，919号；欧州专利申请公开(EP)第58,481号；Sidman等人，Biopolymers(1983)22：547-56；EP第133,988号)。

本发明的药物组合物可以口服给药，也可以胃肠外给药，优选胃肠外给药。具体通过注射和经皮给药对患者进行给药。注射剂型的例子有：例如通过静脉内注射、肌肉内注射或皮下注射等进行全身或局部给药。可以对想要抑制炎症的部位或其周边进行局部注入、特别是肌肉内注射。可以根据患者的年龄、症状选择适当的给药方法。作为给药量，例如可以在每次每kg体重、活性成分为0.0001mg～100mg的范围内选择。或者，例如对病人给药时，每名患者在活性成分为0.001～1000mg/kg体重的范围内选择，每次的给药量例如优选本发明抗体的含量为0.01～50mg/kg体重左右。但本发明的炎症性疾病的预防或治疗药并不限于上述给药量。

需要说明的是，本说明书中引用的所有在先技术文献均作为参照而纳入本说明书中。

实施例

以下，利用实施例来具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。

[实施例1]杂交瘤的制作

1.1.用于DNA免疫的人NR10质粒、食蟹猴(cynomolgus monkey) NR10质粒的制备

1.1.1.hNR10、cynNR10表达载体的制备

将人NR10(核苷酸序列SEQ ID NO：75、氨基酸序列SEQ ID NO：76)插入到在小鼠β-肌动蛋白的启动子控制下表达蛋白的载体pMacII(WO2005/054467)中，构建hNR10表达载体。同样，由食蟹猴NR10(核苷酸序列SEQ ID NO：65、氨基酸序列SEQ ID NO：66)构建cynNR10表达载体。

1.1.2.DNA药筒的制作

为了将1.1.1中制作的hNR10或cynNR10表达载体用于对小鼠进行DNA免疫，使用Herios Gene Gun用药筒试剂盒(BIO-RAD社制)，制作针对各自的DNA每次可以将1μg的DNA免疫的DNA药筒。

1.2.产生抗人NR10抗体的杂交瘤的制作

1.2.1.使用人NR10和食蟹猴NR10免疫小鼠的杂交瘤的制作

使用人NR10或食蟹猴NR10，如下所述对10只Balb/c小鼠(雌，免疫开始时6周龄、日本Charles River)进行免疫。初次免疫时，使用Herios Gene Gun系统(BIO-RAD)给予小鼠由hNR10表达载体制作的DNA药筒进行免疫。1周后，通过Herios Gene Gun系统给予由cynNR10表达载体制作的DNA药筒，进行第2次免疫。从第3次以后开始，以1周的间隔交替给予hNR10和cynNR10表达载体进行免疫。确认对人NR10的血清抗体效价上升后，将用PBS(-)稀释的人NR10蛋白(胞外区)(参考例4)以10μg/只进行静脉内给药，作为最终免疫。最终免疫的4天后，将小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞P3X63Ag8U.1(称作P3U1，ATCC CRL-1597)按照使用PEG1500(Roche Diagnostics)的常规方法进行细胞融合。融合细胞即杂交瘤用含有10％FBS的RPMI1640培养基(以下称作10％FBS/RPMI1640)进行培养。

1.2.2.杂交瘤的筛选

融合的第2天，将(1)融合细胞悬浮于半流动培养基(StemCells)中，进行杂交瘤的选择培养，同时进行杂交瘤的集落化。

融合后，在第9天或第10天取出杂交瘤的集落，向装有HAT选择培养基(10％FBS/RPMI1640，2vol％ HAT 50×浓缩(大日本制药)，5vol％BM-Condimed H 1(Roche Diagnostics))的96孔板的每孔中接种1个集落。培养3～4天后，回收各孔的培养上清，测定培养上清中小鼠IgG的浓度。对于可以确认到小鼠IgG的培养上清，用使用了人IL-31依赖性细胞株(hNR10/hOSMR/BaF3细胞；参考例2)的中和活性进行评价，得到具有高NR10中和活性的若干个克隆(图3)。得到浓度依赖性抑制由人IL-31刺激引起的细胞增殖、且浓度依赖性抑制由食蟹猴IL-31刺激引起的细胞(cynNR10/cynOSMR/BaF3细胞；参考例2)增殖的克隆(图4)。

[实施例2]嵌合抗体的制作

嵌合抗体表达载体的制作

使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)从杂交瘤细胞中提取总RNA，利用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences)合成cDNA。使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences)中附带的10X通用引物A Mix和在抗体的各恒定区中设定的引物(H链：mIgG1-rnot、L链mIgK-rnot)，通过引物STAR HS DNA聚合酶(TaKaRa)进行PCR，分离抗体的可变区基因。对于分离的各DNA片段的核苷酸序列，使用BigDye Terminator循环测序试剂盒(Applied Biosystems)，通过DNA测序仪ABI PRISM 3730xL DNA测序仪或ABI PRISM 3700 DNA测序仪(Applied Biosystems)，按照附录说明书记载的方法进行确定。所得的NS18、NS22、NS23以及NS33的小鼠抗体的氨基酸序列的H链可变区见图1、L链可变区见图2。

对所得的H链、L链各片段，使用表1记载的引物组合，利用引物STAR HS DNA聚合酶(TaKaRa)进行PCR，将所得的扩增片段与恒定区(分别为人γ1或γ2、人κ)连接，插入动物细胞表达载体中。对于各DNA片段的核苷酸序列，使用BigDye Terminator循环测序试剂盒(Applied Biosystems)，通过DNA测序仪ABI PRISM 3730xL DNA测序仪或ABI PRISM 3700DNA测序仪(Applied Biosystems)，按照附录说明书记载的方法进行确定。

[表1]

	序列(5’→3’)	SEQ ID NO
			mIgG1-rnot	TAATAGCGGCCGCTCATTATTTACCAGGAGAGTGGGAGAG	90
mIgK-rnot	TAATAGCGGCCGCTCATTAACACTCATTCCTGTTGAAGCT	91
			mNS18H-feco	GACGAATTCCACCATGGGATGGAGCTGGATCTT	92
mNS18L-feco	GACGAATTCCACCATGAGTGTGCCCACTCAGGT	93
			mNS33H-feco	GACGAATTCCACCATGGAATGTAACTGGATACT	94
mNS33L-feco	GACGAATTCCACCATGGATTTTCTGGTGCAGAT	95

	正向引物	反向引物
			NS18 H链	mNS18H-feco	mIG1-rnot
NS18 L链	mNS18L-feco	mIGK-rnot
			NS22 H链	Mns18H-feco	mIG1-rnot
NS22 L链	mNS18L-feco	mIGK-rnot
			NS23 H链	mNS18H-feco	mIG1-rnot
NS23 L链	mNS18L-feco	mIGK-rnot
			NS33 H链	mNS33H-feco	mIG1-rnot
NS33 L链	mNS33L-feco	mIGK-rnot

嵌合抗体的制作

将来自人胚肾癌细胞(human embryonic kidney cancer cell)的HEK293H株(Invitrogen)悬浮于含有10％胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培养基(Invitrogen)中，按6×10⁵个细胞/mL的细胞密度向粘附细胞用皿(直径为10cm，CORNING)的各皿中分别接种10mL，在37℃、5％CO₂培养箱内培养一昼夜，之后吸除培养基，添加6.9mLCHO-S-SFMII(Invitrogen)培养基。向制备的质粒DNA混合液(总计13.8μg)中加入CHO-S-SFMII培养基至700μL，再加入20.7μL 1μg/mL的聚乙烯亚胺(Polysciences Inc.)，进行混合，在室温下静置10分钟，将所得产物投入各皿的细胞中，在37℃、5％CO₂培养箱内培养4～5小时。之后，添加6.9mL CHO-S-SFMII(Invitrogen)培养基，在CO₂培养箱内培养3～4天。回收培养上清后，在室温下以约2000g的离心力离心5分钟以除去细胞，再通过0.22μm滤器MILLEX(注册商标)-GV(Millipore)。各样品使用前一直在4℃下保存。使用蛋白GSepharose(Amersham Biosciences)，从该上清中纯化抗体。纯化的抗体用Amicon Ultra 15(Millipore)进行浓缩，再使用PD-10脱盐柱(Amersham Biosciences)，将溶剂置换成含有0.05％NaN3的PBS(-)。使用ND-1000分光光度计(NanoDrop)测定280nm的吸光度，按照Pace等人的方法(Protein Science(1995)4：2411-2423)算出浓度。

评价嵌合NS22的活性

使用hIL-31用量依赖性增殖的hNR10/hOSMR/BaF3细胞株，如下所述评价hIL-31中和活性。

用含有10％FBS(MOREGATE)、1％青霉素-链霉素(Invitrogen)的RPMI1640培养基(GIBCO)制备hNR10/hOSMR/BaF3细胞，使达到1.5×10⁵个细胞/mL。取其一部分，添加hIL-31(R&D Systems)使达到4ng/mL(IL-31(+)，终浓度：2ng/mL)。将剩下的细胞悬浮液作为IL-31(-)。已纯化的NS22用培养基调整至2μg/mL，再制备稀释比率(希釈公比)3、总计8系列的稀释液(终浓度≤1μg/mL)。在96孔平底板(CORNING)的各孔中分别接种50μL细胞悬浮液和50μL嵌合NS22(人γ1，κ)稀释溶液，在37℃、5％CO₂培养箱内培养2天。培养结束后，向各孔中添加20μL细胞计数试剂盒-8(Dojindo)与PBS等量混合的溶液，测定吸光度(450nm/620nm)(TECAN，SUNRISE CLAS SIC)。使之在37℃、5％CO₂培养箱内反应2小时，之后再次测定吸光度。NS22的中和活性使用从2小时的值中减去0小时的值得到的差，以抑制率表示。由其结果可知：NS22在hNR10/hOSMR/BaF3细胞株中浓度依赖性地抑制由IL-31刺激引起的细胞增殖，证明对人IL-31信号具有中和活性(图5)。

使用通过IL-31刺激而显示出IL-6产生诱导的DU145细胞株(人前列腺癌细胞株)，如下所示评价IL-31中和活性。

用含有10％FBS(MOREGATE)、2mmol/L L-谷氨酰胺(Invitrogen)、1mmol/L丙酮酸钠(SIGMA)的MEM培养基(Invitrogen)制备DU145，使达到2.5×10⁵个细胞/mL，向48孔板(CORNING)的各孔中分别注入200μL，在37℃、5％CO₂的条件下培养一夜。用含有10％FBS、2mmol/L L-谷氨酰胺、丙酮酸钠的MEM培养基稀释已纯化的嵌合NS22(人γ1，κ)，使达到100μg/mL，使用该溶液制备稀释比率为5、总计6系列的稀释液，分别与100ng/mL的人白介素-31(R&Dsystems)以1∶1混合，向各孔中分别添加50μL。在37℃、5％CO₂条件下培养2天后，使用DuoSet ELISA Development试剂盒(R&D systems)测定培养上清中IL-6浓度。NS22的中和活性以抑制率(％)来评价。即，以IL-31非存在下的IL-6浓度(A)作为最大抑制活性(100％抑制)、以添加IL-31且未添加NS22时的IL-6浓度(B)作为无抑制活性(0％抑制)，利用下式算出添加IL-31且添加NS22时的IL-6浓度(C)。

抑制率(％)＝(B-C)/(B-A)×100

由结果可知：NS22在DU145细胞株中浓度依赖性地抑制由IL-31刺激引起的IL-6的产生，证明对人IL-31信号具有中和活性(图6)。

嵌合抗NR10抗体的IL-31竞争活性评价

用FMAT Blue Monofunctional Reactive Dye(FMAT Blue单官能活性染料)(Applied Biosystems)标记人IL-31(R&D Systems)。向100μL用50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)制备成0.5mg/mL的hIL-31中添加5.25μL溶于DMSO(Junsei)中的25 nmoles FMAT Blue，涡旋，之后在常温下静置15分钟。通过添加5μL 1M的Tris-HCl(pH7.4)和1.1μL10％Tween 20，使向hIL-31中导入FMAT Blue的导入反应停止，之后通过使用Superdex 75(GE Healthcare，17-0771-01)作为柱的凝胶过滤，在0.1％Tween 20/PBS展开液上分离FMAT Blue标记的hIL-31和未反应的FMAT Blue。

使用hNR10表达CHO细胞，如下所述评价抗体的IL-31/NR10结合抑制活性。

使用测定缓冲液(10mM HEPES、140mM NaCl、2.5mM CaCl₂、3mM MgCl₂、2％FBS、0.01％NaN₃)，将NS22和NA633(恒定区分别为γ1、κ)稀释至适当浓度，再制备稀释比率2、总计7系列的稀释液，以40μL/孔添加到板(96孔FMAT板，Applied Biosystems)中。接着，用测定缓冲液将FMAT Blue标记的hIL-31稀释400倍，按20μL/孔进行添加。最后，按40μL/孔添加用测定缓冲液调整至2.5×10⁵细胞/mL的细胞悬浮液(最终为1×10⁴细胞/孔)。添加细胞2小时后，用8200细胞检测系统(Applied Biosystems)测定荧光(FL1)。结果显示：NS22用量依赖性地抑制hIL-31/hNR10的结合，证明其活性较NA633优异(图7)。

[实施例3]抗NR10抗体与NR10的竞争

用FMAT Blue(Applied Biosystems，4328853)标记从杂交瘤培养上清中纯化的NS22抗体。向170μL制备成1mg/ml-PBS的NS22中添加17μL 1M的NaHCO₃溶液和3.4μL溶于DMSO中的17nmolesFMAT Blue，涡旋，之后在常温下静置30分钟。通过添加8μL 1M的Tris-HCl(pH7.4)和1.9μL 1％Tween 20，使向NS22中导入FMATBlue的导入反应停止，之后通过使用Superdex 75(GE Healthcare，17-0771-01)作为柱的凝胶过滤，在0.01％Tween 20/PBS展开液上分离FMAT Blue标记NS22(FMAT Blue-NS22)和未反应的FMAT Blue。

使用8200细胞检测系统(Applied Biosystems，4342920)研究各种抗体对所得的FMAT Blue-NS22与hNR10表达CHO细胞(参考例3)的结合的抑制。向7500个细胞/孔的8.8×10^-2μg/mL FMAT Blue-NS22中添加各种浓度的嵌合抗NR10抗体(恒定区分别为γ1、κ)，在暗室中静置4小时后，测定来自与细胞结合的FMAT Blue的荧光信号。反应在含有2.5mM CaCl₂、3mM MgCl₂、140mM NaCl、2％FBS、0.01％NaNO₃的10mM Hepes-KOH中进行。结果见图8。随着NS22和NS23抗体的浓度升高，表示FMAT Blue-NS22与NR10表达细胞结合的荧光值FL1减少。另一方面，几乎没有确认到FL1随着NA633抗体(参考例6)的浓度上升而下降(图8)。

[实施例4]NS22抗体的人源化

各构架序列的选定

比较小鼠NS22抗体可变区与人的种系序列。其中，人源化时使用的FR序列汇总在表2中。CDR、FR的确定按照Kabat编号来进行。作为进行了人源化的可变区，H链以表2记载的包含FR1、FR2、FR3_1、FR4的序列作为H0-VH(SEQ ID NO：50)、以包含FR1、FR2、FR3_2、FR4的序列作为H1-VH(SEQ ID NO：112)。L链以包含FR1、FR2、FR3、FR4的序列作为L0(SEQ ID NO：52)。

人源化NS22 H0L0的可变区的制作

为了制作人源化时使用的在FR区中移植有NS22的CDR区的人源化NS22的可变区，分别设计H链、L链的合成寡DNA。混合各合成寡DNA，通过装配PCR制成编码人源化NS22的可变区的基因。装配PCR使用KOD-Plus(TOYOBO)来进行，按照以下条件进行PCR法。将包含附带的PCR缓冲液、dNTPs、MgSO₄、KOD-Plus和10pmol合成寡DNA的反应混合物在94℃下加热5分钟后，进行2次由94℃下2分钟、55℃下2分钟、68℃下2分钟构成的PCR反应循环，之后添加10pmol在可变区的5’末端添加有限制酶切位点和Kozak序列的引物和10pmol在3’末端添加有限制酶切位点的引物，进行35次由94℃下30秒、55℃下30秒、68℃下1分钟构成的PCR反应循环，得到扩增片段。将所得的扩增片段克隆到TOPO TA克隆载体(TOYOBO)中，通过测序确认核苷酸序列。组合已制作的可变区和恒定区，制作H0-SKSC(SEQ ID NO：54)、L0(SEQ ID NO：56)，将其插入到在动物细胞中能够表达插入基因的表达载体中。至于各DNA片段的核苷酸序列，使用BigDye Terminator循环测序试剂盒(Applied Biosystems)，通过DNA测序仪ABI PRISM 3730xL DNA测序仪或ABI PRISM 3700DNA测序仪(Applied Biosystems)，按照附录说明书记载的方法来确定。

人源化NS22 H1的可变区的制作

H1-SKSC(SEQ ID NO：130)的制作如下：通过将存在于H0-SKSC(SEQ ID NO：54)的FR3的kabat编号第73位的谷氨酰胺(E)取代成赖氨酸(K)来制作。突变体的制作使用市售QuikChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene)来进行，按照附录说明书的方法制成突变体。

IgG化抗体的表达

抗体的表达使用以下的方法来进行。将来自人胚肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)悬浮于含有10％胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培养基(Invitrogen)中，以5～6×10⁵个细胞/mL的细胞密度，在粘附细胞用皿(直径10cm，CORNING)的各皿中分别接种10mL，在37℃、5％CO₂培养箱内培养一昼夜，之后吸除培养基，添加6.9mLCHO-S-SFMII(Invitrogen)培养基。将制备的质粒DNA混合液(总计13.8μg)与20.7μL 1μg/mL的聚乙烯亚胺(Polysciences Inc.)和690μLCHO-S-SFMII培养基混合，在室温下静置10分钟，将产物投入各皿的细胞中，在37℃、5％CO₂培养箱内培养4～5小时。之后，添加6.9mL CHO-S-SFMII(Invitrogen)培养基，在CO₂培养箱内培养3天。回收培养上清，之后在室温下以约2000g的离心力离心5分钟以除去细胞，再通过0.22μm滤器MILLEX^(R)-GV(Millipore)进行灭菌。各样品使用前一直在4℃下保存。

IgG化抗体的纯化

向得到的培养上清中添加50μL悬浮于TBS中的rProtein ASepharose^TM Fast Flow(Amersham Biosciences)，在4℃下颠倒混合4小时以上。将该溶液移至0.22μm的滤杯Ultrafree(注册商标)-MC(Millipore)中，用500μL TBS清洗3次后，将rProtein A Sepharose^TM树脂悬浮于100μL的50mM乙酸钠水溶液(pH3.3)中，静置3分钟后洗脱抗体。立即加入6.7μL的1.5M Tris-HCl、pH7.8进行中和。洗脱2次，得到200μL纯化抗体。将2μL含有抗体的溶液供给ND-1000分光光度计(NanoDrop社)(Thermo Scientific NanoDrop^TM 1000分光光度计(Thermo Scientific社))、或者将50μL供给分光光度计DU-600(BECKMAN)，测定280nm的吸光度，利用Pace等人的方法(ProteinScience(1995)4：2411-2423)计算抗体浓度。

使用FMAT的IL-31竞争活性的测定

使用hNR10表达CHO细胞，如下所述评价抗体的IL-31/NR10结合抑制活性。使用测定缓冲液(10mM HEPES、140mM NaCl、2.5mM CaCl₂、3mM MgCl₂、2％FBS、0.01％NaN₃、pH7.4)，将NS22嵌合抗体和NS22_H0L0(H链H0-SKSC/SEQ ID NO：54、L链L0/SEQID NO：56)稀释至适当浓度，再制备稀释比率2、总计8系列的稀释液，以40μL/孔添加到板(96-孔FMAT板，Applied Biosystems)中。接着，将FMAT Blue-标记的hIL-31用测定缓冲液稀释400倍，以20μL/孔进行添加。最后，以40μL/孔添加用测定缓冲液调整至2.5×10⁵细胞/mL的细胞悬浮液(最终为1×10⁴细胞/孔)。添加细胞2小时后，用8200细胞检测系统(Applied Biosystems)测定荧光(FL1)。

结果如图9所示，人源化NS22抗体、H0L0(H链H0-SKSC/SEQID NO：54、L链L0/SEQ ID NO：56)、H1L0(H链H1-SKSC/SEQ IDNO：130、L链L0/SEQ ID NO：56)显示出与嵌合抗体几乎同等的竞争活性，因此可称得上是H0L0、H1L0人源化抗IL-31受体抗体。另外，认为用于H0L0、H1L0的FR均可在人源化时用作FR。

由此认为：以后的实施例中显示的相对于CDR的突变位点均可以导入H0、H1中。

[表2]

[实施例5]人源化抗IL31受体抗体中的新型恒定区M14和M58的异质性降低效果

如参考例7～9所示，确认到：在作为人源化抗IL-6受体抗体的huPM1抗体中，通过将恒定区由IgG2变换成M14或M58，可以在不降低稳定性的情况下降低来自IgG2铰链区的异质性。于是，研究在人源化抗IL-31受体抗体中，通过将恒定区由野生型IgG2变换成M14或M58，是否也可以降低异质性。

作为H链，使用组合有包含参考例8和9中制作的M14(SEQ IDNO：129)、M58(SEQ ID NO：128)的IgG1(SEQ ID NO：60)和IgG2(SEQID NO：132)与实施例4中制作的人源化抗IL-31受体抗体的H链可变区H0(H0-VH/SEQ ID NO：50)的H0-M14、H0-M58、H0-IgG1和H0-IgG2；L链使用实施例4中制作的L0(L0/SEQ ID NO：56)，以制作H0L0-IgG1(H链H0-IgG1/SEQ ID NO：133、L链L0/SEQ ID NO：56)、H0L0-IgG2(H链H0-IgG2/SEQ ID NO：134、L链L0/SEQ ID NO：56)、H0L0-M14(H链H0-M14/SEQ ID NO：135、L链L0/SEQ ID NO：56)和H0L0-M58(H链H0-M58/SEQ ID NO：136、L链L0/SEQ ID NO：56)。各抗体的表达、纯化按照实施例4所述的方法来进行。

作为异质性的评价方法，利用阳离子交换色谱进行评价。评价制作的抗体的异质性时，柱使用ProPac WCX-10(Dionex)，流动相A使用20mM乙酸钠(pH5.0)、流动相B使用20mM乙酸钠、1M NaCl(pH5.0)，采用适当的流速和梯度来实施。阳离子交换色谱(IEC)的评价结果见图10。

如图10所示，即使在抗IL-31受体抗体中，通过将恒定区由IgG1变换成IgG2，异质性也会增大；通过将恒定区变换成M14或M58，在所有抗体中均确认到可以降低异质性。

[实施例6]抗IL-31受体抗体中的新型恒定区M58的药物动力学改善效果

如参考例9所示，发现：在作为抗IL-6受体抗体的huPM1抗体中，通过将恒定区由IgG1变换成M58，与人FcRn的结合活性提高，在人FcRn转基因小鼠体内的药物动力学提高。于是，研究对于抗IL-31受体抗体，通过将恒定区变换成M58，是否也可以提高药物动力学。

按照参考例9所示的方法，评价实施例4和实施例5中制作的H0L0-IgG1(H链H0-IgG1/SEQ ID NO：133、L链L0/SEQ ID NO：56)、H0L0-M58(H链H0-M58/SEQ ID NO：136、L链L0/SEQ ID NO：56)与人FcRn的结合活性。其结果见表3。

[表3]

如表3所示，即使在作为抗IL-31受体抗体的H0L0中，通过将恒定区由IgG1变换成M58，与作为抗IL-6受体抗体的hPM1一样，也确认到与人FcRn的结合活性提高。由此显示：通过将恒定区由IgG1变换成M58，也可以提高抗IL-31受体在人体内的药物动力学。

[实施例7]降低等电点的突变位点的鉴定

突变体的制作

各突变体的制作按照实施例4的方法、或者通过进行使用PCR的装配PCR来进行。使用装配PCR来进行的方法是指，进行根据包含修饰位点的顺链和逆链的序列设计的寡DNA的合成。将包含修饰位点的顺链寡DNA和与插入有进行改变的基因的载体结合的逆链寡DNA、包含修饰位点的逆链寡DNA和与插入有进行改变的基因的载体结合的顺链寡DNA分别组合，使用引物STAR(TAKARA)进行PCR，从而制作5’末端侧和3’末端侧的2个包含修饰位点的片段。通过装配PCR连接这2个片段，从而制作各突变体。将所制作的突变体插入能够在动物细胞中表达插入基因的表达载体中，所得的表达载体的核苷酸序列按照本领域技术人员公知的方法来确定。抗体的制作和纯化按照实施例4的方法进行。

突变位点的鉴定

为了提高H0L0(H链H0-SKSC/SEQ ID NO：54、L链L0/SEQ IDNO：56)的药物动力学，研究可以降低可变区的等电点的修饰位点。筛选根据立体结构模型推测的可变区突变位点，结果发现了在不大幅降低与NR10的结合的情况下降低可变区的等电点的位点，将它们汇总在表4中(Hp5-VH/SEQ ID NO：137、Hp7-VH/SEQ ID NO：138、Hp8-VH/SEQ ID NO：139、Hp6-VH/SEQ ID NO：140、Hp9-VH/SEQ IDNO：141、Hp1-VH/SEQ ID NO：142、Hp13-VH/SEQ ID NO：143、Lp1-VL/SEQ ID NO：144、Lp2-VL/SEQ ID NO：145、Lp3-VL/SEQ IDNO：146、Lp4-VL/SEQ ID NO：147、Lp7-VL/SEQ ID NO：148、Lp5-VL/SEQ ID NO：149、Lp6-VL/SEQ ID NO：150)。各变体的制作、纯化按照实施例4所述的方法进行。

使用FMAT评价各变体的hIL-31/hNR10结合抑制活性。方法按照实施例4的方法进行。如图11所示，与H0L0的竞争活性相比，各变体的竞争活性没有大幅降低。

[表4]

上述表4中的“※”表示虽然与等电点无关但为了转变成人序列而修饰的位点。

组合有上述修饰的、等电点降低的人源化NS22抗体的例子有：Hp3Lp15(H链Hp3-SKSC/SEQ ID NO：151、L链Lp15/SEQ ID NO：152)。将Hp3Lp15与NR10的亲和性、等电点和在小鼠体内的血浆中滞留性与H0L0进行比较。

亲和性的测定

按照参考例10的方法测定各抗体与NR10的亲和性。

亲和性的测定结果见表5。结果显示：Hp3Lp15的亲和性与H0L0的亲和性几乎同等。

[表5]

等电点的测定

为了评价由可变区的氨基酸修饰引起的全长抗体的等电点变化，利用各抗体的等电点电泳进行分析。等电点电泳的方法如下。

使用Phastsystem Cassette(Amersham Biosciences社制)，将Phast-Gel Dry IEF(Amersham Biosciences社制)凝胶在以下膨润液中膨润约30分钟。

Milli-Q水 1.5mL

IEF用Pharmalyte 5-8(Amersham Biosciences社制) 100μL

使用已膨胀的凝胶，利用PhastSystem(Amersham Biosciences社制)按照下述程序进行电泳。在步骤2中将样品添加到凝胶中。pI标记使用pI的校准试剂盒(Amersham Biosciences社制)。

步骤1：2000V 2.5mA 3.5W 15℃ 75Vh

步骤2：200V 2.5mA 3.5W 15℃ 15Vh

步骤3：2000V 2.5mA 3.5W 15℃ 410Vh

电泳后，将凝胶用20％TCA固定，之后使用银染色试剂盒、蛋白(Amersham Biosciences社制)，按照试剂盒中附带的操作指南进行银染色。染色后，由pI标记的已知等电点算出样品(全长抗体)的等电点。

通过等电点电泳测定等电点的结果如下：H0L0的等电点为约7.8，Hp3Lp15的等电点为约5.5，所以与H0L0的等电点相比，Hp3Lp15的等电点下降约2.3。此外，利用GENETYX(GENETYXCORPORATION)计算可变区VH/VL的理论等电点时，H0L0可变区的理论等电点为7.76，Hp3Lp15可变区的理论等电点为4.63，与H0L0相比，Hp3Lp15的理论等电点下降3.13。

评价等电点降低的抗体在小鼠体内的药物动力学

为了评价等电点降低的修饰抗体Hp3Lp15的血浆中滞留性，比较H0L0和Hp3Lp15在正常小鼠体内的血浆中滞留性。将H0L0和Hp3Lp15以1mg/kg对小鼠(C57BL/6J、日本Charles River)进行静脉内单次给药，比较血浆中浓度变化。血浆中浓度测定按照ELISA法进行测定。将适当浓度的标准曲线试样和血浆测定试样分别注入固定有抗人IgG(Fc-specific)抗体(Sigma社制)的多孔板(immunoplate)(Nunc-Immuno Plate，MaxiSorp(Nalge nunc International社制))中，在室温下静置1小时。使山羊抗人IgG-ALP(Sigma社制)在室温下反应1小时，之后使用BluePhos微孔磷酸酶底物系统(Kirkegaard & PerryLaboratories社制)作为底物进行显色反应，利用酶标仪(microplatereader)测定650nm的吸光度。使用分析软件SOFTmax PRO(MolecularDevices社制)，根据标准曲线的吸光度算出血浆中浓度。

使用药物动力学分析软件WinNonlin(Pharsight社制)由所得的血浆中浓度变化的数据算出药物动力学参数(AUC、全身清除率(CL))，所得参数如表6所示。相对于H0L0，静脉内给予Hp3Lp15后的AUC增加约14％、清除率下降约12％。由此可见：使H0L0的等电点降低的Hp3Lp15，其药物动力学得到改善。

[表6]

[实施例8]可变区与恒定区的组合对生物活性的影响

为了评价使用不同的恒定区对生物活性产生的影响，制作以下变体。

作为H链，将恒定区即参考例7和9中制作的SKSC(SEQ ID NO：62)、M58(SEQ ID NO：128)与可变区即实施例7中制作的可变区Hp3(Hp3-VH/SEQ ID NO：167)组合，制作Hp3-M58(SEQ ID NO：240)、Hp3-SKSC(SEQ ID NO：151)。将制作的H链与实施例7中制作的L链Lp15(Lp15/SEQ ID NO：152)组合，制作Hp3Lp15-SKSC(H链Hp3-SKSC/SEQ ID NO：151、L链Lp15/SEQ ID NO：152)和Hp3Lp15-M58(H链Hp3-M58/SEQ ID NO：240、L链Lp15/SEQ ID NO：152)。各抗体的表达、纯化按照实施例4所述的方法进行。

对于上述制作的各抗体和使用了参考例7中所述的恒定区SKSC(SEQ ID NO：62)的H0L0-SKSC(H链H0-SKSC/SEQ ID NO：54、L链L0/SEQ ID NO：56)、实施例5中制作的H0L0-M58(H链H0-M58/SEQID NO：136、L链L0/SEQ ID NO：56)和H0L0-IgG2(H链H0-IgG2/SEQ ID NO：134、L链L0/SEQ ID NO：56)，按照实施例2所述的方法评价使用BaF/NR10的生物活性，其结果汇总在图18中。

如图18所示，恒定区之间没有检测到大的生物活性的差别。即使将2个可变区H0、Hp3与各恒定区组合，对生物活性也没有影响，由此认为：在今后制作的可变区中，即使与任何恒定区组合，生物活性都不会发生变化。

[实施例9]抑制由热加速试验引起的分解的突变位点的鉴定

药品中使用的抗体尽管是由来自单一抗体产生细胞的克隆得到的单克隆抗体也存在异质性。已知这样的抗体的异质性源自氧化、脱酰胺化等修饰，在长期保存中或暴露于热应力、光应力这样的应力条件下异质性会增加(参考文献：Heterogeneity of Monoclonal Antibodies：Journal of pharmaceutical sciences，第97卷，No.7，2426-2447)。但是，在开发抗体作为药品时，其蛋白的理化性质、其中均匀性和稳定性极为重要，希望降低目标物质/相关物质的异质性，且尽可能是单一物质。于是，为了评价抗体在应力条件下的异质性、并降低其异质性，进行以下实验。

为了评价分解物，按照以下方法制备H0L0(H链H0-SKSC/SEQID NO：54、L链L0/SEQ ID NO：56)的热加速品。对于制备的热加速品和未加速品(初品)，按照以下方法，利用阳离子交换色谱进行分析。

·热加速品的制备方法

缓冲液：PBS

抗体浓度：0.2-1.0mg/mL

加速温度：60℃

加速期间：1天

·阳离子交换色谱的分析方法

柱：ProPac WCX-10，4×250mm(Dionex)

流动相：(A)25mmol/L MES/NaOH，pH6.1

(B)25mmol/L MES/NaOH，250mmol/L NaCl，pH6.1

流速：0.5mL/分钟

柱温：40℃

梯度：％B 0～0(0-5分钟)→0～30(5-80分钟)

检测：280nm

H0L0的热加速前、后的样品的色谱图结果见图19。在H0L0的热加速后的样品中，显示出基峰(basic peak)有增加的趋势。

于是，为了减低该峰而进行筛选，结果发现了Ha355、Ha356、Ha360、Ha362，制作将这些H链变体与L0组合的Ha355L0(H链Ha355-SKSC/SEQ ID NO：242、L链L0/SEQ ID NO：56)、Ha356L0(H链Ha356-SKSC/SEQ ID NO：243、L链L0/SEQ ID NO：56)、Ha360L0(H链Ha360-SKSC/SEQ ID NO：244、L链L0/SEQ ID NO：56)、Ha362L0(H链Ha362-SKSC/SEQ ID NO：245、L链L0/SEQ ID NO：56)。各变体的序列汇总在表7中。

[表7]

发现的各抗体的表达、纯化按照实施例4所述的方法进行。与H0L0一样，制备已制作的各抗体的热加速品，利用阳离子交换色谱进行分析，其结果见图19。

其结果，在包含H链第101位的天冬氨酸被取代成谷氨酸的修饰的修饰抗体中，与H0L0相比，热加速后增加的基峰的生成少。按照实施例2所述的方法，评价这些修饰抗体的使用BaF/NR10的生物活性，其结果见图20。如图20所示，这些修饰抗体的生物活性与H0L0的生物活性几乎同等或其以上。由以上结果可知：Ha355、Ha356、Ha360、Ha362的修饰抑制因热加速而生成的分解物，对提高抗体稳定性有效。

[实施例10]增加亲和性的突变位点的鉴定

为了提高H0L0与NR10的亲和性，制作向CDR序列中导入了突变的文库，并进行研究。筛选在CDR中导入有突变的文库，结果发现了提高与NR10的亲和性的突变，这些突变汇总在表8中。将各自的H链变体Ha101-SKSC(SEQ ID NO：246)、Ha103-SKSC(SEQ ID NO：247)、Ha111-SKSC(SEQ ID NO：248)、Ha204-SKSC(SEQ ID NO：249)、Ha219-SKSC(SEQ ID NO：250)与L0(L0/SEQ ID NO：56)、以及各自的L链变体La134(SEQ ID NO：251)、La130(SEQ ID NO：252)、La303(SEQ ID NO：253)、La328(SEQ ID NO：254)与H0(H0-SKSC/SEQ ID NO：54)分别组合，制作各抗体。各变体的制作、纯化按照实施例4所述的方法进行。

使用Biacore评价各变体与NR10的亲和性，结果见表9。方法按照参考例10所述的方法进行。如表9所示，发现与H0L0(H链H0-SKSC/SEQ ID NO：54、L链L0/SEQ ID NO：56)的KD值相比，各变体的KD值提高。

[表8]

[表9]

将提高上述亲和性的突变与实施例7中制作的降低等电点的突变组合的例子有：Ha401La402(H链Ha401-SKSC/SEQ ID NO：255、L链La402/SEQ ID NO：256)或H17L11(H链H17-M58/SEQ ID NO：222、L链L11/SEQ ID NO：236)。各变体的制作、纯化按照实施例4所述的方法进行。

按照参考例10和实施例2所述的方法评价Ha401La402(H链Ha401-SKSC/SEQ ID NO：255、L链La402/SEQ ID NO：256)与NR10的亲和性和使用了BaF/NR10的生物活性，并与H0L0(H链H0-SKSC/SEQ ID NO：54、L链L0/SEQ ID NO：56)进行比较。亲和性的测定结果见表10、使用了BaF/NR10的生物活性见图21。结果显示：亲和性、生物活性均较H0L0(H链H0-SKSC/SEQ ID NO：54、L链L0/SEQ ID NO：56)有所提高。

[表10]

按照实施例7和实施例2所述的方法评价H17L11(H链H17-M58/SEQ ID NO：222、L链L11/SEQ ID NO：236)与NR10的亲和性和使用了BaF/NR10的生物活性，并与H0L0(H链H0-M58/SEQID NO：136、L链L0/SEQ ID NO：56)进行比较。亲和性的测定结果见表11、使用了BaF/NR10的生物活性见图22。结果发现：亲和性、生物活性均较H0L0(H链H0-M58/SEQ ID NO：136、L链L0/SEQ IDNO：56)有所提高。

[表11]

[实施例11]用于降低免疫原性风险的突变位点的鉴定

降低H链CDR1的免疫原性风险

使用TEPITOPE(Methods.2004 Dec；34(4)：468-75)分析存在于H0L0可变区序列中的T细胞表位。其结果，预测H链CDR1中存在多个与HLA结合的T细胞表位(存在免疫原性风险高的序列)。于是，在TEPITOPE分析中研究降低H链CDR1的免疫原性风险的修饰时，发现：通过将kabat编号第33位的异亮氨酸(I)取代成丙氨酸(A)，免疫原性风险大幅降低(表12)。对实施例10中制成的H17实施上述修饰，来制作H19(H19-M58/SEQ ID NO：223)。将制作的H19与L12组合，制作H19L12(H链H19-M58/SEQ ID NO：223、L链L12/SEQ IDNO：237)。各变体的制作、纯化按照实施例4所述的方法进行。

按照参考例10和实施例2所述的方法，评价与NR10的亲和性和使用了BaF/NR10的生物活性，并与H0L0(H链H0-M58/SEQ ID NO：136、L链L0/SEQ ID NO：56)进行比较。亲和性的测定结果见表13、使用了BaF/NR10的生物活性见图23。显示出与H0L0几乎同等的亲和性和生物活性。

[表12]

[表13]

降低L链CDR1的免疫原性风险

存在于L链CDR1中的kabat编号第25位的苏氨酸(T)在生殖细胞系列序列中是丙氨酸(A)或丝氨酸(S)。于是，预想通过将第25位的苏氨酸(T)改变成丙氨酸(A)或丝氨酸(S)使免疫原性风险降低(表14)。为此，制作对L12实施了上述修饰的L17(SEQ ID NO：238)。将制作的L17与H0组合，制作H0L17(H链H0-M58/SEQ ID NO：136、L链L17/SEQ ID NO：238)。变体的制作、纯化按照实施例4所述的方法进行。

按照参考例10和实施例2所述的方法，评价各变体与NR10的亲和性和使用了BaF/NR10的生物活性，并与H0L0(H链H0-M58/SEQID NO：136、L链L0/SEQ ID NO：56)和H0L12(H链H0-M58/SEQ IDNO：136、L链L12/SEQ ID NO：237)进行比较。由于L12中含有提高亲和性的序列，所以与H0L0相比，显示出约2倍高的亲和性。亲和性的测定结果见表15，使用了BaF/NR10的生物活性见图24。在亲和性、生物活性方面，均显示出与H0L12几乎同等的亲和性和生物活性。

[表14]

[表15]

[实施例12]完全人源化NS22抗体的制作

向H0(H0-M58/SEQ ID NO：136)、H1(H1-M58/SEQ ID NO：257)或L0(L0/SEQ ID NO：56)中组合多个上述实施例中发现的降低pI的修饰、提高亲和性的修饰、抑制H链分解的修饰、降低免疫原性风险的修饰，制成NS22变体的可变区，进行各种筛选，结果发现了：H28L17(H链H28-M58/SEQ ID NO：224、L链L17/SEQ ID NO：238)、H30L17(H链H30-M58/SEQ ID NO：225、L链L17/SEQ ID NO：238)、H34L17(H链H34-M58/SEQ ID NO：226、L链L17/SEQ ID NO：238)、H42L17(H链H42-M58/SEQ ID NO：227、L链L17/SEQ ID NO：238)、H44L17(H链H44-M58/SEQ ID NO：228、L链L17/SEQ ID NO：238)、H46L17(H链H46-M58/SEQ ID NO：229、L链L17/SEQ ID NO：238)、H57L17(H链H57-M58/SEQ ID NO：230、L链L17/SEQ ID NO：238)、H71L17(H链H71-M58/SEQ ID NO：231、L链L17/SEQ ID NO：238)、H78L17(H链H78-M58/SEQ ID NO：232、L链L17/SEQ ID NO：238)、H92L17(H链H92-M58/SEQ ID NO：233、L链L17/SEQ ID NO：238)、H97L50(H链H97-M58/SEQ ID NO：234、L链L50/SEQ ID NO：239)、H98L50(H链H98-M58/SEQ ID NO：235、L链L50/SEQ ID NO：239)。变体的制作、纯化按照实施例4所述的方法进行。

按照参考例10和实施例2所述的方法，评价各变体与NR10的亲和性和使用了BaF/NR10的生物活性，并与H0L0(H链H0-M58/SEQID NO：136、L链L0/SEQ ID NO：56)进行比较。亲和性的测定结果见表16，使用了BaF/NR10的生物活性见图25-1和图25-2。所有抗体的亲和性、生物活性均与H0L0几乎同等或其以上。

[表16]

[实施例13]抗NR10中和抗体的结合结构域的分析

(1)人/小鼠野生型和嵌合抗原的制备

将编码人和小鼠的野生型和嵌合NR10胞外区(hhh(SEQ ID NO：258)、mmm(SEQ ID NO：259)、hhm(SEQ ID NO：260)、mmh(SEQ IDNO：261)、hmm(SEQ ID NO：262)、mhm(SEQ ID NO：263)、mhh(SEQID NO：264))的基因与His tag和Myc tag(HHHHHHEQKLISEEDL/SEQ ID NO：287)在C末端融合，之后插入动物细胞表达载体中，利用FreeStyle 293表达系统(invitrogen^TM)进行一过性表达。上述人/小鼠野生型和嵌合NR10-ECD的模式图见图26。

利用Ni-NTA Superflow柱层析，从培养上清中纯化人/小鼠野生型和嵌合抗原(hhh、mmm、hhm、mmh、hmm、mhm、mhh)。即，将1mL Ni-NTA Superflow(QIAGEN)填充到Poly-Prep Empty柱(BioRad)中，再添加各30mL的培养上清，用含有150mM氯化钠和20mM咪唑的D-PBS(Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水)清洗，之后用含有150mM氯化钠和250mM咪唑的D-PBS洗脱。洗脱组分用截留分子量10K的Amicon-Ultra(Millipore)交换成D-PBS后进行浓缩。

(2)利用蛋白质印迹法检测结合抗原

制备的人/小鼠野生型和嵌合抗原按各0.5μg/泳道在3块4-20％聚丙烯酰胺凝胶(第一化学)中进行电泳。使用半干印迹装置在PVDF膜(Millipore)上进行电转印，用含有5％SkimMilk的TBS封闭。使3块凝胶在室温下反应1小时：1块(人源化抗人NR10抗体检测系统)在5μg/mL H44M58L17中反应；1块(小鼠抗人NR10抗体检测系统)在5μg/mL ND41中反应；1块(Myc tag检测系统)在用含有5％SkimMilk的TBS稀释了500倍的抗Myc抗体(SantaCruz、Cat.#sc-789)中反应。

使用含有0.05％Tween^TM 20的TBS，用3分钟清洗3次，之后使二次抗体反应。人源化抗人NR10抗体检测系统使用碱性磷酸酶标记山羊抗人IgGγ(BIOSOURCE、Cat.#AHI0305)，小鼠抗人NR10抗体检测系统使用碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG(SantaCruz、Cat.#sc-2008)，Myc tag检测系统使用碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG(SantaCruz、Cat.#sc-2057)，在室温下反应1小时。使用含有0.05％Tween^TM 20的TBS，用3分钟清洗4次，之后利用BCIP/NBT磷酸酶底物、1-Component System(KPL)使之显色。此处使用的TBS(Tris缓冲盐水)是将1包TBS(Tris-缓冲盐)粉末(TaKaRa)溶于1L蒸馏水中制备而成。结果见图27。

使用人源化抗体、小鼠抗体时，检测到只与NR10的胞外区hhh、hhm、hmm结合。

[参考例1]食蟹猴NR10、OSMR、IL-31基因的分离

为了评价临床前阶段的安全性，认为与食蟹猴的交叉性、中和活性是重要的，尝试着分离食蟹猴NR10基因、OSMR基因。根据公开的中国恒河猴基因组信息等设计引物，利用PCR法成功地由食蟹猴胰脏cDNA扩增了NR10基因、OSMR基因。分离的食蟹猴NR10、OSMR、IL-31的基因序列见SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：67。食蟹猴NR10、OSMR、IL-31的氨基酸序列见SEQ ID NO：66、SEQ IDNO：70、SEQ ID NO：68。

[参考例2]确立表达NR10和OSMR的Ba/F3细胞株

将人全长NR10 cDNA(SEQ ID NO：75)插入到表达载体pCOS1(Biochem Biophys Res Commun.228，第838-45页，1996)中，构建pCosNR10.3。利用PCR法从人胎盘文库中分离制癌蛋白M受体cDNA(OSMR，GenBank检索号NM003999)，同样构建表达载体pCosl-hOSMR。利用电穿孔法，将各10μg的载体同时导入来自小鼠IL-3依赖性pro-B细胞的细胞株Ba/F3中(BioRad Gene Pulser，960μF，0.33kV)。导入后，添加人IL-31(R&D Systems)，进行培养，得到显示出IL-31依赖性增殖的细胞株(hNR10/hOSMR/BaF3细胞)。另外，将食蟹猴IL-31基因(SEQ ID NO：67)插入到哺乳动物细胞用表达载体中，再导入CHO细胞株DG44中，以其培养上清的形式得到食蟹猴IL-31。使用该培养上清，与hNR10/hOSMR/BaF3一样，将食蟹猴全长NR10和食蟹猴OSMR基因分别插入表达载体pCOS1中，使之在Ba/F3细胞中表达，确立食蟹猴IL-31依赖性细胞株(cynNR10/cynOSMR/BaF3细胞)。

[参考例3]确立表达NR10的CHO细胞株

将胞内区缺失型人NR10基因(SEQ ID NO：73)以及胞内区缺失型食蟹猴NR10基因(SEQ ID NO：71)分别插入哺乳动物细胞用表达载体中，利用限制酶使该载体形成直链状，之后利用电穿孔法导入CHO细胞株DG44中(BioRad Gene Pulser，25μF，1.5kV)。用药物进行选择，使用抗人NR10抗体，通过FCM分析选择、确立NR10表达细胞。需要说明的是，由胞内区缺失型人NR10基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：73)编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：74，由胞内区缺失型食蟹猴NR10基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：71)编码的氨基酸序列见SEQ ID NO：72。

[参考例4]NR10蛋白(胞外区)的制备

以人NR10 cDNA为模板，利用PCR法仅扩增胞外区，再向C末端添加FLAG tag序列，之后插入到哺乳动物细胞用表达载体中。利用电穿孔法将10μg直链状的该载体导入中国仓鼠卵巢细胞株DG44中(BioRad Gene PulserII，25μF，1.5kV)，得到显示出高度表达的细胞株。大量培养该细胞株，利用抗FLAG抗体柱(SIGMA制)、凝胶过滤法，从培养上清中进行纯化，得到可溶型NR10。可溶型NR10的核苷酸序列见SEQ ID NO：77、氨基酸序列见SEQ ID NO：78。

[参考例5]抗人NR10抗体的制作

用人NR10蛋白(胞外区)[记载在参考例4中]对小鼠进行免疫，利用常规方法制作杂交瘤。通过使用了参考例2所示的人IL-31依赖性细胞株(hNR10/hOSMR/BaF3细胞)的中和活性评价这些杂交瘤的培养上清，得到具有NR10中和活性的NA633。

此外，使用插入有人NR10全长基因(SEQ ID NO：75)的哺乳动物用表达载体，使用He气射出基因枪进行DNA免疫，利用常规方法制作杂交瘤。通过使用了参考例2所示的人IL-31依赖性细胞株(hNR10/hOSMR/BaF3细胞)的中和活性评价这些杂交瘤的培养上清，得到具有NR10中和活性的ND41。

[参考例6]人嵌合抗体的制作

NA633的重链可变区的氨基酸序列见SEQ ID NO：104、轻链链可变区的氨基酸序列见SEQ ID NO：108。此外，NA633重链可变区的CDR1的氨基酸序列见SEQ ID NO：105、CDR2的氨基酸序列见SEQID NO：106、CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO：107、轻链可变区的CDR1的氨基酸序列见SEQ ID NO：109、CDR2的氨基酸序列见SEQID NO：110、CDR3的氨基酸序列见SEQ ID NO：111。并且，按照常规方法，制作上述小鼠可变区与人恒定区(H链为γ1、L链为κ)的嵌合抗体。

[参考例7]制作在不降低稳定性的情况下降低野生型IgG2的异质性的huPM1-SKSC

由于NS22抗体是NR10中和抗体，所以在考虑免疫原性和副作用时，认为有可能并不优选与Fcγ受体结合。为了减少与Fcγ受体的结合，考虑恒定区的同种型不选择IgG1、而选择IgG2或IgG4的方法(Ann Hematol.1998 Jun；76(6)：231-48.)，从Fcγ受体I和血浆中滞留性的角度考虑，认为与IgG4相比，更优选IgG2(Nat Biotechnol.2007 Dec；25(12)：1369-72)。另一方面，在开发抗体作为药品时，其蛋白的理化性质、其中均匀性和稳定性极其重要，有报道称：IgG2同种型的来自铰链区二硫键的异质性非常多(J Biol Chem.2008 Jun 6；283(23)：16206-15.)。难以在维持来源于此的目标物质/相关物质的异质性的制造间差的同时作为药品进行大量制造，且成本增加，希望尽可能是单一物质。因此，在开发IgG2同种型的抗体作为药品时，希望在不降低稳定性的情况下减少来自二硫键的异质性。

为了降低野生型IgG2的异质性，对IgG2的铰链部分的半胱氨酸和存在于CH1结构域的半胱氨酸进行修饰。各种变体的研究结果，认为在野生型IgG2恒定区序列中，利用将存在于H链CH1结构域的EU编号(Sequences of proteins of immunological interest，NIHPublication No.91-3242)第131位的半胱氨酸和第133位的精氨酸分别改成丝氨酸和赖氨酸、将存在于H链的上铰链的EU编号第219位的半胱氨酸改成丝氨酸的恒定区SKSC(SEQ ID NO：62)，可以在不降低稳定性的情况下降低异质性。另一方面，作为降低异质性的方法，考虑只将存在于H链的上铰链的EU编号第219位的半胱氨酸改成丝氨酸的方法、以及只将第220位的半胱氨酸改成丝氨酸的方法。于是，制作将IgG2的EU编号第219位的半胱氨酸改成丝氨酸的恒定区SC(SEQ ID NO：153)和将IgG2的EU编号第220位的半胱氨酸改成丝氨酸的恒定区CS(SEQ ID NO：154)。

作为H链，使用上述制作的各恒定区、IgG1(SEQ ID NO：60)、以及IgG2(SEQ ID NO：132)与人源化抗IL-6受体抗体的可变区(H链可变区huPM1-VH/SEQ ID NO：155、L链可变区huPM1-VL/SEQ IDNO：156)(Cancer Res.1993 Feb 15；53(4)：851-6.)组合的huPM1-SC(SEQ ID NO：157)、huPM1-CS(SEQ ID NO：158)、huPM1-IgG1(SEQID NO：159)、huPM1-IgG2(SEQ ID NO：160)和huPM1-SKSC(SEQ IDNO：161)；作为L链，使用huPM1-L(SEQ ID NO：162)，来制作各抗体。各抗体的表达、纯化按照实施例4所述的方法进行。

比较各抗体的异质性。作为huPM1-IgG1、huPM1-IgG2、huPM1-SC、huPM1-CS、huPM1-SKSC的异质性的评价方法，利用阳离子交换色谱进行评价。柱使用ProPac WCX-10(Dionex)，流动相A使用20mM乙酸钠(pH5.0)，流动相B使用20mM乙酸钠、1M NaCl(pH5.0)，采用适当的流量和梯度来进行。阳离子交换色谱的评价结果见图12。

其结果如图12所示，通过将恒定区由IgG1变换成IgG2，异质性增大；但通过将恒定区变换成SKSC，异质性大幅降低。另一方面，当恒定区为SC时，与恒定区为SKSC时的情形一样，异质性大幅降低，但当恒定区为CS时，异质性没有得到充分改善。

通常，为了开发抗体作为药品，除了希望异质性少以外，还希望具有高稳定性，以制备稳定的制剂。因此，作为稳定性的评价方法，利用差示扫描量热法(DSC)测定热变性中间温度(Tm值)来进行评价(VP-DSC、Microcal社制)。热变性中间温度(Tm值)是稳定性的指标，为了制备稳定的制剂作为药品，希望热变性中间温度(Tm值)高(JPharm Sci.2008 Apr；97(4)：1414-26.)。于是，将huPM1-IgG1、huPM1-IgG2、huPM1-SC、huPM1-CS、huPM1-SKSC用20mM乙酸钠、150mM NaCl、pH6.0的溶液进行透析(EasySEP；TOMY)，在约0.1mg/mL的蛋白浓度下以1℃/分钟的升温速度在40℃～100℃之间进行DSC测定。所得的DSC变性曲线见图13，Fab部分的Tm值如以下的表17所示。

[表17]

huPM1-IgG1和huPM1-IgG2的Tm值几乎同等，均为约94℃左右(IgG2约低1℃)；相对于此，huPM1-SC和huPM1-CS的Tm值为约86℃，与huPM1-IgG1和huPM1-IgG2相比，Tm值明显降低。另一方面，huPM1-SKSC的Tm值为约94℃，与huPM1-IgG1和huPM1-IgG2几乎同等。与IgG2相比，huPM1-SC和huPM1-CS的稳定性明显低，由此认为：为了以药品形式进行开发，优选CH1结构域的半胱氨酸也改变成丝氨酸的huPM1-SKSC。与IgG2相比，huPM1-SC和huPM1-CS的Tm值大幅下降，认为其原因在于huPM1-SC和huPM1-CS在二硫键构象方面不同于IgG2。

比较DSC变性曲线时，huPM1-IgG1和huPM1-SKSC的Fab部分的变性峰窄，相对于此，与上述变性峰相比，huPM1-SC和huPM1-CS的Fab部分的变性峰宽，确认huPM1-IgG2在Fab部分的变性峰的低温侧出现肩峰。认为当DSC的变性峰为单一成分时，通常显示出窄变性峰，而当存在Tm不同的多种成分(即异质性)时，变性峰变宽。即，huPM1-IgG2、huPM1-SC和huPM1-CS中存在多种成分，暗示huPM1-SC和huPM1-CS可能没有充分降低天然型IgG2的异质性。由此认为：野生型IgG2的异质性不仅与铰链部分的半胱氨酸有关，还与存在于CH1结构域的半胱氨酸有关，为了降低DSC上的异质性，不仅必需改变铰链部分的半胱氨酸，还必需改变CH1结构域的半胱氨酸。如上所述，通过不仅改变铰链部分的半胱氨酸、还改变CH1结构域的半胱氨酸，首次有可能与天然型IgG2具有同等的稳定性。

根据上述结果认为：作为降低来自IgG2铰链区的异质性的恒定区，只将铰链部分的半胱氨酸取代成丝氨酸的恒定区SC和CS，从异质性和稳定性的角度考虑并不充分，并发现：通过将存在于CH1结构域的EU编号第131位的半胱氨酸也取代成丝氨酸，首次可以在维持与IgG2同等的稳定性的同时大幅降低异质性。这样的恒定区的例子有SKSC。

[参考例8]Fcγ受体非结合的最优化恒定区M14的制作和评价

IgG2恒定区的Fcγ受体结合位点中，EU编号第233、234、235、236位是非结合型，而Fcγ受体结合位点中EU编号第327、330、331位是不同于非结合型IgG4的序列，所以必需将EU编号第327、330、331位的氨基酸改变成IgG4的序列(Eur J Immunol.1999 Aug；29(8)：2613-24中的G2Δa)。但是，IgG4中EU编号第339位的氨基酸是丙氨酸，而IgG2中是苏氨酸，所以只将EU编号第327、330、331位的氨基酸改变成IgG4的序列，就可出现能够形成天然不存在的T细胞表位肽的9个氨基酸的新型肽序列，产生免疫原性风险。于是发现：除上述修饰外，通过将IgG2的EU编号第339位的苏氨酸取代成丙氨酸可以防止新的肽序列的出现。除了导入上述突变外，还导入了下述突变：提高IgG2在酸性条件下的稳定性的、IgG2中EU编号第397位的甲硫氨酸取代成缬氨酸的突变。并且，参考例7中制作的改善来自铰链区二硫键的异质性的SKSC(SEQ ID NO：62)，随着导入第131位和第133位的突变，出现能够形成天然不存在的T细胞表位肽的9个氨基酸的新型肽序列，产生免疫原性风险，所以通过导入EU编号第137位的谷氨酸取代成甘氨酸的突变、第138位的丝氨酸取代成甘氨酸的突变，使第131位～第139位附近的肽序列与IgG1相同。制成导入了上述所有突变的恒定区序列M14(SEQ ID NO：129)。

H链使用huPM1-M14、L链使用huPM1-L(SEQ ID NO：162)的huPM1-M14的表达、纯化按照参考例7所示的方法进行。利用阳离子交换色谱，按照参考例7所示的方法评价制作的huPM1-M14(SEQ IDNO：163)和huPM1-IgG1、huPM1-IgG2的异质性。

如图14所示，与huPM1-SKSC同样，在huPM1-M14中异质性也有所减少。

[参考例9]降低H链C末端侧的异质性、提高药物动力学的huPM1-M58的制作

huPM1-M58分子的制作

huPM1是IgG1抗体。作为IgG抗体的H链C末端序列的异质性，有人报道了：由C末端氨基酸的赖氨酸残基的缺失和C末端的2个氨基酸甘氨酸和赖氨酸的缺失引起的C末端氨基的酰胺化(AnalBiochem.2007Jan 1；360(1)：75-83.)。在huPM1中，其主要成分也是存在于核苷酸序列上的C末端氨基酸的赖氨酸在翻译后通过修饰而缺失的序列，残留有赖氨酸的副成分和由甘氨酸、赖氨酸两者的缺失引起的C末端氨基的酰胺化的副成分也以异质性的形式存在。难以在维持目标物质/相关物质的异质性的制造间差的同时作为药品进行大量制造，且成本增加，希望尽可能是单一物质。在开发抗体作为药品时，希望减少上述异质性。因此，以药品形式进行开发时，希望不存在H链C末端的异质性。此外，为了减少抗体的给药量，希望延长抗体的血浆中半减期。

于是，为了制作降低H链C末端侧的异质性、药物动力学较huPM1-IgG1有所改善、且在不降低稳定性的情况下减少来自野生型IgG2的异质性的新型恒定区，导入了以下的改变。

具体而言，在具有高稳定性且与IgG2同种型的恒定区的抗体有关的上述异质性有所减少的huPM1-SKSC中，EU编号第137位的谷氨酸被取代成甘氨酸、第138位的丝氨酸被取代成甘氨酸、第268位的组氨酸被取代成谷氨酰胺、第355位的精氨酸被取代成谷氨酰胺、第419位的谷氨酰胺被取代成谷氨酸，为了降低H链C末端的异质性除了上述取代以外使第446位的甘氨酸和第447位的赖氨酸缺失，由此得到了huPM1-M58(SEQ ID NO：164)。H链使用huPM1-M58、L链使用huPM1-L(SEQ ID NO：162)的huPM1-M58的表达、纯化按照实施例4所述的方法进行。

对于制作的huPM1-M58、huPM1-IgG1和huPM1-IgG2，按照实施例5所述的方法，利用阳离子交换色谱评价异质性，利用DSC评价稳定性。

DSC的结果见表18。如图13和图16所示，与huPM1-SKSC同样，在huPM1-M58中，在不损及稳定性的情况下异质性也有所减少。

[表18]

huPM1-M58的血浆中滞留性评价

IgG分子的血浆中滞留性长(消除慢)，这是由于作为IgG分子的补救受体而已知的FcRn在起作用(Nat Rev Immunol.2007 Sep；7(9)：715-25)。通过胞饮作用进入核内体中的IgG分子，其在核内体内的酸性条件下(pH6.0附近)与在核内体内表达的FcRn结合。未能与FcRn结合的IgG分子进入溶酶体内，被溶酶体分解，但与FcRn结合的IgG分子向细胞表面移动，在血浆中的中性条件下(pH7.4附近)自FcRn上解离，又返回到血浆中。

作为IgG型抗体，已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4同种型，有报道称，上述同种型在人体内的血浆中半衰期分别为：IgG1、IgG2的半衰期为约36天；IgG3的半衰期为约29天；IgG4的半衰期为16天(Nat Biotechnol.2007 Dec；25(12)：1369-72.)，认为IgG1和IgG2的血浆中滞留性最长。通常，抗体药物的同种型为IgG1、IgG2、IgG4，作为进一步提高上述IgG抗体的药物动力学的方法，有人报道了：通过修饰IgG恒定区的序列来提高上述的与人FcRn的结合活性的方法(J Biol Chem.2007 Jan 19；282(3)：1709-17；J Immunol.2006 Jan 1；176(1)：346-56)。

由于小鼠FcRn与人FcRn之间存在种特异性差异(Proc Natl AcadSci U S A.2006 Dec 5；103(49)：18709-14)，所以为了预测恒定区序列已进行了修饰的IgG抗体在人体内的血浆中滞留性，认为最好评价与人FcRn的结合以及评价在人FcRn转基因小鼠体内的血浆中滞留性(Int Immunol.2006 Dec；18(12)：1759-69)。

评价与人FcRn的结合

FcRn是FcRn与β2-微球蛋白的复合体。根据公开的人FcRn基因序列(J.Exp.Med.180(6)，2377-2381(1994))制作寡DNA引物。以人cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA，Clontech)为模板，使用制作的引物，通过PCR法制备编码全长基因的DNA片段。以得到的DNA片段为模板，通过PCR法扩增编码包含信号区的胞外区(Met1-Leu290)的DNA片段，之后将其插入动物细胞表达载体中(人FcRn氨基酸序列/SEQ ID NO：165)。同样，根据公开的人β2-微球蛋白基因序列(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26)，16899-16903(2002))制作寡DNA引物。以人cDNA(Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA，CLONTECH)为模板，使用制作的引物，利用PCR法制备编码全长基因的DNA片段。以所得的DNA片段为模板，通过PCR法扩增编码包含信号区的全长β2-微球蛋白(Met1-Met119)的DNA片段，之后将其插入动物细胞表达载体中(人β2-微球蛋白氨基酸序列/SEQ ID NO：166)。

可溶型人FcRn的表达按照下述程序进行。使用10％胎牛血清(Invitrogen)，利用脂质转染法，将制备的人FcRn和人β2-微球蛋白的质粒导入来自人胚肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)中。回收所得的培养上清，之后使用IgG Sepharose 6 Fast Flow(AmershamBiosciences)，按照(J Immunol.2002 Nov 1；169(9)：5171-80.)的方法进行纯化。之后，使用HiTrap Q HP(GE Healthcare)进行纯化。

评价与人FcRn的结合时使用Biacore 3000，使作为分析物的人FcRn与抗体相互作用，所述抗体与固定在传感器芯片上的蛋白L或兔抗人IgG Kappa链抗体结合。由相互作用时的人FcRn的结合量算出亲和性(KD)。具体而言，使用含有150mM NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)作为运行缓冲液，利用胺耦合法将蛋白L固定在传感器芯片CM5(BIACORE)上。之后，用含有0.02％Tween 20的运行缓冲液稀释抗体并注入，使抗体与芯片结合，之后注入人FcRn，评价抗体与人FcRn的结合活性。

计算亲和性时使用BIA评估软件。由得到的传感图求出在人FcRn注入即将结束前与抗体结合的hFcRn的量，通过稳态亲和法进行拟合，算出人FcRn与抗体的亲和性。

使用人FcRn预测评价huPM1-IgG1、huPM1-M58在人体内的血浆中滞留性

使用BIAcore来评价huPM1-IgG1和huPM1-M58与人FcRn的结合活性。如表19所示，huPM1-M58的结合活性较huPM1-IgG1大，为约1.4倍左右。

[表19]

人FcRn转基因小鼠体内的血浆中滞留性的评价

人FcRn转基因小鼠(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276+/+小鼠，Jackson Laboratories)的体内药物动力学的评价如下进行。将抗体以1mg/kg的给药量对小鼠进行静脉内单次给药，在适当的时间点采血。采集的血液立即在4℃下以15,000rpm的转速离心15分钟，得到血浆。分离的血浆在实施测定前一直保存在被设定为-20℃以下的冷库中。血浆中浓度按照ELISA法来测定。

使用人FcRn转基因小鼠预测评价huPM1-IgG1、huPM1-M58在人体内的血浆中滞留性

对huPM1-IgG1和huPM1-M58在人FcRn转基因小鼠体内的血浆中滞留性进行评价。结果如图17所示，确认到：与huPM1-IgG1相比，huPM1-M58的药物动力学有所改善。这暗示：人FcRn结合活性与在人FcRn转基因小鼠体内的血浆中滞留性相关。

[参考例10]使用Biacore测定抗原抗体反应的亲和性

使用Biacore T100(GE Healthcare)，进行抗原抗体反应的动力学分析(速度論的解析)。将rec-Protein A(ZYMED)(以下记作蛋白A)固定在传感器芯片上，将抗体捕集到该固定化蛋白A上，再以抗原作为分析物进行反应，测定抗体与抗原的相互作用。抗原使用调整成各种浓度的rhNR10。由测定中得到的传感图算出动力学参数即结合速度常数k_a(1/Ms)和解离速度常数k_d(1/s)，根据该值算出K_D(M)。使用Biacore T100评估软件1.1版(GE Healthcare Biosciences)算出各参数。

在传感器芯片上固定蛋白A

利用胺耦合法，将蛋白A固定在传感器芯片CM5(GE HealthcareBiosciences)的所有流式细胞(flow cell)上。运行缓冲液使用HBS-EP+(10mM HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v表面活性剂P20)，以10μL/分钟的流速进行实验。使用75mg/mL EDC(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐)与11.5mg/mL NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的1∶1的100μL混合液，将传感器芯片上的羧甲基葡聚糖的羧基活化，向其中通入用10mM乙酸缓冲液(pH4.5)制备成50μg/mL的蛋白A，进行反应。之后，通入100μL 1M的乙醇胺盐酸盐(pH8.5)，将未反应的活性基团钝化。最终固定量为约4000-5000RU。所有实验均在25℃下进行。

蛋白A上捕集的抗体与rhNR10的抗原抗体反应的亲和性测定

运行缓冲液使用HBS-EP+。将各抗体调整成0.25μg/mL、或者约100RU与蛋白A结合。用作分析物的rhNR10用HBS-EP+制成0、38.5、77.0、154nM或0、19.25、77.01nM。测定时，首先，将抗体溶液捕集到蛋白A上，再以20μL/分钟的流速使分析物溶液反应3分钟，之后切换成HBS-EP+，测定解离相5分钟。解离相的测定结束后，用10mM甘氨酸-HCl(pH1.5)清洗，使传感器芯片再生。根据所得的传感图，使用Biacore专用的数据分析软件即Biacore T100评估软件1.1版进行动力学的分析。

产业实用性

由本发明人获得的抗NR10抗体对NR10显示出有效的中和活性，例如可以作为炎症性疾病的治疗药。

Claims

1.以下(1)～(20)中任一项所述的抗体可变区或抗体：

(1)重链可变区H17，其中包含SEQ ID NO：196记载的CDR1、SEQ IDNO：197记载的CDR2、SEQ ID NO：11记载的CDR3；

(2)重链可变区H19，其中包含SEQ ID NO：176记载的CDR1、SEQ IDNO：197记载的CDR2、SEQ ID NO：11记载的CDR3；

(3)重链可变区H28、H42，其中包含SEQ ID NO：196记载的CDR1、SEQ ID NO：197记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(4)重链可变区H30、H44，其中包含SEQ ID NO：9记载的CDR1、SEQ ID NO：197记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(5)重链可变区H34、H46，其中包含SEQ ID NO：176记载的CDR1、SEQ ID NO：197记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(6)重链可变区H57、H78，其中包含SEQ ID NO：9记载的CDR1、SEQ ID NO：198记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(7)重链可变区H71、H92，其中包含SEQ ID NO：176记载的CDR1、SEQ ID NO：198记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(8)重链可变区H97、H98，其中包含SEQ ID NO：9记载的CDR1、SEQ ID NO：199记载的CDR2、SEQ ID NO：184记载的CDR3；

(9)轻链可变区L11，其中包含SEQ ID NO：200记载的CDR1、SEQ IDNO：170记载的CDR2、SEQ ID NO：193记载的CDR3；

(10)轻链可变区L12，其中包含SEQ ID NO：201记载的CDR1、SEQID NO：170记载的CDR2、SEQ ID NO：193记载的CDR3；

(11)轻链可变区L17，其中包含SEQ ID NO：202记载的CDR1、SEQID NO：170记载的CDR2、SEQ ID NO：193记载的CDR3；

(12)轻链可变区L50，其中包含SEQ ID NO：203记载的CDR1、SEQID NO：170记载的CDR2、SEQ ID NO：193记载的CDR3；

(13)抗体，该抗体包含(3)的重链可变区和(11)的轻链可变区；

(14)抗体，该抗体包含(4)的重链可变区和(11)的轻链可变区；

(15)抗体，该抗体包含(5)的重链可变区和(11)的轻链可变区；

(16)抗体，该抗体包含(6)的重链可变区和(11)的轻链可变区；

(17)抗体，该抗体包含(7)的重链可变区和(11)的轻链可变区；

(18)抗体，该抗体包含(8)的重链可变区和(12)的轻链可变区；

2.以下(1)～(32)中任一项所述的抗体可变区或抗体：

(1)重链可变区H17，其中具有SEQ ID NO：204记载的氨基酸序列；

(2)重链可变区H19，其中具有SEQ ID NO：205记载的氨基酸序列；

(3)重链可变区H28，其中具有SEQ ID NO：206记载的氨基酸序列；

(4)重链可变区H30，其中具有SEQ ID NO：207记载的氨基酸序列；

(5)重链可变区H34，其中具有SEQ ID NO：208记载的氨基酸序列；

(6)重链可变区H42，其中具有SEQ ID NO：209记载的氨基酸序列；

(7)重链可变区H44，其中具有SEQ ID NO：210记载的氨基酸序列；

(8)重链可变区H46，其中具有SEQ ID NO：211记载的氨基酸序列；

(9)重链可变区H57，其中具有SEQ ID NO：212记载的氨基酸序列；

(10)重链可变区H71，其中具有SEQ ID NO：213记载的氨基酸序列；

(11)重链可变区H78，其中具有SEQ ID NO：214记载的氨基酸序列；

(12)重链可变区H92，其中具有SEQ ID NO：215记载的氨基酸序列；

(13)重链可变区H97，其中具有SEQ ID NO：216记载的氨基酸序列；

(14)重链可变区H98，其中具有SEQ ID NO：217记载的氨基酸序列；

(15)轻链可变区L11，其中具有SEQ ID NO：218记载的氨基酸序列；

(16)轻链可变区L12，其中具有SEQ ID NO：219记载的氨基酸序列；

(17)轻链可变区L17，其中具有SEQ ID NO：220记载的氨基酸序列；

(18)轻链可变区L50，其中具有SEQ ID NO：221记载的氨基酸序列；

(19)抗体H28L17，该抗体含有(3)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(20)抗体H30L17，该抗体含有(4)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(21)抗体H34L17，该抗体含有(5)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(22)抗体H42L17，该抗体含有(6)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(23)抗体H44L17，该抗体含有(7)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(24)抗体H46L17，该抗体含有(8)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(25)抗体H57L17，该抗体含有(9)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(26)抗体H71L17，该抗体含有(10)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(27)抗体H78L17，该抗体含有(11)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(28)抗体H92L17，该抗体含有(12)的重链可变区和(17)的轻链可变区；

(29)抗体H97L50，该抗体含有(13)的重链可变区和(18)的轻链可变区；

(30)抗体H98L50，该抗体含有(14)的重链可变区和(18)的轻链可变区；

3.权利要求1或2所述的抗NR10抗体，该抗体是人源化抗体。

4.以下(1)～(32)中任一项所述的抗体重链、抗体轻链或抗体：

(1)重链H17，其中具有SEQ ID NO：222记载的氨基酸序列；

(2)重链H19，其中具有SEQ ID NO：223记载的氨基酸序列；

(3)重链H28，其中具有SEQ ID NO：224记载的氨基酸序列；

(4)重链H30，其中具有SEQ ID NO：225记载的氨基酸序列；

(5)重链H34，其中具有SEQ ID NO：226记载的氨基酸序列；

(6)重链H42，其中具有SEQ ID NO：227记载的氨基酸序列；

(7)重链H44，其中具有SEQ ID NO：228记载的氨基酸序列；

(8)重链H46，其中具有SEQ ID NO：229记载的氨基酸序列；

(9)重链H57，其中具有SEQ ID NO：230记载的氨基酸序列；

(10)重链H71，其中具有SEQ ID NO：231记载的氨基酸序列；

(11)重链H78，其中具有SEQ ID NO：232记载的氨基酸序列；

(12)重链H92，其中具有SEQ ID NO：233记载的氨基酸序列；

(13)重链H97，其中具有SEQ ID NO：234记载的氨基酸序列；

(14)重链H98，其中具有SEQ ID NO：235记载的氨基酸序列；

(15)轻链L11，其中具有SEQ ID NO：236记载的氨基酸序列；

(16)轻链L12，其中具有SEQ ID NO：237记载的氨基酸序列；

(17)轻链L17，其中具有SEQ ID NO：238记载的氨基酸序列；

(18)轻链L50，其中具有SEQ ID NO：239记载的氨基酸序列；

(19)抗体H28L17，该抗体包含(3)的重链和(17)的轻链；

(20)抗体H30L17，该抗体包含(4)的重链和(17)的轻链；

(21)抗体H34L17，该抗体包含(5)的重链和(17)的轻链；

(22)抗体H42L17，该抗体包含(6)的重链和(17)的轻链；

(23)抗体H44L17，该抗体包含(7)的重链和(17)的轻链；

(24)抗体H46L17，该抗体包含(8)的重链和(17)的轻链；

(25)抗体H57L17，该抗体包含(9)的重链和(17)的轻链；

(26)抗体H71L17，该抗体包含(10)的重链和(17)的轻链；

(27)抗体H78L17，该抗体包含(11)的重链和(17)的轻链；

(28)抗体H92L17，该抗体包含(12)的重链和(17)的轻链；

(29)抗体H97L50，该抗体包含(13)的重链和(18)的轻链；

(30)抗体H98L50，该抗体包含(14)的重链和(18)的轻链；

5.药物组合物，其中含有权利要求1～4中任一项所述的抗体。

6.权利要求5所述的药物组合物，该药物组合物是炎症性疾病治疗药。