CN101875700B

CN101875700B - 一种增加促胰岛素分泌肽融合蛋白生物活性的方法

Info

Publication number: CN101875700B
Application number: CN2010101424366A
Authority: CN
Inventors: 杨建良; 余传信; 王斯靖; 高琪
Original assignee: WUXI HEBANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd; Jiangsu Institute of Parasitic Diseases
Current assignee: WUXI HEBANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd; Jiangsu Institute of Parasitic Diseases
Priority date: 2010-04-09
Filing date: 2010-04-09
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2030-04-09
Also published as: CN101875700A

Abstract

一种增加促胰岛素分泌肽融合蛋白生物活性的方法，属于生物医药技术领域。本发明采用Exendin-4和GLP-1串联后与人血清白蛋白HSA或人免疫球蛋白Fc连接形成融合蛋白，以增加促胰岛素分泌肽融合蛋白的生物活性；该融合蛋白表示为：(Exendin-4-GLP-1)n-HSA，(GLP-1-Exendin-4)n-HSA，(Exendin-4-GLP-1)n-Fc，(GLP-1-Exendin-4)n-Fc，n为1-5。本发明制备的融合蛋白比Exendin-4-HSA或GLP-1-HSA融合蛋白具有更高的生物活性。本发明的融合蛋白可用于制备非胰岛素依赖性糖尿病及各种症状和肥胖症的治疗药物。

Description

一种增加促胰岛素分泌肽融合蛋白生物活性的方法

技术领域

本发明提供一种增加促胰岛素分泌肽融合蛋白生物活性的方法，涉及治疗非胰岛素依赖性糖尿病及肥胖症的长效药物的制备，在药学领域有良好的应用前景，属于生物医药技术领域。

背景技术

1、糖尿病

随着现代人类劳动强度显著下降和饮食习惯的改变，糖尿病的发病率迅速上升，根据WHO最新统计，全世界有糖尿病患者1.25亿，其中90％以上为II型糖尿病。糖尿病通常分为I型糖尿病和II型糖尿病两种。I型糖尿病，约占糖尿病病人总数的10％，常发生于儿童和青少年，病因是患者体内胰腺产生胰岛素的细胞已经彻底损坏，从而完全失去了产生胰岛素的功能。患者需依靠外源胰岛素存活，一旦中止胰岛素治疗则威胁生命。II型糖尿病，约占糖尿病病人总数的90％，发病年龄多数在35岁以后。II型糖尿病即非胰岛素依赖型糖尿病的确实发生机制，目前仍无定论，但推测可能受遗传及饮食失节、缺乏运动、形体肥胖、化学药物等的影响，逐渐形成的一种内分泌失衡之疾病。主要根源于胰岛之β细胞受损，致胰岛素分泌不足；或是胰岛受体障碍而不能正常利用胰岛素。随着我国国民经济的快速发展，人民生活水平不断提高，糖尿病发病率的上升及患者的低龄化现象越来越明显。上世纪70年代末，国内糖尿病的患病率还不足1％，而目前已达3％以上，2007年统计，中国糖尿病患者已有4000万人以上；据WHO最新数据预测，到2010年中国糖尿病人将增加4倍，且糖尿病人群的发展正趋于低龄化。因此防治糖尿病已是一项迫不及待的紧急任务。

2、肥胖症

肥胖，特别是上身肥胖，是世界上营养过剩的人群当中最常见的营养紊乱。大量研究证实，减轻体重可大大降低慢性疾病的危险，所述慢性疾病如糖尿病、高血压、高血脂症、冠心病和肌骨骼病。减轻体重是许多慢性疾病治疗的一个具体目标。目前帮助减轻体重的方法均不能让人完全满意。某些肥胖症患者可通过刻意调整行为来减轻体重，如改变饮食和增加运动；通过这些方法无法减轻体重的患者则可能是由于某些遗传因素，它们引起食欲增加，导致偏好高脂食物或脂肪生成代谢的倾向。因此，急需帮助减轻体重的新方法和组合物(如药物)来补充旧的方法。

3、促胰岛素分泌肽-1

促胰岛素分泌肽-1，也称类胰高血糖素样肽-1(Glucogan Like Peptide 1，简称GLP-1)是一个含37个氨基酸的短肽，GLP-1的成熟肽是由7-36个氨基酸组成，具有在血糖浓度较高情况下促进胰岛素分泌的功能。因此GLP-1在调节高血糖时不会产生低血糖副作用。又因GLP-1可以抑制食欲，减缓胃液分泌和胃排空(Nauck，1993；Gutniak et al，1992)，所以也可将其作为控制体重的药物。但GLP-1在人体内会迅速降解，在血清中的半衰期只有1-2分钟，因此无法发挥其生物学功能。研究表明，一些GLP-1的衍生物和类似物具有更好的生物活性和稳定性。例如，Amylin公司的Exenatide/Exendin-4，在人体内的半衰期为2-3小时，每天注射2次可改善血浆葡萄糖水平，同时在24周后体重也得到明显降低。但是Exenatide/Exendin-4也需要每天注射两次，仍然很不方便。N Nordisk公司的NN2211(Liraglutide)是GLP-1并连16-碳脂肪酸链，这个NN2211在体内和血浆白蛋白结合，致使血浆半衰期超过10小时，可以实现每天注射1次。

4、长效促胰岛素分泌肽融合蛋白质药物

通过将促胰岛素分泌肽与人血清白蛋白(HSA)或免疫球蛋白Fc的融合，可以产生长效促胰岛素分泌肽融合蛋白质药物。人血清白蛋白在正常生理状态下不易透过肾小球，在血清中的半衰期达14-21天，利用基因工程技术，将人血清白蛋白与具有生物活性的蛋白分子进行重组表达的融合蛋白，已经成为开发长效蛋白药物的一个重要手段。HGS公司的Albugon是GLP-1和人血清白蛋白的融合蛋白，它在猴子体内的半衰期可达3天。又如Lilly公司采用基因工程方法将GLP-1与免疫球蛋白(IgG)的Fc融合；加拿大ConjuChem公司开发研制的Exendin-4与人血清白蛋白在体外结合产生Exendin-4-HSA(CJC-1134-PC)。这些融合蛋白虽然能具备促进胰岛素分泌肽的药理特性，并延长其在体内的半衰期，但这些融合蛋白的生物活性仅为非融合的单体Exendin-4或GLP-1的1/10--1/40(等摩尔数相比)。本发明中采用基因重组技术，将Exendin-4和GLP-1串联组合后与人血清白蛋白或免疫球蛋白(IgG)的Fc进行融合，在保持Exendin-4的药理特性的基础上延长其在体内的半衰期，同时具有比单个Exendin-4或GLP-1与人血清白蛋白或免疫球蛋白(IgG)的Fc的融合蛋白(如Exendin-4-HSA，GLP-1-HSA，Exendin-4-Fc，GLP-1-Fc)具有更高的生物活性，在药学领域包括II型糖尿病及肥胖症治疗将有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于开发一类具有高活性的促胰岛素分泌肽融合蛋白，使之成为新一代治疗糖尿病和肥胖症的药物。为实现上述目的，本发明提供了一种促胰岛素分泌肽融合蛋白及其制备方法，增加该融合蛋白的生物活性。

本发明的技术方案：一种促胰岛素分泌肽融合蛋白，采用Exendin-4和GLP-1串联后与HSA或人免疫球蛋白Fc连接形成融合蛋白，以增加促胰岛素分泌肽融合蛋白的生物活性；该融合蛋白含有2个多肽区，其中第一多肽区序列由Exendin-4-GLP-1或GLP-1-Exendin-4串联序列组成，串联方式为Exendin-4的C-末端与GLP-1的N-末端或GLP-1的C-末端与Exendin-4的N-末端连接，上述串联序列可以以同一方向依次重复n次，重复数n为1-5；优先重复数为1。

上述的(Exendin-4-GLP-1)串联序列氨基酸具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与该序列有90％以上同源性；所述的(GLP-1-Exendin-4)串联序列氨基酸具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与该序列有90％以上同源性。

第二多肽区选自：

a)人血清白蛋白HSA，具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或与该序列有90％以上同源性；

或b)人免疫球蛋白Fc，具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或与该序列有90％以上同源性。

第一多肽区通过其C-末端与第二多肽区的N-末端，或者第二多肽区的C-末端和第一多肽区的N-末端连接；

该融合蛋白表示为：(Exendin-4-GLP-1)n-HSA，(GLP-1-Exendin-4)n-HSA，(Exendin-4-GLP-1)n-Fc，(GLP-1-Exendin-4)n-Fc，上述串联序列中的n代表该串联序列以同一方向依次排列的重复数，重复数n为1-5，优先为1。

例如，一项具体的与HSA连接的融合蛋白制备步骤可以概括描述如下：

制备步骤为：

(1)人血清白蛋白HSA基因克隆，获得HSA基因；

(2)Exendin-4-GLP-1基因或GLP-1-Exendin-4基因合成；

(3)Exendin-4-GLP-1与HSA基因融合或GLP-1-Exendin-4与HSA基因融合；

(4)构建Exendin-4-GLP-1/HSA的表达载体或GLP-1-Exendin-4/HSA的表达载体；

(5)含Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白或GLP-1-Exendin-4/HSA融合蛋白表达工程菌的构建；

(6)Exendin-4-GLP-1/HSA或GLP-1-Exendin-4/HSA融合蛋白的表达和纯化；

(7)Exendin-4-GLP-1/HSA或GLP-1-Exendin-4/HSA融合蛋白的活性测定。

上述步骤(1)至(7)仅描述了一种具体的该融合蛋白的制备方法，不能理解为限制本发明的范围。有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。

上述Exendin-4-GLP-1串联序列氨基酸具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与该序列有90％以上同源性。

上述GLP-1-Exendin-4串联序列氨基酸具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或与该序列有90％以上同源性。

所述的融合蛋白的核苷酸序列为融合蛋白的氨基酸序列对应的核苷酸序列或其互补核苷酸序列。

本发明还提供了一种载体，它含有上面所述核苷酸序列，一个具体的表达载体为：Exendin-4-GLP-1/HSA-pPIC9K表达载体或GLP-1-Exendin-4/HSA-pPIC9K表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，它包含上述载体。

在本发明中的术语及相关方法

术语“蛋白质”、“肽”或“多肽”可互换使用。它们指通过肽键或酰胺键连接在一起的两个或多个氨基酸的链，无论是否经过翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。

术语“第一多肽区的C-末端或与第二多肽区的N-末端连接”是指这两种多肽/蛋白质分子间的连接无任何连接多肽，这避免了因不必要的连接肽可能导致的免疫原性。连接方式可以是以第一多肽区的C-末端直接连接在第二多肽区的N-末端上，也可以是第一多肽区的N-末端直接连接在第二多肽区的C-末端上。优选连接方式是第一多肽区的C-末端直接连接在第二多肽区的N-末端。

术语“单个Exendin-4或GLP-1”。是相对于“串联序列”而言，其指单个Exendin-4或GLP-1多肽。术语“串联序列”指每个Exendin-4单体C-末端与GLP-1单体的N-末端直接连接，或者是每一个GLP-1单体的C-末端与Exendin-4单体的N-末端直接连接，串联序列可以以同一方向依次重复，重复数为1-5，优先重复数为1。

在本发明的一个较佳实施例中，本发明的所述融合蛋白具有选自氨基酸序列SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；

本发明另一方面提供了核酸序列，它具有编码上述融合蛋白的核酸序列或其互补序列。另外，本发明的核酸序列的范围内还涵盖了与相同或基本上相同的核酸序列，如有至少90％、甚至95％以上的同源性或相同性的核酸序列。

本发明的核酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。并用商品化的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA作为模板，扩增而得到有关序列，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起，将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明的融合蛋白用重组方法来制备。具体地说，将编码Exendin-4-GLP-1串联序列与HSA多肽的核酸序列直接连接，形成Exendin-4-GLP-1-HSA重组融合基因，将编码GLP-1-Exendin-4串联序列与HSA多肽的核酸序列直接连接，构成(GLP-1-Exendin-4)_n-HSA重组融合基因；采用类似方法，将编码Exendin-4-GLP-1串联序列与人免疫球蛋白Fc多肽的核酸序列直接连接，构成(Exendin-4-GLP-1)_n-Fc重组融合基因，或将编码GLP-1-Exendin-4串联序列与人免疫球蛋白Fc多肽的核酸序列直接连接，构成(GLP-1-Exendin-4)_n-Fc重组融合基因。上述串联序列中的n代表该串联序列以同一方向依次排列的重复数，重复数n为1-5，优先重复数为1。

然后，上述重组核酸序列被克隆到表达载体质粒中，选用的表达质粒载体包括适合在不同细胞宿主中表达融合蛋白的各种质粒，例如采用表达载体质粒pPIC9K(Invitrogen)，可以在市场上获得。

然后，将上述表达质粒转化到重组工程细胞宿主内，从而构建表达本发明融合蛋白的重组工程细胞宿主。这些重组工程细胞可以是来源于动物，植物，昆虫，真菌，酵母，细菌等。质粒pPIC9K适合在酵母工程菌中表达融合蛋白，因此优选的重组工程细胞宿主为酵母工程菌，例如采用毕赤酵母工程菌KM71。

本文所用的术语“转化”是指用本领域技术人员熟知的方法将含有感兴趣核酸的表达载体直接导入宿主细胞内。转化方法因宿主细胞类型而异，通常包括：电转化；采用氯化钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂转染；感染和其它方法(见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第2版，1989年)。较佳的方法是电转化方法。

随后，在适合本发明融合蛋白表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。本领域技术人员根据常规试验就能选择和确定培养基、培养温度、时间等条件。采用本领域常规检测手段，如SDS-PAGE，Western印迹等，可以检测出本发明融合蛋白的表达。最后，可用常规的蛋白分离纯化技术，进行融合蛋白的纯化，其包括离心，沉淀，过滤，层析等手段。具体地，层析方法又包括亲和法，凝胶过滤，离子交换，疏水层析，以及反向层析等。本发明提供的本发明的融合蛋白的分离纯化方法也包括上述各种方法的适当组合。

本发明也提供了一种鉴定促胰岛素分泌肽融合蛋白的生物活性的方法。具体而言，采用子HEK-293/GLP-1R细胞，GLP-1及激动剂可诱导该细胞系产生cAMP，cAMP产生量与活性呈正相关。该方法是测定融合蛋白激活GLP-1受体的能力，并与Exendin-4激活GLP-1受体的能力进行比较，从而计算出融合蛋白生物活性。

本发明的有益效果：本发明提供了一种产生本发明所述融合蛋白的方法，该方法包括提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含表达载体，在适合蛋白表达的条件下由宿主细胞产生并经分离获得融合蛋白，该融合蛋白不仅具备促胰岛素分泌肽的药理特性、延长其在体内的半衰期，同时具有比Exendin-4-HSA，GLP-1-HSA，Exendin-4-Fc，GLP-1-Fc融合蛋白具有更高的生物活性，在药学领域包括II型糖尿病及肥胖症治疗将有良好的应用前景。

附图说明

图1Exendin-4-GLP-1-HSA融合蛋白表达质粒构建策略图。

图2Exendin-4-GLP-1-HSA融合蛋白表达的SDS-PAGE电泳结果。1、蛋白质分子量标志物，2、3、4为Exendin-4-GLP-1-HSA融合蛋白表达上清液。

图3Exendin-4-GLP-1-HSA融合蛋白表达的Western印迹结果。1、蛋白质分子量标志物，2、与抗Exendin-4抗体的Western-blotting，3、与抗GLP-1抗体的Western-blotting，4、与抗HSA抗体的Western-blotting。

图4HEK-293/GLP-1R细胞经Exendin-4-GLP-1-HSA、Exendin-4-HSA、Exendin-4、HSA刺激后生物活性测定。表明Exendin-4-GLP-1-HSA融合蛋白具有激活人GLP-1受体的生物活性，显示其生物活性高于Exendin-4-HSA。

图5小鼠糖耐量试验。显示Exendin-4-GLP-1-HSA生物活性高于Exendin-4-HSA。

具体实施方式

下面以Exendin-4-GLP-1/HSA为例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献或其它已经公开发表的文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例1：人血清白蛋白HSA基因克隆，获得HSA基因

人血清白蛋白HSA基因可以通过RT-PCR获得。通过以人胚胎cDNA为模板，用PCR方法扩增HSA基因。根据HSA基因序列SEQ ID NO：5设计PCR扩增引物HSA引物1和HSA引物2。其序列如下：

HSA引物1：5’-GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCT-3’

HSA引物2：5’-GCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3’。

划线部分为NotI酶切点。

PCR反应体系为：人胚胎cDNA：1μL；HSA引物1：50μM、1μL；HSA引物2：50μM、1μL；10×pfu聚合酶缓冲液5μL；MgCl₂：25mM、5μL；dNTP：2mM、4μL；pfu聚合酶1μL；ddH₂O：补足到总的反应体系为50μL。

PCR反应条件为：94℃、2min；然后，94℃、30sec；55℃、30sec；72℃、90sec，共进行30个循环。用1％的琼脂糖胶对PCR产物进行凝胶电泳，在紫外灯下切下1800bp左右的目的DNA条带，再用PROMEGA公司的PCR产物胶回收试剂盒回收HSA基因片段。采用紫外分光光度法测定回收产物的浓度后，-20℃保存。

实施例2：Exendin-4-GLP-1基因合成

按照SEQ ID NO：6的要求，由上海英俊生物技术有限公司合成Exendin-4-GLP-1的基因序列，并使其3′端带上一段HSA基因的5′端序列。

实施例3：Exendin-4-GLP-1与HSA基因融合

本实施例以Exendin-4-GLP-1基因和HSA基因融合形成Exendin-4-GLP-1/HSA融合基因为例，说明融合基因的克隆方法。本方法也适合HSA基因与其它基因形成融合基因的克隆。

根据SEQ ID NO：6，设计合成一条引物：

EXT 1：5′-TTTACGTACACGGTGA AGGTACTTTCACT-3′

划线部分为SnaB1酶切点。

融合蛋白基因的制备使用Overlap PCR的反应方法获得。具体如下。

Overlap PCR的反应体系为：Exendin-4-GLP-1DNA：2μL；HSA DNA：2μL；10×pfu聚合酶缓冲液5μL；25mM的MgC1₂5μL；2mM的dNTP 4μL；pfu聚合酶1μL；ddH₂O补足到总的反应体系为50μL。

PCR条件为：开始，94℃、2min；然后，94℃、30sec；55℃、30sec；72℃、2min；一共5个循环。然后，加入50μM引物EXT1：2μL和50μM HSA引物2：2μL。进入下个程序：94℃、30sec；55℃、30sec；72℃、2min；一共30个循环。

然后用常用的分子生物学方法，分离获得融合基因克隆。采用1％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，从电泳胶上切下分子量在1900bp左右的DNA条带，再用PROMEGA公司的PCR产物胶回收试剂盒回收Exendin-4-GLP-1/HSA融合基因片段。

实施例4：Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白表达载体Exendin-4-GLP-1/HSA-pPIC9K的构建

以下以Exendin-4-GLP-1/HSA融合基因为例，说明表达载体的构建。

本实验采用pPIC9K为表达质粒，其构建方法为常用分子生物学方法。即，通过培养含有表达载体的菌种，提取获得该质粒。制备好的质粒-20℃保存待用。

为了将Exendin-4-GLP-1/HSA融合基因连接到pPIC9K表达质粒中，先用SnaB1和Not1限制性内切酶对表达质粒pPIC9K和Exendin-4-GLP-1/HSA融合基因进行双酶切。具体条件如下。

37℃恒温水浴锅内反应3小时，酶切体系如下：

Exendin-4-GLP-1/HSA融合基因的酶切体系：Exendin-4-GLP-1/HSA DNA：10μL；SnaB1：1μL；Not1：1μL；NEBuffer2：5μL；ddH₂O补足到总反应体积50μL。

pPIC9K的酶切体系：表达质粒pPIC9K DNA：10μL；SnaB1：1μL；Not1，1μL；NEBuffer2：5μL；ddH₂O补足到总反应体积50μL。

然后用常用的分子生物学方法，分离获得经双酶切的Exendin-4-GLP-1/HSA融合基因以及经双酶切的pPIC9K质粒DNA。具体是用1％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳，切下目的条带，再用PROMEGA公司的PCR产物胶回收试剂盒回收经双酶切的Exendin-4-GLP-1/HSA融合基因片段，以及pPIC9K质粒DNA片段。

然后，对酶切产物进行连接，获得Exendin-4-GLP-1/HSA融合基因表达载体Exendin-4-GLP-1/HSA-pPIC9K。具体如下：总的连接体系为10μL，包括T4DNA连接酶缓冲液1μL，双酶切的Exendin-4-GLP-1/HSA基因DNA：2μL，双酶切表达质粒pPIC9K DNA：2μL，T4DNA连接酶1μL，无菌水补足至10μL。16℃恒温水浴保温过夜。

连接产物转化感受态DH5α细胞。取一管感受态DH5α细胞加入连接产物，轻柔混匀后冰上放置30min，再在42℃水浴放置2min。加入500μL LB液体培养基在37℃180r/min摇40min。取100μL转化液涂于卡那抗性的LB固体培养基，37℃倒置培养12-16小时。

阳性克隆的鉴定是通过挑取单个转化子菌落，抽提质粒，进行酶切分析和测序结果来确定。

实施例5：含Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白表达工程菌的构建

本实施例利用电转化方法和融合表达载体(Exendin-4-GLP-1/HSA-pPIC9K)为例，构建表达Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白的工程菌。具体方法如下。

首先挑选含有Exendin-4-GLP-1/HSA-pPIC9K表达载体的细菌进行克隆，提取表达载体DNA，提取方法为常用的分子生物学方法。然后，用电转化的方法把质粒转入毕赤酵母KM27。电转化方法具体如下：先进行菌体的准备。挑取毕赤酵母KM27单菌落，接种至含有5mLYPD培养基的50mL三角瓶中，30℃、250-300r/min培养过夜。然后取100-500μL的培养物接种至含有500mL新鲜YPD培养基的2L三角摇瓶中，28～30℃、250-300r/min培养过夜，至OD₆₀₀达到11.5。再将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。离心后，再用250mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。再离心，用20mL的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。再离心，用1mL的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5mL。

然后用电击方法进行转化。具体如下：将5～20μg表达质粒Exendin-4-GLP-1/HSA-pPIC9K的DNA溶解于5～10μL Tris缓冲液中，与80μL的上述步骤所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中。将电转化杯冰浴5min。然后根据相应的电转化仪，采用优化的电压、电流、电容等参数，进行电击。电击完毕后，加入1mL冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5mL的Eppendorf管中，将菌体悬液涂布于山梨醇平板上，每200～600μL涂布一块平板。将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。

实施例6：Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白的表达和纯化

实施例5中构建的Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白表达工程菌，可以用以下的方法表达融合蛋白：将Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白表达酵母菌种接种于500mL的BMGY培养基(蛋白胨2％，酵母提取物1％，甘油1％，YNB 1.34％，D-biotin 4×10^-5％，用0.1M的磷酸钾缓冲液调pH至6)中，摇床30℃、180r/min，培养48小时。然后，5升YP(蛋白胨2％，酵母提取物1％)的发酵罐中，高压灭菌30min，冷却后加入除菌后的YNB 1.34％，D-biotin 4×10^-5％和甲醇1％配成BMMY培养基。将预培养的菌液接种至BMMY中，发酵过程控温在30℃，溶氧始终大于20％的饱和度，pH控制在5.5-6左右，每24h补加1％甲醇，连续发酵5天。利用常用的重组蛋白分离方法，获得以上酵母所表达的融合蛋白初提物。具体地，可以利用离心，超滤浓缩等方法。然后，可以利用层析方法，进一步纯化融合蛋白。具体地，可以采用Sepharose SP XL层析柱用于融合蛋白的捕获，再利用Butyl Sepharose FF层析柱，以及DEAE Sepharose FF层析柱，进行更高的纯化。

融合蛋白表达和纯化结果通过常用的蛋白分析方法进行鉴定，包括但不限制于SDS-PAGE，Western印迹等方法。图2为Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳，结果显示71KDa左右的蛋白质条带，Western印迹方法证明该蛋白质条带具有Exendin-4，GLP-1，HSA抗原性，证明表达的蛋白质为Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白，如图3所示。

实施例7：Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白的活性

本实施例中采用HEK-293/GLP-1R细胞体外测定方法对HSA/GLP-1融合蛋白进行活性测定，GLP-1及激动剂可诱导该细胞系产生cAMP，cAMP产生量与活性呈正相关。具体是测定Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白激活GLP-1受体的能力，并与Exendin-4-HSA激活GLP-1受体的能力进行比较。具体方法如下：按20,000至40,000细胞/孔(96孔黑亮底平板)的量，接种HEK-293/GLP-1R细胞，培养1天后换用无血浆培养15-20小时后分别加人不同浓度的Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白，Exendin-4或HSA，培育2h后测定每孔细胞的cAMP含量(AB公司cAMP-Screen system，ELISA Kit)，结果表明Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白比Exendin-4-HSA融合蛋白具有更高的生物活性，结果见图4。

实施例8：小鼠耐糖试验

C57BL/6J小鼠禁食过夜(15小时)后按每公斤小鼠体重腹腔内分别注射Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白0.2mg，或Exendin-4-HSA融合蛋白0.2mg。1h后再在小鼠腹腔内按每公斤小鼠体重注射葡萄糖2mg/kg小鼠体重，在不同的时间段取血样测定其葡萄糖含量，结果显示Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白比Exendin-4-HSA融合蛋白具有更明显降低小鼠血糖的效果，如图5所示。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。

序列表

<210>SEQ ID NO：1

<211>69

<212>PRT

<213>Exendin-4-GLP-1

<400>1

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu

5 10 15

Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly

20 25 30

Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser His Gly Glu Gly Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu

50 55 60

Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

65 69

<210>SEQ ID NO：2

<211>69

<212>PRT

<213>GLP-1-exendin-4

<400>2

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu

1 10 15

Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu

35 40 45

Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly

50 55 60

Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

65 69

<210>SEQ ID NO：3

<211>585

<212>PRT

<213>HSA

<400>3

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly

5 10 15

Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr

20 25 30

Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu

35 40 45

Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu

5 05 560

Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys

65 70 75

Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys

80 85 90

Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His

95 100 105

Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val

110 115 120

Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu

125 130 135

Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr

140 145 150

Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe

155 160 165

Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro

170 175 180

Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys

185 190 195

Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala

200 205 210

Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys

215 220 225

Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp

245 250 255

Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser

260 265 270

Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu

275 280 285

Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala

290 295 300

Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val

305 310 315

Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe

320 325 330

Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu

335 340 345

Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys

350 355 360

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp

365 370 375

Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln

380 385 390

Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn

395 400 405

Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr

410 415 420

Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser

425 430 435

Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu

440 445 450

Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu

455 460 465

Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu

485 490 495

Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His

500 505 510

Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys

515 520 525

Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr

530 535 540

Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val

545 550 555

Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu

560 565 570

Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

575 580 585

<210>SEQ ID NO：4

<211>223

<212>PRT

<213>IgG Fc

<400>4

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

5 10 15

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

20 25 30

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

35 40 45

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

Hi s Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

65 70 75

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

80 85 90

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

95 100 105

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

110 115 120

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

125 130 135

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

140 145 150

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

155 160 165

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Pro Phe

170 175 180

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

185 190 195

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

200 205 210

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

215 220 223

<210>SEQ ID NO：5

<211>1758

<212>DNA

<213>HSA

<400>5

gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcga tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60

gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120

aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180

aat1gtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240

cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300

tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360

gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420

gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480

tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540

aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600

gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660

cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720

gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780

gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840

aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900

gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960

gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020

tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc 1080

tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140

gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200

tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260

ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320

cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380

tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc 1440

ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500

gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560

agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620

aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680

gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740

gctgccttag gcttataa 1758

<210>SEQ ID NO：6

<211>207

<212>DNA

<213>Exendin-4-GLP-1

<400>6

cacggtgaag gtactttcac ttctgatttg tctaagcaaa tggaagaaga agctgttaga 60

ttgttcattg aatggttgaa gaacggtggt ccatcttctg gtgctccacc accatctcac 120

ggtgaaggta ctttcacttc tgatgtttct tcttacttgg aaggtcaagc tgctaaggaa 180

ttcattgctt ggttggttaa gggtaga 207

Claims

1.一种促胰岛素分泌肽融合蛋白，其特征在于采用Exendin-4和GLP-1串联后与人血清白蛋白HSA连接形成融合蛋白，以增加促胰岛素分泌肽融合蛋白的生物活性；该融合蛋白含有2个多肽区，其中第一多肽区序列由Exendin-4-GLP-1串联序列组成，串联方式为Exendin-4的C-末端与GLP-1的N-末端连接；

第二多肽区选自：人血清白蛋白HSA；

第一多肽区通过其C-末端与第二多肽区的N-末端连接；

该融合蛋白表示为：Exendin-4-GLP-1-HSA。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于Exendin-4-GLP-1串联序列氨基酸为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于第二多肽区选自：

人血清白蛋白HSA，为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

4.一种权利要求1所述的促胰岛素分泌肽融合蛋白的制备方法，其特征在于制备步骤为：

(1)人血清白蛋白HSA基因克隆，即SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列克隆，获得HSA基因；

(2)Exendin-4-GLP-1基因，即SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列基因合成；

(3)Exendin-4-GLP-1与HSA基因融合；

(4)构建Exendin-4-GLP-1/HSA的表达载体；

(5)含Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白表达工程菌的构建；

(6)Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白的表达和纯化；

(7)Exendin-4-GLP-1/HSA融合蛋白的活性测定。