CN102533655A - 高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的CHO-S细胞株及其建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的细胞株CHO-S，通过将带有人源GLP1/Fc基因的质粒转染至CHO-S细胞，经筛选后，获得稳定、高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的CHO-S(GLP1/Fc)单克隆细胞株。本发明获得的CHO-S(GLP1/Fc)单克隆细胞株分泌产生GLP1/Fc融合蛋白，GLP1/Fc融合蛋白直接作用于GLP-1受体，促进胰脏β-细胞再生，分泌胰岛素和葡萄糖耐受性，促进β-细胞的生长，增加β-细胞的数量，能使II型糖尿病人的β-细胞功能恢复到正常水平。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的CHO-S细胞株及其建立方法。
背景技术
糖尿病是造成人类死亡的主要原因之一，严重危及人类健康。国际糖尿病联盟公布的世界卫生组织对糖尿病发病现状和发展趋势的最新预测显示，全球已经诊断的II型糖尿病患者已达一亿三千万人。本世纪糖尿病将在中国、印度等发展中国家流行。到2025年，全球糖尿病患者人数将突破三亿，中国的糖尿病患者总数将占其中三分之一。截至目前，中国的糖尿病患者人数已经超过五千万，并以年增加5-6％的速率增长。
I型糖尿病和II型糖尿病是糖尿病的两种主要形式。I型和II型糖尿病人都表现有进行性的胰岛β-细胞质量减少和β-细胞功能的降低，而β-细胞的程序性死亡是I型和II型糖尿病胰岛细胞的主要原因。胰岛素疗法是治疗I型糖尿病的主要手段。II型糖尿病占糖尿病患者的比率约为90-95％。
I型糖尿病人的治疗方式主要是给予胰岛素注射或胰岛移植。对于II型糖尿病人来说，使用胰岛素增敏剂和胰岛素分泌促进素是主要的药物治疗方式。
传统的糖尿病的治疗仅侧重于缓解如高血糖等主要症状，而不是针对II型糖尿病真正的发病原因。国际上目前的主流观点认为，糖尿病发病的真正原因是胰岛细胞的程序性死亡。
现已证实多种激素可以促进β-细胞生长，包括生长因子、胰岛素样生长因子、催乳素、表皮生长因子和最近发现的肠胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种肠促胰岛素，它具有促进胰岛素分泌，抑制胰升糖素释放，抑制胃排空的作用。其重要的功能是促进β-细胞的生长，增加β-细胞的数量，能使II型糖尿病人的β-细胞功能恢复到正常水平。
GLP-1的另外一个优点是它降血糖作用是葡萄糖依赖性的，因此不会产生低血糖。在这一点上甚至优于胰岛素。此外，它还能改善机体胰岛素抵抗及改善机体血脂水平。研究显示GLP-1也可能对I型糖尿病患者有效。比如能减少对外源胰岛素的用量。由于GLP-1在体内的半衰期很短(约1分钟)，因此，致力寻找具有GLP-1同样作用的长效类似物(肠降糖素类似物)是近几年国际药界的关注热点。
GLP1/Fc融合蛋白主要特点是半衰期更长，功效更强。实验已证明其注射一次可维持药效4-6周，具有很强的竞争优势。由于它的二聚体结构的特点可显著加强同为二聚体的GLP-1受体的亲和力，使药效更强。该融合蛋白直接作用于GLP-1受体，促进胰脏β-细胞再生，分泌胰岛素和葡萄糖耐受性，激活cAMP和其耦联的第二信使途径，促进β-细胞中蛋白激酶(Akt1和MAPK)的表达并增加其含量，降低细胞凋亡的关键酶caspase-3的活性。因此该融合蛋白能够从根本上预防和治疗I型和II型糖尿病。
基因重组技术的建立为生产治疗用蛋白开辟了新途径。由于原核细胞外源基因表达系统自身的局限性难以克服，真核细胞外源基因表达系统广泛应用于表达需要翻译后修饰的生物活性蛋白，特别是哺乳动物表达系统具有准确的转录后修饰功能，与原核细胞表达系统和酵母细胞表达系统比，表达的糖基化蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子，是目前重组蛋白生产的首选体系。
在不同的哺乳动物细胞的表达系统中，CHO-S中国仓鼠卵巢细胞外源蛋白表达系统经过多年的实践运用，已经成为最成功的表达外源蛋白的哺乳动物细胞系。其优点是外源基因能够稳定整合于细胞内，且该细胞系易于规模化培养。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的细胞株CHO-S，本发明通过将带有人源GLP1/Fc基因的质粒转染至CHO-S细胞，经筛选后，获得稳定、高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的CHO-S(GLP1/Fc)单克隆细胞株。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：
高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的CHO-S细胞株，它由带有GLP1/Fc基因的pMTE2质粒载体转染至CHO-S宿主细胞中制得。
进一步的，所述CHO-S(GLP1/Fc)单克隆细胞株的目的蛋白GLP1/Fc的表达量达到9.25ug/24h·106细胞。
又进一步的，高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的CHO-S细胞株的建立方法包括以下步骤：
(1)用阳离子脂质体将pMTE2质粒载体转染至CHO-S细胞株中；
(2)用含有Hygromycin B的选择培养基筛选整合GLP1/Fc基因的稳定转染细胞株；
(3)通过Dot blot方法筛选出能够表达人源GLP1/Fc重组蛋白的阳性克隆；
(4)将得到的阳性克隆于二氧化碳培养箱中摇养，待生长至平台期时收集所分泌蛋白液；所述CHO-S细胞株在培养过程中分泌表达GLP1/Fc重组蛋白于培养基中；
(5)用Western blot方法检测收集蛋白液中GLP1/Fc的相对表达量。
再进一步的，高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的CHO-S细胞株，其用途在于制备治疗I型和II型糖尿病方面的药物中的应用。
由于采用本发明的技术方案，本发明与现有技术相比具有以下优点：CHO-S(GLP1/Fc)单克隆细胞株分泌产生GLP1/Fc融合蛋白，GLP1/Fc融合蛋白直接作用于GLP-1受体，促进胰脏β-细胞再生，分泌胰岛素和葡萄糖耐受性，促进β-细胞的生长，增加β-细胞的数量，能使II型糖尿病人的β-细胞功能恢复到正常水平。
具体实施方式
实施例1
本发明的具体制备方法描述如下：
1.实验材料：
1.1细胞系
CHO-S，中国仓鼠卵巢细胞。
1.2主要试剂
1.2.1 CD CHO无血清培养基
CD CHO培养基干粉24.3g，加入950ml灭菌水，搅拌至完全溶解，调节PH值至6.8-7.2之间，加灭菌水至1000ml，用0.22um滤膜过滤除菌，4℃保存。
1.2.2转染试剂
转染所用的试剂为Lipofectamin2000(Invitrogen公司)。
1.2.3选择培养基
在10ml液体CD CHO无血清培养基中，加入终浓度为1mg/ml的Hygromycin B。
1.2.4一抗
兔抗人IgG/HRP，使用浓度为1∶1000稀释。
2.方法和结果
2.1细胞复苏
按照常规细胞复苏方法：从细胞库中取出一支冻存细胞，迅速置于预热至37℃的恒温水浴锅中，边轻轻摇动边融化，待融化完毕后，立即消毒冻存管外壁，在生物安全柜内将细胞悬液转移至含有约6mlCD CHO无血清培养基的培养方瓶中，于36.5℃，8％二氧化碳的培养箱中进行培养。
2.2细胞扩增
待方瓶中培养的CHO-S长到80％左右时，按照1∶1的比例转移至一次性三角摇瓶中进行摇养，根据细胞生长状况，摇瓶内可不断添加新鲜培养基，最多添加至摇瓶体积的三分之一，摇养的转速根据摇瓶内液体体积进行调整，一般在60rpm-100rpm之间。待细胞生长至2-3×106个/ml时可分养。
2.3质粒载体的构建
转染所用的质粒载体由加拿大多伦多大学提供。
2.4待转染细胞的制备
将摇瓶中生长至对数期的细胞进行计数，根据计数结果将细胞分养至6孔板中，每个孔的细胞密度在8-16×105个/ml。
2.5细胞的转染
CHO-S(GLP1/Fc)细胞的转染采用脂质体法，转染所用的试剂为Lipofectamin2000(Invitrogen公司)。
2.6细胞的筛选
细胞转染24h后，更换新鲜的CD CHO选择培养基(含1mg/ml的Hygromycin B)，同时将转染细胞稀释后加入96孔板中，于37℃，8％二氧化碳中培养1～2周，中间换一次选择培养基，直至细胞克隆形成。
2.7Dot blot
细胞筛选至第十天左右，对96孔板做Dot blot实验。每个孔取1ul培养液进行点样，用封闭液室温封闭1h，后用一抗(兔抗人IgG/HRP，1∶1000稀释)室温孵育2h，用TBST缓冲液洗6次，每次5min，于暗室下用ECL进行化学发光。根据曝光情况，筛选出6个阳性克隆。
2.8对阳性克隆放大培养
将筛选出的6个阳性克隆分别进行扩养。首先分别转移至24孔板中进行培养，待铺满24孔板底部时再转移至6孔板进行培养，同时补加新鲜的CD CHO无血清培养基；长满后分别转移至一次性三角摇瓶中进行摇养，待生长至平台期，分别收获各个阳性克隆的蛋白液。
2.9Western blot
对放大培养的阳性克隆收集蛋白液，采用AKTA亲和层析提取细胞培养液中的蛋白。对提取的蛋白样品做Western blot实验，鉴定、分析其蛋白表达量。将蛋白样品经SDS-Page电泳后，转移至PVDF膜上，用含5％脱脂牛奶进行封闭1h，然后用一抗(兔抗人IgG/HRP，1∶1000稀释)室温孵育2h，用TBST缓冲液洗6次，每次5min，于暗室下用ECL进行化学发光。根据化学发光情况，计算出蛋白表达量约5.36-9.25ug/24h·106细胞。
本发明构建出能够稳定转染人源GLP1/Fc基因的哺乳动物细胞系，并通过药物筛选，获得能够稳定、高效表达该重组蛋白的单克隆细胞株。CHO-S(GLP1/Fc)单克隆细胞株的目的蛋白GLP1/Fc是一种肠促胰岛素，它具有促进胰岛素分泌，抑制胰升糖素释放，抑制胃排空的作用。重要的功能是促进β-细胞的生长，增加β-细胞的数量，能使II型糖尿病人的β-细胞功能恢复到正常水平。目的蛋白GLP1/Fc的另外一个优点是它降血糖作用是葡萄糖依赖性的，因此不会产生低血糖。
Claims (4)
1.高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的CHO-S细胞株，其特征在于它由带有GLP1/Fc基因的pMTE2质粒载体转染至CHO-S宿主细胞中制得。
2.如权利要求1所述的高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的CHO-S细胞株，其特征在于所述CHO-S(GLP1/Fc)单克隆细胞株的目的蛋白GLP1/Fc的表达量达到9.25ug/24h·106细胞。
3.如权利要求1所述的高效表达人源重组蛋白GLP1/Fc的CHO-S细胞株的建立方法，它包括以下步骤：
(1)用阳离子脂质体将pMTE2质粒载体转染至CHO-S细胞株中；
(2)用含有Hygromycin B的选择培养基筛选整合GLP1/Fc基因的稳定转染细胞株；
(3)通过Dot blot方法筛选出能够表达人源GLP1/Fc重组蛋白的阳性克隆；
(4)将得到的阳性克隆于二氧化碳培养箱中摇养，待生长至平台期时收集所分泌蛋白液；所述CHO-S细胞株在培养过程中分泌表达GLP1/Fc重组蛋白于培养基中；
(5)用Western blot方法检测收集蛋白液中GLP1/Fc的相对表达量。
4.如权利要求1或3所述的高效表达人源重组蛋白GLP/Fc的CHO-S细胞株，其用途在于制备治疗I型和II型糖尿病方面的药物中的应用。
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