CN101864430B - 小麦渐渗系抗非生物胁迫基因Tamyb31及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦渐渗系抗非生物胁迫(盐、旱等)新基因Tamyb31及含有所述基因Tamyb31的植物表达载体pStart/Tamyb31；本发明还公开了所述基因Tamyb31及含有所述基因Tamyb31的植物表达载体在培育抗非生物胁迫(盐、旱等)中的应用。实验证明，本发明所述过表达转基因植株的抗非生物胁迫(盐、旱等)能力明显提高。

Description

小麦渐渗系抗非生物胁迫基因Tamyb31及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及抗非生物胁迫基因Tamyb31及其应用。

背景技术

据有关部门预计，2010年世界人口将达到70亿，2039年将超过100亿。与此相反，世界上可供耕种土地则以每年38610方哩的速度减少。盐渍化是土地退化的一个重要原因。据统计，中国约有10％的耕地存在不同程度的盐渍化，其中大部分是由自然条件引发的，如长时间风化的岩石中Na⁺、Mg²⁺等盐离子的积累，降雨带来的盐分等。干旱也是土地退化的重要因素。干旱、半干旱区占全球陆地面积的33％，而我国则更为严重，已占全国陆地面积的38％，达5.7亿亩。

除了传统育种方法外，利用基因工程和细胞工程等新技术可以快速稳定地获得具有优良抗盐/旱能力的作物新品种。利用转基因技术将新的抗盐/旱功能基因转入到作物中，以此高效开发抗逆转基因作物新品种，用于在盐渍/干旱地区种植是一项具有广阔应用前景的技术。其前提是，必须较系统地了解植物抗逆机制，分离高效的与抗逆旱相关的基因。

多年来，有关植物抗逆机制方面的研究已取得了较大的进展，克隆了分生物胁迫相关基因，为进一步阐明植物抗逆的分子机制提供了理论线索和依据。一些实验表明，将植物本身以及其他生物中与抗旱相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的抗旱能力发生改变。用于转化的功能基因包括两类：一类基因转化后可以直接提高植物的抗逆能力，这可以通过被转基因的过量表达或诱导型表达提高植物的抗逆能力；另一类是通过抑制或诱导型抑制植株本身的组成型表达提高植物的抗逆能力。

MYB蛋白是一类非常重要的转录因子，参与植物对多种非生物胁迫的响应过程。近年来已有试验表明，拟南芥中的MYB基因可以提高拟南芥的抗逆能力，但有关小麦MYB基因在植物抗旱过程中的作用尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种抗逆基因——小麦渐渗系抗非生物胁迫基因Tamyb31及其应用。

本发明的技术方案在于从小麦体细胞杂种渐渗系山融3号中分离得到了小麦MYB等位变异基因——Tamyb31，并构建双子叶植物表达载体pSTART/Tamyb31转化模式植物拟南芥，以鉴定基因的功能并最终将该基因用于小麦等重要农作物的转化，提高农作物的抗逆性。

本发明提供的小麦渐渗系抗逆基因名称为小麦体细胞杂种渐渗系山融3号MYB基因Tamyb31，所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了含上述抗逆基因Tamyb1的植物表达载体pCAMBIA3301/Tamyb31。

本发明所述基因Tamyb31及含所述基因Tamyb1的植物表达载体pCAMBIA3301(pSTART)/Tamyb1在培育抗逆植物中的应用。其中所述植物优选是普通小麦或拟南芥。

将本发明所述基因导入植物细胞，使其在植物中过量表达就可以使转基因植物获得抗逆能力。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因Tamyb31的植物表达载体pSTART/Tamyb31进行加工，如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)等。

本发明所述的基因可广泛用于培育抗逆农作物新品种，并可为深入阐明植物抗逆机制提供理论依据。

本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦渐渗系山融3号抗非生物胁迫新基因Tamyb31，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，转基因植株的抗逆能力明显增强。据此可通过过表达策略开发和培育抗逆作物新品种。

附图说明

图1Tamyb31基因全长cDNA序列的扩增结果

其中：Maker：DNA分子量标准，λDNA/EcoRI+HindIII(下同)。

图2Tamyb31在多种处理下山融3号中的半定量RT-PCR分析，不同发育时期RT-PCR分析。

图3Tamyb31转基因拟南芥植株qPCR及southern鉴定。

其中：VC：空载体对照(下同)，3-21、4-21、6-10为Tamyb31过表达系(下同)。

图4Tamyb31转基因拟南芥植株在各种胁迫下种子的萌发率。

图5Tamyb31转基因拟南芥植株在盐/旱胁迫下表型。

图6Tamyb31转基因拟南芥植株在LiCl/KCl/Mannitol胁迫下表型

图7Tamyb31转基因拟南芥植株中胁迫标记基因的qPCR结果。

图8Tamyb31转基因小麦植株及检测。

图9pCAMBIA3301-ubi载体图。

具体实施方式

实施例1、Tamyb31的克隆

1.1山融3号RNA提取

(1)将PEG渗透胁迫处理的组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；

(2)待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入1ml Trizol提取液，剧烈振荡使样品充分裂解，室温放置5分钟；

(3)4℃，12000rpm离心15分钟；

(4)用移液器小心将上层水相转移至一个新的1.5ml的离心管中，加入200μl氯仿(chloroform)，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；

醇(1∶1体积)，充分混匀，-20℃，沉淀30min或过夜；

(5)4℃，12000rpm离心15分钟；

(6)用移液器小心将上层水相转移至一个新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1∶1体积)，充分混匀，-20℃，沉淀30min或过夜；

(7)4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

(8)RNA沉淀用1ml的75％乙醇洗涤。4℃，8000rpm离心10min收集沉淀；

(9)重复用75％乙醇洗涤一次RNA沉淀；

(10)去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适当体积(30-50μl)的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存)；

(11)紫外分光光度计及1％Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。

注：a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD＝40ug/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应接近2.0(比值最好在1.9～2.1之间)。

b)用1％Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1ul RNA加入3μl的RNase-free水，加1μl上样缓冲液65℃变性5分钟。电泳后用EB染色，另取3μl的1kbDNAMarker作为对照。

1.2cDNA 3′和5′末端第一链的快速扩增

5’和3’RACE第一链cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNAEnds，RACE)按Clonetech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit操作指南进行。1.3 Tamyb315’和3’端克隆

(1)根据基因芯片的检测结果，获得Tamyb1的部分序列并按照SMART RACE cDNAAmplification Kit操作指南设计两对基因特异引物(序列如下)：

Tamyb31-NT3：5′GAACCTCCACTGAGAAACATTACC3′

Tamyb31-NT7：5′GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC3′引物序列

Tamyb31-As：5′GATCAAGAACGTCTGGCACA 3’

Tamyb31-S：5’GAGGCCATCGAGTAGTCAGC 3’；

(2)按照SMART RACE cDNAAmplification Kit操作指南分别扩增Tamyb31的5’和3’末端；

(3)将5’和3’端序列拼接，分别在起始密码上游和终止密码下游设计引物(序列如下)，以5’或3’RACE产物为模板扩增该基因全长。

引物1：ATGGTGAGGGCTCCTTGCTGC

引物2：TTAAATCTGTGACAAACTCTGCA

1.4Tamyb1全长克隆

1.引物序列：见1.3部分。

2.PCR反应体系(20μL)：

10×buffer                             2μl

模板(5’RACE产物)                      1μl

dNTPs(2.0mM each)                      0.5μl

Primer1(5μM)                          1μl

Primer2(5μM)                          1μl

高保真Taq酶(STRATAGEN，Cat No：600380) 0.5μl

ddH₂O                                  14μl

3.PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，57.5℃复性45sec，72℃延伸45sec，循环35次；72℃延伸7min。

4.扩增片段的回收后与T载体连接、转化大肠杆菌、选取阳性克隆测序。结果见图1。

实施例2、Tamyb31的表达分析

2.1胁迫下RNA的提取

山融3号种子正常萌发，Hoagland培养液培养至株高约10cm时(约3周时间)开始进行干旱控水、盐胁迫(200mM NaCl)、ABA、GA、ACC、JA和SA处理。处理不同时间后，Trizol法提取幼苗根、叶RNA同上。

2.2逆转录获得cDNA

逆转录产生cDNA，按说明书操作。

2.3PCR反应及电泳

(1)以cDNA为模板，进行PCR反应。引物如下：

5′端引物：GATCAAGAACGTCTGGCACA

3′端引物：GAGGCCATCGAGTAGTCAGC

(2)PCR体系：

ddH₂O                                12.6μl

10×Taq bufferr(Mg2+free)            2μl

MgCl₂(25mM)                          1.2μl

Primer1(5μM)                        1μl

Primer2(5μM)                        1μl

dNTP(2mM each)                       1μl

Taq polymerase(5U/μl)               0.2μl

模板(逆转录cDNA)                     1μl

ToTal Volume                         20μl

(3)PCR程序：

95℃3min，25～30cycles 95℃30s，60℃30s，72℃60s；72℃5min。

根据内参Actin的扩增情况确定PCR的循环数，调整cDNA模板的加入量。

(4)1.5％琼脂糖凝胶电泳。结果见图2。

实施例3、植物表达载体的构建(35S启动子)

植物表达载体pStart是含有35S启动子和NPT II基因的双元载体，在其多克隆位点上含有限制性内切酶BamHI和SmaI的识别位点。据此在目的基因起始密码上游和终止密码下游设计含BamHI和SmaI识别序列的引物，用高保真Taq酶扩增目的基因，体系同1.4。

用限制性内切酶BamHI和SmaI对载体pStart和目的基因扩增产物片断分别进行酶切。完全酶切的载体在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离后，经胶回收，然后与酶切的目的基因扩增片段相连。

酶切体系，

(1)质粒BamHI单酶切

10×Buffer              1μl

质粒                    1～2μl

BamHI                   1μl

SmaI                    1μl

加ddH₂O至总体积         20μl

于37℃恒温水浴锅酶切2小时以上。酶切后以0.5×TBE为电泳缓冲液，将酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pStart大片段和目的基因条带，回收。

(2)回收的载体大片段的脱磷。

(3)经酶切的载体片段和目的基因片段以摩尔比1∶4的比例进行16℃连接过夜。

(4)连接产物热激法转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化菌在含Kan 50μg/ml的LB固体平板上37℃培养16小时左右。

(5)重组子的鉴定

①载体特异引物的合成

为了鉴定目的基因的插入方向，根据35S启动子序列设计一个载体特异引物，序列如下：GTT GGG GTT TCTACA GGA CGT

②重组质粒的PCR验证

挑取在kan培养基上的抗性单菌落分别接种于5ml含Kan的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜，碱变性法提取质粒，用载体特异引物和基因的下游引物进行PCR扩增，体系同2.3。PCR反应条件如下：预变性94℃3min，35个循环为：94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，最后，72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

③质粒酶切鉴定

提质粒进行BamHI和SmaI酶切，酶切体系同上。0.8％琼脂糖凝胶电泳，检测是否含有预期分子量大小的片段，验证载体的正确构建。

实施例4、农杆菌感受态的制备与转化

4.1农杆菌AGL1/EHA105感受态的制备

(1)从YEP平板(含50μg/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于含50μg/ml利福平的YEP液体培养基中，200rpm/min，28℃培养过夜。

(2)取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件下培养至OD₆₀₀达0.5。

(3)菌液冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

(4)将菌体重悬于冰浴的10ml 0.15mol/L的NaCl中，离心收集菌体。

(5)再悬浮于1ml 20mmol/L冰预冷的CaCl2溶液中，以200μl/管将菌液分装在1.5mlEppendorf管中，置液氮中速冻1min，-70℃保存备用。

4.2冻融法转化根癌农杆菌AGL1/EHA105

(1)在室温下融化两管农杆菌感受态细胞，分别加入1μg表达载体质粒DNA和1μg空载体，混匀后冰浴30min。

(2)置液氮速冻1min，迅速移至37℃温浴3min。

(3)加入无抗生素的YEP 800μl，28℃震荡培养3hr。

(4)7000rpm离心30s收集菌体，涂于含50μg/ml利福平、50μg/ml Kan的YEP平板上，28℃倒置暗培养2-3天。

4.3菌体PCR鉴定

菌体PCR方法及程序同上。

实施例5、拟南芥转化及筛选

5.1拟南芥种植

取拟南芥(哥伦比亚野生型)种子，置于垫有滤纸的平皿内，用少量蒸馏水润湿滤纸，于4℃冰箱进行春化处理，3-5天后播种于育苗盘内，放置于人工气候箱内(16h光照，22℃/8h黑暗，18℃)，生长6-8周后，待抽苔开花时用于转化。

5.2拟南芥转化

(1)转化前一天，取2ml活化的农杆菌AGL 1加到含相应抗生素的200ml YEP培养基中，过夜培养至OD₆₀₀＝1.0-1.2。

(2)离心收集菌体，并重悬于浸染液(5％蔗糖，0.04％Silwet L-77)中，使OD₆₀₀＝0.g。

(3)将花序浸入浸染液30秒，其间前后摆动花序，使花序上形成一层膜。

(4)用保鲜膜覆盖花序，暗培养一天后揭去保鲜膜，继续置人工气候箱使其生长。

(5)隔5-7天再用相同的方法浸染一次。

(6)大约一个月后收获种子。

(7)空载体的转化同上

5.3拟南芥转化阳性株系筛选

(1)收获的T0代种子消毒后(75％乙醇5min，清洁剂洗涤10-15min，无菌水冲洗3-5次)，铺于含50μg/mL Kan的MS筛选培养基上。

(2)4℃春化48h，移到培养室(16h光照/8h黑暗，22℃恒温)生长7-10天。将抗性绿色小苗移到土中继续生长。

(3)等植物绝大多数花苞已经结荚时，用小绳将植物单株绑起，以便单株收获T1代种子。

(4)重复步骤(1)-(3)，将单株收获的T1代种子继续在含卡那的MS培养基上进行筛选，挑选抗性比为3∶1的单插入独立株系移栽，并单株收获种子得到T2，继续重复步骤(1)-(3)，直至T2代单株种子在卡那抗性培养基上不再分离，至此得到纯合的T2代植株用于后续的进一步研究。空载体纯合体的筛选方法同上。

(5)CTAB法提取野生型、空载体对照及不同转基因株系的基因组DNA，提取相应材料的总RNA并逆转录合成cDNA。

(6)PCR扩增：以上述不同材料的基因组DNA为模板，使用基因特异引物、空载体检测特异引物(35S启动子序列)，PCR反应体系和反应条件如前。

(7)qPCR及Southern验证表明，Tamyb31在转化植株中正常表达。结果见图3。

实施例6、转Tamyb1拟南芥胁迫抗性分析

6.1萌发率测定

将空载体对照、三个株系的转Tamyb31拟南芥种子经消毒(方法同上)后，铺入含有NaCl、ABA的MS培养基中，25℃培养，观察萌发情况，子叶完全张开为萌发，萌发率的＝子叶展开的种子数/用于萌发试验的种子总数×100％。结果见图4。

6.2植株胁迫抗性分析

(1)拟南芥种子消毒、萌发(方法同上)；

(2)将萌发2天的幼苗转移至含Mannitol、NaCl、KCl和LiCl的MS培养基中垂直培养，观察幼苗生长差异。结果见图5、6。

(3)将土培3周左右的转基因植株及对照控水10天再浇水使其恢复生长3天，观察植株抗旱状况。结果见图5。

6.3转Tamyb31拟南芥幼苗中抗旱相关Marker基因分析

(1)拟南芥种子消毒、萌发、培养(方法同上)；

(2)经旱、ABA处理后的对照及转基因株系，提取植株总RNA，逆转录形成cDNA，进行RT-PCR分析。方法同实施例2，结果见图7。

实施例7、转Tamyb31小麦植株及检测

7.1TaMYB31-pCAMBIA3301载体构建

TaMYB31-ORF用TaMYB31-CDS-3301-S(Sac1)和TaMYB31-CDS-3301-As(BamH1)扩增后，连入pCAMBIA3301-ubi载体的Sac1和BamH1位点。转化子通过测序鉴定。

pCAMBIA3301-ubi载体图如图9。

7.2小麦转化

将构建好的载体转入农杆菌EHA105同实施例4。采用本实验室建立的生长点转化小麦的专利方法转化了小麦栽培品种济麦21和济南17。转化幼苗在农杆侵染后壮苗恢复生长1周，移栽至纸杯中，利用PCR鉴定阳性植株，结果见图8。

Claims (1)

1.一种小麦渐渗系抗盐旱胁迫基因TAmyb31，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

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