CN103172718A - 植物耐低氮胁迫相关蛋白GmDUF-CBS及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物耐低氮胁迫相关蛋白GmDUF-CBS及其编码基因与应用。该蛋白质GmDUF-CBS来源于大豆（Glycine max(L.)Merr.），为如下a）或b）的蛋白质：a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低氮胁迫和/或种子产量相关的由（a）衍生的蛋白质。实验证明，将含有序列表序列2所示DNA分子的重组表达载体pCXSN-GmDUF-CBS转化拟南芥得到的T₃代纯合转基因植株经低氮胁迫培养后，其单株种子产量、叶和主茎的总鲜重、总氮量和总蛋白量均明显高于相同条件下的野生型拟南芥植株。本发明在培育低氮适应性植物方面具有重要意义。

Description

植物耐低氮胁迫相关蛋白GmDUF-CBS及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐低氮胁迫相关蛋白GmDUF-CBS及其编码基因与应用。

背景技术

在过去的50年里，世界人口虽然增加了一倍，但世界粮食产量也有显著提高，因此有效地缓解了世界饥饿水平。然而，在今后的50年随着人口的进一步增长，有效地增加粮食产量将成为一个巨大的挑战，主要是受可耕地面积的减少、水资源短缺、全球气候骤变、饮食习惯的改变以及生物燃料的生产会消耗生物量等一系列问题的影响。此外，农民的花费特别是肥料的消费很高，同时化肥的大量使用也造成了很大的环境问题。对许多农作物来说，施加氮肥是单一成本投入最高的，由于其产量是能源密集型的，因此花费由能源价格决定。随着化肥的引入，为了实现提高单位面积产量的目标，把氮肥的应用与经济最佳水平紧密联系。但是，实际上作物实际氮肥利用率是很低的。氮复合物主要有硝态氮和铵态氮两种形式，在土壤中很不稳定，作物可利用的只有30-40%左右，超过60%的氮通过挥发、淋失、脱氮以及微生物分解等途径流失掉了。据估计，氮利用效率每增加1%每年将节省11亿美元。因此，为了减少氮损失，减少环境污染，减少投入成本，发展氮高效的作物品种是关键。营养高效利用不仅可以使植物在低营养条件下生长并增产，降低生产成本和充分利用边际土地资源，而且可以减少因施肥造成的资金投入和环境污染，改良土壤和改善生态环境，保持农业的可持续发展。因此从基因水平上进行探索以提高植物的氮素营养利用率，提高植物对低氮土壤适应性，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐低氮胁迫相关蛋白GmDUF-CBS及其编码基因与应用。

本发明所提供的与植物耐低氮胁迫相关的蛋白质，来源于大豆（Glycinemax(L.)Merr.），名称为GmDUF-CBS，该蛋白质为如下a）或b）的蛋白质：

a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b）将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低氮胁迫相关的由（a）衍生的蛋白质。

序列表序列1所示的氨基酸序列487个氨基酸残基组成。

为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白的编码基因可通过将序列表序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述蛋白质的编码基因也是本发明保护的范围。

所述蛋白质的编码基因为如下1）或2）或3）的基因：

1）其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

2）与1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。

序列表序列2由1464个脱氧核苷酸组成，是大豆蛋白GmDUF-CBS的编码序列。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

本发明保护含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子（如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin））、组成型启动子或组织特异表达启动子（如种子特异表达的启动子），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

所述重组载体具体可为在载体pCXSN的两个XcmⅠ位点间插入所述基因得到的重组载体。

本发明所提供的所述蛋白质及所述基因可用于调控目的植物的耐低氮胁迫能力和/或种子产量。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：在所述目的植物中导入所述基因，得到耐低氮胁迫能力和/或种子产量高于所述目的植物的转基因植物。

本发明还提供一种提高目的植物耐低氮胁迫能力和/或种子产量的方法，包括在所述目的植物中导入所述基因的步骤。

在上述两种方法中，所述导入是通过在载体pCXSN的两个XcmⅠ位点间处插入所述基因得到的重组载体实现的。

在上述方法或应用中，所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。

在上述方法或应用中，所述双子叶植物具体可为拟南芥（Arabidopsis thaliana）。

在上述方法或应用中，所述低氮是指所述目的植物可利用的氮量或浓度低于其正常生长发育的需要量或浓度；在本发明的实施例中，所述低氮具体为在拟南芥种子萌发14天内的氮浓度为0.3mM；在四叶期拟南芥幼苗培养中的氮浓度为1mM。

所述耐低氮胁迫能力与经所述低氮胁迫的植物的种子产量、和/或器官总鲜重、和/或器官总氮量、和/或器官总蛋白量正相关；所述器官为叶和/或茎。

实验证明，将含有序列表序列2所示DNA分子的重组表达载体pCXSN-GmDUF-CBS转化拟南芥得到的T₃代纯合转基因植株经低氮胁迫培养后，其单株种子产量、叶和主茎的总鲜重、总氮量和总蛋白量均明显高于相同条件下的野生型拟南芥植株。本发明在培育低氮适应性植物方面具有重要意义。

附图说明

图1为T₃代纯合转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系（TL）植株的PCR检测结果。其中，M为分子量标准，从上至下的条带大小依次为2000、1000、750、500、250、100bp；泳道1—7分别为TL1—TL7为不同的TL株系；泳道8为重组载体pCXSN-GmDUF-CBS阳性对照；泳道9为野生型拟南芥阴性对照。

图2为T₃代纯合转空载体的拟南芥株系（CK）植株的PCR检测结果。其中，M为分子量标准，从上至下的片段大小依次为2000、1000、750、500、250、100bp；泳道1—5分别为不同的CK株系植株；泳道6为载体pCXSN阳性对照；泳道7为野生型拟南芥阴性对照。

图3为T₃代纯合转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系（TL）中目的基因GmDUF-CBS的相对表达量测定结果。其中，WT为野生型拟南芥阴性对照，TL1—TL8为不同的TL株系。

图4为将T₃代纯合转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系（TL）和野生型拟南芥（WT）的种子于低氮培养基中培养14天的表型。其中，TL1、TL3和TL8为不同的TL株系。

图5为T₃代纯合转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系（TL）和野生型拟南芥（WT）植株经低氮胁迫培养9天后的表型。其中，TL1、TL3和TL8为不同的TL株系。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、大豆蛋白GmDUF-CBS及其编码基因与重组表达载体的获得

取大豆品种“坡黄”（Glycine max(L.)Merr.）正常条件下培养至第一片三初复叶长出时期的叶片部位，提取总RNA，并反转录获得cDNA，以该cDNA为模板，在引物PF和引物PR的引导下，用常规PCR法进行扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约1.5kb的DNA片段；将载体pCXSN（在载体pCXSN的T-DNA片段上含有致死基因ccdB，其两侧含XcmⅠ酶切识别序列。该载体购自拟南芥生物资源中心（The Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC；网址：http://abrc.osu.edu/)，产品目录编号为Vector:5019471951）用XcmⅠ酶切，回收载体骨架片段；将该载体骨架片段与所述约1.5kb的DNA片段用T4连接酶连接，获得重组载体pCXSN-GmDUF-CBS，经测序证实，该重组载体pCXSN-GmDUF-CBS为在载体pCXSN的两个XcmⅠ位点间插入了序列表序列2所示1464bp的DNA片段。将序列表序列2所示基因命名为GmDUF-CBS，该基因编码具有序列表序列1所示的由487个氨基酸组成的蛋白GmDUF-CBS。

上述引物的序列如下：

引物PF：5’-ATGGCGGCAGAGATACCG-3；

引物PR：5’-CTATTGATTCCTTAGTGACTCACT-3。

实施例2、重组根癌农杆菌的获得

将实施例1获得的重组载体pCXSN-GmDUF-CBS冻融法转化根癌农杆菌GV3101（文献：Amanda M Davis，Anthony Hall，Andrew J Millar，Chiarina Darrah and SethJ Davis，Protocol:Streamlined sub-protocols for floral-dip transformationand selection of transformants in Arabidopsis thaliana，2009，5:310.1186/1746-4811-5-3；公众可从中国农业科学院油料作物研究所获得），获得含有重组载体pCXSN-GmDUF-CBS的根癌农杆菌GV3101，将该重组农杆菌命名为GV3101/pCXSN-GmDUF-CBS；

将空载体pCXSN冻融法转化根癌农杆菌GV3101，获得含有空载体pCXSN的根癌农杆菌GV3101，将该重组农杆菌命名为GV3101/pCXSN。

实施例3、转基因拟南芥的获得及鉴定

一、转基因拟南芥的获得

利用实施例2获得的两种重组农杆菌，分别花芽浸泡法转化哥伦比亚生态型拟南芥Columbia-0（以下简称为野生型拟南芥WT）（文献：Xia T,Xiao D,Liu D,Chai W,Gong Q,Wang NN.Heterologous expression of ATG8c from soybean conferstolerance to nitrogen deficiency and increases yieldin Arabidopsis.PLoS One.2012;7(5):e37217；公众可从中国农业科学院油料作物研究所获得），获得T₃代纯合转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系8个，T₃代纯合转空载体的拟南芥株系5个，具体方法如下：

1、取重组农杆菌GV3101/pCXSN-GmDUF-CBS或GV3101/pCXSN，用含利福平30μg/ml和卡那霉素100μg/ml的YEP培养液培养至OD₆₀₀为0.8；室温离心后将菌体沉淀重悬于5%蔗糖溶液中，获得菌悬液；将待转基因的拟南芥植株倒置，使莲座叶以上的花序在菌悬液中浸泡15S后，将植株水平放置于22℃环境中，用不透光的塑料袋封住盆钵；24小时后将植株取出，竖直培养直至收获种子（即T₀代种子），种子经室温干燥后备用。

2、将步骤1获得的T₀代种子，4℃低温处理4—7天，播种于含75mg/l潮霉素的MS培养基中，置于22℃光照培养箱中持续培养，7—10天后挑选可正常生长的潮霉素抗性植株（潮霉素抗性植株表现为植株健壮，根系发达，非潮霉素抗性植株表现为黄化死亡，根系弱小），移入正常MS培养基中缓苗3—7天，播种于营养土中直至收获T₁代种子。按照同样的方法种植筛选T₁代种子，移栽潮霉素抗性分离比为3:1的T₁代株系，并单株收获T₁代株系内各单株上所结T₂代种子，取T₂代株系种子按照同样的方法进行潮霉素抗性筛选，得到T₂代不再产生潮霉素抗性分离的纯合转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系10个和T₂代不再产生潮霉素抗性分离的纯合转空载体株系8个；随机取8个T₂代纯合转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系繁殖，收获T₃代纯合转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系种子；随机取5个T₂代纯合转空载体的拟南芥株系繁殖，收获T₃代纯合转空载体的拟南芥株系种子。

T₀代表示转化当代所结的种子及由它所长成的植株；T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株；T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株；T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。

二、转基因拟南芥的分子检测

1、PCR鉴定

取步骤一获得的T₃代纯合转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系（分别命名为株系TL1—TL8）和野生型拟南芥（WT）的植株，分别提取基因组DNA，用实施例1的引物PF和引物PR对目的基因GmDUF-CBS进行PCR扩增，目的产物大小为1464bp，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，将获得1464bp条带的植株记为阳性。结果：TL1—TL8株系植株全部为阳性，WT植株全部为阴性，部分结果如图1所示。

取步骤一获得的T₃代纯合转空载体的拟南芥株系（CK，各株系分别为CK1—CK5）和野生型拟南芥（WT）的植株，分别提取基因组DNA，用引物5’-AGACCGGCAACAGGATTCAATC-3’和引物5’-CTCAAGCAATCAAGCATTCT-3’PCR扩增靶基因ccdB基因，目的产物大小为896bp，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，将获得896bp条带的植株记为阳性。结果：CK1-CK5株系植株全部为阳性，WT植株全部为阴性，部分结果如图2所示。

2、实时荧光定量PCR检测

取步骤一获得的T₃代纯合转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系（TL1—TL8），T₃代纯合转空载体的拟南芥株系（CK）和野生型拟南芥（WT）植株，分别提取总RNA，反转录获得cDNA，以该cDNA为模板，用特异引物F1和R1对基因GmDUF-CBS的cDNA进行实时荧光定量PCR扩增，以大豆β-actin为内参，引物为FC和RC。实时荧光定量PCR在StepOnePlus^TM实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用LivakKJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即

计算相对表达量。

ΔΔC_T=（C_T.Target－C_T.Actin）_Timex－（C_T.Target－C_T.Actin）_Time0

Time x表示任意时间点，Time₀表示经β-actin校正后1倍量的目标基因表达。

上述引物的序列(5’—3’)如下：

F1：5’-ATTCACTGGTCCATCCCG-3’；

R1：5’-GTCCTTTGCCCAACATCC-3’；

FC：5’-ATTGGACTCTGGTGATGGTG-3’；

RC：5’-TCAGCAGAGGTGGTGAACAT-3’。

结果如图3所示，结果表明，WT植株中不表达目的基因GmDUF-CBS；而转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系TL1—TL8中目的基因GmDUF-CBS的表达量都很高。CK株系植株的结果与WT相同。

三、转基因拟南芥的表型鉴定

1、取步骤一获得的T₃代纯合转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系（TL1—TL8），T₃代纯合转空载体的拟南芥株系（CK）和野生型拟南芥（WT）种子，消毒后分别进行两种处理（即正常处理和低氮胁迫处理），每种处理以播种同皿中的WT为对照，具体方法和结果如下：

正常处理：将种子播种于正常的1/2MS培养基（其中的硝酸钾和硝酸铵的浓度均为1mM）上，于23℃、每天16h光照/8h黑暗条件下培养14天，观察植株表型；

低氮胁迫处理：将种子播种于低氮培养基（硝酸钾和硝酸铵的浓度均为0.1mM的1/2MS培养基）上，于23℃、每天16h光照/8h黑暗条件下培养14天，观察植株表型；

结果：WT植株和转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系植株在正常处理下均表现正常；而在低氮胁迫处理下，与同皿的WT株系植株相比，转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系植株叶片黄化程度较低，且植株较健壮，部分结果如图4所示。

2、将步骤1正常处理下长到四片叶的各株系植株幼苗移至全蛭石中，于23℃、每天16h光照/8h黑暗条件下，用正常霍格兰营养液（溶剂为水，溶质及其浓度分别为：2mM Ca(NO₃)₂·4H₂O，2.5mM KNO₃,0.5mM NH₄NO₃,0.5mM KH₂PO₄,1mM MgSO₄·7H₂O,0.05mM Fe-EDTA,0.005mM KI,0.1mM H₃BO₃,0.1mM MnSO₄·H₂O,0.03mM ZnSO₄·7H₂O,0.0001mM CuSO₄·5H₂O,0.001mM Na₂MO₄·2H₂O,0.0001mM CoCl₂·6H₂O）培养7天后；取一半数量的植株用低氮的霍格兰营养液（即将所述正常霍格兰营养液中浓度为2mM的Ca(NO₃)₂·4H₂O替换为浓度为2mM的CaCl₂·2H₂O，将浓度为2.5mM的KNO₃替换为浓度为1.25mM的K₂SO₄）培养（即低氮胁迫培养），另一半数量的植株继续用正常霍格兰营养液培养（即正常培养）；9天后，经正常培养的TL株系植株与WT植株表型无显著差异，而经低氮胁迫培养的转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系（TL1—TL8）植株莲座均比野生型拟南芥WT大，且黄化程度较低（部分结果如图5所示），这说明转基因GmDUF-CBS的拟南芥营养利用效率更高，对低氮胁迫的耐受能力更强，此时分别测定不同处理下各株系植株叶和茎的总鲜重、氮含量和总蛋白量，测定方法和结果分别如下：

1）总鲜重的测定

分别从各株系中随机取8个单株，按株系分别收获叶片和主茎，立即称重，三次重复的平均值结果如表2所示。

表2.各株系植株叶和茎的总鲜重测定结果（g）

注：*表示相同器官、相同处理、不同株系的结果与WT植株相比在P﹤0.05差异显著；#表示相同器官、不同处理、同一株系的结果间相比在P﹤0.05差异显著。

结果：表2的结果表明，在正常培养条件下，WT植株和转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系植株的叶或主茎的总鲜重无显著差异。而在低氮胁迫条件下，转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系植株的叶或主茎的总鲜重明显高于非转基因野生型拟南芥植株。CK的结果与WT相比无显著差异。

2）总氮量的测定

取经步骤1）称重的叶片和主茎，分别按照文献A.E.Kimberly,M.G.Roberts Amethod for the direct determination of organic nitrogen by the Kjeldahl processPublic Health Pap.Rep.,31(2)(1905),pp.109–122中的凯氏定氮法测定含氮量(%)，通过公式：总氮量(g)=单株器官（叶或主茎）总鲜重(g)×含氮量(%)，结果取三次重复的平均值，如表3所示。

表3.各株系植株叶和主茎的总氮量（g）测定结果

注：*表示相同器官、相同处理、不同株系的结果与WT植株相比在P﹤0.05差异显著；#表示相同器官、不同处理、同一株系的结果间相比在P﹤0.05差异显著。

结果：表3的结果表明，在正常和低氮胁迫培养条件下转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系植株的叶中的总氮量均高于WT植株；而转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系植株的主茎中的总氮量在低氮胁迫培养条件下显著高于WT植株，在正常培养条件下与WT植株差异不明显。CK的结果与WT相比无显著差异。

3）总蛋白量的测定

取经步骤2）称重的叶片和主茎，分别按照文献Bradford MM(1976)A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem72:248–254中的考马斯亮蓝方法测定蛋白含量(%)，通过公式：总蛋白量(g)=单株器官（叶或主茎）总鲜重(g)×蛋白含量(%)，结果取三次重复的平均值，如表4所示。

表4.各株系植株叶和主茎的总蛋白量（g）测定结果

注：*表示相同器官、相同处理、不同株系的结果与WT植株相比在P﹤0.05差异显著；#表示相同器官、不同处理、同一株系的结果间相比在P﹤0.05差异显著。

结果：表4的结果表明，在低氮胁迫培养条件下的转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系植株的叶和主茎中的总蛋白量都显著高于WT植株，在正常培养条件下差异不明显；部分转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系在正常培养条件下与低氮胁迫培养条件下的总蛋白量差异显著。CK的结果与WT相比无显著差异。

3、单株种子产量的测定

将步骤1正常处理下长到四片叶的各株系植株幼苗移至全蛭石中，于23℃、每天16h光照/8h黑暗条件下，用正常霍格兰营养液（溶剂为水，溶质及其浓度分别为：2mMCa(NO₃)₂·4H₂O，2.5mM KNO₃,0.5mM NH₄NO₃,0.5mM KH₂PO₄,1mM MgSO₄·7H₂O,0.05mMFe-EDTA,0.005mM KI,0.1mM H₃BO₃,0.1mM MnSO₄·H₂O,0.03mM ZnSO₄·7H₂O,0.0001mMCuSO₄·5H₂O,0.001mM Na₂MO₄·2H₂O,0.0001mM CoCl₂·6H₂O）培养7天后；取一半数量的植株用低氮的霍格兰营养液（即将所述正常霍格兰营养液中浓度为2mM的Ca(NO₃)₂·4H₂O替换为浓度为2mM的CaCl₂·2H₂O，将浓度为2.5mM的KNO₃替换为浓度为1.25mM的K₂SO₄）培养（即低氮胁迫培养），另一半数量的植株继续用正常霍格兰营养液培养（即正常培养）；培养9天后，停止使用营养液，用清水继续浇灌植株，直至植株种子完全成熟后，从每个株系中随机选4个单株分别收获种子（在37℃烘干4天）后称重，取单株种子产量的平均值，结果如表5所示。

表5.各株系植株的单株种子产量（mg）测定结果

处理	WT	TL1	TL3	TL8
					低氮胁迫	579.13±59.66	779.51±79.17*	653.10±28.81*	855.40±89.39*
正常	785.80±32.56#	1211.46±23.11*#	1074.79±130.61#	1042.69±25.96*#

注：*表示同一处理中的不同株系结果与WT植株相比，在P﹤0.05水平差异显著；#表示同一株系的不同处理结果相比，在P﹤0.05水平差异显著。

表3的结果表明，转基因GmDUF-CBS的拟南芥株系植株的单株种子产量在正常和低氮胁迫培养条件下，均显著高于WT植株。

实施例3的结果表明，导入基因GmDUF-CBS获得的转基因植物与野生型植物耐低氮胁迫能力和种子产量明显提高。这说明蛋白GmDUF-CBS及其编码基因可调控目的植物的耐低氮胁迫能力和种子产量。

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下a）或b）的蛋白质：

a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b）将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低氮胁迫能力和/或种子产量相关的由（a）衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。

所述蛋白质的编码基因具体可为如下1）或2）或3）的基因：

1）其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

2）与1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

3.含有权利要求2所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是在载体pCXSN的两个XcmⅠ位点间插入了权利要求2所述基因。

5.权利要求1所述蛋白质及权利要求2所述基因在调控目的植物的耐低氮胁迫能力和/或种子产量中的应用。

6.一种提高目的植物耐低氮胁迫能力和/或种子产量的方法，包括在所述目的植物中导入权利要求2所述基因的步骤。

7.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：在所述目的植物中导入权利要求2所述基因，得到耐低氮胁迫能力和/或种子产量高于所述目的植物的转基因植物。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述导入是通过权利要求4所述重组载体实现的。

9.根据权利要求5—8中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为拟南芥（Arabidopsis thaliana）。

10.根据权利要求1或5—9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述低氮是指所述目的植物可利用的氮量低于其正常生长发育的需要量；

所述耐低氮胁迫能力与经所述低氮胁迫的植物的种子产量、和/或器官总鲜重、和/或器官总氮量、和/或器官总蛋白量正相关；所述器官为叶和/或茎。

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