CN101851274B - 抑制丙型肝炎病毒侵入的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制丙型肝炎病毒侵入的多肽。本发明提供如下十种多肽：多肽I如序列表的序列1所示；多肽II如序列2所示；多肽III如序列3所示；多肽IV如序列4所示；多肽V如序列5所示；多肽VI如序列6所示；多肽VII如序列7所示；多肽VIII如序列8所示；多肽IX如序列9所示；多肽X如序列10所示。本发明的多肽有下述优点：由16-24个氨基酸组成，相对较短，既可通过化学合成，也便于通过重组表达制备；多肽序列和作用位点与现有HCV侵入抑制剂不同，靶点明确，特异性抑制HCV病毒囊膜与宿主受体CLDN1的相互作用；不易产生耐药性：由于本发明提供的多肽序列来源于人类蛋白CLDN1，非HCV病毒囊膜蛋白，对多种基因型的HCV具有抑制作用。

Description

抑制丙型肝炎病毒侵入的多肽

技术领域

本发明涉及抑制丙型肝炎病毒侵入的多肽。

背景技术

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染引起的，经急性期感染后相当一部分患者可转归为慢性感染(Chronic hepatitis C)、肝硬化(Cirrhosis)和肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)(Kiyosawa K，Sodeyama T，Tanaka E，Gibo Y，Yoshizawa K，Nakano Y，Furuta S，Akahane Y，Nishioka K，Purcell RH，et a1.Interrelationship of blood transfusion，non-A，non-B hepatitis andhepatocellular carcinoma：analysis by detection of antibody to hepatitis Cvirus.Hepatology.1990 Oct；12(4 Pt 1)：671-5.)。HCV感染的慢性化率非常高，为50％～85％，对患者的健康和生命危害极大，相关医疗成本逐年增加，已成为严重的社会和公共卫生问题。根据世界卫生组织1999年的调查，全球HCV感染者达1.7亿，感染率为3.1％(Lauer GM，Walker BD.Hepatitis C virus infection.N EnglJ Med.2001 Jul 5；345(1)：41-52.)。我国的HCV感染者和发病者总数均居世界首位，属于丙肝高发区之一。我国一般人群的HCV感染率为3.2％，感染者约为4200万左右，且近年来一直呈快速上升趋势(中华医学会，《丙型肝炎防治指南》，2005)。更为严峻的是目前世界上还没有可预防HCV感染的疫苗，无法阻断新发的丙肝感染。而且目前也没有直接针对HCV病毒靶点的药物。聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)和利巴韦林(Ribavirin)的联合治疗作为目前唯一治疗手段对于我国和全球流行性毒株(1b和1a基因型)的有效率不高(约50％)，治疗周期长，费用昂贵并且有强烈的副作用。因此，研究开发新型抗HCV药物和治疗方案将对丙型肝炎的防治具有极其重要的意义。

HCV具有独特的基因组结构及生活周期。HCV属黄病毒科(Flaviviridae)单股正链RNA病毒，该科的主要人类病原体还包括：Yellow fever virus、Dengue virus、West Nile virus等。HCV基因组长约9.6kb，包含一个大的开放阅读框，编码一个由约3000个氨基酸组成的前体蛋白，开放阅读框两侧为非翻译区(Untranslatedregions，UTRs)(Choo QL，Kuo G，Weiner AJ，Overby LR，Bradley DW，Houghton M.Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A，non-B viralhepatitis genome.Science.1989 Apr 21；244(4902)：359-62.)。HCV前体蛋白经由宿主和病毒编码的蛋白酶的联合作用下，加工成熟为四个结构蛋白：Core，E1，E2和p7，以及六个非结构蛋白：NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B。其中E1和E2为囊膜糖蛋白。HCV的重要遗传特征之一是其基因组的高度变异性，其中E1和E2区域变异程度最高，而3’和5’-UTR相对较为保守。这一特性为设计和开发HCV疫苗带来了相当程度的困难。目前HCV可分为6个主要基因型及近百种不同亚型，按照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示HCV基因型，以小写的英文字母表示基因亚型(如1b、2a、3c等)。基因1型呈全球性分布，占所有HCV感染的70％以上。HCV与许多其他RNA病毒类似，感染宿主后，经一定时期，在感染者体内形成以一个优势株为主的相关突变株病毒群，称为准种(Quasispecies)。HCV完整生活周期通常分为：病毒吸附与侵入宿主细胞；前体蛋白的翻译、加工与成熟；病毒基因组复制；病毒组装等环节。

HCV感染宿主细胞的第一个环节为利用细胞膜表面受体完成病毒颗粒的侵入过程。近两年来，关于发现和鉴定HCV受体的工作异常活跃，且成果丰硕。目前已经发现的特异性HCV受体主要包括：CD81，SR-BI，Claudin-1(CLDN1)和Occludin(OCLN)。CD81分子属于四次跨膜蛋白家族成员之一，主要通过其胞外区与HCV囊膜蛋白E2相互作用，完成介导病毒侵入宿主细胞(Pileri P，Uematsu Y，Campagnoli S，Galli G，Falugi F，Petracca R，Weiner AJ，Houghton M，Rosa D，Grandi G，Abrignani S.Binding of hepatitis C virus to CD81.Science.1998 Oct 30；282(5390)：938-41.)。E1与E2结合为异源二聚体后具有增强E2与CD81结合的能力。SR-BI(Scavengerreceptor class B type I)为由509个氨基酸组成的二次跨膜蛋白，具有一个大的胞外区，其胞外区含9个糖基化位点。SR-BI主要与HCV的E2结合(Scarselli，E.，Ansuini，H.，Cerino，R.，Roccasecca，R.M.，Acali，S.，Filocamo，G.，Traboni，C.，Nicosia，A.，Cortese，R.and Vitelli，A.(2002)The human scavenger receptorclass B type I is a novel candidate receptor for the hepatitis C virus.EMBOJ.21，5017-5025.)。此外有证据表明：SR-BI也可作为乙酰化和氧化的低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDLs)的受体，而HDLs等脂蛋白可通过SR-BI促进HCV的感染。

需要着重指出的是：四次跨膜蛋白CLDN1作为细胞紧密连接(Tight junction)的组分之一，2007年被美国洛克菲勒大学的Rice博士及其同事报道可以作为HCV的新的辅助受体(Evans MJ，von Hahn T，Tscherne DM，Syder AJ，Panis M，

B，Hatziioannou T，McKeating JA，Bieniasz PD，Rice CM.Claudin-l is a hepatitisC virus co-receptor required for a late step in entry.Nature.2007 Apr12；446(7137)：801-5.)。尽管过表达CLDN1可以使得HCV进入非敏感细胞系293T，但仍有一系列相关问题等待回答：HCV的囊膜蛋白是否可以与CLDN1相互作用？为什么一些非敏感细胞(如HeLa)在过表达CLDN1后HCV仍然无法进入？另外，关于CLDN1介导HCV进入的分子机理人们也知之甚少。目前，针对HCV侵入的抑制剂主要集中于抗HCV囊膜蛋白和先前发现的受体CD81和SR-BI的中和抗体。鉴于HCV新受体CLDN1、OCLN以及细胞Tight junction结构在HCV进入宿主细胞过程中可能发挥的重要作用，同时，为了延续对HCV受体的一些创新性研究，迫切需要得到针对HCV新受体的较短氨基酸序列的多肽类病毒侵入抑制剂。这一类多肽类抑制剂应具有易合成、靶点明确、副作用小、对多种基因型病毒有效的特点。

发明内容

本发明的目的是提供抑制丙型肝炎病毒侵入的多肽。

本发明提供的抑制丙型肝炎病毒侵入的多肽，为如下十种多肽中的任意一种：

多肽I：氨基酸序列如序列表的序列1所示；NH₂-MANAGLQLLGFILAFLGW-COOH；

多肽II：氨基酸序列如序列表的序列2所示；NH₂-LLGFILAFLGWIGAIVST-COOH；

多肽III：氨基酸序列如序列表的序列3所示；NH₂-FILAFLGWIGAIVSTALP-COOH；

多肽IV：氨基酸序列如序列表的序列4所示；NH₂-AFLGWIGAIVSTALPQWR-COOH；

多肽V：氨基酸序列如序列表的序列5所示；NH₂-GWIGAIVSTALPQWRIYS-COOH；

多肽VI：氨基酸序列如序列表的序列6所示；NH₂-GAIVSTALPQWRIYSYAG-COOH；

多肽VII：氨基酸序列如序列表的序列7所示；NH₂-MANAGLQLLGFILAFL-COOH；

多肽VIII：氨基酸序列如序列表的序列8所示；NH₂-MANAGLQLLGFILAFLGWIG-COOH；

多肽IX：氨基酸序列如序列表的序列9所示；NH₂-MANAGLQLLGFILAFLGWIGAI-COOH；

多肽X：氨基酸序列如序列表的序列10所示；NH₂-MANAGLQLLGFILAFLGWIGAIVS-COOH。

本发明还保护所述多肽的衍生物，为如下(1)或(2)、：

(1)将所述多肽进行一个或多个氨基酸的插入和/或替换和/或缺失，得到的衍生物；

(2)将所述多肽或(1)所述衍生物与载体联接，得到的衍生物。

将所述多肽中的一个或多个氨基酸残基用构象为D-型的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸或人工修饰的氨基酸替换，可以增加生物利用度及提高抗病毒活性。所述载体包括但不局限于多肽串联体、蛋白质、聚乙二醇和脂类物质等。所述多肽或所述多肽的衍生物，可直接或与其它分子偶联用于制备抑制多种包膜病毒感染的药物，或作为先导肽开发为新型抗病毒药物。

所述多肽或所述衍生物在制备丙型肝炎病毒侵入抑制剂中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种丙型肝炎病毒侵入抑制剂，它的活性成分为所述多肽或所述衍生物。

所述丙型肝炎病毒可为H77基因型(1a)的丙型肝炎病毒、Con1基因型(1b)的丙型肝炎病毒或JFH1基因型(2a)的丙型肝炎病毒。所述H77基因型(1a)的丙型肝炎病毒具体可为基因组DNA中具有序列表的序列11所示DNA的丙型肝炎病毒；所述Con1基因型(1b)丙型肝炎病毒具体可为基因组DNA中具有序列表的序列12所示DNA的丙型肝炎病毒；所述JFH1基因型(2a)的丙型肝炎病毒具体可为基因组DNA中具有序列表的序列13所示DNA的丙型肝炎病毒。

所述多肽或所述衍生物在制备治疗或预防丙型肝炎的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种治疗或预防丙型肝炎的药物，它的活性成分为所述多肽或所述衍生物。

本发明多肽可以直接单独用于HCV感染的治疗，也可以与已知的一种或多种抗HCV药物联合使用，这些药物包括但不限于干扰素、利巴韦林等。

本发明以HCV病毒进入宿主细胞的受体为靶点设计了抑制性多肽文库，筛选获得了具有较强的抗病毒活性的候选抑制多肽。对候选多肽序列与结构进行重头设计和优化后，得到一系列具有抗HCV活性的多肽。这些多肽既能抑制HCV假病毒又能抑制感染性HCV病毒，其主要作用靶点为阻断病毒与其受体的结合而抑制病毒的早期进入。

本发明所提供的多肽在有机相或接触到脂质双分子层等膜结构时，具有典型的α螺旋结构。

本发明所提供的多肽具有下述优点：

(1)制备方便：由16-24个氨基酸残基组成，相对较短，既可以通过化学合成的方法制备，也便于通过重组表达的方式制备。

(2)多肽序列和作用位点与现有HCV侵入抑制剂不同：本发明所提供的多肽作用靶点明确，为特异性地抑制HCV病毒囊膜与宿主受体CLDN1的相互作用。

(3)不易产生耐药性：由于本发明提供的多肽序列来源于人类蛋白CLDN1，而非来源于HCV病毒囊膜蛋白，因此其对多种基因型(亚型)的HCV具有抑制作用。

附图说明

图1为各种受体来源的多肽文库对HCV假病毒侵入效率的影响。

图2为多肽1的圆二色谱图。

图3为多肽1对H77基因型(1a)的HCVpp假病毒的侵入抑制能力。

图4为多肽1对Con1基因型(1b)的HCVpp假病毒的侵入抑制能力。

图5为多肽1对JFH1基因型(2a)的HCVpp假病毒的侵入抑制能力。

图6为多肽1处理Huh7细胞后，免疫荧光染色检测HCV受体Claudin-1的亚细胞定位；结果表明多肽1处理并不影响细胞表面受体Claudin-1的表达水平及其定位。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

293T细胞：购自美国典藏细胞库ATCC，目录号：CRL-11268。Huh7细胞：(肝癌细胞系)购自美国Apath公司。质粒pNL4.3-Luc-R^-E^-购自美国国立卫生研究院艾滋病研究与参比试剂计划(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)。HepG2：购自美国典藏细胞库ATCC。胎牛血清及DMEM培养基购自Invitrogen公司，转染试剂购自Giantagen公司。一次性细胞培养板以及移液管等耗材购自Corning公司。

实施例1、抗病毒多肽的设计

抗病毒多肽的设计原理如下。

HCV感染宿主的首要环节是病毒的E1和E2囊膜蛋白依次与宿主细胞表面受体SR-BI、CD81、CLDN1和OCLN相互作用，通过细胞内吞与膜融合作用完成病毒感染的第一步。理论上，细胞表面受体的特定区域具有结合HCV囊膜蛋白的能力，通过多肽文库筛选的方法，可以得到相应的竞争性多肽。

鉴于以上实验设计的合理性，以HCV受体SR-BI、CD81、CLDN1和OCLN的氨基酸序列为基础设计多肽文库，每条多肽长18个氨基酸，相邻的两条多肽具有5个氨基酸的重复区域(overlap)。

多肽文库共包含113条多肽。以假病毒(HCVpp)和Huh7肝癌细胞系为筛选模型，对113条多肽(初筛浓度为50μM)进行抗病毒筛选，获得2条抗病毒活性＞90％的多肽(多肽1和多肽2)，分别位于受体CLDN1的N端(见图1)。图1为多肽文库筛选示意图；图中的受体1-4分别代表HCV受体CD81、SR-BI、CLDN1和OCLN；其中58号和59号两个多肽显示出良好的抗病毒活性。

多肽1(CL58)：MANAGLQLLGFILAFLGW；

多肽4(CL58.4)：AFLGWIGAIVSTALPQWR。

其中，多肽1在50μM的处理浓度下的抑制效率＞99％，而多肽4的抑制效果较CL58稍差，在50μM的终浓度下的抑制效率＞90％。

根据以上两条多肽的序列，对多肽1和多肽4的氨基酸序列进行重头设计和优化，得到10条多肽，见表1。

表110条多肽的氨基酸序列

	多肽序列(NH2-多肽-COOH)
		CL58(多肽1)	MANAGLQLLGFILAFLGW
CL58.2(多肽2)	LLGFILAFLGWIGAIVST
		CL58.3(多肽3)	FILAFLGWIGAIVSTALP

CL58.4(多肽4)	AFLGWIGAIVSTALPQWR
		CL58.5(多肽5)	GWIGAIVSTALPQWRIYS
CL58.6(多肽6)	GAIVSTALPQWRIYSYAG
		CL58-2(多肽7)	MANAGLQLLGFILAFL
CL58+2(多肽8)	MANAGLQLLGFILAFLGWIG
		CL58+4(多肽9)	MANAGLQLLGFILAFLGWIGAI
CL58+6(多肽10)	MANAGLQLLGFILAFLGWIGAIVS

以后各个实施例中的多肽1、多肽2、多肽3、多肽4、多肽5、多肽6、多肽7、多肽8、多肽9和多肽10均指的是表1中的各条多肽。

实施例2、多肽的合成及其化学性质测定

一、多肽1和对照多肽的合成

1、多肽1的合成

由美国Genscript公司通过化学方法合成多肽1。用DMSO溶解多肽1，配制成10mM的储备液，-20℃冷冻保存。

2、对照多肽的合成

对照多肽(NH₂-多肽-COOH)：SWLRDIWDWICEVLSDFK。

对照多肽同样为来源于CLDN1的序列，在原始多肽文库中的序号为60号，位置紧邻58号和59号多肽，在58号和59号多肽的C端；经过筛选，对照多肽对HCV的侵入不具有任何影响。

由美国Genscript公司通过化学方法合成对照多肽。用DMSO溶解对照多肽，配制成10mM的储备液，-20℃冷冻保存。

二、多肽1的物理化学性质(圆二色谱分析)

1、实验目的

通过测定多肽1的螺旋度或螺旋含量，确定多肽1可能的二级结构。

2、实验仪器、试剂及方法

利用Jasco J-720圆二色谱(CD)仪(Jasco，Easton，MD)，在25℃温和条件下(50mMKH₂PO₄/K₂HPO₄/100mM KCl，pH7)，和含有50％α-螺旋诱导试剂2，2，2-三氟乙醇(TFE)的条件下(50mM KH₂PO₄/K₂HPO₄/100mM KCl，pH7缓冲液/50％TFE)，分别测定多肽1的平均残基摩尔椭圆度系数。将500μM的多肽存储母液经过10倍稀释以后加入到0.02cm石英测试管中，通过190到250nm的扫描得到产物多肽的椭圆度系数。在222nm波长下测定得到的多肽摩尔椭圆度系数被用于评估多肽的α-螺旋性。

3、实验结果

典型的α-螺旋在CD图上显示为208nm和222nm处有双负峰。从图2中可以看出，多肽1在含50％TFE条件下，在208nm和222nm处出现双负峰。表明多肽1在疏水相中(例如含有膜的结构)具有螺旋构象，而在水溶液中(Buffer)则为无序构象。

用实施例2制备的多肽进行后续实施例的检测。

实施例3、多肽1对病毒侵入的抑制能力

一、各种基因型的HCVpp假病毒的制备

1、H77基因型(1a)的HCVpp假病毒的制备

(1)重组质粒的制备

根据HCVdb数据库(http://www.hcvdb.org)中的序列，由Genscript公司合成序列表的序列11所示的H77基因。通过HindIII和EcoRI酶切识别位点，将序列11所示的H77基因插入载体质粒pcDNA3(Invitrogen)，得到重组质粒pcDNA3-H77(H77基因克隆于CMV启动子下游)。

(2)H77基因型的HCVpp假病毒的制备

293T细胞于转染前一天接种于10cm细胞培养皿中，转染时细胞密度为50％。以pNL4.3-Luc-R^-E^-质粒和pcDNA3-H77共转染293T细胞，其中pNL4.3-Luc-R^-E^-∶pcDNA3-H77∶转染试剂的量为15μg∶15μg∶60μL。转染后48小时收取病毒上清(HCVpp)，以0.45μM滤器过滤分装，保存于-80℃。

2、Con1基因型(1b)的HCVpp假病毒的制备

(1)重组质粒的制备

根据HCVdb数据库(http://www.hcvdb.org)中的序列，由Genscript公司合成序列表的序列12所示的Con1基因。通过HindIII和EcoRI酶切识别位点，将序列12所示的Con1基因插入载体质粒pcDNA3，得到重组质粒pcDNA3-Con1(Con1基因克隆于CMV启动子下游)。

(2)Con1基因型的HCVpp假病毒的制备

同步骤1的(2)。

3、JFH1基因型(2a)的HCVpp假病毒的制备

(1)重组质粒的制备

根据HCVdb数据库(http://www.hcvdb.org)中的序列，由Genscript公司合成序列表的序列13所示的JFH1基因。通过HindIII和EcoRI酶切识别位点，将序列13所示的JFH1基因插入载体质粒pcDNA3，得到重组质粒pcDNA3-JFH1(JFH1基因克隆于CMV启动子下游)。。

(2)JFH1基因型的HCVpp假病毒的制备

同步骤1的(2)。

将pcDNA3-H77、pcDNA3-Con1和pcDNA3-JFH1统称为HCV囊膜蛋白表达质粒pcDNA3-E1E2。

二、多肽1对病毒的抑制能力

1、HCV假病毒侵入实验

①假病毒包装

293T细胞于转染前一天接种于10cm细胞培养皿中，转染时细胞密度为50％。以pNL4.3-Luc-R^-E^-质粒和pcDNA3-E1E2质粒(pcDNA3-H77、pcDNA3-Con1或pcDNA3-JFH1)共转染293T细胞，其中pNL4.3-Luc-R^-E^-∶pcDNA3-E1E2∶转染试剂的量为15μg∶15μg∶60μL。转染后48小时收取病毒上清(HCVpp)，以0.45μM滤器过滤分装，保存于-80℃。

②假病毒侵入实验

将Huh7细胞接种于96孔板，培养至90％汇合密度；取100μL步骤①得到的病毒上清与各个浓度(0、5、10、15、20μM)的多肽1混合，然后加入Huh7细胞进行感染，48小时后裂解细胞进行荧光素酶报告基因检测(检测试剂购自Promega公司，仪器为Turner BioSystems公司的Modulus Microplate Luminometer)。

结果如图3、图4和图5所示，多肽1(CL58)对于在我国的HCV主要流行株1a、1b和2a亚型的病毒均有明显的抑制作用。

实施例4、抗病毒多肽的半数有效量

1、H77基因型的HCVpp假病毒的制备

同实施例3的步骤一的1。

2、半数有效量测定

取100μL步骤1制备的病毒上清分别与各个多肽混合均匀(每种多肽分别设置若干浓度；多肽终浓度分别为20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM和0μM)，将混合物加入肝癌细胞系Huh7中感染3小时，更换新鲜含10％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen公司购买)继续培养48小时，利用荧光素酶检测系统(购自Promega公司)进行病毒感染效率的测定。结果见表2。

表210条多肽的IC50值

	IC50，μM		IC50，μM
				CL58(多肽1)	2.1±0.5	CL58.6(多肽6)	23.8±2.1
CL58.2(多肽2)	4.3±0.3	CL58-2(多肽7)	7.6±0.9
				CL58.3(多肽3)	8.9±1.0	CL58+2(多肽8)	17.8±1.1

CL58.4(多肽4)	12.5±1.5	CL58+4(多肽9)	4.0±0.3
				CL58.5(多肽5)	21.5±1.9	CL58+6(多肽10)	5.1±0.6

实施例5、多肽1对肝癌细胞系Huh7以及HepG2、293T细胞等的细胞毒性

利用MTT检测试剂盒(购自Promega公司)分别分析多肽1对各种细胞(肝癌细胞系Huh7、HepG2和293T)的细胞毒性等细胞的细胞毒性分析。对每种细胞的分析方法如下：细胞接种于96孔板中，培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中至细胞密度达到50％，取不同终浓度的多肽1(2μM、4μM、8μM、16μM、32μM、64μM和128μM)处理上述细胞48小时，按照Promega公司试剂盒说明书进行操作，测定细胞毒性。

结果：多肽1对于肝癌细胞系Huh7、HepG2和293T等细胞的毒性(半数致死剂量)均大于100μM。

实施例6、多肽1的抗病毒机理研究

由于多肽1的序列来源于HCV的受体CLDN1，为深入研究多肽1抑制HCV侵入的机制，探讨多肽1的抗病毒活性是否由于改变了受体CLDN1的亚细胞定位而造成的，分别用20μM的多肽1和相同体积的溶剂DMSO作为对照处理Huh7细胞24小时后，利用免疫荧光染色的方法分析CLDN1的细胞定位情况。

细胞接种于含玻片的96孔板中，进行相应处理。处理结束后，以PBS洗涤细胞3次，采用2％的多聚甲醛固定细胞后，以Triton-X100处理通透细胞3次，每次10分钟。分别以抗Claudin-1的抗体和FITC荧光标记二抗进行细胞染色，细胞核以DAPI标记。通过Leica TCS SP5采集图像。

结果如图6所示，多肽1处理Huh7肝癌细胞不改变HCV受体CLDN1的表达量及亚细胞定位。其中DMSO处理作为阴性对照。两种处理后CLDN1蛋白仍然定位于细胞紧密连接处(Tight Junction)。这一结果说明多肽1的作用靶点并不在宿主，因此其细胞毒性可能极低。

序列表

<110>中国医学科学院病原生物学研究所

<120>抑制丙型肝炎病毒侵入的多肽

<130>CCGNARY102180

<160>13

<210>1

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Met Ala Asn Ala Gly Leu Gln Leu Leu Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu

1               5                   10                  15

Gly Trp

<210>2

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Leu Leu Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu Gly Trp Ile Gly Ala Ile Val

1               5                   10                  15

Ser Thr

<210>3

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Phe Ile Leu Ala Phe Leu Gly Trp Ile Gly Ala Ile Val Ser Thr Ala

1               5                   10                  15

Leu Pro

<210>4

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

Ala Phe Leu Gly Trp Ile Gly Ala Ile Val Ser Thr Ala Leu Pro Gln

1               5                   10                  15

Trp Arg

<210>5

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

Gly Trp Ile Gly Ala Ile Val Ser Thr Ala Leu Pro Gln Trp Arg Ile

1               5                   10                  15

Tyr Ser

<210>6

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

Gly Ala Ile Val Ser Thr Ala Leu Pro Gln Trp Arg Ile Tyr Ser Tyr

1               5                   10                  15

Ala Gly

<210>7

<211>16

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

Met Ala Asn Ala Gly Leu Gln Leu Leu Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu

1               5                   10                  15

<210>8

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

Met Ala Asn Ala Gly Leu Gln Leu Leu Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu

1               5                   10                  15

Gly Trp Ile Gly

            20

<210>9

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

Met Ala Asn Ala Gly Leu Gln Leu Leu Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu

1               5                   10                  15

Gly Trp Ile Gly Ala Ile

            20

<210>10

<211>24

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

Met Ala Asn Ala Gly Leu Gln Leu Leu Gly Phe Ile Leu Ala Phe Leu

1               5                   10                  15

Gly Trp Ile Gly Ala Ile Val Ser

            20

<210>11

<211>1677

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

taccaagtgc gcaattcctc ggggctttac catgtcacca atgattgccc taactcgagt     60

attgtgtacg aggcggccga tgccatcctg cacactccgg ggtgtgtccc ttgcgttcgc    120

gagggtaacg cctcgaggtg ttgggtggcg gtgaccccca cggtggccac cagggacggc    180

aaactcccca caacgcagct tcgacgtcat atcgatctgc ttgtcgggag cgccaccctc    240

tgctcggccc tctacgtggg ggacctgtgc gggtctgtct ttcttgttgg tcaactgttt    300

accttctctc ccaggcgcca ctggacgacg caagactgca attgttctat ctatcccggc    360

catataacgg gtcatcgcat ggcatgggat atgatgatga actggtcccc tacggcagcg    420

ttggtggtag ctcagctgct ccggatccca caagccatca tggacatgat cgctggtgct    480

cactggggag tcctggcggg catagcgtat ttctccatgg tggggaactg ggcgaaggtc    540

ctggtagtgc tgctgctatt tgccggcgtc gacgcggaaa cccacgtcac cgggggaagt    600

gccggccgca ccacggctgg gcttgttggt ctccttacac caggcgccaa gcagaacatc    660

caactgatca acaccaacgg cagttggcac atcaatagca cggccttgaa ctgcaatgaa    720

agccttaaca ccggctggtt agcagggctc ttctatcagc acaaattcaa ctcttcaggc    780

tgtcctgaga ggttggccag ctgccgacgc cttaccgatt ttgcccaggg ctggggtcct    840

atcagttatg ccaacggaag cggcctcgac gaacgcccct actgctggca ctaccctcca    900

agaccttgtg gcattgtgcc cgcaaagagc gtgtgtggcc cggtatattg cttcactccc   960

agccccgtgg tggtgggaac gaccgacagg tcgggcgcgc ctacctacag ctggggtgca  1020

aatgatacgg atgtcttcgt ccttaacaac accaggccac cgctgggcaa ttggttcggt  1080

tgtacctgga tgaactcaac tggattcacc aaagtgtgcg gagcgccccc ttgtgtcatc  1140

ggaggggtgg gcaacaacac cttgctctgc cccactgatt gtttccgcaa gcatccggaa  1200

gccacatact ctcggtgcgg ctccggtccc tggattacac ccaggtgcat ggtcgactac  1260

ccgtataggc tttggcacta tccttgtacc atcaattaca ccatattcaa agtcaggatg  1320

tacgtgggag gggtcgagca caggctggaa gcggcctgca actggacgcg gggcgaacgc  1380

tgtgatctgg aagacaggga caggtccgag ctcagcccat tgctgctgtc caccacacag  1440

tggcaggtcc ttccgtgttc tttcacgacc ctgccagcct tgtccaccgg cctcatccac  1500

ctccaccaga acattgtgga cgtgcagtac ttgtacgggg tagggtcaag catcgcgtcc  1560

tgggccatta agtgggagta cgtcgttctc ctgttcctcc tgcttgcaga cgcgcgcgtc  1620

tgctcctgct tgtggatgat gttactcata tcccaagcgg aggcggcttt ggagaac     1677

<210>12

<211>1677

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

tatgaagtgc gcaacgtatc cggagtgtac catgtcacga acgactgctc caacgcaagc   60

attgtgtatg aggcagcgga catgatcatg catacccccg ggtgcgtgcc ctgcgttcgg  120

gagaacaact cctcccgctg ctgggtagcg ctcactccca cgctcgcggc caggaacgct  180

agcgtcccca ctacgacgat acgacgccat gtcgatttgc tcgttggggc ggctgctctc  240

tgctccgcta tgtacgtggg agatctctgc ggatctgttt tcctcgtcgc ccagctgttc  300

accttctcgc ctcgccggca cgagacagta caggactgca attgctcaat atatcccggc  360

cacgtgacag gtcaccgtat ggcttgggat atgatgatga actggtcacc tacagcagcc  420

ctagtggtat cgcagttact ccggatccca caagctgtcg tggatatggt ggcgggggcc   480

cattggggag tcctagcggg ccttgcctac tattccatgg tggggaactg ggctaaggtt   540

ctgattgtga tgctactctt tgccggcgtt gacgggggaa cctatgtgac aggggggacg   600

atggccaaaa acaccctcgg gattacgtcc ctcttttcac ccgggtcatc ccagaaaatc   660

cagcttgtaa acaccaacgg cagctggcac atcaacagga ctgccctgaa ctgcaatgac   720

tccctcaaca ctgggttcct tgctgcgctg ttctacgtgc acaagttcaa ctcatctgga   780

tgcccagagc gcatggccag ctgcagcccc atcgacgcgt tcgctcaggg gtgggggccc   840

atcacttaca atgagtcaca cagctcggac cagaggcctt attgttggca ctacgcaccc   900

cggccgtgcg gtatcgtacc cgcggcgcag gtgtgtggtc cagtgtactg cttcacccca   960

agccctgtcg tggtggggac gaccgaccgg ttcggcgtcc ctacgtacag ttggggggag  1020

aatgagacgg acgtgctgct tcttaacaac acgcggccgc cgcaaggcaa ctggtttggc  1080

tgtacatgga tgaatagcac tgggttcacc aagacgtgcg ggggcccccc gtgtaacatc  1140

ggggggatcg gcaataaaac cttgacctgc cccacggact gcttccggaa gcaccccgag  1200

gccacttaca ccaagtgtgg ttcggggcct tggttgacac ccagatgctt ggtccactac  1260

ccatacaggc tttggcacta cccctgcact gtcaacttta ccatcttcaa ggttaggatg  1320

tacgtggggg gagtggagca caggctcgaa gccgcatgca attggactcg aggagagcgt  1380

tgtaacctgg aggacaggga cagatcagag cttagcccgc tgctgctgtc tacaacggag  1440

tggcaggtat tgccctgttc cttcaccacc ctaccggctc tgtccactgg tttgatccat  1500

ctccatcaga acgtcgtgga cgtacaatac ctgtacggta tagggtcggc ggttgtctcc  1560

tttgcaatca aatgggagta tgtcctgttg ctcttccttc ttctggcgga cgcgcgcgtc  1620

tgtgcctgct tgtggatgat gctgctgata gctcaagctg aggccgccct agagaac     1677

<210>13

<211>1677

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>13

gcccaggtga agaataccag tagcagctac atggtgacca atgactgctc caatgacagc     60

atcacttggc agctcgaggc tgcggttctc cacgtccccg ggtgcgtccc gtgcgagaga    120

gtggggaata cgtcacggtg ttgggtgcca gtctcgccaa acatggctgt gcggcagccc    180

ggtgccctca cgcagggtct gcggacgcac atcgatatgg ttgtgatgtc cgccaccttc    240

tgctctgctc tctacgtggg ggacctctgt ggcggggtga tgctcgcggc ccaggtgttc    300

atcgtctcgc cgcagtacca ctggtttgtg caagaatgca attgctccat ctaccctggc    360

accatcactg gacaccgcat ggcatgggac atgatgatga actggtcgcc cacggccacc    420

atgatcctgg cgtacgtgat gcgcgtcccc gaggtcatca tagacatcgt tagcggggct    480

cactggggcg tcatgttcgg cttggcctac ttctctatgc agggagcgtg ggcgaaggtc    540

attgtcatcc ttctgctggc cgctggggtg gacgcgggca ccaccaccgt tggaggcgct    600

gttgcacgtt ccaccaacgt gattgccggc gtgttcagcc atggccctca gcagaacatt    660

cagctcatta acaccaacgg cagttggcac atcaaccgta ctgccttgaa ttgcaatgac    720

tccttgaaca ccggctttct cgcggccttg ttctacacca accgctttaa ctcgtcaggg    780

tgtccagggc gcctgtccgc ctgccgcaac atcgaggctt tccggatagg gtggggcacc    840

ctacagtacg aggataatgt caccaatcca gaggatatga ggccgtactg ctggcactac    900

cccccaaagc cgtgtggcgt agtccccgcg aggtctgtgt gtggcccagt gtactgtttc    960

acccccagcc cggtagtagt gggcacgacc gacagacgtg gagtgcccac ctacacatgg   1020

ggagagaatg agacagatgt cttcctactg aacagcaccc gaccgccgca gggctcatgg   1080

ttcggctgca cgtggatgaa ctccactggt ttcaccaaga cttgtggcgc gccaccttgc   1140

cgcaccagag ctgacttcaa cgccagcacg gacttgttgt gccctacgga ttgttttagg   1200

aagcatcctg atgccactta tattaagtgt ggttctgggc cctggctcac accaaagtgc   1260

ctggtccact acccttacag actctggcat tacccctgca cagtcaattt taccatcttc   1320

aagataagaa tgtatgtagg gggggttgag cacaggctca cggccgcatg caacttcact   1380

cgtggggatc gctgcgactt ggaggacagg gacaggagtc agctgtctcc tctgttgcac   1440

tctaccacgg aatgggccat cctgccctgc acctactcag acttacccgc tttgtcaact   1500

ggtcttctcc accttcacca gaacatcgtg gacgtacaat acatgtatgg cctctcacct   1560

gctatcacaa aatacgtcgt tcgatgggag tgggtggtac tcttattcct gctcttagcg   1620

gacgccagag tctgcgcctg cttgtggatg ctcatcttgt tgggccaggc cgaagca      1677

Claims (13)

1.多肽，为如下十种多肽中的任意一种：

多肽I：氨基酸序列如序列表的序列1所示；

多肽II：氨基酸序列如序列表的序列2所示；

多肽III：氨基酸序列如序列表的序列3所示；

多肽IV：氨基酸序列如序列表的序列4所示；

多肽V：氨基酸序列如序列表的序列5所示；

多肽VI：氨基酸序列如序列表的序列6所示；

多肽VII：氨基酸序列如序列表的序列7所示；

多肽VIII：氨基酸序列如序列表的序列8所示；

多肽IX：氨基酸序列如序列表的序列9所示；

多肽X：氨基酸序列如序列表的序列10所示。

2.权利要求1所述多肽在制备丙型肝炎病毒侵入抑制剂中的应用，所述多肽为多肽I，所述丙型肝炎病毒为H77基因型的丙型肝炎病毒、Con1基因型的丙型肝炎病毒或JFH1基因型的丙型肝炎病毒。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述H77基因型的丙型肝炎病毒为基因组DNA中具有序列表的序列11所示DNA的丙型肝炎病毒；所述Con1基因型的丙型肝炎病毒为基因组DNA中具有序列表的序列12所示DNA的丙型肝炎病毒；所述JFH1基因型的丙型肝炎病毒为基因组DNA中具有序列表的序列13所示DNA的丙型肝炎病毒。

4.权利要求1所述多肽在制备丙型肝炎病毒侵入抑制剂中的应用，所述多肽为多肽II至多肽X中的任意一条，所述丙型肝炎病毒为H77基因型的丙型肝炎病毒。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述H77基因型的丙型肝炎病毒为基因组DNA中具有序列表的序列11所示DNA的丙型肝炎病毒。

6.一种丙型肝炎病毒侵入抑制剂，它的活性成分为权利要求1所述多肽；所述多肽为多肽I；所述丙型肝炎病毒为H77基因型的丙型肝炎病毒、Con1基因型的丙型肝炎病毒或JFH1基因型的丙型肝炎病毒。

7.如权利要求6所述的抑制剂，其特征在于：所述H77基因型的丙型肝炎病毒为基因组DNA中具有序列表的序列11所示DNA的丙型肝炎病毒；所述Con1基因型的丙型肝炎病毒为基因组DNA中具有序列表的序列12所示DNA的丙型肝炎病毒；所述JFH1基因型的丙型肝炎病毒为基因组DNA中具有序列表的序列13所示DNA的丙型肝炎病毒。

8.一种丙型肝炎病毒侵入抑制剂，它的活性成分为权利要求1所述多肽；所述多肽为多肽II至多肽X中的任意一条；所述丙型肝炎病毒为H77基因型的丙型肝炎病毒。

9.如权利要求8所述的抑制剂，其特征在于：所述H77基因型的丙型肝炎病毒为基因组DNA中具有序列表的序列11所示DNA的丙型肝炎病毒。

10.权利要求1所述多肽在制备治疗或预防丙型肝炎的药物中的应用，所述多肽为多肽I，所述丙型肝炎病毒为H77基因型的丙型肝炎病毒、Con1基因型的丙型肝炎病毒或JFH1基因型的丙型肝炎病毒。

11.权利要求1所述多肽在制备治疗或预防丙型肝炎的药物中的应用，所述多肽为多肽II至多肽X中的任意一条，所述丙型肝炎病毒为H77基因型的丙型肝炎病毒。

12.一种治疗或预防丙型肝炎的药物，它的活性成分为权利要求1所述多肽；所述多肽为多肽I；所述丙型肝炎病毒为H77基因型的丙型肝炎病毒、Con1基因型的丙型肝炎病毒或JFH1基因型的丙型肝炎病毒。

13.一种治疗或预防丙型肝炎的药物，它的活性成分为权利要求1所述多肽；所述多肽为多肽II至多肽X中的任意一条；所述丙型肝炎病毒为H77基因型的丙型肝炎病毒。

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