CN107304224B

CN107304224B - 一种抑制丙型肝炎病毒感染的多肽及其应用

Info

Publication number: CN107304224B
Application number: CN201610240273.2A
Authority: CN
Inventors: 杨威; 迟晓静
Original assignee: National Institute of Pathogen Biology CAMS and PUMC
Current assignee: National Institute of Pathogen Biology CAMS and PUMC
Priority date: 2016-04-18
Filing date: 2016-04-18
Publication date: 2020-07-07
Anticipated expiration: 2036-04-18
Also published as: CN107304224A

Abstract

本发明公开了一种抑制丙型肝炎病毒感染的多肽及其应用。本发明提供一种多肽，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抑制丙型肝炎病毒感染相关的由序列1衍生的多肽。以所述多肽为免疫原得到的抗体也属于本发明的保护范围。本发明还保护所述多肽或所述抗体在抑制丙型肝炎病毒感染中的应用。本发明发现、设计和优化了抗HCV入侵的膜融合抑制多肽候选物，为进一步开发阻断HCV感染的药物提供新靶点，为研发高效的新型小分子抗HCV病毒感染药物奠定了理论基础，在医学领域具有重要的应用前景和创新意义。

Description

一种抑制丙型肝炎病毒感染的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种抑制丙型肝炎病毒感染的多肽及其应用。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)是黄病毒科丙型肝炎病毒属的重要人类病原体，其慢性感染常导致肝硬化、肝癌等严重肝病，威胁人类健康。根据WHO于2013年7月更新的数据，全球约有1.5亿人为HCV慢性感染者，每年死于丙型肝炎相关肝病的人数超过35万。由于HCV具有多种基因型(包括亚型)、病毒基因组高度变异，且缺乏有效的小动物模型等原因，针对HCV的疫苗研究迄今未有实质性突破。近年来，作用于HCV的直接抗病毒药物(DAAs)研发取得了较好的进展，相继获得针对蛋白酶、聚合酶以及NS5A等病毒蛋白的小分子化合物，但迅速产生的耐药突变、价格昂贵以及靶点范围相对较窄等问题仍有待于人们设计新策略。

HCV作为囊膜病毒，病毒的膜融合(membrane fusion)环节是继受体结合和病毒内吞后，实现感染的必需过程。针对囊膜病毒融合机制，通过阻断病毒膜融合可实现高效的抗病毒治疗。例如：针对人免疫缺陷病毒(HIV-1)的膜融合抑制剂已应用于临床治疗多年，是鸡尾酒疗法的重要组成部分，目前HIV膜融合抑制剂的药物开发已进入第三代。然而在HCV领域，尽管受体研究取得重要进展，但是人们对于HCV的膜融合机制仍然知之甚少。

用于HCV膜融合的研究方法通常包括两类：即基于病毒受体与囊膜蛋白的细胞-细胞融合试验和基于病毒囊膜蛋白的脂质体融合试验。病毒膜中的脂类组成对膜融合发挥重要作用，其中胆固醇是必须的组成成分，去掉胆固醇的病毒颗粒的感染效率极低。有趣的是，在目标膜中存在胆固醇的情况下，向病毒膜中加入鞘磷脂可以显著增强膜融合效率。这些证据表明，由胆固醇以及鞘磷脂等脂类组成的所谓脂筏(raft)在HCV入侵特别是融合过程中扮演重要角色。HCV病毒颗粒所结合β脂蛋白(ApoE和ApoB)，也可显著提高其膜融合能力。总体上，尽管科学家们付出了艰辛的努力，但是关于HCV膜融合的分子机制，特别是参与膜融合的囊膜蛋白组成与关键位点、构象变化、外部诱发环境，以及膜融合抑制剂研发等领域仍然留下太多的问题等待回答。

由于病毒膜融合是HCV生活周期的关键环节，因此清晰的阐明病毒膜融合分子机制不但对基础病毒学研究具有重要意义，而且对于开发全新的抗病毒策略更具有创新性指导意义。在世界范围内，病毒膜融合抑制剂类药物研发最成功的领域为人免疫缺陷病毒。2003年，美国FDA批准了第一个抗病毒膜融合抑制剂恩夫韦肽(Enfuvirtide，T20)进入临床应用，从而开启了一类新的抗病毒策略的应用。通过十几年的研究，目前HIV膜融合抑制剂在提高抗病毒活性、广谱性、抗耐药等方面得到了显著地提高。但HCV的膜融合抑制剂领域的研究还刚刚起步。

多年来，人们对于HCV入侵的研究大多数集中在病毒辅助受体的发现及功能研究方面，而随着辅助受体逐步被发现，HCV是如何完成膜融合过程以及如何根据膜融合机制设计新的抗病毒策略这一重要科学问题便摆在科学家面前。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制丙型肝炎病毒感染的多肽及其应用。

本发明提供一种多肽，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抑制丙型肝炎病毒感染相关的由序列1衍生的多肽。

编码所述多肽的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：

(1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码与抑制丙型肝炎病毒感染活性相关多肽的DNA分子；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与抑制丙型肝炎病毒感染活性相关多肽的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

以所述多肽为免疫原得到的抗体也属于本发明的保护范围。所述抗体具体可为多克隆抗体或单克隆抗体。所述多克隆抗体具体可为以所述多肽为免疫原免疫小鼠得到的多克隆抗体。所述小鼠具体可为BLAB/C小鼠。

本发明还保护所述多肽或所述抗体在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(a1)-(a7)中任意一种：

(a1)抑制丙型肝炎病毒感染活性；

(a2)抑制丙型肝炎病毒感染细胞；

(a3)抑制丙型肝炎病毒入侵；

(a4)抑制丙型肝炎病毒入侵细胞；

(a5)抑制丙型肝炎病毒介导的细胞融合；

(a6)预防丙型肝炎；

(a7)治疗丙型肝炎。

本发明还保护一种产品，其活性成分为所述多肽或所述抗体；所述产品的用途为如下(a1)-(a7)中任意一种：

(a1)抑制丙型肝炎病毒感染活性；

(a2)抑制丙型肝炎病毒感染细胞；

(a3)抑制丙型肝炎病毒入侵；

(a4)抑制丙型肝炎病毒入侵细胞；

(a5)抑制丙型肝炎病毒介导的细胞融合；

(a6)预防丙型肝炎；

(a7)治疗丙型肝炎。

本发明还保护所述多肽或所述抗体的应用；所述应用为如下(b1)或(b2)：(b1)抑制丙型肝炎病毒感染；(b2)丙型肝炎病毒感染细胞。所述丙型肝炎病毒具体可为1a亚型的丙型肝炎病毒、1b亚型的丙型肝炎病毒、2a亚型的丙型肝炎病毒、2b亚型的丙型肝炎病毒、3a亚型的丙型肝炎病毒、4a亚型的丙型肝炎病毒、4c亚型的丙型肝炎病毒、5a亚型的丙型肝炎病毒或6a亚型的丙型肝炎病毒。所述丙型肝炎病毒具体可为HCV1a(TNcc)毒株、HCV 2a(J6cc)毒株、HCV 2b(DH8cc)毒株、HCV 3a(S52_5-5A)毒株、HCV4a(ED43_5-5A)毒株、HCV 5a(SA13_5-5A)毒株、HCV 6a(HK6a_5-5A)毒株或JC-1毒株。所述细胞为哺乳动物细胞，具体可为Huh7.5.1细胞。

本发明还保护所述多肽或所述抗体的应用；所述应用为如下(b3)或(b4)：(b3)抑制丙型肝炎病毒入侵；(b4)抑制丙型肝炎病毒入侵细胞。所述丙型肝炎病毒具体可为1a亚型的丙型肝炎病毒、1b亚型的丙型肝炎病毒、2a亚型的丙型肝炎病毒、2b亚型的丙型肝炎病毒、3a亚型的丙型肝炎病毒、4a亚型的丙型肝炎病毒、4c亚型的丙型肝炎病毒、5a亚型的丙型肝炎病毒或6a亚型的丙型肝炎病毒。所述丙型肝炎病毒具体可为HCV 1a(TNcc)毒株、HCV2a(J6cc)毒株、HCV 2b(DH8cc)毒株、HCV 3a(S52_5-5A)毒株、HCV 4a(ED43_5-5A)毒株、HCV5a(SA13_5-5A)毒株、HCV 6a(HK6a_5-5A)毒株或、JC-1毒株。所述细胞为哺乳动物细胞，具体可为Huh7.5.1细胞。

本发明还保护所述多肽或所述抗体的应用；所述应用为抑制丙型肝炎病毒介导的细胞融合。所述丙型肝炎病毒具体可为1a亚型的丙型肝炎病毒、1b亚型的丙型肝炎病毒、2a亚型的丙型肝炎病毒、2b亚型的丙型肝炎病毒、3a亚型的丙型肝炎病毒、4a亚型的丙型肝炎病毒、4c亚型的丙型肝炎病毒、5a亚型的丙型肝炎病毒或6a亚型的丙型肝炎病毒。所述丙型肝炎病毒具体可为HCV 1a(TNcc)毒株、HCV 2a(J6cc)毒株、HCV 2b(DH8cc)毒株、HCV 3a(S52_5-5A)毒株、HCV 4a(ED43_5-5A)毒株、HCV5a(SA13_5-5A)毒株、HCV 6a(HK6a_5-5A)毒株或、JC-1毒株。所述细胞为哺乳动物细胞。所述细胞融合具体可为293T细胞和Huh7.5.1细胞的融合。

本发明还保护所述多肽或所述抗体应用；所述应用为如下(b5)或(b6)：(b5)预防丙型肝炎；(b6)治疗丙型肝炎。

本发明以HCV膜融合模型和囊膜蛋白多肽文库筛选为切入点，充分利用HCV假病毒、细胞培养活病毒等先进病毒学研究工具，通过病毒学、生物化学、结构生物学等方法手段，发现、设计和优化了抗HCV入侵的膜融合抑制多肽候选物，为进一步开发阻断HCV感染的药物提供新靶点。本发明为研发高效的新型小分子抗HCV病毒感染药物奠定了理论基础，在医学领域具有重要的应用前景和创新意义。

附图说明

图1为多肽E27对HCV不同型假病毒入侵细胞的抑制结果。

图2为多肽E27对HCV不同型病毒株入侵细胞的抑制结果。

图3为多肽E27抗体对HCV病毒株感染的抑制结果。

图4为多肽E27的细胞毒性实验结果。

图5为多肽E27抑制HCV E152介导的细胞融合的实验结果。

图6为多肽E27抗体抑制HCV E152介导的细胞融合的实验结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

Huh7.5.1细胞：参考文献：Jin Z，Pablo G，Guofeng C，et al.Robust hepatitisC virus infection in vitro.[J].Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America，2005，102(26)：9294-9299.；公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

293T细胞：国家实验细胞资源共享平台，资源编号：3111C0001CCC000091。

多肽E27先用DMOS作为溶剂制备得到浓度为10mM的母液。使用时将母液加入DMEM培养基，得到含有不同浓度多肽E27的DMEM培养基。

PBS缓冲液：北京索莱宝科技有限公司，产品编号：P1020，PH7.4，0.01M。

荧光素酶检测系统和细胞裂解液：Promega公司，产品编号：E2610。

HCV 1a(TNcc)：参考文献：Yi-Ping L，Santseharay R，Jensen S B，et al.Highlyefficient full-length hepatitis C virus genotype 1(strain TN)infectiousculture system.[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America，2012，109(48)：19757-19762.；公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

HCV 2a(J6cc)：参考文献：Yi-Ping L，Santseharay R，Gottwein J M，etal.Robust full-length hepatitis C virus genotype 2a and 2b infectiouscultures using mutations identified by a systematic approach applicable topatient strains.[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America，2012，109(18)：6806-6807.；公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

HCV 2b(DH8cc)：参考文献：Santseharay R，Yi-Ping L，Jensen S B，etal.Highly efficient infectious cell culture of three hepatitis C virusgenotype 2b strains and sensitivity to lead protease，nonstructural protein5A，and polymerase inhibitors.[J].Hepatology，2014，59(2)：395-407.；公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

HCV 3a(S52_5-5A)：参考文献：Yi-Ping L，Santseharay R，Daryl H，etal.Differential sensitivity of 5’UTR-NS5A recombinants of hepatitis C virusgenotypes 1-6 to protease and NS5A inhibitors.[J].Gastroenterology，2014，146(3)：812-821(e4).；公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

HCV 4a(ED43_5-5A)：参考文献：Yi-Ping L，Santseharay R，Daryl H，etal.Differential sensitivity of 5’UTR-NS5A recombinants of hepatitis C virusgenotypes 1-6 to protease and NS5A inhibitors.[J].Gastroenterology，2014，146(3)：812-821(e4).；公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

HCV 5a(SA13_5-5A)：参考文献：Yi-Ping L，Santseharay R，Daryl H，etal.Differential sensitivity of 5’UTR-NS5A recombinants of hepatitis C virusgenotypes 1-6 to protease and NS5A inhibitors.[J].Gastroenterology，2014，146(3)：812-821(e4).；公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

HCV 6a(HK6a_5-5A)：参考文献：Yi-Ping L，Santseharay R，Daryl H，etal.Differential sensitivity of 5’UTR-NS5A recombinants of hepatitis C virusgenotypes 1-6 to protease and NS5A inhibitors.[J].Gastroenterology，2014，146(3)：812-821(e4).；公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

抗-HCV核心蛋白的抗体：Thermo公司货号：39-6900。

IRDye二抗：Li-Cot，Nebraska，USA。

pPr-CREM/CMV-STOP-luc质粒(包括pPr-CREM质粒和CMV-STOP-luc质粒)：Addgene公司，货号：#8406。

Scramble：阴性对照多肽，氨基酸序列如序列表的序列3所示。

HCV病毒株JC-1：参考文献：Yang W，Hood BL，Chadwick SL，Liu S，Watkins SC，Luo G，Conrads TP，et al.Fatty acid synthase is up-regulated during hepatitis Cvirus infection and regulates hepatitis C virus entry andproduction.Hepatology 2008；48：1396-1403.；公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

实施例1、多肽E27的制备

人工合成多肽E27。多肽E27的氨基酸序列如序列表的序列1所示。

多肽E27的编码基因如序列表的序列2所示。

实施例2、多肽E27抑制HCV假病毒感染

待测假病毒分别为：HCV 1a(H77)、HCV 1b(CH35)、HCV 2a(JFH1)、HCV 3a(UKN3)A1.28、HCV 4c(ED43)、HCV 5(UKN 14.4)、HCV 6(UKN 5.34)或VSV-G。HCV代表丙型肝炎病毒。VSV代表水疱性口炎病毒。上述各个待测假病毒中均携带荧光素酶报告基因。

一、假病毒的制备

1、HCV 1a(H77)假病毒的制备(培养条件均为：37℃、5％CO₂、静置)

HCV 1a(H77)假病毒的囊膜蛋白为H77毒株的囊膜蛋白，代表HCV 1a亚型。HCV 1a(H77)假病毒的制备方法参见文献：Bartosch B，Dubuisson J，Cosset FL.Infectioushepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelopeprotein complexes.J Exp Med 2003；197：633-642.；HCV 1a(H77)假病毒即文献中的“HCVgenotypes 1a”。公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

HCV 1a(H77)假病毒具体可按如下方法制备：

(1)将293T细胞接种至装有含10％FBS的DMEM培养基的10cm平皿内，培养24小时。

(2)完成步骤(1)后，取所述平皿，用pNL4-3.Luc.R-E-和pCMV-E1E2(HCVpp 1aH77)转染其中的细胞(采用TransMAXi转染试剂)，然后将培养体系更换为新的含10％FBS的DMEM培养基并培养48小时。

(3)完成步骤(2)后，离心并收集上清液，即为含有HCV 1a(H77)假病毒的病毒液，简称1a(H77)病毒液。

2、HCV 1b(CH35)假病毒的制备

HCV 1b(CH35)假病毒的囊膜蛋白为CH35毒株的囊膜蛋白，代表HCV 1b亚型。HCVpp1b CH35：参考文献：McKeating JA，Zhang LQ，Logvinoff C，Flint M，Zhang J，Yu J，Butera D，et al.Diverse hepatitis C virus glycoproteins mediate viralinfection in a CD81-dependent manner.J Virol 2004；78：8496-8505.。公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

HCV 1b(CH35)假病毒具体可按如下方法制备：用pCMV-E1E2(HCVpp 1b CH35)代替pCMV-E1E2(HCVpp 1a H77)，其它同步骤1。得到含有HCV 1b(CH35)假病毒的病毒液，简称1b(CH35)病毒液。

3、HCV 2a(JFH1)假病毒的制备

HCV 2a(JFH1)假病毒的囊膜蛋白为JFH1毒株的囊膜蛋白，代表HCV 2a亚型。HCV2a(JFH1)假病毒的制备方法参见文献：Si，Y.et al.A Human Claudin-1-Derived PeptideInhibits Hepatitis C Virus Entry.HEPATOLOGY.56，507-515(2012).；HCVpp 2a JFH1又称为pCMV-E1E2(HCVpp 2a JFH1)；HCV 2a(JFH1)假病毒即文献中的“HCV genotype 2a”。公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

HCV 2a(JFH1)假病毒具体可按如下方法制备：用pCMV-E1E2(HCVpp 2a JFH1)代替pCMV-E1E2(HCVpp 1a H77)，其它同步骤1。得到2a(JFH1)病毒液。

4、HCV 3a(UKN3)A1.28假病毒的制备

HCV 3a(UKN3)A1.28假病毒的囊膜蛋白为UKN3毒株的囊膜蛋白，代表HCV 3a亚型。HCVpp 3a UKN2.8：参考文献：Bartosch B，Dubuisson J，Cosset FL.Infectioushepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelopeprotein complexes.J Exp Med 2003；197：633-642.；公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

HCV 3a(UKN3)A1.28假病毒具体可按如下方法制备：用pCMV-E1E2(HCVpp 3aUKN3)代替pCMV-E1E2(HCVpp 1a H77)，其它同步骤1。得到3a(UKN3)A1.28病毒液。

5、HCV 4c(ED43)假病毒的制备

HCV 4c(ED43)假病毒的囊膜蛋白为ED43毒株的囊膜蛋白，代表HCV 4c亚型。HCVpp4c ED43：参考文献：Bartosch B，Dubuisson J，Cosset FL.Infectious hepatitis Cvirus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope proteincomplexes.J Exp Med 2003；197：633-642.；公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

HCV 4c(ED43)假病毒具体可按如下方法制备：用pCMV-E1E2(HCVpp 4c ED43)代替pCMV-E1E2(HCVpp 1a H77)，其它同步骤1。得到4c(ED43)病毒液。

6、HCV 5(UKN 14.4)假病毒的制备

HCV 5(UKN 14.4)假病毒的囊膜蛋白为UKN 14.4毒株的囊膜蛋白，代表HCV 5亚型。HCVpp 5a UKN 14.4：参考文献：Bartosch B，Dubuisson J，Cosset FL.Infectioushepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelopeprotein complexes.J Exp Med 2003；197：633-642.；公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

HCV 5(UKN 14.4)假病毒具体可按如下方法制备：用pCMV-E1E2(HCVpp 5a UKN14.4)代替pCMV-E1E2(HCVpp 1a H77)，其它同步骤1。得到5(UKN 14.4)病毒液。

7、HCV 6(UKN 5.34)假病毒的制备

HCV 6(UKN 5.34)假病毒的囊膜蛋白为UKN 5.34毒株的囊膜蛋白，代表HCV 6亚型。HCVpp 6a UKN 5.34：参考文献：Bartosch B，Dubuisson J，Cosset FL.Infectioushepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelopeprotein complexes.J Exp Med 2003；197：633-642.；公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

HCV 6(UKN 5.34)假病毒具体可按如下方法制备：用pCMV-E1E2(HCVpp 6a UKN5.34)代替pCMV-E1E2(HCVpp 1a H77)，其它同步骤1。得到6(UKN 5.34)病毒液。

8、VSV-G假病毒的制备

VSV-G假病毒的囊膜蛋白为VSV-G蛋白。VSV-G假病毒的制备方法参见文献：Bartosch B，Dubuisson J，Cosset FL.Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.J Exp Med2003；197：633-642.”；VSV-G假病毒即文献中的“VSV-Gpp”。公众可以从中国医学科学院病原生物学研究所获得。

VSV-G假病毒具体可按如下方法制备：用pCMV-VSV-G代替pCMV-E1E2(HCVpp 1aH77)，其它同步骤1。得到VSV-G病毒液。

9、对照液的制备

(2)完成步骤(1)后，取所述平皿，用PNL4-3.Luc.R-E-转染其中的细胞(采用TransMAXi转染试剂)，然后将培养体系更换为新的含10％FBS的DMEM培养基并培养48小时。

(3)完成步骤(2)后，离心并收集上清液，即为对照液。

10、荧光信号的检测

分别检测步骤1至8得到的各个病毒液以及步骤9得到的对照液的荧光信号，步骤1至8得到的各个病毒液的荧光信号均为对照液的30倍以上。

二、多肽E27抑制HCV假病毒感染

分别将步骤一制备的各个病毒液分别进行如下操作(培养条件均为：37℃、5％CO₂、静置)：

1、取48孔板，每孔接种2×10⁴个Huh7.5.1细胞(采用10％FBS的DMEM培养基)，培养16小时。

2、完成步骤1后，取所述48孔板，将孔内的培养基更换为新鲜的含10％FBS的DMEM培养基(200μL/孔)。

3、完成步骤2后，取所述48孔板，吸弃培养基，每孔中加入200μL感染混合液，先在台式离心机中旋转(30℃、2500rpm)感染1.5h，然后培养1.5h。

感染混合液(200μL)的制备方法：将步骤一制备的病毒液、0.2μL 8μg/mL聚凝胺溶液和2μL HEPES缓冲液(pH7.55、2M)混合。

4、完成步骤3后，取所述48孔板，加入含有不同浓度的多肽E27的DMEM培养基(20μL/孔)，37℃培养6小时。多肽E27在培养体系中的浓度分别为：2.2nM、4.4nM、8.5nM、17nM、34nM、68nM、136nM、312nM、725nM、1250nM、2500nM、5000nM或10000nM。设置用等体积DMEM培养基代替“含有不同浓度的多肽E27的DMEM培养基”的对照甲(空白对照组)。设置用等体积含0.5％(体积比)DMSO的DMEM培养基代替“含有不同浓度的多肽E27的DMEM培养基”的对照乙。每个多肽E27浓度设立3个复孔。对照甲和对照乙均各设置3个复孔。

5、完成步骤4后，取所述48孔板，将孔内的培养基更换为新鲜的含10％FBS的DMEM培养基，37℃培养48小时。

6、完成步骤5后，取所述48孔板，弃除培养基，用无菌PBS缓冲液洗细胞一次，然后加入1×细胞裂解液(80μL/孔)，室温裂解20分钟。

7、完成步骤6后，将所述48孔板的每个孔中的液相以一一对应的方式转移到不透光的96孔板中。

8、完成步骤7后，取所述96孔板，加入Luciferase Assay Reagent(70-100μL/孔)，然后检测荧光强度。荧光强度反应了荧光素酶的活性，从而指示假病毒感染的水平。假病毒入侵效率＝试验组荧光强度/空白对照组荧光强度×100％。

结果如图1所示。图1中，横坐标为多肽E27的浓度以10为底的对数值；纵坐标为假病毒入侵效率。结果表明，多肽E27以剂量依赖的方式抑制HCV假病毒感染。多肽E27不抑制VSV-G假病毒感染。对照组乙的荧光强度与对照组甲的荧光强度无显著差异。

计算多肽E27对不同HCV假病毒引起细胞病变的半数抑制浓度IC₅₀值，结果如表1所示。

表1 多肽E27对不同HCV假病毒的抗病毒活性IC₅₀

实施例3、E27抑制HCV病毒株感染

待测HCV病毒株为：HCV 1a(TNcc)、HCV 2a(J6cc)、HCV 2b(DH8cc)、HCV 3a(S52_5-5A)、HCV 4a(ED43_5-5A)、HCV 5a(SA13_5-5A)或HCV 6a(HK6a_5-5A)。

各个待测病毒株分别按照如下步骤进行操作(培养条件均为：37℃、5％CO₂、静置)：

1、取48孔板，每孔接种2×10⁴个Huh7.5.1细胞(采用10％FBS的DMEM培养基)，培养24小时。

3、完成步骤2后，取所述48孔板，吸弃培养基，每孔加入200μL含有待测HCV病毒株的DMEM培养基(MOI＝0.01)。

4、完成步骤3后，取所述48孔板，加入含有不同浓度的多肽E27的DMEM培养基(20μL/孔)，37℃培养6小时。多肽E27在培养体系中的浓度分别为：0.001894nM、0.009472nM、0.047360nM、0.236800nM、1.184000nM、5.920000nM、29.600000nM、148.000000nM或740.000000nM。设置用等体积DMEM培养基代替“含有不同浓度的多肽E27的DMEM培养基”的对照甲(空白对照组)。设置用等体积含0.5％(体积比)DMSO的DMEM培养基代替“含有不同浓度的多肽E27的DMEM培养基”的对照乙。每个多肽E27浓度设立3个复孔。对照甲和对照乙均各设置3个复孔。

5、完成步骤4后，取所述48孔板，将孔内的培养基更换为新鲜的含10％FBS的DMEM培养基，培养48小时。

6、完成步骤5后，取所述48孔板，弃除孔内的培养基，加入多聚甲醛固定细胞，使用Triton X-100渗透后加入免疫染色的抗-HCV核心蛋白的抗体(1∶400稀释)和IRDye二抗(1∶1000稀释)，最终通过Odeyssey红外荧光扫描成像系统获得数据图片。

病毒株入侵效率＝试验组具有荧光信号的细胞个数/空白对照组具有荧光信号的细胞个数×100％。

结果如图2所示。图2中，横坐标为多肽E27的浓度以10为底的对数值；纵坐标为病毒株入侵效率。结果表明，多肽E27以剂量依赖的方式抑制多种病毒株感染。对照组乙的荧光强度与对照组甲的荧光强度无显著差异。

计算多肽E27对不同HCV病毒株引起细胞病变的半数抑制浓度IC₅₀值，结果如表2所示。

表2 多肽E27对不同HCV病毒株的抗病毒活性IC₅₀

HCV病毒株	IC<sub>50</sub>
		1a(TNcc)	0.5163nM
2a(J6cc)	29.48nM
		2b(DH8cc)	0.1582nM
3a(S52_5-5A)	11.22nM
		4a(ED43_5-5A)	0.3650nM
5a(SA13_5-5A)	0.1800nM
		6a(HK6a_5-5A)	0.3595nM

实施例4、多肽E27抗体抑制HCV病毒株感染

一、以多肽E27为免疫原制备多克隆抗体

用E27多肽(抗原)免疫雌性BLAB/C小鼠，具体步骤如下：

1、初次免疫：抗原剂量80微克/只，使用完全佐剂(250微升/只)，背部皮下多点免疫；

2、第一次加强免疫：抗原剂量40微克/只，使用不完全佐剂(250微升/只)，背部皮下多点免疫；

3、第二次加强免疫：抗原剂量40微克/只，使用不完全佐剂(250微升/只)，背部皮下多点免疫；

4、终加强免疫：抗原剂量80微克/只，使用PBS缓冲液为佐剂(100微升/只)，脾内加强。

5、收集血清，得到多克隆抗体(命名为E27多克隆抗体)。

二、制备同型抗体IgG制备

1、人工合成对照抗原。对照抗原的氨基酸序列如序列表的序列4所示。

2、用对照抗原代替E27多肽，其他同步骤一，得到多克隆抗体(命名为同型抗体IgG)。

三、多肽E27抗体抑制HCV病毒株感染

参照实施例3，具体差异如下：

用E27多克隆抗体取代多肽E27，E27多克隆抗体在培养体系中的浓度分别为：1.0μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、50.0μg/ml或100.0μg/ml(E27多克隆抗体的浓度以总蛋白浓度计)；设置用同型抗体IgG代替E27多克隆抗体的对照；

用HCV JC-1毒株代替待测病毒株。

结果如图3所示。结果表明，E27多克隆抗体以剂量依赖的方式抑制HCV病毒株的入侵，同型抗体IgG不能抑制HCV病毒株的入侵。E27多克隆抗体对HCV病毒引起细胞病变的半数抑制浓度IC₅₀值为9.64μg/ml。

实施例5、多肽E27细胞毒性

培养条件均为：37℃、5％CO₂、静置。

1、将Huh7.5.1细胞以3×10⁴个/mL的浓度加入96孔板中(每孔180μL)，96孔板周边以无血清培养基封闭，培养24小时。

2、完成步骤1后，取所述96孔板，加入含有不同浓度的多肽E27的DMEM培养基(每孔20μL)，培养48小时。多肽E27在培养体系中的浓度分别为：1μM、4μM、5μM、20μM、25μM、50μM、100μM、200μM或400μM。设置用等体积含0.5％(体积比)DMSO的DMEM培养基代替“含有不同浓度的多肽E27的DMEM培养基”的对照。各组均设置相应的背景孔，背景孔不接种细胞，只加入含有相应浓度的多肽E27的DMEM培养基或含有0.5％DMSO的DMEM培养基。每个多肽E27浓度设立3个复孔。对照各设置3个复孔。背景孔各设置3个复孔。

3、完成步骤2后，取所述96孔板，每孔中加入20μL MTT，培养4小时。

4、完成步骤3后，取所述96孔板，吸去各孔内液体，每孔中加入150μL DMSO，平板摇床震摇10min，酶标仪测定各孔的光吸收，波长为570nm。

计算细胞存活率及多肽E27对细胞的毒性CC₅₀值。

按照下列公式计算各浓度组细胞存活率：

细胞存活率％＝(OD_实验组-OD_{实验组背景})/(OD_对照组-OD_{对照组背景})×100％；

细胞增殖抑制率＝100％-细胞存活率％；

结果见图4。图4中，横坐标为多肽浓度以10为底的对数值，纵坐标为细胞增殖抑制率。结果表明，多肽E27以剂量依赖的方式抑制Huh7.5.1细胞的生长，多肽E27对细胞的毒性CC₅₀值为180.3μM。

实施例6、多肽E27抑制HCV介导的细胞融合

293T细胞作为“供体”细胞，Huh7.5.1细胞作为受体细胞，只有融合细胞具有荧光素酶的活性。

培养条件：37℃、5％CO₂、静置。

1、在24孔板内接种293T细胞(采用10％FBS的DMEM培养基)，培养24小时。

2、完成步骤1后，取所述24孔板，向细胞内转染PCMV-E1E2(HCVpp 1a H77)质粒和CMV-STOP-luc质粒(每10⁵个细胞约转染0.5微克PCMV-E1E2(HCVpp 1a H77)质粒和0.5微克CMV-STOP-luc质粒)并培养4小时，然后将培养基更换为新的含10％FBS的DMEM培养基并培养12小时。

3、在24孔板内接种Huh7.5.1细胞(采用10％FBS的DMEM培养基)，培养24小时。

4、完成步骤3后，取所述24孔板，向细胞内转染pPr-CREM质粒(每10⁵个细胞约转染0.5微克pPr-CREM质粒)并培养4小时，然后将培养基更换为新的含10％FBS的DMEM培养基并培养12小时。

5、完成步骤4后，取细胞并进行消化。

6、将步骤5得到的消化后受体细胞覆盖在完成步骤2的供体细胞上(供体细胞与受体细胞的数量比约为1∶2)，共培养4-6小时。

7、完成步骤6后，取所述24孔板，用融合缓冲液处理细胞1-5分钟，然后将孔内液体更换为含有不同浓度的多肽E27的DMEM培养基(每孔中加入20μL)，然后培养6小时。多肽E27在培养体系中的浓度分别为：0.1μM、0.4μM、0.8μM、1.0μM、2.0μM、4.0μM、8.0μM、16.0μM或20.0μM，设置用等浓度的scramble代替多肽E27的对照甲。设置用等体积DMEM培养基代替“含有不同浓度的多肽E27的DMEM培养基”的对照乙(空白对照组)。设置用等体积含0.5％(体积比)DMSO的DMEM培养基代替“含有不同浓度的多肽E27的DMEM培养基”的对照丙。每个多肽E27浓度设立3个复孔。对照甲、对照乙和对照丙均各设置3个复孔。

8、完成步骤7后，取所述24孔板，将孔内的培养基更换为新鲜的含10％FBS的DMEM培养基，培养12小时。

9、完成步骤8后，取所述24孔板，弃除培养基，用无菌PBS缓冲液洗细胞一次，弃掉残留液体，然后加入1×细胞裂解液(80μL/孔)，室温下轻晃，裂解20分钟。

10、完成步骤9后，将所述24孔板的每个孔中的液相以一一对应的方式转移到不透光的96孔板中。

11、完成步骤10后，取所述96孔板，加入Luciferase Assay Reagent(70-100μL/孔)，在化学发光检测仪上检测荧光强度，荧光强度反应了荧光素酶的活性，从而指示细胞的融合水平，并计算多肽E27对Huh7.5.1细胞的抑制半数融合值。

细胞融合率＝实验组荧光强度/空白对照组荧光强度×100％。

细胞融合抑制率＝100％-细胞融合率％。

结果如图5所示。图5中，横坐标为多肽浓度以10为底的对数值，纵坐标为细胞融合率。结果表明，多肽E27以剂量依赖的方式抑制细胞的融合，多肽E27对Huh7.5.1细胞的抑制半融合值为734.2nM。

实施例7、多肽E27抗体抑制HCV介导的细胞融合

参照实施例6，具体差异如下：

使用实施例5制备的E27多克隆抗体替代多肽E27，E27多克隆抗体在培养体系中的浓度分别为：5.0μg/ml、10.0μg/ml、20.0μg/ml、40.0μg/ml、50.0μg/ml、80.0μg/ml、100.0μg/ml、120.0μg/ml、150.0μg/ml、200.0μg/ml或250.0μg/ml(多克隆抗体的浓度以总蛋白浓度计)；使用同型抗体IgG代替E27多克隆抗体作为对照甲。

结果如图6所示。结果表明，mAb anti-E27以剂量依赖的方式抑制细胞的融合，mAbanti-E27对Huh7.5.1细胞的抑制半融合值为108.75μg/ml。

Claims

1.一种多肽，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽。

2.编码权利要求1所述多肽的基因。

3.权利要求1所述多肽在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下（a1）或（a2）：

（a1）预防丙型肝炎；

（a2）治疗丙型肝炎。

4.一种产品，其活性成分为权利要求1所述多肽；所述产品的用途为如下（a1）或（a2）：

（a1）预防丙型肝炎；

（a2）治疗丙型肝炎。