CN101802675A - 荧光焦点调制显微系统和方法 - Google Patents

Abstract

公开一种荧光焦点调制显微系统(10)和方法(200)，以便对具有单光子激发荧光的厚生物组织(140)进行高分辨率分子成像。通过使用焦点调制，即用于抑制由散射光激发的背景荧光信号的技术，对于多散射介质内的成像，保持光学层析和衍射有限空间分辨率。焦点调制显微系统具有插入在激发光路(34)中的空间相位调制器(18)，该空间相位调制器以预定频率周期性地改变焦点体积周围的相干激发光的空间分布。用解调的荧光在显示器(114)上形成荧光焦点调制图像(122，142)，然而共焦图像(120，140)同时是可变的。

Description

荧光焦点调制显微系统和方法

技术领域

本发明总体地涉及光学显微镜，更具体地涉及荧光共焦光学显微系统和方法。

背景技术

已经开发多种光学显微镜，并且在现代生物研究和临床诊断中已经使用了这些光学显微镜。常常需要这些光学显微镜来观察细胞及其亚细胞结构。作为现代细胞生物学的起源，在300多年以前开始发现了细胞，这是发明显微镜的直接结果。传统的光显微镜具有非常有限的成像深度。仅有表面显微结构能够被观察，或者需要将样品机械地分割为非常薄的切片(slice)。作为光学层析能力(optical sectioningcapability)的结果，如美国专利No.3013467中所描述的共焦显微术的发明导致成像深度的飞跃。用生物组织可以实现至多200微米的穿透深度(penetration depth)。共焦显微镜通常用荧光染料工作，以提供分子敏感性(sensitivity)和特异性。通过使用荧光分子的多光子激发，成像深度可以进一步被提高到大约700微米。然而，多光子显微镜需要使用昂贵的脉冲激光器。另外，脉冲激光输出可以对活体细胞产生非线性光子诱导破坏，对于人体的应用尤其不希望这样。

从微观尺度到宏观尺度，生物组织是非均质的(heterogeneous)。通常，由于光子经受强散射和吸收，所以这些生物组织似乎对于可见光和近红外光不透明。散射，尤其是多次散射，在改变光子的传播方向的成像科学中是不希望的现象。妨碍共焦显微镜看见生物组织内的更深处的主要问题是多次散射。可以扩散到焦点体积(focal volume)的从焦点区域发出的荧光不能被共焦针孔(confocal pinhole)充分地拒斥，从而有助于背景信号。信号背景比(signal to background ratio)和空间分辨率随着深度增加而快速地劣化。散射平均值自由程/s，即连续的散射事件之间的平均距离，在人的软组织中的典型值为大约100微米。虽然传统的宽场显微术仅仅能够处理非常薄的样品，但是由于提供光学层析能力，所以共焦显微术的发明在现代光显微术中是一个显著的进步。在共焦显微镜中，用聚焦的光束照射样品，对样品逐点进行扫描，并且通过使用共焦针孔，将检测系统聚焦到样品中的同一区域。在理想的情况中，在收集来自焦点的信号的同时，来自样品的离焦光(out-of-focus light)大部分地被拒斥。然而，在焦点移动到样品中的散射光子占弹道光子(ballistic photon)中的主导的这样深度时，这种选择检测机制不是如此有效。确定空间分辨率的点扩展函数随着成像深度的增加而在空间中快速地扩宽。虽然在几个/_s的深度可以检测到强目标，但是即使在目标位于离表面的仅一个/_s处时，通过背景信号也可以容易地掩盖高分辨率细节。通常用共焦显微镜在几十个微米的最大成像深度处执行亚细胞成像。

在多光子显微术中，在小于1皮秒的超短时间窗内将聚焦的照明光束进一步会聚。非线性吸收率在离焦时急剧地衰减，并且，在成像深度小于1mm时，这种选择激发方法是有效的。作为提高了的成像深度和局部化的光化学(localized photochemistry)的结果，多光子显微术已经日益成为对共焦显微术的流行的另一种选择。然而，多光子显微术是使用超短脉冲的激光源的非常昂贵的技术。另外，在下述一些情况中单光子激发优于多光子激发：其中，非线性光子破坏、荧光探针的可用性、组织自发荧光背景和图像获取速度备受关注。

光学相干X线体层照相术(tomography)是能够提供高分辨率结构图像的相对较新的成像技术。使用相干光栅来分解(resolve)来自不同深度的信号。由于多次散射光子的相干性质在散射后丧失了，所以来自多次散射光子的贡献被严重地抑制。用这种技术可以轻易地实现几个毫米的成像深度。该技术在视网膜前段成像(retinal andanterior segment imaging)中的应用已经被商业化。对该技术在下述领域中的潜在的应用正在进行积极的研究：组织工程产品表征、血管评价、皮肤癌诊断和用于肠胃(GI)跟踪的癌症检测。不幸的，光学相干X线体层照相术的对比机制是基于背散射，并且与荧光不兼容。很多研究组一直试图将诸如吸收和第二谐振产生的其它分子特定技术与光学相干X线体层照相术连接起来。然而，除了其它限制以外，空间分辨率通常与这些组合严格地妥协。光学相干X线体层照相术中的相干光栅机制在拾取期望的信号方面是非常有效的。虽然多次散射的光中的一些仍然到达光电检测器，但是具有很好限定的光程长和偏振状态的背散射、散射一次或反射的光产生用于图像形成的条纹信号。近来用傅立叶域技术进一步提高了成像深度和速度。不幸的，光学相干X线体层照相术与荧光不兼容。虽然光学相干X线体层照相术已经成功地应用到对人眼和中空器官的精细结构的可视化，但是其分子成像能力是相当有限的。

因此，需要一种解决上述缺陷或者至少减轻上面对传统的光学显微镜讨论的问题的光学显微镜。特别地，需要保持较深区域中的近衍射限制分辨率并开发有效地防止与图像形成有关的多次散射光子的机制。

发明内容

本发明的一个方面提供一种荧光焦点调制显微系统，该荧光焦点调制显微系统包括：光源组件，用于产生光束并照射样品的目标区域；空间相位调制器，被布置在光束的路径中并将光束分离为第一光束和第二光束，第一光束与第二光束平行并与第二光束在空间上分离，第二光束被调制有与第一光束不同的相位延迟；聚焦组件，接收第一光束和第二光束并照射样品的目标区域；以及光电检测器组件，用于接收从样品的照射目标区域发射的发光信号，并且将由光电检测器检测到的发光信号转换为具有直流分量和交流分量的光电信号。

在实施例中，该系统还包括处理器和显示器，处理器基于接收光电信号并根据交流分量的交流振幅和直流分量的直流幅度之和计算最大发射强度，处理显示器上的图像，并且/或者，处理器基于接收光电信号和将图像基于光电信号的交流分量，处理显示器上的图像。

空间相位调制器可以包括波长扫描源和差分延迟线，并且，波长扫描源可以被布置为在光路中以预定的差重复地扫动光源的波长。空间相位调制器可以包括第一反射镜和第二反射镜，第二反射镜可相对于第一反射镜移动，以相对于第一光束调制第二光束，其中，第二反射镜可以被安装在压电致动器上，并且第一光束和第二光束之间的相对相移取决于施加到压电致动器的电压。空间相位调制器可以沿着从光源产生的光束的路径和从样品的照射目标区域发射的光的路径布置。聚焦组件可以包括二向色镜和物镜，并且，空间相位调制器可以沿着光束的路径布置在二向色镜的上游或下游。该系统还可以包括扫描组件，用于相对于样品扫描第一光束和第二光束，其中，扫描组件可以包括转向反射镜(steering mirror)，用于相对于样品扫描第一光束和第二光束，并且/或者，扫描组件包括用于保持样品的保持器或可移动载物台(movable stage)和用于相对于第一光束和第二光束可移动地扫描样品的致动器。该系统还可以包括在从样品的照射目标区域发射的发光信号的路径中的光阑，以防止从样品的非目标区域发射的光到达光电检测器，其中，光阑可以是，例如，针孔、狭缝、长通滤波器、光缆等。光源可以被布置用于单光子激发、多光子激发等。光电检测器组件还可以包括光电倍增器，用于将由光电检测器检测到的发光信号转换为具有直流分量和交流分量的光电信号。

本发明的一个方面提供一种用于执行荧光焦点调制显微术的方法，该方法包括：产生用于照射样品的目标区域的光束；用被布置在光束的路径中的空间相位调制器将光束分离为第一光束和第二光束，第一光束与第二光束平行并与第二光束在空间上分离，第二光束被调制有与第一光束不同的相位延迟；用聚焦组件将第一光束和第二光束聚焦；用第一光束和第二光束照射样品的目标区域；接收从样品的照射目标区域发射的发光信号；以及将由光电检测器检测到的发光信号转换为具有直流分量和交流分量的光电信号。

在实施例中，该方法还包括基于接收光电信号并根据交流分量的交流振幅和直流分量的直流幅度之和计算最大发射强度，处理显示器上的图像，并且/或者，基于接收光电信号和将图像基于光电信号的交流分量，处理显示器上的图像。将光束分离可以包括将光束分离为第一光束和第二光束，并且包括在光路中以预定的差重复地扫动光源的波长。将光束分离为第一光束和第二光束可以包括空间相位调制器，该空间相位调制器包括第一反射镜和第二反射镜，并且相对于第一反射镜移动第二反射镜以相对于第一光束调制第二光束。第二反射镜可以被安装在压电致动器上，并且通过将电压施加到压电致动器，在第一光束和第二光束之间产生相对相移。该方法还可以包括相对于样品扫描第一光束和第二光束。该方法还可以包括：通过将光阑放置在从样品的照射目标区域发射的发光信号的路径中，防止从样品的非目标区域发射的光到达光电检测器。用于分离光束的空间相位调制器可以沿着从光源产生的光束的路径布置。空间相位调制器还可以沿着从样品的照射目标区域发射的光的路径布置。

附图说明

为了可以通过非限制性的例子全面、更清楚地理解本发明的实施例，结合附图进行如下的描述，在附图中相同的附图标记表示相似或相应的元件、区域和部分，并且，在附图中：

图1是根据本发明实施例的具有空间相位调制的荧光焦点调制显微镜的示意框图；

图2A-B示出根据本发明实施例的空间相位调制的配置；

图3是根据本发明实施例的具有波长扫描源的空间相位调制器的示意框图；

图4是根据本发明实施例的空间相位调制器的示意图；

图5是根据本发明实施例的具有空间相位调制的荧光焦点调制显微镜的示意框图；

图6A-C示出根据本发明实施例的荧光微球的图像的共焦显微图像(图6A)和焦点调制显微图像(图6B)、以及共焦显微信号和焦点调制显微信号的作为离焦的函数的曲线图(图6C)；

图7A-D示出根据本发明实施例的以400微米的深度的软骨细胞的图像的共焦显微图像(图7A)和焦点调制显微图像(图7B)、以及各自较高的放大(图7C-D)；以及

图8示出根据本发明实施例的方法的流程图。

具体实施方式

公开了焦点调制显微系统和方法。根据本发明实施例的技术以可比得上结合有分子特异性的光学相干X线体层照相术的成像深度为目标。通过在激发光路中使用空间相位调制器，即使在焦点位于混浊介质内的深处时，也主要仅仅在焦点体积中实现强度调制。可以轻易地将检测到的荧光信号中的振荡分量与由多次散射引起的背景信号区分开。实施方式允许同时获取共焦显微图像和焦点调制显微图像。使用取自鸡的组织模型(tissue plantom)和软骨组织，用一系列图像实验来演示焦点调制显微术的优点。可以用根据本发明实施例的焦点调制显微术实现相对于传统共焦显微系统的改进的成像穿透深度，该焦点调制显微术包括较低噪声激光器和较低暗电流的光电检测器。

在图1中示出根据本发明实施例的荧光焦点调制显微系统10。系统机构(system setup)类似于共焦显微镜，该系统机构包括：激发光源16；包括物镜的聚焦组件30；2维扫描镜28；二向色镜22；透镜20；光阑24；光电检测器26；和用于保持样品40的保持器或载物台32。光源产生激发光束34。空间相位调制器18被引入到激发光路中，并且，为图像形成检索时间改变发射信号。由光源产生激发光束，该光源可以是，例如，激光器或者低时间相干源等。然而，激发光束34可以具有良好的空间相干性，并且可以被形成为平行光束。空间相位调制器可以是反射的或透射的。空间调制器18可以具有快时间响应，使得可以使用高调制频率(f～MHz)。具有处理器38、存储器118、输入器116和数据获取(DAQ)系统14的个人计算机12可以处理在检测器上检测到的信号，以在显示器114上显示样品的图像。

图2A-B示出相位调制器调制图案的两个例子。在图2A中，光阑被分成两个大致相同面积的圆形区50。激发光束34被分成相同强度的中心光束52和外周光束54。通过透明区的周围光束经受恒定的相位延迟。用例如频率(f)的谐振信号的时间改变信号调制中心光束的相位，使得这两条光束之间的相差在0和π之间交替地切换。在图2B中，光阑60被分成两个半圆62，64。相位调制仅仅被引入到阴影区52，62。在这两种情况中，两条平行光束被形成有时间改变相差。这些光束通过二向色镜并被2D扫描镜偏转到无限校正的物镜。焦点周围的激发光强度取决于两条入射光束之间的相差。当这两条光束同相位时，它们彼此相长干涉，并且焦点体积内的强度达到最大值。当相差为π时，这两条光束在焦点处彼此相消干涉，并且光功率被引导到焦点体积的右外侧。在相位调制的同一频率处发生强度波动，并且，强度波动被限制在焦点周围的区域。在厚组织样品的其它区域中的激发光的分布保持恒定。这是因为入射光束的弹道分量仅仅在焦点处彼此相遇。多次散射的光子丧失了其相干性，并且不会产生任何强度涨落。来自焦点体积的荧光发射36被同一物镜收集，被2D扫描镜解扫描(descan)，被二向色镜反射，被透镜聚焦，并且在被光电检测器检测之前通过针孔。另一个滤光器可以被插入在光电检测器之前，以进一步抑制激发光。光阑24可以是针孔，并且可以用具有小芯直径的光纤替代。针孔与其它光纤部件一起限定样品内的检测体积。光电检测器组件26可以包括诸如线CCD等的检测器阵列。包括这种检测器阵列的光电检测器组件可以与狭缝光阑等一起使用，或者，在另一个实施例中，检测器阵列自身可以充当狭缝光阑。光电检测器组件还可以包括光电倍增器(PMT)102，用于将由光电检测器检测到的发光信号转换为具有直流分量和交流分量的光电信号。当检测体积与焦点体积匹配或者被包围在焦点体积内时，强交流分量存在于检测的光电信号中。交流信号的振幅仅仅在检测体积中与荧光分子的浓度成比例。该机构也可以在没有针孔的情况下工作。在这种情况下，交流信号与焦点周围的荧光团浓度的差分变化相关。正如传统共焦显微镜中一样，逐点对样品进行扫描，以获得交流振幅和/或相位的2D或3D图，这些2D或3D图是可以由该显微镜实现的分子特定图像。图2A-2B示出调制图案的例子，但是将会理解，可以想象到相位调制器的其它配置，例如，可以在这两条光束之间存在比图2A-2B中示出的间隙大的间隙，光阑可以是具有粗边界的锯齿状光阑等。

实现空间相位调制的另一可选择的方法是使用波长扫描源80，如图3所示。

示出了具有波长扫描源的空间相位调制器70，并且来自光源的输出光束78通过差分延迟线72，该差分延迟线72导致在光程长中具有一定(例如，非零)差的两条平行光束。第一光束74是未调制的光束84，并且，第二光束76是调制光束86。当重复地扫动光源的波长时，对这两条光束之间的相差进行调制。由于检测到的荧光发射中的交流信号仅仅来自焦点体积，所以焦点调制技术等同于多光子显微术中的选择激发。在单光子激发的系统的实施例中，仅仅需要低功率CW光源。然而，原则上，可以将该技术与甚至更大的成像深度的多光子激发相结合。

图5示出该系统的另一个实施例。

图5是根据本发明实施例的原型焦点调制显微系统100的示意图。图5示出原型焦点调制显微系统的示意图。660nm激发光束34的空间相位分布通过使用两个平行反射镜90，92(分别为M1，M2)来被调制。该系统可以具有扩束器110。如在图4中详细地示出，M1相对于光束是稳定的，并且，M2是相对于M1是轴向振荡的。例如，M2可以以5kHz振荡。来自焦点体积的荧光发射36由基于光纤的共焦检测系统收集，然后，从图像信息检索以5kHz的振荡分量94。个人计算机12与该系统互连112，并且用于使用处理器38的数据获取和分析(DAQ)14、使用快转向反射镜28的横向扫描和使用3D载物台的轴向扫描。将会理解，扫描组件可以不同地配置，使得保持样品40的保持器或载物台32可以相对于光束被扫描。另外，空间相位调制器18被示出布置在由光源产生的光束的路径中，将会理解，空间相位调制器18也可以被配置在沿着光束路径的其它位置处，并且可以被配置在例如二向色镜22或扫描镜28和物镜20之间的从样品的照射目标区域发射的光的路径中。在实施例中，调制器被放置为：例如，通过将调制器放置在分束器和扫描镜之间，使得荧光在被检测之前也通过调制器。

图8示出根据本发明实施例的方法200的流程图。产生202光束。将光束分成204第一光束和第二光束。相对于第一光束对第二光束进行调制，并且，对第一光束和第二光束进行聚焦206，以在样品的目标区域上进行照射。检测器接收208从样品的照射目标区域发射的发光信号。将发光信号转换210为具有直流分量和交流分量的光电信号。光电信号的图像可以由计算机12中的处理器14，38处理，并且在显示器114上显示。基于接收光电信号和从交流分量的交流振幅和直流分量的直流幅度之和计算最大发射强度，处理器可以处理显示器114上的图像。基于接收光电信号和将图像基于光电信号的交流分量，处理器可以处理显示器114上的图像。可以检测信号的其它分量。例如，与检测信号的同相和正交分量的锁定放大器一样，可以检测交流信号的相位。

如已经讨论的，焦点调制显微系统是基于共焦显微镜。将空间相位调制器18插入到激发光路中。光源是，例如，660nm固态激光器，该固态激光器的5mW输出光束的直径从1mm扩展到大约5mm。这样的激光器是，例如，美国新泽西州Barrington的Edmund Optics Inc.的NT57-968。当光束通过空间相位调制器时，该光束被分成两条空间分离的半光束，对这些光束进行不同的相位延迟。在实施例中，用虚线框内的两个平行反射镜(M1和M2)实施空间相位调制，每一个反射镜将激发光束的一半偏转到另一个反射镜M3。在M2被安装在压电致动器上的同时，将M1被安装在固定基底上。这种压电致动器是，例如，美国新泽西州Newton的Thorlabs Inc.的AE0203D04。这两半光束之间的相对相移取决于施加到压电致动器的电压。在当前配置中，单频率f-5kHz的正弦电压信号被重叠在适当的DC偏压上，以周期性地改变0和π之间的相对相移。

被M3偏转后的空间相位调制激发光束通过50/50分束器(BS)或二向色镜，并且由2维快转向反射镜引导到20X物镜。转向反射镜可以是，例如，得自美国加利福尼亚州Irvine的Newport Corporation的FSM-300-01，并且，物镜可以是，例如，得自日本东京的Olympus Inc.的LUCPLFLN 20X。由于改变的空间相位分布，进入物镜光阑的激发光束不必一定会聚到焦点。因此，在焦点周围实现激发光的强度调制。当焦点在混浊介质内时，到达焦点的激发光子包括两个弹道的、未散射的和散射的光子。仅有弹道光子有助于振荡的激发率，因为它们具有很好限定的相位和偏振。若有的话，荧光发射由同一物镜收集，并且，由同一快转向反射镜执行解扫描。长通滤波器106用来拒斥660nm的激发光。长通滤波器可以是，例如，得自美国佛蒙特州Brattleboro的Omega Optical Inc.的3RD670LP。然后，用消色差透镜108对荧光进行聚焦，并且，将荧光耦合到单模式光纤119中，该单模式光纤可以充当检测针孔。光电倍增管(PMT)102将由光纤传送的弱光信号转换为电信号，该电信号在被数字化到个人计算机12中之前由40分贝放大器104进一步增强。由于调制激发和随机噪声，获取的光电信号包含直流分量、以5kHz的交流分量。光电倍增管116可以是，例如，日本的Hamamatsu Photonics Co.的R7400U-20。在个人计算机上执行快傅立叶变换(FFT)，以检索交流和直流信号二者。交流振幅和直流幅度之和等于最大发射强度，从而等同于传统的共焦显微信号。然而，焦点调制显微术仅仅使用交流振幅用于图像形成。个人计算机12还控制2D快转向反射镜以逐点扫描样品，从而同时获得共焦显微图像和焦点调制显微图像。

荧光微球的成像

用组织模型执行成像，以表征散射介质中的焦点调制显微术的光学层析能力。猩红的荧光聚苯乙烯微球，例如，得自美国加利福利亚州Carlsbad的Invitrogen Inc.的FluoSpheres F8843，被分布在盖玻片的表面上。微球的激发/发射峰分别是645/680nm。用例如得自OlympusInc.的LUCPLFLN 20X的20X物镜对微球直接成像，在横向和轴向分辨率方面显示共焦显微图像和焦点调制显微图像之间略有不同。然后，荧光层由白色胶制的均质散射层覆盖。散射层的厚度是大约100微米，大致等于2/_s。以50nm的最小增量运动将样品安装在例如得自Thorlabs Inc.的T25XYZ/M的3-轴电动平移载物台。

图6A示出在将激发光束聚焦在这些较小微球的顶表面上获取的微球的共焦显微图像。在图6B中示出同时获取的焦点调制显微图像，这清楚地揭示了关于表面的更多的细节。容易看出，在焦点调制显微图像的中间的微球在中心呈暗色，并且，仅仅其边界是可见的。原因是，该微球大于其它的微球，并且其顶表面是离焦的。相反，同一微球看起来完整无缺，并且几乎与共焦显微图像中的其它微球一样亮。为了进一步比较光学层析能力，通过将平移载物台以4微米增量移动来轴向地扫描样品。在图6C中，在微球处于焦平面中被归一化为峰值的信号电平被描绘为散焦量ΔZ的函数。焦点调制显微信号被限制在大约7微米的FWHM(半峰全宽)，这比得上物镜场深度(～6.5微米)。共焦显微信号的峰值位置向后稍微偏移，并且，FWHM被增大至大约23微米。如图6A-C所示，实现大约400微米的成像深度。图6A-B示出被2/_s厚的散射介质覆盖的荧光微球的图像。图6A示出荧光微球的共焦显微图像120。图6B示出同时获取的焦点调制显微图像122，示出高分辨率细节。图6C示出共焦显微信号132和焦点调制显微信号134作为散焦的函数的曲线图130。焦点调制显微术的很窄的轴向轮廓表示不被散射妥协的光学层析能力。

鸡软骨中的软骨细胞的成像

为了演示用于细胞和亚细胞结构和功能的活体成像的方法，鸡软骨是样品组织，以评价焦点调制显微术的性能。软骨细胞是在软骨中发现的唯一细胞。这些细胞通常呈圆形或钝角形式，位于腺状或几乎均质的母体中的两个以上的组中。亲脂荧光示踪剂用来标记细胞膜，使得仅有软骨细胞在荧光焦点调制显微图像和共焦显微图像中是可见的。

鸡软骨被切成大约1mm厚的切片，并且用DiR(DilC₁₈(7))、即具有780nm的发射峰的亲脂示踪剂标记。用原型焦点调制显微系统以220至400微米的范围内的各种深度扫描样品。在大约220微米的深度处获取共焦显微图像。各个细胞的边界是模糊的，并且，它们都具有相似的形状。在相应的焦点调制显微图像中，较高的分辨率和更好的对比度是显然的。在280微米的深度处，在共焦显微图像中，背景信号似乎甚至更强。聚焦深度以外的细胞投下了不能与焦平面中的细胞区分开的阴影。此外，焦点调制显微图像被获取，并且显示了不妥协的光学层析能力和空间分辨率，这些对于精确评价细胞密度、研究细胞形态学和荧光染料的位点特异性结合能力而言是基本的。

制备组织样品

获得新鲜的鸡翅，并且将软骨切成1mm厚的切片。用PBS清洗软骨切片，然后，用4％多聚甲醛将软骨切片固定在4℃下24个小时。在4℃下将固定的组织浸没在乙醇的1mM DiR(DilC₁₈(7)，Invitrogen)储备溶液中大于24个小时，以允许深区域中的细胞充分着色。用PBS冲洗标记的样品，然后用抗衰减的聚乙烯醇安装介质将标记的样品安装在玻璃载片上并被盖玻片覆盖，例如，该抗衰减的聚乙烯醇安装介质得自美国密苏里州的St.Louis的Sigma-Aldrich的产品No.10981。

焦点调制显微图像和共焦显微图像获取，样品被安装在3-轴载物台上，以便精确电动定位。用点至点扫描同时获取焦点调制显微图像和共焦显微图像。根据成像深度和信号强度，在每一个像素上的停留时间在1至20ms之间变化。每一个图像由具有0.5微米步长的200×200像素构成，并且被插入到400×400像素。在具有鸡软骨的成像实验中，附加的发射滤波器，例如，得自Thorlabs Inc.的RG715，被添加用来进一步拒斥激发光。

图7A-D示出从400微米深度处的鸡软骨获得的软骨细胞的共焦调制图像140(图7A)和焦点调制显微图像142(图7B)。在图7A-B中的框区域的较高放大率显示图像144，146分别被示出在图7C-D中，其中，尺度棒是20微米。图7B示出焦点调制显微图像，图7A示出从400微米深度获得的共焦显微图像。从焦点调制显微图像即图7B评价的细胞密度类似于较浅区域中的那些细胞密度，然而共焦显微图像即图7A包含更多的来自邻近层的细胞。视场的左下角中的小区域被放大并被显示在图7C-D中，以便图像质量比较。

因此，公开一种荧光焦点调制显微系统和方法，以便对具有单光子激发荧光的厚生物组织进行高分辨率分子成像。通过使用焦点调制，即用于抑制由散射光激发的背景荧光信号的技术，对于多散射介质内的成像，保持光学层析和衍射有限空间分辨率。焦点调制显微系统具有插入在激发光路34中的空间相位调制器18，该空间相位调制器以预定频率周期性地改变焦点体积周围的相干激发光的空间分布。用解调的荧光在显示器114上形成荧光焦点调制图像122，142，然而共焦图像120，140同时是可变的。本发明的实施例实现了可比得上光学相干X线体层照相术和多光子显微术的穿透深度。根据本发明的实施例，所实现的成像穿透深度明显大于用传统的共焦荧光显微术可实现的成像穿透深度。然而，本发明的实施例不需要用于选择性激发的脉冲激光源。如已经描述的那样，本发明的实施例使用弹道激光的相干性来仅仅通过焦点调制技术选择性地从焦点体积拾取分布。控制激发光束以在焦点周围产生强度波动。来自此区域的荧光发射具有不存在背景信号的同一频率的交流分量。由于交流信号的起源被限制在由弹道激发光限定的小体积内，所以对于比共焦显微术更大的成像深度，可以保持分辨率和对比度。各实施例与荧光兼容，并且可以用宽范围的市售的荧光染料工作。对人体或动物模型中的细胞结构和机能的活体成像成为可能且不太昂贵。对于此新成像技术，存在宽范围的应用。

将会这样理解，如针对图1-8所描述的各个实施例是出于示例性的目的，因为用于实施公开的示例实施例的具体硬件的诸多变型是可能的。例如，可以通过一个或多个编程计算机系统或装置来实施上述实施例的个人计算机12的功能和这种变型，以执行这些示例系统的一个或多个装置和子系统的功能。针对图1-8描述的示例系统可以用来存储与这里描述的各种处理有关的信息。这种信息可以存储在上述实施例的装置和子系统的诸如硬盘、光盘、磁光盘、RAM等的一个或多个存储器中。上述装置和子系统的一个或多个数据库可以存储用于实施示例实施例的信息。使用包含在诸如各种存储器的一个或多个存储器中的诸如记录、表格、阵列、字段(field)、图形、树(tree)、列表等的数据结构，可以组织上述数据库。使用根据公开的示例实施例的教导编程的一个或多个通用计算机系统、微处理器、数字信号处理器、微控制器等，可以方便地实施针对图1-8描述的示例系统的所有和一部分。本领域的普通程序员基于公开的示例实施例的教导可以轻易地制备合适的软件。另外，通过制备专用集成电路或者通过将元件电路的合适的网络互联，可以实施示例系统。

虽然已经描述和示出本发明的各实施例，但是本领域的技术人员将会理解，在不脱离本发明的情况下，可以对设计或构造的细节作出诸多变型或修改。

Claims (28)

1.一种荧光焦点调制显微系统，包括：

光源组件，用于产生光束并照射样品的目标区域；

空间相位调制器，被布置在光束的路径中并将光束分离为第一光束和第二光束，第一光束与第二光束平行并与第二光束在空间上分离，第二光束被调制有与第一光束不同的相位延迟；

聚焦组件，接收第一光束和第二光束并照射样品的目标区域；以及

光电检测器组件，用于接收从样品的照射目标区域发射的发光信号，并且将由光电检测器检测到的发光信号转换为具有直流分量和交流分量的光电信号。

2.根据权利要求1所述的系统，还包括处理器和显示器，该处理器用于基于接收光电信号和从交流振幅和直流幅度之和计算最大发射强度，处理显示器上的图像。

3.根据权利要求1所述的系统，还包括处理器和显示器，该处理器基于接收光电信号和将图像基于光电信号的交流分量，在显示器上显示图像。

4.根据权利要求1-3中的任意一项所述的系统，其中，空间相位调制器包括波长扫描源和差分延迟线。

5.根据权利要求4所述的系统，其中，波长扫描源被布置为在光路中以预定的差重复地扫动光源的波长。

6.根据权利要求1-5中的任意一项所述的系统，其中，空间相位调制器包括第一反射镜和第二反射镜，第二反射镜可相对于第一反射镜移动，以相对于第一光束调制第二光束。

7.根据权利要求6所述的系统，其中，第二反射镜被安装在压电致动器上，并且第一和第二光束之间的相对相移取决于施加到压电致动器的电压。

8.根据权利要求1-7中的任意一项所述的系统，其中，聚焦组件包括二向色镜和物镜。

9.根据权利要求8所述的系统，其中，空间相位调制器沿着光束的路径布置在二向色镜的上游。

10.根据权利要求8所述的系统，其中，空间相位调制器沿着光束的路径布置在二向色镜的下游。

11.根据权利要求1-10中的任意一项所述的系统，其中，空间相位调制器沿着从光源产生的光束的路径和从样品的照射目标区域发射的光的路径布置。

12.根据权利要求1-11中的任意一项所述的系统，还包括用于相对于样品扫描第一光束和第二光束的扫描组件。

13.根据权利要求12所述的系统，其中，扫描组件包括用于相对于样品扫描第一光束和第二光束的转向反射镜。

14.根据权利要求12所述的系统，其中，扫描组件包括用于保持样品的保持器和用于相对于第一光束和第二光束可移动地扫描样品的致动器。

15.根据权利要求1-14中的任意一项所述的系统，还包括在从样品的照射目标区域发射的发光信号的路径中的光阑，以防止从样品的非目标区域发射的光到达光电检测器。

16.根据权利要求15所述的系统，其中，光阑是从包括针孔、狭缝、长通滤波器或光缆的组中选择的。

17.根据权利要求1-16中的任意一项所述的系统，其中，光源被布置用于单光子激发。

18.根据权利要求1-16中的任意一项所述的系统，其中，光源被布置用于多光子激发。

19.根据权利要求1-18中的任意一项所述的系统，其中，光电检测器组件还包括光电倍增器，用于将由光电检测器检测到的发光信号转换为具有直流分量和交流分量的光电信号。

20.一种用于执行荧光焦点调制显微术的方法，包括：

产生用于照射样品的目标区域的光束；

用被布置在光束的路径中的空间相位调制器将光束分离为第一光束和第二光束，第一光束与第二光束平行并与第二光束在空间上分离，第二光束被调制有与第一光束不同的相位延迟；

用聚焦组件将第一光束和第二光束聚焦；

用第一光束和第二光束照射样品的目标区域；

接收从样品的照射目标区域发射的发光信号；以及

将由光电检测器检测到的发光信号转换为具有直流分量和交流分量的光电信号。

21.根据权利要求20所述的方法，还包括：基于接收光电信号和从交流振幅和直流幅度之和计算最大发射强度，处理显示器上的图像。

22.根据权利要求20所述的方法，还包括：基于接收光电信号和将图像基于光电信号的交流分量，处理显示器上的图像。

23.根据权利要求20-22中的任意一项所述的方法，其中，将光束分离为第一光束和第二光束包括在光路中以预定的差重复地扫动光源的波长。

24.根据权利要求20-23中的任意一项所述的方法，其中，将光束分离为第一光束和第二光束包括空间相位调制器，该空间相位调制器包括第一反射镜和第二反射镜，并且相对于第一反射镜移动第二反射镜以相对于第一光束调制第二光束。

25.根据权利要求24所述的方法，其中，第二反射镜被安装在压电致动器上，并且通过施加电压到压电致动器来产生第一和第二光束之间的相对相移。

26.根据权利要求20-25中的任意一项所述的方法，还包括相对于样品扫描第一光束和第二光束。

27.根据权利要求20-26中的任意一项所述的方法，还包括：通过将光阑放置在从样品的照射目标区域发射的发光信号的路径中，防止从样品的非目标区域发射的光到达光电检测器。

28.根据权利要求20-27中的任意一项所述的方法，其中，用于分离光束的空间相位调制器沿着从光源产生的光束的路径和从样品的照射目标区域发射的光的路径布置。

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