DE102010013829A1

DE102010013829A1 - Mikroskop und Verfahren zur Erfassung von Probenlicht

Info

Publication number: DE102010013829A1
Application number: DE201010013829
Authority: DE
Inventors: Dr. Kalkbrenner Thomas; Ralf Wolleschensky
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH; Carl Zeiss MicroImaging GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2011-09-29
Also published as: JP2013524260A; EP2553512A2; WO2011116901A3; US20130020473A1; US9097889B2; WO2011116901A2

Abstract

Mikroskop und Verfahren zur Erfassung von Probenlicht, mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und einem Mikroskopobjektiv zur intensitätsmodulierten Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe sowie einem Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Demodulator wobei vorteilhaft mindestens ein elektrooptischer Modulator (EOM) zur Phasenmodulation mindestens eines Teils, vorzugsweise der Hälfte des Beleuchtungsstrahls eingesetzt wird oder unterschiedliche Strahlabschnitte – oder hälften des Beleuchtungsstrahls durch gegenphasige Ansteuerung von Piezoelementen unterschiedlich, vorzugsweise gegenphasig, moduliert werden oder akustooptische Modulatoren zur Aufteilung in mehrere Teilstrahlengänge sowie optischen Elemente zur teilweisen Phasenmodulation des Anregungsstrahls vorgesehen sind sowie vorteilhaft Stellelemente zur Einstellung des Phasenunterschieds vorgesehen sind oder mindestens ein optischer Modulator, vorzugsweise ein akustooptischer Modulator (AOM), zur Demodulation in der Detektion eingesetzt wird oder eine Änderung der Betriebsweise der Detektoren zur Demodulation erfolgt oder bei einer Fokiverteilung, beispielsweise erzeugt durch eine rotierende Mikrolinsenscheibe oder einer Multispoterzeugung wird den Einzelfoki eine Intentsitätsmodulation nach dem aufgeprägt, entweder durch Anordnung einer Halbraumphasenmaske in einer Pupillenebene des Objektives oder durch Einzelbeeinflussung jedes Teilstrahles indem er entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird oder Beeinflussung eines Strahls indem er entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und seiner nachfolgender Aufteilung.

Description

Die Erfindung betrifft die Mikroskopie zur optischen Untersuchung insbesondere in stark streuenden Medien mit begrenzter Eindringtiefe, insbesondere biologische Proben.
Herangezogene Literatur:

[1] Chen et al., Opt. Express 16, 18764 (2008)
[2] Wong et al., Appl. Opt. 48, 3237 (2009)
[3] http://www.yokogawa.com/scanner/products/csuX1e_1.htm
[4] Dissertation R. Lange, Universität Siegen (2000)
[5] TOF Kamera mit Lock-In pixeln: http://www.mesa-imaging.ch/
[6] Gated-lntensifier-Kamera: z. B. tautec pico star: http://www.tautec.com/4709/4736.html

Herangezogene Patente sin dim nachfolgenden Text aufgeführt.
Um die Nachteile der Beeinflussung der Probenstreuung auf das Detektionssignal zu begrenzen, sind unterschiedliche Verfahren bereits bekannt:
Die Multiphotonen-Mikroskopie (EP 500717 B2):
Es werden gepulste Laser zur Mehrphotonenanregung verwendet. Die verwendeten Laser sind sehr teuer.
Es gibt applikative Einschränkungen, beispielsweise in der in Wahl der Farbstoffe und durch die hohe Probenbelastung.
Die Fokal Modulation Microscopy (FMM) wie beispielsweise in [1, 2] publiziert:
Bei FMM wird der halbe Anregungslaserstrahl (im Durchmesser) phasenmoduliert. Bei Fokussierung durch ein Mikroskopobjektiv führt diese halbseitige Phasenmodulation zu einer Intensitätsmodulation im Fokalvolumen. Diese Intensitätsmodulation kann nach dem konfokalen Pinhole beispielsweise durch Lock-In-Detektion erfasst werden. Der Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass nur die ballistischen, also ungestreuten, Photonen zu diesem Modulationssignal beitragen; die z. B. in stark streuenden Medien mehrfach gestreuten Photonen verlieren die feste Phasenbeziehung. Dementsprechend tragen die gestreuten Photonen nicht zum Lock-In-demodulierten Signal bei, dadurch wird der Hintergrund durch gestreutes Licht (sowohl in Anregung als auch in Detektion) stark reduziert und die Eindringtiefe eines Laser-Konfokalmikroskops dadurch erhöht.
Bislang werden zur Phasenmodulation des halben Laserstrahls mechanische Ansätze verwendet. In [1] wird der Laserstrahl auf einen geteilten Spiegel gelenkt, dessen eine Hälfte über ein Piezoelement relativ zur anderen Hälfte bewegt wird.
In [2] wird der Strahl zur Hälfte durch eine Glasscheibe geleitet, die sich auf einem Galvanometer-Scanner befindet. Durch Rotation dieser Scheibe wird die Phase der einen Strahlhälfte relativ zur anderen moduliert.
Das Grundproblem aller mechanischen Ansätze (abgesehen von Justage etc.) ist die niedrige Modulationsrate, die durch die mechanische Resonanzfrequenz der eingesetzten Stellelemente beschränkt wird (5–20 kHz für [1] und [2]). Da für das Lock-In-Detektionsverfahren eine Mindestanzahl von Modulationsperioden pro Pixelverweilzeit erforderlich ist (Minimum 5–10), wird damit die Bildaufnahmerate stark eingeschränkt.
Aufgabe der Erfindung ist es die Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden.
Diese Aufgabe wird durch Verfahren und Mikroskope gemäß den unabhängigen Patentansprüchen gelöst.
Bevorzugte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche.
Nachstehend werden besonders vorteilhafte Aspekte der Erfindung anhand von schematischen Darstellungen erläutert.
1. Elektro-Optischer Modulator (EOM):
Erfindungsgemäß werden EOM zur besonders schnellen, nichtmechanischen Phasenmodulation mindestens eines Teils, vorzugsweise der Hälfte des Anregungsstrahls eingesetzt.
Vorteilhaft kann ein Teil des Anregungsstrahls über den EOM verlaufen oder der EOM nur teilweise in einem Teil in dem der Anregungsstrahl verläuft moduliert werden.
Besonders vorteilhaft werden unterschiedliche Strahlabschnitte – oder hälften durch gegenpolige Ansteuerung von Teilen eines EOM oder durch mehrerer EOM unterschiedlich (gegenphasig) moduliert.
Elektro-Optische Modulatoren nutzen den Pockels-Effekt in einem doppelbrechenden Kristall aus, bei dem durch Anlegen einer Spannung die Polarisation oder Phase des Laserlichts verändert wird. Dies kann, abhängig von Art und Größe des Kristalls sehr schnell erfolgen (bis zu einige 10 MHz).
Im Folgenden werden Ausführungen beschrieben, wie sich dies vorteilhaft für die FMM Mikroskopie ausnutzen lässt:

– EOM-Kristall mit entsprechender Strahlaufweitung und kollimiertem Laserstrahl halb beleuchtet ( )
– EOM-Kristall, bei dem das elektrische Wechselfeld durch die Elektroden nur über den halben Strahl definiert wird ( )
– EOM mit gegenläufigen Feldern (ggf. sequentiell angeordnet, um Streufelder zu minimieren) ( )
– Klassischer EOM in Verbindung mit Polarisator vor und nach dem Strahl, wobei die Polarisatoren nur vom halben Strahl durchlaufen wird; so wird direkt die Intensität des halben Strahls moduliert, was ebenfalls zu einer Intensitätsmodulation im Fokus führt.

Ein grundsätzlicher wichtiger Vorteil aller EOM-basierten Lösungen ist die größtmögliche Modulationsrate von einigen 10 MHz.
zeigt die Phasenmodulation eines Teils, insbesondere des halben Laserstrahls mit einem Elektrooptischem Modulator (EOM).
In der –c) ist in einer Draufsicht die Ebene des EOM mit dem schraffiert dargestellten, Laserstrahl L zu sehen.
Der EOM befindet sich in Anlehnung an [1, 2] im Beleuchtungsstrahlengang, vorteilhaft in einem aufgeweiteten (kollimierten) Strahlabschnitt.
Durch die Größe der Strahlaufweitung kann eine Anpassung des Strahlquerschnitts an die Kristallgröße erfolgen.
In wird der Modulationsraum durch den EOM über eine Beleuchtung des Kristalls mit der Hälfte des Laserstrahls L definiert.
Der Kristall weist an den Seiten Elektroden zu seiner hochfrequenten Ansteuerung auf.
In wird der Modulationsraums über die Elektroden des EOM definiert indem nur die Hälfte des EOM, die über der unteren Strahlhälfte liegt, über die Elektroden angesteuert wird, d. h. der Kristall wird zwar ganz beleuchtet, aber nur die Hälfte wird moduliert (durch die Lage der Elektroden).
In werden zwei obere und untere Strahlhälften mit im oberen und im unteren Teil gegenphasig gepolten Elektroden unterschiedlich moduliert.
Die modulierten Abschnitte können, müssen aber am Laserstrahl nicht übereinander sitzen.
Im rechten Teil in 1c ist eine Seitenansicht (in Pfeilrichtung im linken Teil) schematisch dargestellt bei der die angesteuerten Abschnitte vorteilhaft gegeneinander seitenversetzt sind.
Das kann zur Vermeidung von Streufeldern (bei EOM sind hohe Spannungen erforderlich) vorteilhaft sein.
Es kann eine gegenphasig gepolte Ausführung vorteilhaft sein beispielsweise wenn der Kristall nicht modifiziert werden soll, aber Übersprecheffekte von einer Seite auf die andere vermieden werden sollen. Durch die gegenphasige Ansteuerung wird außerdem vorteilhaft der Hubabstand (Abstand der gegenläufigen Amplituden) verdoppelt im Vergleich zur einphasigen Ansteuerung, bei einem gewünschten Phasenunterschied (Hub) könnte dadurch vorteilhaft auch der Kristall verkürzt werden (verkürzte Lauflänge). Durch die versetzte Anordnung der angesteuerten Gebiete des EOM ist außerdem eine Überlappung der beiden Strahlgebiete möglich (über die Hälfte hinaus).
Interessant ist dass sich die gegenphasige Ansteuerung auch eine vorteilhafte Weiterentwicklung von Chen [1] darstellt – hier könnte ein zweiter Piezoantrieb für die zweite Strahlhälfte installiert werden wobei beide Piezoantriebe gegenphasig betrieben werden.
Auch eine entlang des Strahls versetzte Beeinflussung wie in 1c dargestellt ist in Chen [1] vorteilhaft möglich.
2. Vorteilhafter Einsatz Akusto-Optischer Modulatoren (AOM) bei FMM:
Erfindungsgemäß werden akustooptische Modulatoren verwendet um im Zusammenwirken mit einer Aufteilung in mehrere Teilstrahlengänge und optischen Elementen zur teilweisen Phasenmodulation des Anregungsstrahls sowie vorteilhaft Stellelementen zur Einstellung des Phasenunterschieds den Anregungsstrahl zu modulieren.
Akusto-Optische Modulatoren nutzen die Beugung des Laserstrahls an einer stehenden Schallwelle in einem Kristall zum schnellen Ablenken bzw. Schalten eines Lasers. Auch dieser Effekt lässt sich wie folgt zur schnellen Phasenmodulation des halben Laserstrahls verwenden, wenn man die Ablenkung des Strahls entsprechend ausnutzt:

– AOD schaltet schnell zwischen Teilstrahlengängen mit jeweils halber, fester Phasenschiebung (z. B. durch halbe Glasplatte), vgl. .
– AOD schaltet schnell zwischen Teilstrahlengängen, die über einen speziellen Strahlvereiniger wieder kombiniert werden, bei dem ein Halbkreis als Spiegel und der komplementäre Halbkreis als Apertur ausgeführt wird (vgl. ).

Die Phasenverschiebung kann über Veränderung der opt. Weglänge mittels eines Piezostellelements an einem der Umlenkspiegel fein eingestellt und so beispielsweise an unterschiedliche Wellenlängen angepasst werden.
AOMs schalten nicht so schnell wie EOMs (aufgrund der akustischen Ausbreitungsgeschwindigkeit im Kristall), sind aber kostengünstiger.
Die möglichen Schaltraten sind mit 1–10 MHz aber immer noch deutlich höher als alle mechanisch oder elektromechanisch erreichbaren Elementen.
zeigt die schnelle Phasenmodulation des halben Laserstrahls L mittels AOM (A).
In durch Schalten zwischen zwei Strahlwegen, wobei der obere halb durch eine Glasplatte geführt wird. Die Strahlwege werden am Strahlvereiniger (BC) wieder kombiniert.
In teilweise wie in 2a), aber mit einer halben verspiegelten Lochmaske als Strahlvereiniger (weiss = verspiegelt, schwarz = Öffnung).
In ist jeweils ein Laserstrahl im Bereich der Beleuchtung des Mikroskops dargestellt, ein akustooptisches Element A wie beispielsweise ein AOM und Umlenkspiegel m1, m2, m3, Strahlvereiniger BC und ein Piezosteller PZT sowie eine halbkreisförmige Glasplatte P.
A ist akustooptischer Deflektor und schaltet einen Strahl mit einer Frequenz ω zwischen zwei Winkelrichtungen hin und her, in denen ein durchgehender Strahl Sd und ein abgelenkter Strahl Sa verlaufen, in Sa über Spiegel m1, m2, m3 als Strahlumweg.
Platte P in 2a) ist eine Glasplatte als Halbkreis, damit wird der volle Strahl Sa der Umleitung auf der Hälfte phasenmoduliert und der durchgehende Strahl wird nicht phasenmoduliert, am Strahlvereiniger BC werden die beiden Strahlen wieder überlagert und erhalten in BC einen halbseitig modulierten Strahl Sm.
Die absolute Phase des oberen, umgeleiteten Strahls kann über einen Spiegel auf einem Piezostellelement (PZT) eingestellt werden (langsam, DC). Die schnelle Modulation erfolgt durch Schalten zwischen den Strahlengängen durch den AOM.
Das Piezoelement PCT in b) kann auch ein Spiegel mit einem mechanischen Stellelement sein wie in a) durch den Pofeil angedeutet, um den Gangunterschied einstellen zu können.
Der AOM schaltet mit ω zwischen den beiden Strahlen um und schaltet dadurch die halbstrahlige Phasenmodulation an und aus, das führt dann im Fokus zu der erfindungsgemäßen Intensitätsmodulation. Diese Intensitätsmodulation ist periodisch an- und absteigend aber nicht zwingend eine reine Sinusfunktion, sie könnte z. B. rechteckig verlaufen, bei der Demodulation wäre das zu berücksichtigen (höhere harmonische Anteile). Bei einer durch den AOM angenäherten Sinusfunktion würde der Ablenkwinkel zwischen durchgehendem und umgeleiteten Strahl durch den AOM auf M1 leicht variiert werden.
In 2b) ist keine Phasenplatte in Sa vorgesehen, sondern in BC ein halbkreisförmiger reflektierender Teil und einen Halbkreis offen (halbe Lochblende), d. h. der reflektierende Teil wird über den Weglängenunterschied der Strahlengänge (durch das Stellelement PCT einstellbar) phasenverschoben beeinflusst und nach BC hat der Strahl Sm zwei phasenverschobenen Hälften die sich im Fokus überlagern.
Die hier beschriebenen Modulationsverfahren können direkt für die wie in [1] und [2] ausgeführte FMM-Mikroskopie zusammen mit einem schnellen Lock-In-Verstärker eingesetzt werden.
Sie eignen sich aber auch für Detektionsverfahren wie im Folgenden anhand 3 beschrieben, die den Einsatz eines teuren Lock-In Verstärkers umgehen.
Die Verfahren können bei Platzierung des Modulators in der Pupille oder einer konjugierten Ebene auch für Multi-Spot Rastermikroskope eingesetzt werden.
3. Vorteilhafte Ausführungen in der Detektion einer FMM Anordnung.
Erfindungsgemäß werden optische Modulatoren zur Demodulation in der Detektion eingesetzt
oder die Betriebsweise der Detektoren zur Demodulation genutzt.
zeigt einen Mikroskopaufbau zur Erhöhung der Eindringtiefe/Streulichtunterdrückung wobei in einem schematischen Strahlengang von einem Laser L in Richtung einer Probe P ein dichroitischer Teilerspiegel D zur Trennung von Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang vorgesehen.
Die Detektion wird über einen Strahlteiler BS in zwei Teilstrahlengänge aufgespalten, in denen sich Detektoren d1, d2 befinden:
Weiterhin dargestellt sind optische Modulatoren m1, m2, ein Element Ph zur Phaseneinstellung, ein Filter F, ein Fokus-Modulator FM sowie ein Subtraktionsoperator O-.
Der Laser L zur Fluoreszenzanregung wird mit einem Fokus-Modulator (FM) wie beispielsweise anhand 1 und 2 beschrieben mit der Frequenz ω moduliert.
Die über den Dichroiten (D) reflektierte, nun ebenfalls mit ω_· modulierte Fluoreszenz-Strahlung der Probe (P) wird über einen 50/50 Strahlteiler (BS) von zwei Detektoren d1 und d2 phasensensitiv detektiert. Dazu wird beispielsweise vor d1 und d2 jeweils noch ein Modulator m eingesetzt (m1, m2 in 3a) oder der Detektor-gain von d1 und d2 wird moduliert ( ).
Die geglätteten Signale (Filter F, z. B. Integrator) werden dann voneinander subtrahiert (Operator O-).
Die Modulatoren M1, m2 können vorteilhaft optische Modulatoren wie EOM sein m1 wird direkt moduliert und m2 erfährt eine Phasenverschiebung über Ph, dadurch werden zwei Teilsignale detektiert die zueinander eine Phasendifferenz aufweisen (Delta Phi) und gemischt und mit Tiefpassfilter gefiltert, es erfolgt also vorteilhaft eine optische Demodulation mit eingestellter Relativphase, im Idealfall von 90 Grad zwischen den beiden Detektionskomponenten, um die Zustände mit intaktem Fokus und die verschobenen Zustände in denen der Fokus durch die destruktive Interferenz gestört ist, voneinander subtrahieren zu können (-Operator).
So wird auf jedem Pixel vom Signal aus dem Fokus der außerfokale Hintergrund (Streulicht) abgezogen.
In 3b wird nicht das optische Signal moduliert sondern der „gain” der Detektoren (z. B. Beschleunigungsspannung eines PMT), jeweils über FM angesteuert und wieder über Ph die Phase eingestellt, die Signale mit F gefiltert und mit O- subtrahiert.
Die Detektoren d1, d2 werden beispielsweise mit Frequenz ω (und eingestellter Phasenverschiebung) ein- und ausgeschaltet.
Abb. 4:
Dient der Veranschaulichung der Signaldetektion.
Oben ist zunächst die Fluoreszenzanregung im Fokusbereich mit den Strahlhälften in Phase (1) und 180° phasenverschoben (aus Gong et al., Optics Letters 34, 3508 (2009)) dargestellt.
Unten werden die Signale veranschaulicht

a) ist ein angenommenes Signal eines klassischen Konfokalmikroskops in einem stark streuenden Medium über 3 Pixel. Das Signal aus dem Fokus liegt kaum über dem Hintergrund, der durch den Weg des Anregungsstrahls durch die Probe erzeugt wird.
b) ist das entsprechende Signal unter Verwendung eines Phasenmodulators wie z. B. in . Es wird schnell zwischen den oben gezeigten Zuständen 1) und 2) hin- und hergeschaltet. Da der Anregungsstrahl aber phasenmoduliert ist und sich diese Modulation erst im Fokus in eine Intensitätsmodulation umwandelt, ist der starke Hintergrundbeitrag durch den Strahlweg durch die Probe für beide Zustände 1) und 2) im Wesentlichen gleich.

Durch phasenrichtige elektronische Subtraktion dieser beiden Signale gemäß kann also der gesamte Hintergrundbeitrag eliminiert werden, es bleibt das in c) gezeigte Nutzsignal.
4. Optische Modulation im Detektionsstrahlengang:
Erfindungsgemäß wird mittels AOM eine Strahlumschaltung zur Demodulation genutzt.
zeigt einen Strahlengang ähnlich wie in 3 dargestellt.
Hier wird zwischen jedoch zwischen den Detektoren d1 und d2 mit der Frequenz ω umgeschaltet, vorteilhaft mittels eines AOD (A), ähnlich wie in 2 dargestellt, jedoch hier in der Detektion.
Wiederum und wie schon dargestellt und erläutert erfolgt eine Subtraktion der in-Fokus und ausser-Fokus Signale und Tiefpass-Filtern.
Dadurch dass kein Strahlteiler verwendet wird geht nicht jeweils die Hälfte der Signalintensität verloren.
Über Ph kann der Phasenunterschied eingestellt werden.
5. Weitfeldmikroskop mit Hintergrundunterdrückung
Erfindungsgemäß und überraschend wird einer Fokiverteilung, beispielsweise erzeugt durch eine rotierende Mikrolinsenscheibe oder einer Multispoterzeugung wie in US 6.028.306 beschrieben die zum Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden Anmeldung gemacht wird, eine Intensitätsmodulation nach dem FMM verfahren wird den Einzelfoki aufgeprägt, entweder gemeinsam durch Anordnung einer Halbraummaske nach dem FMM Verfahren, insbesondere wir oben beschrieben, in einer Pupillenebene des Objektives oder durch Einzelbeeinflussung jedes Teilstrahles nach dem FMM Verfahren oder durch gemeinsame Beeinflussung eines Strahls und nachfolgender Aufteilung wie in DE 199 04 592 C2 , US 6219179 beschrieben.
Die oben dargestellten für ein punktscannendes System ausgeführten Modulations- und Demodulationsverfahren lassen sich wie im Folgenden ausgeführt vorteilhaft beispielsweise auch auf eine Weitfeld-Fluoreszenzabbildung ausdehnen.
Dazu kann ein Mikroskopaufbau wie in skizziert verwendet werden.
zeigt ein Weitfeld-FMM Mikroskop mit rotierender Mikrolinsen-Scheibe (SML) im Zwischenbild, einem Fokusmodulator (FM) in der Pupille des Mikroskopobjektives O, und Kamera (K) mit triggerbarem Bildverstärker.
zeigt ein Beispiel zur diskreten Demodulation mit 4 Teilbildern (aus [4]).
dient beispielhaft zur Veranschaulichung der Modulations- und Pixelfrequenzen.
Eine Spinning-Microlens-Disc wie z. B. in einem Yokogawa-Weitfeld Scanmodul [3] wird so in die Nähe einer Zwischenbildebene gebracht, dass die Foki der Mikrolinsen durch das Objektiv in die Probe abgebildet werden. Jeder dieser Foki muss nun wie oben oder in [1] und [2] beschrieben in seiner Intensität moduliert werden. Um dies zu erreichen, kann ein Modulator wie in oben schon beschrieben in eine Pupille des Beleuchtungsstrahlengangs gebracht werden. Durch die dort erfolgende Phasenmodulation erfahren alle Foki eine entsprechende Intensitätsmodulation in der Probe.
Um die vorteilhafte Streulichtunterdrückung der Methode auszunutzen, muss nun auch phasenrichtig im Weitfeld detektiert werden. Dies kann über eine Kamera mit triggerbarem Bildverstärker (z. B. [6]) erfolgen: letzterer kann sehr schnell geschaltet werden und fungiert als schnelles „Gate”, das während der vergleichsweise langen Aufnahmezeit der konventionellen CCD oder CMOS Kamera dahinter moduliert wird. Bei entsprechender Synchronisation von Modulator FM, Bildverstärker und rotierender Mikrolinsenscheibe SML können beispielsweise zwei Bilder sequentiell aufgenommen werden, wobei das erste mit „intakten” Foki (beide Anregungsstrahlenhälften in Phase, ) und das zweite mit „zerstörten” Foki (beide Anregungsstrahlenhälften gegenphasig, ). Wenn mehr als diese zwei beispielhaften „Stützstellen” der Modulationsperiode abgetastet werden, kann so die Phasenlage auch im Weitfeld rekonstruiert werden, beispielsweise aus 3 oder 4 Kamerabildern pro Periode. Die Mittelung über mehrere Perioden kann die Signalqualität weiter verbessern.
Die Lage von FM in der Pupille bedeutet dass alle Teilstrahlen je nach Lage auf der Probe unter unterschiedlichem Winkel in der Pupille vorliegen, in der Pupille füllt jeder Punkt die Pupille aus und dadurch dass die halbe Pupille durch FM moduliert wird wird jeder Spot zur Hälfte phasenmoduliert und in der Probe überlagert,
FM kann ein EOM sein, jedoch auch ein Element wie im Stand der Technik unter [1, 2].
In reduziert dargestellt ist das Scanschema einer Spinning Microlens Disc: alle Pixel 1 werden gleichzeitig belichtet, dann alle Pixel 2 etc. Bei einem Umlauf der Scheibe wird ein komplettes Bild belichtet. Damit das gesamte Bild phasenrichtig demoduliert werden kann, muss die Rotation der Scheibe phasengekoppelt erfolgen, so dass alle Pixel 1, 2, 3, 4 ... die gleiche Phasenlage haben. Die Modulation ω muss also auch ein ganzzahliges Vielfaches der Rotationsfrequenz und Pixelfrequenz der Scheibe sein. Die Frequenz, mit der der Intensifier getriggert wird, muss wiederum ein Vielfaches der Modulationsfrequenz sein.
Konkretes Beispiel:
Eine typische Spinning Disc [3] kann mit 125 U/sec oder mehr betrieben werden, wobei das Verhältnis (Gesamtzahl Mikrolinsen/Zahl simultan beleuchteter Linsen) z. B. 12 beträgt, so dass pro Umdrehung 12 Bilder gerastert werden, also eine Bildrate von 1500 Hz. Bei beispielsweise 1000 simultan gerasterten Linsen und 500×500 Kamerapixeln ergeben sich 250 Pixelbelichtungen pro Mikrolinse und Bild und damit bei 10 MHz Modulationsfrequenz des Halbstrahl-Modulators 10 MHz/(1500 Hz·250) ~26 Modulationsperioden pro Pixel, die abgetastet und aufintegriert werden können, um z. B. einen Messpunkt zur Ermittelung der Phasenlage zu erhalten. Für 4 Phasenpunkte (wie in ) würde sich dann eine vorteilhafte Gesamt-Bildrate von 375 Hz ergeben.
Alternativ zu der Image-Intensifier Kamera kann auch eine CMOS/CCD Kamera mit integrierten Lock-In-Pixeln verwendet werden, wie z. B. [4] & [5]. Diese Kameras werden normalerweise für Time-of-flight-basierte Entfernungsmessung in Verbindung mit einer modulierten Beleuchtung eingesetzt, können aber auch in einer Anordnung wie in zur Demodulation eingesetzt werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 500717 B2 [0004]
US 6028306 [0073]
DE 19904592 C2 [0073]
US 6219179 [0073]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Chen et al., Opt. Express 16, 18764 (2008) [0002]
Wong et al., Appl. Opt. 48, 3237 (2009) [0002]
http://www.yokogawa.com/scanner/products/csuX1e_1.htm [0002]
Dissertation R. Lange, Universität Siegen (2000) [0002]
http://www.mesa-imaging.ch/ [0002]
http://www.tautec.com/4709/4736.html [0002]
Gong et al., Optics Letters 34, 3508 (2009) [0064]

Claims

Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und einem Mikroskopobjektiv zur intensitätsmodulierten Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe sowie einem Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Demodulator wobei mindestens ein elektrooptischer Modulator (EOM) zur Phasenmodulation mindestens eines Teils, vorzugsweise der Hälfte des Beleuchtungsstrahls eingesetzt wird.
Mikroskop nach Anspruch 1, wobei ein Teil des Beleuchtungssstrahls über den EOM verläuft oder der EOM sich nur teilweise im Beleuchtungsstrahl befindet.
Mikroskop nach mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, wobei unterschiedliche Strahlabschnitte – oder hälften des Beleuchtungsstrahls durch gegenpolige Ansteuerung von Teilen eines EOM oder mehrerer EOM unterschiedlich, vorzugsweise gegenphasig, moduliert werden.
Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und einem Mikroskopobjektiv zur intensitätsmodulierten Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe sowie einem Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Demodulator wobei unterschiedliche Strahlabschnitte – oder hälften des Beleuchtungsstrahls durch gegenphasige Ansteuerung von Piezoelementen unterschiedlich, vorzugsweise gegenphasig, moduliert werden.
Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und einem Mikroskopobjektiv zur intensitätsmodulierten Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe sowie einem Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Demodulator, insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei akustooptische Modulatoren zur Aufteilung in mehrere Teilstrahlengänge sowie optische Elemente zur teilweisen Phasenmodulation des Anregungsstrahls vorgesehen sind sowie vorteilhaft Stellelemente zur Einstellung des Phasenunterschieds vorgesehen sind.
Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und einem Mikroskopobjektiv zur intensitätsmodulierten Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe sowie einem Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Demodulator insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mindestens ein optischer Modulator, vorzugsweise ein akustooptischer Modulator (AOM), zur Demodulation in der Detektion eingesetzt wird.
Mikroskop nach Anspruch 6, wobei mittels mindestens eines akustooptischen Modulators (AOM) eine Strahlumschaltung zur Demodulation erfolgt.
Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und einem Mikroskopobjektiv zur intensitätsmodulierten Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe sowie einem Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Demodulator insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Änderung der Betriebsweise der Detektoren zur Demodulation erfolgt.
Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl, der entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und einem Mikroskopobjektiv zur intensitätsmodulierten Fokussierung des Beleuchtungsstrahls in eine Probe sowie einem Detektionsstrahlengang mit mindestens einem Demodulator insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei bei einer Fokiverteilung, beispielsweise erzeugt durch eine rotierende Mikrolinsenscheibe oder einer Multispoterzeugung wird den Einzelfoki eine Intentsitätsmodulation nach dem aufgeprägt, entweder durch Anordnung einer Halbraumphasenmaske in einer Pupillenebene des Objektives oder durch Einzelbeeinflussung von aufgespaltenen oder separaten Teilstrahlen indem sie entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert werden oder Beeinflussung eines Strahls indem er entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und seiner nachfolgender Aufteilung in Teilstrahlen.
Verfahren zur mikroskopischen Erfassung von Licht einer Probe, die mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl über ein Mikroskopobjektiv zur Fokussierung beleuchtet wird, der in seinem Querschnitt teilweise phasenmoduliert ist, wobei in einem Detektionsstrahlengang eine Demodulation erfolgt, wobei vorzugsweise die Phasenmodulierung der Beleuchtung in der Probe in eine Intensitätsmodulation umgewandelt wird die in der Detektion demoduliert wird wobei mindestens ein elektrooptischer Modulator (EOM) zur Phasenmodulation mindestens eines Teils, vorzugsweise der Hälfte des Beleuchtungsstrahls eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei ein Teil des Beleuchtungssstrahls über den EOM verläuft oder der EOM sich nur teilweise im Beleuchtungsstrahl befindet.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei unterschiedliche Strahlabschnitte – oder hälften des Beleuchtungsstrahls durch gegenpolige Ansteuerung von Teilen eines EOM oder mehrerer EOM unterschiedlich, vorzugsweise gegenphasig, moduliert werden.
Verfahren zur mikroskopischen Erfassung von Licht einer Probe, die mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl über ein Mikroskopobjektiv zur Fokussierung beleuchtet wird, der in seinem Querschnitt teilweise phasenmoduliert ist, wobei in einem Detektionsstrahlengang eine Demodulation erfolgt, wobei vorzugsweise die Phasenmodulierung der Beleuchtung in der Probe in eine Intensitätsmodulation umgewandelt wird die in der Detektion demoduliert wird, wobei unterschiedliche Strahlabschnitte – oder hälften des Beleuchtungsstrahls durch gegenpolige Ansteuerung von Piezoelementen unterschiedlich, vorzugsweise gegenphasig, moduliert werden,
Verfahren zur mikroskopischen Erfassung von Licht einer Probe, die mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl über ein Mikroskopobjektiv zur Fokussierung beleuchtet wird, der in seinem Querschnitt teilweise phasenmoduliert ist, wobei in einem Detektionsstrahlengang eine Demodulation erfolgt, wobei vorzugsweise die Phasenmodulierung der Beleuchtung in der Probe in eine Intensitätsmodulation umgewandelt wird die in der Detektion demoduliert wird insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mindestens ein akustooptischer Modulator eine Aufteilung in mehrere Teilstrahlengänge vornimmt sowie optischen Elemente zur teilweisen Phasenmodulation des Anregungsstrahls vorgesehen sind sowie vorteilhaft Stellelemente eine Einstellung des Phasenunterschieds durchführen.
Verfahren zur mikroskopischen Erfassung von Licht einer Probe, die mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl über ein Mikroskopobjektiv zur Fokussierung beleuchtet wird, der in seinem Querschnitt teilweise phasenmoduliert ist, wobei in einem Detektionsstrahlengang eine Demodulation erfolgt, wobei vorzugsweise die Phasenmodulierung der Beleuchtung in der Probe in eine Intensitätsmodulation umgewandelt wird die in der Detektion demoduliert wird, insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mindestens ein optischer Modulator, vorzugsweise ein akustooptischer Modulator (AOM), zur Demodulation in der Detektion eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei mittels des AOM eine Strahlumschaltung zur Demodulation erfolgt.
Verfahren zur mikroskopischen Erfassung von Licht einer Probe, die mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl über ein Mikroskopobjektiv zur Fokussierung beleuchtet wird, der in seinem Querschnitt teilweise phasenmoduliert ist, wobei in einem Detektionsstrahlengang eine Demodulation erfolgt, wobei vorzugsweise die Phasenmodulierung der Beleuchtung in der Probe in eine Intensitätsmodulation umgewandelt wird die in der Detektion demoduliert wird, insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Änderung der Betriebsweise der Detektoren zur Demodulation erfolgt.
Verfahren zur mikroskopischen Erfassung von Licht einer Probe, die mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl über ein Mikroskopobjektiv zur Fokussierung beleuchtet wird, der in seinem Querschnitt teilweise phasenmoduliert ist, wobei in einem Detektionsstrahlengang eine Demodulation erfolgt, wobei vorzugsweise die Phasenmodulierung der Beleuchtung in der Probe in eine Intensitätsmodulation umgewandelt wird die in der Detektion demoduliert wird, insbesondere nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei bei einer Fokiverteilung, beispielsweise erzeugt durch eine rotierende Mikrolinsenscheibe oder eine Multispoterzeugung den Einzelfoki eine Intentsitätsmodulation aufgeprägt wird entweder durch Anordnung einer Halbraumphasenmaske in einer Pupillenebene des Objektives oder durch Einzelbeeinflussung von aufgespaltenen oder separaten Teilstrahlen indem sie entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird oder durch Beeinflussung eines Strahls indem er entlang seines Querschnitts teilweise mit einer Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und seiner nachfolgender Aufteilung.