CN101781636A - 一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒、其构建方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程学和病毒学，尤其涉及一种含人类B亚群11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒、其构建方法及其用途。该腺病毒可以是11型腺病毒，也可以是用11型腺病毒纤毛蛋白的编码序列取代非11型腺病毒的纤毛蛋白编码序列而构成的杂合腺病毒。该腺病毒通过对其增殖必须基因进行的有效控制或突变而具有选择性增殖能力。作为具有更广的感染谱和改良感染能力的条件增殖型的重组病毒，本发明的重组溶瘤腺病毒可以用于基因治疗尤其是肿瘤的基因治疗。

Description

一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒、其构建方法及其用途

技术领域

本发明涉及基因工程学和病毒学，尤其涉及一种含人类B亚群11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒、其构建方法及其用途。该腺病毒可以是11型腺病毒，也可以是用11型腺病毒纤毛头的氨基酸序列取代非11型腺病毒的纤毛头氨基酸序列而构成的杂合腺病毒。该腺病毒通过对其增殖必须基因进行的有效控制或突变而具有选择性增殖能力。作为具有更广的感染谱和改良感染能力的条件增殖型的重组病毒，本发明的重组溶瘤腺病毒可以用于基因治疗尤其是肿瘤的基因治疗。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的一大类疾病，随着社会经济的发展，肿瘤的主要危险因素不但未得到有效控制，反而愈演愈烈，是其发病率和死亡率持续上升。目前恶性肿瘤的常规治疗难以收到预期的疗效，特别是化疗药物的治疗指数低，毒副作用大。近几年，包括基因治疗在内的综合治疗成为肿瘤临床中不可或缺的一部分。我国的重组腺病毒p53注射液“Ad-p53”已于2004年上市，成为世界上第一个上市的癌症基因治疗药物(Wang X等，Mol Cancer Ther.2008Jun；7：1598-1603)。

腺病毒是肿瘤基因治疗的最常用的病毒载体，它是一种双链DNA病毒，基因组长约36kb，衣壳(capsid)呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。衣壳含有240个六联体(hexon)、12个五联体(penton)及12根纤毛(fiber)，除此之外还有其他一些小蛋白，如Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅲa和Ⅳa2等。六联体是形成病毒衣壳20个三角形面的主要蛋白，12个顶端是5个五联体亚单位和3个纤毛蛋白构成的复合物，12根纤毛(Fiber)以五联体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤毛顶端形成头节区(knob)。五联体和纤毛的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用(Gall JG等，J Virol.1998 Dec；72：10260-10264；Sakurai F等，Curr Gene Ther.2007Aug；7：229-238)。

人类腺病毒家族有51个已知血清型，分为6个亚属(A-F)。基因治疗常用的人的2型(Ad2)及5型(Ad5)腺病毒在血清学分类上均属C亚群，在DNA序列上有95％的同源性。腺病毒感染细胞的过程是从腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体开始的。C亚群腺病毒主要与柯萨奇B病毒共用一种受体，因此这种受体被称为柯萨奇/腺病毒受体(coxsackie/adenovirus receptor，CAR)。但是，在人体内造血细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、某些表皮细胞和肿瘤细胞(如膀胱癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、头颈部肿瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤等)表面，CAR是低表达甚至不表达的。由于以腺病毒为载体的基因治疗中CAR介导的腺病毒进入靶细胞是基因转移中的限速步骤，并且转染效率与细胞表面CAR表达水平有关。低水平表达的CAR无疑是制约腺病毒转导效率的主要原因，即表现出细胞对C亚群腺病毒载体的抗性作用(Kim J等，J Virol.2002；76：1892-1903；Cripe TP等，Cancer Res.2001 Apr1；61：2953-2960；Suzuki K等，Clin Cancer Res.2001；7：120-126；Wesseling JG等，Gene Therapy.2001；8：969-976；Bao Y等，Prostate.2005 Sep 1；64：401-407；Stoff-Khalili MA等，Gene Ther.2005 Dec；12：1696-1706)。以CAR为受体的C亚群腺病毒还存在在体内会引起严重毒副作用、人体内广泛存在的Ad5型腺病毒中和抗体很快清除病毒。这些问题限制了Ad5和Ad2的广泛应用。

B亚群腺病毒包括3型、7型、11型、16型、35型、50型腺病毒，该组腺病毒的感染细胞不通过CAR受体，主要以CD46分子为吸附受体(Fleischli C等，J Gen Virol.2007 Nov；88：2925-2934；Pache L等，Virology.2008 Jun 5；375：573-579；Pache L等，J Virol.2008Aug；82：7923-7931)。CD46是一种广泛表达的补体调节蛋白，这种蛋白几乎表达在除了红细胞以外所有人外周血细胞、各类干细胞以及大多数肿瘤细胞表面。因此，利用CD46受体的腺病毒载体近来受到更广泛的关注，人们针对腺病毒载体的靶向性修饰问题提出了许多策略。腺病毒Ad5/F35载体即是一种外壳改造的杂合病毒载体，它的主要结构是在现在的Ad5腺病毒载体的基础上，其受体结合位置的纤毛改造成了35型腺病毒(Ad35)的纤毛。因此，Ad5/F35的细胞受体从Ad5的CAR变成了CD46，原有的感染吸附受体的改变，提高了它对血液细胞、干细胞、肿瘤细胞的感染效率，感染谱比现在常用的Ad5更广，且转导效率普遍比Ad5高(Stone D等，Mol Ther.2007Dec；15：2146-2153；Brouwer E等，Cancer Gene Ther.2007Feb；14：211-219)。实验结果证实，Ad5/F35载体对髓系来源的K562细胞的感染能力明显优于常规的5型腺病毒载体，对B淋巴细胞的感染能力也略高于Ad5载体。AD5/F35的改造改变了载体的感染特性，但是其对细胞的毒性作用并没有因此而增加，证实这种方式的改造载体在干细胞、肿瘤细胞等转导和基因治疗研究中有更广阔的应用空间。

此外，有实验证实，B亚群腺病毒可能存在另一种感染细胞的特异受体。利用Ad5/11-CMV-GFP和Ad5/35-CMV-GFP分别感染CD46阳性表达的A549和Hela细胞，Ad5/11-CMV-GFP的感染效率均比Ad5/35-CMV-GFP高，而同时用这两种载体去感染CD46阳性表达的CHO-C2细胞，效率几乎一样(Stone D等，J Virol.2005；79：5090-5104)。另外，抗血清实验显示，Ad11-Fiber的knob区能完全抑制Ad35与A549细胞的结合，而Ad35-Fiber的knob区并不能完全抑制Ad11与A549细胞的结合(MeiYF等，Virology.2002；295：3043)。分别用Ad5、Ad5/11和Ad5/35感染11种食道癌细胞和6种口腔癌细胞，Ad5/11和Ad5/35对所有肿瘤细胞的感染效率均比Ad5要高很多，而且Ad5/11和Ad5/35的感染效率不依赖于CD46的表达水平(Ling Y等.Oncol Rep.2005；14：831-835)。因此推测可能有其他的受体参与调节Ad11和Ad35对细胞的感染。

尽管以腺病毒为载体的肿瘤基因治疗在实验和临床中取得了一些疗效，但是，进一步提高腺病毒对肿瘤细胞的转导效率、增强抗肿瘤基因的表达、使病毒载体具有更特异的靶向性，从而提高疗效和安全性，是未来肿瘤基因治疗研究的重点方向。

人11型腺病毒载体与传统的C组腺病毒载体相比，有诸多的优点：血清中中和抗体的阳性率较低；与Ad5、Ad35之间也没有交叉免疫反应；感染细胞不依赖CAR受体，对包括造血干细胞、原代肿瘤细胞、肿瘤干细胞在内的许多重要细胞都有较高感染效率；肝脏毒性低，免疫副作用小。因此，开发Ad11载体，高效转染多数干细胞和肿瘤细胞，靶向杀灭肿瘤干细胞，实现彻底杀灭肿瘤的目的，将有十分重要的意义。

基因治疗方案中采用的腺病毒载体，多数采用没有复制能力的增殖缺陷型腺病毒。虽然增殖缺陷型腺病毒在体内外显示了一定的安全性，然而至今在临床试验中应用的大多数此类腺病毒载体尚存在表达外源基因的时间短、免疫原性较强、高滴度时有明显的细胞毒性等许多缺点，因此临床疗效不佳。

要解决上述问题，需要一种能在肿瘤细胞中具有特异性增殖能力、能提高外源基因拷贝数和表达量、并且可以溶解杀死肿瘤细胞的条件增殖型腺病毒载体，即溶瘤腺病毒载体。国内外溶瘤腺病毒项目进展较快，国内上海三维公司的H101项目2005年底被批准上市(Yu W等，Curr Cancer Drug Targets.2007 Mar；7：141-148)。越来越多的数据证明，溶瘤腺病毒有希望成为新一代的肿瘤治疗药物。

发明内容

所要解决的技术问题：

基因治疗方案中采用的腺病毒载体，多数采用人类C亚群5型腺病毒(Ad5)，其感染细胞的过程依赖于CAR。但是，在人体内造血细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、某些表皮细胞和肿瘤细胞表面，CAR低表达甚至不表达。因此，低水平表达的CAR成为制约该类型腺病毒转导效率的主要原因，即表现出细胞对C亚群腺病毒载体的抗性作用。以CAR为受体的C亚群腺病毒还存在在体内会引起严重毒副作用、人体内广泛存在的5型腺病毒中和抗体很快清除病毒。

基因治疗方案中采用的腺病毒载体，多数采用没有复制能力的增殖缺陷型腺病毒。该类腺病毒载体普遍存在表达外源基因的时间短、免疫原性较强、高滴度时有明显的细胞毒性等许多缺点，影响了其临床疗效。

因此，进一步提高病毒载体对肿瘤细胞的转导效率、增强抗肿瘤基因的表达、使病毒载体具有更特异的靶向性，从而提高疗效和安全性，是未来肿瘤基因治疗研究的重点方向。

采用的技术方案：

本发明的目的在于提供一种可用于多种人体肿瘤的基因治疗的增殖型重组溶瘤腺病毒，该重组溶瘤腺病毒能够克服当前增殖缺陷型腺病毒载体(如Ad-p53)转运及表达抗癌基因效率低下、无靶向性的缺点，克服以人Ad5增殖型腺病毒载体(如H101、ONYX-015)仅具有单一抗肿瘤机制、对肿瘤细胞感染力低下、安全性不佳等缺点，其抗肿瘤疗效得以提高，安全性得以改善。

为实现上述目的，本发明提供一种含B亚群11型腺病毒纤毛头(knob)氨基酸编码序列的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，该重组病毒的基因组含B亚群11型腺病毒纤毛头(knob)氨基酸编码序列，所述11型腺病毒纤毛蛋白编码序列，既可以是11型腺病毒，也可以是用人类11型腺病毒纤毛头(knob)的氨基酸序列取代非11型腺病毒的纤毛头氨基酸序列而构成。

在实施例中，该增殖型重组溶瘤腺病毒的骨架序列是5型腺病毒(Ad5)，并由11型腺病毒纤毛头的氨基酸序列取代5型腺病毒的纤毛头氨基酸序列，其纤毛蛋白编码序列如SEQ ID NO：1所示。病毒载体构建方面，通过两种实施方案来说明含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒的功能的改进和用途，一是采用人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子调控E1a基因，同时用人缺氧反应元件(HRE)调控E1b区基因(E1b-55kDa和E1b-19kDa基因)，构建增殖型溶瘤腺病毒，二是对E1b-55kDa实施突变，使其失去活性，从而使病毒的增殖获得肿瘤特异性。在外源基因选择方面，通过两种实施方案来说明含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒介导基因表达的功能和用途，一是携带人趋化因子CCL5基因，二是携带绿色荧光蛋白报告基因EGFP。

含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒能够识别CD46膜受体和可能存在的其他特异受体，从而能高效感染人造血系统细胞、间充质干细胞、树突状细胞、肿瘤干细胞、原代肿瘤细胞等重要细胞，且免疫原性较低，与传统的C组腺病毒载体无交叉免疫反应；该腺病毒基因组通过基因缺失或者基因调节的有效控制，使其选择性地在肿瘤细胞内增殖，而在正常细胞内基本不增殖；该腺病毒可作为基因转移的载体，在其基因组中同时插入多种抗肿瘤治疗基因，使肿瘤治疗基因随病毒的复制在肿瘤细胞内高效表达。通过病毒增殖和抗癌基因双重作用，特异性杀灭肿瘤细胞，用于治疗多种人体肿瘤。

人类腺病毒有A、B、C、D、E、F 6个不同亚属，它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病史各不相同。本发明涉及腺病毒B亚群11型。

本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，腺病毒基因组的纤毛蛋白编码序列由人11型腺病毒纤毛蛋白基因组成。所述11型腺病毒纤毛蛋白基因，既可以是完整的野生型11型腺病毒的纤毛蛋白编码序列，也可以是由11型腺病毒纤毛头的氨基酸序列取代非11型腺病毒的纤毛头氨基酸序列杂合而成。该病毒能够识别CD46膜受体和其他可能存在的特异受体，而不再依赖于CAR受体，从而使其感染人肿瘤细胞的感染谱更广，转导效率更高，提高了它对人造血系统细胞、间充质干细胞、树突状细胞、肿瘤干细胞、原代肿瘤细胞等重要细胞的感染效率。在实施方案中，所述重组腺病毒的11型纤毛蛋白基因序列如SEQ ID NO：1所示，其中：(1)第1-134位碱基：5型腺病毒纤毛的tail蛋白编码序列；(2)第135-981位碱基：11型腺病毒纤毛的shaft、knob蛋白编码序列。

另一方面，本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，该腺病毒基因组通过肿瘤特异性启动子对增殖必需基因的有效控制，使其选择性地在肿瘤细胞内增殖，而在正常细胞内基本不增殖，从而使其靶向人肿瘤细胞，保证腺病毒在肿瘤细胞内高度增殖，发挥溶瘤作用。该肿瘤特异性启动子可以是以下任何一种肿瘤特异性启动子或增强子：(a)癌胚抗原启动子、增强子及其突变体序列；(b)甲胎蛋白启动子、增强子及其突变体序列；(c)人表皮生长因子受体家族(EGFRs)的受体酪氨酸激酶(包括EGFR、Her-2、Her-3和Her-4)启动子、增强子及其突变体序列；(d)乳腺癌相关抗原DF3/MUC1启动子、增强子及其突变体序列；(e)血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR的启动子、增强子及其突变体序列；(f)L-plastin启动子、增强子及其突变体序列；(g)凋亡抑制蛋白家族(IAP)成员的启动子、增强子及其突变体序列；(h)前列腺素特异性抗原的启动子、增强子及其突变体序列；(i)缺氧诱导因子-1(HIF-1)调控的缺氧反应元件保守序列；(j)转录因子E2F启动子、增强子及其突变体序列；和(k)人端粒酶亚基启动子。

本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，至少一个病毒增殖必需基因受一种肿瘤特异性启动子控制。该病毒增殖必需基因可以是E1a。该溶瘤腺病毒能够在在肿瘤细胞内特异性地增殖复制，表达E1a，发挥E1a抗肿瘤作用。E1a可以通过抑制Her-2/neu基因的转录、阻断NF-κB的活性、提高免疫细胞的杀伤效应、增强转移抑制基因nm23的表达等多种途径，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤侵袭转移，提高肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性。该溶瘤腺病毒与化疗和放疗合用，能够增强肿瘤细胞对化疗和放疗的敏感性，进一步提高治疗效果。

本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，至少一个病毒增殖必需基因受一种肿瘤特异性启动子控制。肿瘤特异性启动子控制的病毒增殖必需基因还可以是E1b-55kDa、E1b-19kDa、E2或E4，该增殖必需基因可以是野生型的，也可以是经过缺失、突变等改造的基因变体。

本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，其E1b-55kDa蛋白功能丧失，通过对编码E1b-55kDa蛋白的基因序列进行全部缺失、点突变、部分缺失、插入突变或者插入终止密码子等方式。E1b-55kDa是腺病毒在正常细胞增殖复制必需的而在肿瘤细胞中复制时的非必需的蛋白，E1b-55kDa编码基因的选择性缺失可以使腺病毒在肿瘤细胞内保持增殖复制的能力，而在正常细胞中失去复制能力。

本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，其E1b-19kDa蛋白功能丧失通过对编码E1b-19kDa蛋白的基因序列进行全部缺失、点突变、部分缺失、插入突变或者插入终止密码子等方式。腺病毒E1b-19kDa基因与凋亡抑制基因Bc1-2同源，编码的E1b-19kDa蛋白能够结合Bax或/和Bak启动下游的凋亡抑制程序，E1b-19kDa还可以破坏Fas介导的凋亡过程，保护感染的细胞免受TNF-α介导的杀伤作用。E1b-19kDa基因失活，因而该病毒在肿瘤细胞内增殖的特异性得以提高，而在正常细胞内的增殖活性被削弱。E1b-19kDa蛋白功能的丧失，不但能够促进肿瘤细胞凋亡通路的恢复，而且有利于病毒在正常细胞内的快速清除以及在肿瘤细胞内的快速释放和播散，使该溶瘤腺病毒治疗肿瘤的特异性更好，效能更强。

本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，其基因组中预置了多克隆位点，可作为基因转移的载体。该位点可以在E1a启动子上游，也可以在E1a和E1b之间，或在E3区，便于携带各种抗肿瘤基因表达盒。将抗肿瘤基因插入该病毒的外源基因多克隆位点，发挥多重抗肿瘤效能。随着病毒在肿瘤内的特异性增殖复制，其携带的抗肿瘤基因的拷贝数和表达量得到提高，从而抑制肿瘤细胞生长或杀灭肿瘤细胞。

本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，其抗肿瘤基因的选择还可以是下列任意一种：(a)干扰素系列免疫调节因子基因；(b)白细胞介素系列免疫调节因子基因；(c)细胞集落刺激因子基因；(d)抑癌基因；(e)原癌基因反义序列；(f)人肿瘤表皮生长因子受体家族(EGFRs)的抗体基因；(g)具有抗血管生成的内皮抑素、血管抑素及其片段、纤溶酶原激活因子抑制剂、Canstatin、血小板反应蛋白等核苷酸序列；(h)细胞凋亡诱导因子家族基因；(i)血管内皮生长因子抗体基因；(j)药物前提转化基因(又称自杀基因)；和(k)肿瘤坏死因子基因。

本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，抗肿瘤基因表达盒中编码序列受人类巨细胞病毒(CMV)启动子的控制，该顺式作用元件插入抗肿瘤基因序列的转录起始位点与翻译起始位点之间，保证该基因蛋白在病毒感染的肿瘤内部高效表达，发挥生物学活性。抗肿瘤基因还可以受下列启动子控制：(a)癌胚抗原启动子、增强子及其突变体序列；(b)甲胎蛋白启动子、增强子及其突变体序列；(c)人表皮生长因子受体家族(EGFRs)的受体酪氨酸激酶(包括EGFR、Her-2、Her-3和Her-4)启动子、增强子及其突变体序列；(d)乳腺癌相关抗原DF3/MUC1启动子、增强子及其突变体序列；(e)血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR的启动子、增强子及其突变体序列；(f)L-plastin启动子、增强子及其突变体序列；(g)凋亡抑制蛋白家族(IAP)成员的启动子、增强子及其突变体序列；(h)前列腺素特异性抗原的启动子、增强子及其突变体序列；(i)缺氧诱导因子-1(HIF-1)调控的缺氧反应元件保守序列；(j)转录因子E2F启动子、增强子及其突变体序列；和(k)人端粒酶亚基启动子。

本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，抗肿瘤基因表达盒中编码序列的加尾序列为SV40 Poly A，该顺式作用元件插入基因核苷酸序列的翻译终止密码子之后。

本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，至少一个病毒增殖必需基因受一种肿瘤特异性启动子控制。其多个增殖必需基因之间可以由多核糖体进入位点(IRES)序列连接，使之共同受肿瘤特异性启动子调控，或由多个肿瘤特异性启动子分别调控。实施例中，以双启动子分别控制E1a和E1b基因，人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子控制E1a基因，人缺氧反应元件(HRE)调控E1b区基因(E1b-55kDa和E1b-19kDa基因)。

本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于，该病毒突变体由人类腺病毒载体、肿瘤特异性启动子的顺式作用元件、人类11型腺病毒纤毛蛋白基因和抗肿瘤基因表达盒可操作地连接而成。该增殖型溶瘤腺病毒由含人类11型腺病毒纤毛蛋白基因的骨架质粒与携带抗肿瘤基因的腺病毒穿梭质粒在293细胞内通过Cre-loxP重组酶切割系统定点重组而产生。其含人类11型腺病毒纤毛蛋白基因的骨架质粒序列如SEQ ID NO：2所示，其中：(1)第1-85位碱基：腺病毒ITR序列；(2)第562-700位碱基：SV40\AN序列；(3)第1245-2294位碱基：pSP13Cre序列；(4)第2375-2716位碱基：HCMV\IE序列；(5)第2962-3819位碱基：amp编码序列；(6)第4901-4934位碱基：LoxP序列；(7)第31516-31649位碱基：5型腺病毒纤毛蛋白的tail编码序列；(8)第31649-32496位碱基：11型腺病毒纤毛蛋白基因的shaft、knob编码序列；(8)第35554-35655位碱基：腺病毒ITR序列；(9)其余：5型腺病毒基因组序列，见MicrobixBiosystems公司的pBHGloxdeltaE1，3Cre序列。

实现的技术效果：

1.本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，该腺病毒具有外源基因的多克隆位点，可用于构建多种抗肿瘤基因治疗的腺病毒产品，为肿瘤的基因治疗建立一种疗效可靠的技术平台。

2.本发明提供的溶瘤腺病毒具有多重抗肿瘤机制和特异性优势：1)该重组病毒的基因组含11型腺病毒纤毛蛋白蛋白编码序列，使病毒能够识别CD46膜受体，从而高效感染人造血系统细胞、间充质干细胞、树突状细胞、肿瘤干细胞、原代肿瘤细胞等重要细胞；2)以肿瘤特异性启动子调控腺病毒增殖必须基因表达，使病毒在大多数类型的人类肿瘤细胞中增殖并破坏肿瘤细胞，其调控具有严谨性和安全性；3)在肿瘤细胞内高效而特异性表达的E1a，促进病毒增殖，同时其本身也具有抗肿瘤作用；4)将编码抗肿瘤基因的核苷酸序列插入该病毒的基因组中，随着病毒在肿瘤内的特异性增殖复制，其携带的抗肿瘤基因的拷贝数和表达量增加，从而抑制肿瘤生长。

3.本发明提供的溶瘤腺病毒，比国内目前已上市的基因治疗产品重组p53腺病毒注射液“Ad-p53”具有更好的广谱性和感染效率，疗效得到提高；比国内目前已上市的增殖腺病毒产品H101具有更好的疗效和更高的安全性，适应于人类绝大多数类型恶性肿瘤的治疗。

附图简述

图1表示含11型腺病毒纤毛蛋白基因编码序列的腺病毒载体pCLON9-F11的构建流程。

图2表示腺病毒包装质粒pPE3的构建流程。

图3表示pPE3-F11构建流程。

图4表示L02正常肝细胞，MOI＝10感染Ad5-EGFP，荧光细胞约占25％左右。

图5表示L02正常肝细胞，MOI＝10感染SG511-EGFP，荧光细胞约占85％左右。

图6表示SMMC-7721肝癌细胞，MOI＝10感染Ad5-EGFP，荧光细胞约占35％左右。

图7表示SMMC-7721肝癌细胞，MOI＝10感染SG511-EGFP，荧光细胞约占95％左右。

图8表示用人CCL5基因引物扩增1-4号腺病毒克隆，均能扩增出349bp条带，与阳性对照(P)一致，说明1-4号腺病毒均含有CCL5基因。其中M1：100bp DNA Ladder；N：阴性对照；P：阳性对照(pENTR12-CCL5)；1-4：SG511-CCL5病毒克隆

图9表示SG511-CCL5在肝癌细胞中随着时间呈几何倍数增殖，具有良好的增殖能力，而在正常细胞株BJ中的增殖倍数很低。

图10表示SG511-CCL5治疗组同其他对照组相比，显示出更强的抑制肿瘤生长作用，肿瘤体积一直明显小于对照组，有显著统计学差异(p＜0.05)，说明嵌合增殖型腺病毒SG511-CCL5对肝癌动物模型有很强的抗肿瘤作用，能明显抑制肿瘤的生长发展。

发明详述

下面通过实施例阐述本发明的实施方式，所述实施例仅用于例示性阐示本发明，其不限制本发明的保护范围，本领域技术人员根据本发明通过同等的变型和改良的技术方案都包含在本发明中。

在实施例中，第一方案以人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子控制5型腺病毒E1a，用人缺氧反应元件(HRE)调控E1b区基因(E1b-55kDa和E1b-19kDa基因)为例；第二方案对E1b-55kDa实施突变，使其失去活性，从而使病毒的增殖获得肿瘤特异性，构建含11型腺病毒纤毛蛋白基因的溶瘤腺病毒载体。在实施例的具体实施中，以人趋化因子CCL5基因和绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)为例设立两种策略，构建携带目的基因的腺病毒载体。

具体实施方式：

实施例1：含11型腺病毒纤毛蛋白基因编码序列的腺病毒载体pCLON9-F11的构建

第一步：合成含11型腺病毒纤毛蛋白基因编码序列如SEQ ID NO：3所示，命名Ad5F11，其中：(1)第236-369位碱基：5型腺病毒纤毛tail蛋白编码序列；(2)第367-1216位碱基：11型腺病毒纤毛shaft、knob蛋白编码序列；(3)其余碱基：5型腺病毒基因组序列，见Microbix Biosystems公司的pBHGloxdeltaE1，3Cre序列。

第二步：合成VT176序列(SEQ ID NO：4)和VT177序列(SEQ IDNO：5)，构建pCLON9载体。Ad5F11序列经PacI+HindIII酶切，回收2656bp片段，与pCLON9/PacI+HindIII酶切的载体连接，构建成pCLON9-F11，经酶切和测序鉴定确认。构建步骤如图1所示。

实施例2：BJ5183细胞内同源重组

第一步：pCLON9-F11经HindIII+AatII酶切，回收5913bp片段。

第二步：合成ADP序列(SEQ ID NO：6)，如图2所示，构建腺病毒包装质粒pPE3。

第三步：pPE3载体经PacI酶切，回收线性化载体。pCLON9-F11/HindIII+AatII 4微升，pPE3/PacI 2微升，共同转化感受态大肠杆菌BJ5183(Qbiogene公司)。铺板培养，挑取克隆进行酶切鉴定，正确者命名为pPE3-F11，经大样质粒提取纯化，保存于深低温冰箱中。pPE3-F11构建流程如图3所示。

实施例3：含Ad11腺病毒纤毛蛋白基因的腺病毒在体外对培养细胞的感染力实验

第一步：以人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子控制5型腺病毒E1a，插入位点NotI+SwaI，构建腺病毒载体pQW-hTERT-Ep-HRE(见：专利ZL028138198，一种高效表达抗癌基因的肿瘤细胞内特异性增殖的病毒及其用途；现改名为pSG502)。其中hTERT启动子调控E1a基因，同时用人缺氧反应元件(HRE)调控E1b区基因(E1b-55kDa和E1b-19kDa基因)。所述hTERT启动子核心序列如SEQ ID NO：7所示，缺氧反应元件HRE序列如SEQ ID NO：8所示。

第二步：将EGFP基因(SEQ ID NO：9)插pSG502，构建成pSG502-EGFP，EGFP插入位点为EcoRI+SalI。

第二步：含有EGFP基因的腺病毒质粒pSG502-EGFP与骨架质粒pPE3-F11共转染HEK293细胞(购于加拿大Microbix Biosystems公司，该细胞由剪切的5型腺病毒DNA转化，含5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率，通过细胞内重组产生具有感染力的腺病毒)，进行细胞内重组。转染具体方法步骤参见Invitrogen公司的LipoFectamine2000试剂盒操作说明书。重组产物经PCR鉴定正确者命名为SG511-EGFP。EGFP基因PCR引物为：上游引物5’-GCTCTAGAGAATTCACCATGGTGAGCAAGGGC-3’(SEQ ID NO：10)，下游引物5’-CGGGATCCGTCGACTTATTACCTAGATCCGGTGG-3’(SEQ ID NO：11)，扩增片段793bp。

第三步：将EGFP基因插入腺病毒质粒pDC315(MicrobixBiosystems公司)中的EcoRI+SalI位点，构建成pDC315-EGFP，与骨架质粒pPE3进行细胞内重组，重组产物经PCR鉴定正确者命名为Ad5-EGFP，作为对照病毒。该对照病毒为含5型腺病毒纤毛蛋白基因的病毒载体。

第四步：正常细胞株和肿瘤细胞株分别按5×10⁵细胞/孔铺在6孔板中，在37℃孵箱5％CO2培养，第二天换无血清液体1ml，然后按MOI＝10分别加入重组溶瘤腺病毒SG511-EGFP和Ad5-EGFP，24小时后荧光显微镜下观察。

观察结果：图4中为L02正常肝细胞，MOI＝10感染Ad5-EGFP，荧光细胞约占25％左右。图5中为L02正常肝细胞，MOI＝10感染SG511-EGFP，荧光细胞约占85％左右。图6中为SMMC-7721肝癌细胞，MOI＝10感染Ad5-EGFP，荧光细胞约占35％左右。图7中为SMMC-7721肝癌细胞，MOI＝10感染SG511-EGFP，荧光细胞约占95％左右。表明SG511-EGFP感染能力明显强于Ad5-EGFP。

实施例4：含11型腺病毒纤毛蛋白基因编码序列、E1b-55kDa失活的溶瘤腺病毒的重组

以我们前期构建成功的E1b-55kDa失活的腺病毒载体pXC-delE1b(钱其军等，中华医学杂志.2002，82：557-560)为基础，与pPE3-F11共转染HEK293细胞，重组含11型腺病毒纤毛蛋白基因编码序列的腺病毒SG211，该病毒E1b-55kDa失活，获得在肿瘤细胞内特异增殖的能力。

实施例5：携带抗肿瘤基因的腺病毒载体的构建

本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的重组溶瘤腺病毒，其特征在于，通过基因缺失或者基因调节的有效控制，使其选择性地在肿瘤细胞内增殖；其基因组中预置了多克隆位点，该位点可以携带各种抗肿瘤基因表达盒。溶瘤腺病毒载体以人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子控制5型腺病毒E1a基因，同时用人缺氧反应元件(HRE)调控E1b区基因(E1b-55kDa和E1b-19kDa基因)为例，抗肿瘤基因以人趋化因子CCL5基因为例。同时构建非增殖的腺病毒载体为对照病毒。

第一步：以人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子控制5型腺病毒E1a，插入位点NotI+SwaI，构建腺病毒载体pSG502(见：专利ZL028138198)。其中hTERT启动子核心序列如SEQ ID NO：7所示。

第二步：合成含有人趋化因子CCL5基因核苷酸序列(SEQ IDNO：12)，其5’端和3’端分别引入EcoRI和BamHI位点，经EcoRI+BamHI酶切后分别插入质粒pENTR11(Invitrogen LifeTechnology Inc.)和pDC315多克隆位点区，构成pENTR12-CCL5和pDC315-CCL5，再分别与骨架质粒pPE3-F11进行重组，重组产物经酶切鉴定正确者命名为pPE3-F11-CCL5和Ad5F11-CCL5。

实施例6：含11型腺病毒纤毛蛋白基因的溶瘤腺病毒的细胞内重组及扩增纯化

本发明提供一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒，对肿瘤细胞具有良好感染能力和靶向性。

第一步：将构建好的5型腺病毒质粒pSG502，与含有11型腺病毒纤毛蛋白基因的杂合腺病毒载体质粒pPE3-F11-CCL5，通过LipoFectamine2000共同转染HEK293细胞。pPE3-F11-CCL5含有5型腺病毒右臂，缺失E1区，其重组酶系统Cre/LoxP可以保证病毒的高效重组。在载体共转染后的9-14天，陆续出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化(具体方法参见GeneTransfer and Expression Protocols，Murray EJ主编，Humana Press，Clifton，New Jersey)，重组得到溶瘤腺病毒SG511-CCL5。

第二步：重组溶瘤腺病毒的鉴定，以腺病毒E1a基因引物排除野生型腺病毒，以人CCL5基因引物鉴定重组腺病毒是否含有CCL5序列。腺病毒E1a基因引物：上游引物5’-cggaattcaccatgagacatattatc-3’(SEQ ID NO：13)，下游引物5’-gcgtcgacttatggcctggggcg-3’(SEQID NO：14)，扩增片段1005bp。人CCL5基因引物为：上游引物5’-CGGAATTCACCATGAAGGTCTCCGCGGCAG-3’(SEQ ID NO：15)，下游引物5’-CGGGATCCCTATAACTGGAAGTCATCATCCATTG-3’(SEQ ID NO：16)，扩增片段349bp。

如图8所示，以人CCL5基因引物扩增1-4号腺病毒克隆，均能扩增出349bp条带，与阳性对照(P)一致，说明1-4号腺病毒均含有CCL5基因。

第三步：重组溶瘤腺病毒在HEK293细胞中大量扩增，应用氯化铯梯度离心的方法纯化腺病毒(具体方法参见GeneTransfer andExpression Protocols，Murray EJ主编，Humana Press，Clifton，NewJersey)。用TCID50法测得重组溶瘤腺病毒SG511-CCL5的滴度达到2.79×10¹⁰pfμ/ml。

实施例7：重组溶瘤腺病毒SG511-CCL5的在体外培养的肿瘤细胞内增殖实验

正常细胞株和肿瘤细胞株分别按5×10⁵细胞/孔铺在6孔板中，在37℃孵箱5％ CO₂培养，第二天换无血清液体1ml，然后按MOI＝5加入重组溶瘤腺病毒SG511-CCL5，培养90分钟后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两次，将病毒洗去，与加入5％胎牛血清的培养液培养，分别在0小时、48小时、96小时收集，冻融三次，用TCID50法来检测病毒滴度(方法参见美国Qbiogene公司的AdEasyTM操作手册)。以0小时病毒滴度为参照，算出病毒在48小时、96小时的增殖倍数，结果发现SG511-CCL5在肝癌细胞中随着时间呈几何倍数增殖，具有良好的增殖能力，而在正常细胞株BJ中的增殖倍数很低，具体如图9所示。

实施例8：重组溶瘤腺病毒SG511-CCL5动物实验

第一步：4～6周龄BALB/C裸鼠50只，平均重量22～27g，由上海中科院实验动物培育中心提供，清洁级动物实验室饲养。

第二步：体外培育人肝癌细胞SMMC-7721，取对数生长期贴壁生长细胞，0.25％胰酶消化，离心、收集细胞后用PBS液重悬，3000g室温离心2分钟，弃上清，再用PBS液重悬后离心收集细胞，调整细胞悬液浓度至5×10⁷个/ml。

第三步：于裸鼠右肋背部皮下接种SMMC-7721细胞，0.1ml/只。接种三周左右后，可见接种部位皮下长出米粒大小硬结，移植瘤模型建成。待瘤体直径生长至7-9mm时开始治疗。挑选40只皮下肿瘤生长至7-9mm的SMMC-7721移植瘤进行治疗，将裸鼠随机分分为5组。给药途径为直接瘤内多点注射。

第四步：每日观察小鼠的生活状态并定期测量肿瘤的体积，定期测量一次肿瘤的最长径(A)及其垂直径(B)，按公式(A×B²)/2计算肿瘤的体积，观察不同剂量组的疗效。

实验设置带CCL5基因的非增殖型的腺病毒Ad5F11-CCL5和不带CCL5基因的增殖型腺病毒SG511(其名称为人腺病毒5/11嵌合型SG511，保藏日为2009年1月9日，保藏号为CCTCC-V2000903，保藏地点为中国典型培养物保藏中心)为对照病毒。结果发现SG511-CCL5治疗组同其他对照组相比，显示出更强的抑制肿瘤生长作用，肿瘤体积一直明显小于对照组，有显著统计学差异(p＜0.05)，说明杂合增殖型腺病毒SG511-CCL5对肝癌动物模型有很强的抗肿瘤作用，能明显抑制肿瘤的生长发展(见图10)。SG511-CCL5治疗组同其他对照组相比，显示出更强的抑制肿瘤生长作用，肿瘤体积一直明显小于对照组，有显著统计学差异(p＜0.05)，说明嵌合增殖型腺病毒SG511-CCL5对肝癌动物模型有很强的抗肿瘤作用，能明显抑制肿瘤的生长发展。

序列表

<110>第二军医大学东方肝胆外科医院

<120>一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒、其构建方法及其用途

<130>IDC080XXX

<160>16

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>981

<212>DNA

<213>11纤毛序列

<400>1

atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg tgtatccata tgacacggaa    60

accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg tatcccccaa tgggtttcaa    120

gagagtcccc ctggagttct tactttaaaa tgtttaaccc cactaacaac cacaggcgga    180

tctctacagc taaaagtggg agggggactt acagtggatg acaccaacgg ttttttgaaa    240

gaaaacataa gtgccaccac accactcgtt aagactggtc actctatagg tttaccacta    300

ggagccggat tgggaacgaa tgaaaataaa ctttgtatca aattaggaca aggacttaca    360

ttcaattcaa acaacatttg cattgatgac aatattaaca ccttatggac aggagtcaac    420

cccaccgaag ccaactgtca aatcatgaac tccagtgaat ctaatgattg caaattaatt    480

ctaacactag ttaaaactgg agcactagtc actgcatttg tttatgttat aggagtatct    540

aacaatttta atatgctaac tacacacaga aatataaatt ttactgcaga gctgtttttc    600

gattctactg gtaatttact aactagactc tcatccctca aaactccact taatcataaa    660

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actgcctatc ctttcaatga taattctaga gaaaaagaaa actacattta cggaacttgt    780

tactacacag ctagtgatcg cactgctttt cccattgaca tatctgtcat gcttaaccga    840

agagcaataa atgacgagac atcatattgt attcgtataa cttggtcctg gaacacagga    900

gatgccccag aggtgcaaac ctctgctaca accctagtca cctccccatt taccttttac    960

tacatcagag aagacgactg a                                              981

<210>2

<211>35655

<212>DNA

<213>Ad5/11重组载体序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(721)..(721)

<223>n is a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(849)..(849)

<223>n is a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(874)..(874)

<223>n is a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(1118)..(1118)

<223>n is a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(1197)..(1197)

<223>n is a，c，g，或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(2254)..(2254)

<223>n is a，c，g，或t

<400>2

ttattttgga ttgaagccaa tatgataatg agggggtgga gtttgtgacg tggcgcgggg    60

cgtgggaacg gggcgggtga cgtagtagtg tggcggaagt gtgatgttgc aagtgtggcg    120

gaacacatgt aagcgacgga tgtggcaaaa gtgacgtttt tggtgtgcgc cggatccaca    180

ggacgggtgt ggtcgccatg atcgcgtagt cgatagtggc tccaagtagc gaagcgagca    240

ggactgggcg gcggccaaag cggtcggaca gtgctccgag aacgggtgcg catagaaatt    300

gcatcaacgc atatagcgct agcagcacgc catagtgact ggcgatgctg tcggaatgga    360

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ggatcttcga tgctagacga tccagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc    600

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caagaaggcg atagaaggcg atgcgctgcg aatcgggagc ggcgataccg taaagcacga   840

ggaagcggnc agcccattcg ccgccatgtt tttnagcaat atcacgggta gccaacgcta   900

tgtcctgata gcggtccgcc acacccagcc tcgacaattc caaccttacc caagagttcg   960

ccaaactcag acatcacttt agcaaaaccg cgccgtgctt cttcctcggt ggcattcatc   1020

acgaaatgtt cagcactacg catacttttg gacaggaaac gcaacggata ttgagtcaat   1080

atcaggcatt ctatcgctca gctttacagt gacaatgncg gctggcgact gaatattagt   1140

gcttacagac agcactacat attttccgtc gatgttgaaa tcctttctca tatgtcncca   1200

taaatatcaa ataattatag caatcattta cgcgttaatg gctaatcgcc atcttccagc   1260

aggcgcacca ttgcccctgt ttcactatcc aggttacgga tatagttcat gacaatattt   1320

acattggtcc agccaccagc ttgcatgatc tccggtattg aaactccagc gcgggccata   1380

tctcgcgcgg ctccgacacg ggcactgtgt ccagaccagg ccaggtatct ctgaccagag   1440

tcatccttag cgccgtaaat caatcgatga gttgcttcaa aaatcccttc cagggcgcga   1500

gttgatagct ggctggtggc agatggcgcg gcaacaccat tttttctgac ccggcaaaac   1560

aggtagttat tcggatcatc agctacacca gagacggaaa tccatcgctc gaccagttta   1620

gttaccccca ggctaagtgc cttctctaca cctgcggtgc taaccagcgt tttcgttctg   1680

ccaatatgga ttaacattct cccaccgtca gtacgtgaga tatctttaac cctgatcctg   1740

gcaatttcgg ctatacgtaa cagggtgtta taagcaatcc ccagaaatgc cagattacgt   1800

atatcctggc agcgatcgct attttccatg agtgaacgaa cctggtcgaa atcagtgcgt   1860

tcgaacgcta gagcctgttt tgcacgttca ccggcatcaa cgttttcttt tcggatccgc   1920

cgcataacca gtgaaacagc attgctgtca cttggtcgtg gcagcccgga ccgacgatga   1980

agcatgttta gctggcccaa atgttgctgg atagttttta ctgccagacc gcgcgcctga   2040

agatatagaa gataatcgcg aacatcttca ggttctgcgg gaaaccattt ccggttattc   2100

aacttgcacc atgccgccca cgaccggcaa acggacagaa gcattttcca ggtatgctca   2160

gaaaacgcct ggcgatccct gaacatgtcc atcaggttct tgcgaacctc atcactcgtt   2220

gcatcgaccg gtaatgcagg caaattttgg tgtncggtca gtaaattgga caccttcctc   2280

ttcttcttgg gcatggtcga gtctagactc gagggatcct cgactcgaag actgatcccc   2340

aggctggatc ggtcccggtg tcttctatgg aggtcaaaac agcgtggatg gcgtctccag   2400

gcgatctgac ggttcactaa acgagctctg cttatataga cctcccaccg tacacgccta   2460

ccgcccattt gcgtcaatgg ggcggagttg ttacgacatt ttggaaagtc ccgttgattt   2520

tggtgccaaa acaaactccc attgacgtca atggggtgga gacttggaaa tccccgtgag   2580

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atgactaata cgtagatgta ctgccaagta ggaaagtccc ataaggtcat gtactgggca   2700

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tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt   2880

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ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa   3600

gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct   3660

ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc   3720

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atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg   3960

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cagccatatc cctccgggga ttcatgttgt gcagaaccac cagcacagtg tatccggtgc   5940

acttgggaaa tttgtcatgt agcttagaag gaaatgcgtg gaagaacttg gagacgccct   6000

tgtgacctcc aagattttcc atgcattcgt ccataatgat ggcaatgggc ccacgggcgg   6060

cggcctgggc gaagatattt ctgggatcac taacgtcata gttgtgttcc aggatgagat   6120

cgtcataggc catttttaca aagcgcgggc ggagggtgcc agactgcggt ataatggttc   6180

catccggccc aggggcgtag ttaccctcac agatttgcat ttcccacgct ttgagttcag   6240

atggggggat catgtctacc tgcggggcga tgaagaaaac ggtttccggg gtaggggaga   6300

tcagctggga agaaagcagg ttcctgagca gctgcgactt accgcagccg gtgggcccgt   6360

aaatcacacc tattaccggg tgcaactggt agttaagaga gctgcagctg ccgtcatccc   6420

tgagcagggg ggccacttcg ttaagcatgt ccctgactcg catgttttcc ctgaccaaat   6480

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acggtttgag accgtccgcc gtaggcatgc ttttgagcgt ttgaccaagc agttccaggc   6600

ggtcccacag ctcggtcacc tgctctacgg catctcgatc cagcatatct cctcgtttcg   6660

cgggttgggg cggctttcgc tgtacggcag tagtcggtgc tcgtccagac gggccagggt   6720

catgtctttc cacgggcgca gggtcctcgt cagcgtagtc tgggtcacgg tgaaggggtg   6780

cgctccgggc tgcgcgctgg ccagggtgcg cttgaggctg gtcctgctgg tgctgaagcg   6840

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gcagtgcaga cttttgaggg cgtagagctt gggcgcgaga aataccgatt ccggggagta   7020

ggcatccgcg ccgcaggccc cgcagacggt ctcgcattcc acgagccagg tgagctctgg   7080

ccgttcgggg tcaaaaacca ggtttccccc atgctttttg atgcgtttct tacctctggt   7140

ttccatgagc cggtgtccac gctcggtgac gaaaaggctg tccgtgtccc cgtatacaga   7200

cttgagaggc ctgtcctcga gcggtgttcc gcggtcctcc tcgtatagaa actcggacca   7260

ctctgagaca aaggctcgcg tccaggccag cacgaaggag gctaagtggg aggggtagcg   7320

gtcgttgtcc actagggggt ccactcgctc cagggtgtga agacacatgt cgccctcttc   7380

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ggggctataa aagggggtgg gggcgcgttc gtcctcactc tcttccgcat cgctgtctgc   7500

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gtcgcgatcg gcgcgctcct tggccgcgat gtttagctgc acgtattcgc gcgcaacgca   7800

ccgccattcg ggaaagacgg tggtgcgctc gtcgggcacc aggtgcacgc gccaaccgcg   7860

gttgtgcagg gtgacaaggt caacgctggt ggctacctct ccgcgtaggc gctcgttggt   7920

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gtccgggggg tctgcgtcca cggtaaagac cccgggcagc aggcgcgcgt cgaagtagtc   8040

tatcttgcat ccttgcaagt ctagcgcctg ctgccatgcg cgggcggcaa gcgcgcgctc   8100

gtatgggttg agtgggggac cccatggcat ggggtgggtg agcgcggagg cgtacatgcc   8160

gcaaatgtcg taaacgtaga ggggctctct gagtattcca agatatgtag ggtagcatct   8220

tccaccgcgg atgctggcgc gcacgtaatc gtatagttcg tgcgagggag cgaggaggtc   8280

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atgtgagttg gatgatatgg ttggacgctg gaagacgttg aagctggcgt ctgtgagacc   8400

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ttggatcgga aacccgtcgg cctccgaacg gtaagagcct agcatgtaga actggttgac   8640

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acgcggattt ggcagggcga aggtgacatc gttgaagagt atctttcccg cgcgaggcat   8880

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gcgacctatg gccatttttt ctggggtgat gcagtagaag gtaagcgggt cttgttccca   9240

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ataggtctct acatcgtagg tgacaaagag acgctcggtg cgaggatgcg agccgatcgg   9420

gaagaactgg atctcccgcc accaattgga ggagtggcta ttgatgtggt gaaagtagaa   9480

gtccctgcga cgggccgaac actcgtgctg gcttttgtaa aaacgtgcgc agtactggca  9540

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ttgtccttga ccgtctggct gctcgagggg agttacggtg gatcggacca ccacgccgcg  9720

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cgacggcgca tggtctcggt gacggcgcgg ccgttctcgc gggggcgcag ttggaagacg  10980

ccgcccgtca tgtcccggtt atgggttggc ggggggctgc catgcggcag ggatacggcg  11040

ctaacgatgc atctcaacaa ttgttgtgta ggtactccgc cgccgaggga cctgagcgag  11100

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ttttgacatc ggcgcaggtc tttgtagtag tcttgcatga gcctttctac cggcacttct  11400

tcttctcctt cctcttgtcc tgcatctctt gcatctatcg ctgcggcggc ggcggagttt  11460

ggccgtaggt ggcgccctct tcctcccatg cgtgtgaccc cgaagcccct catcggctga  11520

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gtagactgga agtcatccat gtccacaaag cggtggtatg cgcccgtgtt gatggtgtaa  11640

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tacctgagac gcgagtaagc cctcgagtca aatacgtagt cgttgcaagt ccgcaccagg  11760

tactggtatc ccaccaaaaa gtgcggcggc ggctggcggt agaggggcca gcgtagggtg  11820

gccggggctc cgggggcgag atcttccaac ataaggcgat gatatccgta gatgtacctg  11880

gacatccagg tgatgccggc ggcggtggtg gaggcgcgcg gaaagtcgcg gacgcggttc  11940

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gcgcaatcgt tgacgctcta ccgtgcaaaa ggagagcctg taagcgggca ctcttccgtg  12060

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cggccgtccg ccgtgatcca tgcggttacc gcccgcgtgt cgaacccagg tgtgcgacgt  12180

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tgacaaggtg gccgccatca actattccat gcttagcctg ggcaagtttt acgcccgcaa  13320

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agtgtcagcc gcgcgctggg gcaggaggac acgggcagcc tggaggcaac cctaaactac  14640

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cggccgttta tcaaccgcct aatggactac ttgcatcgcg cggccgccgt gaaccccgag  14880

tatttcacca atgccatctt gaacccgcac tggctaccgc cccctggttt ctacaccggg  14940

ggattcgagg tgcccgaggg taacgatgga ttcctctggg acgacataga cgacagcgtg  15000

ttttccccgc aaccgcagac cctgctagag ttgcaacagc gcgagcaggc agaggcggcg  15060

ctgcgaaagg aaagcttccg caggccaagc agcttgtccg atctaggcgc tgcggccccg  15120

cggtcagatg ctagtagccc atttccaagc ttgatagggt ctcttaccag cactcgcacc  15180

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cgcgaaaaaa acctgcctcc ggcatttccc aacaacggga tagagagcct agtggacaag  15300

atgagtagat ggaagacgta cgcgcaggag cacagggacg tgccaggccc gcgcccgccc  15360

acccgtcgtc aaaggcacga ccgtcagcgg ggtctggtgt gggaggacga tgactcggca  15420

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aggctgggga gaatgtttta aaaaaaaaaa agcatgatgc aaaataaaaa actcaccaag  15540

gccatggcac cgagcgttgg ttttcttgta ttccccttag tatgcggcgc gcggcgatgt  15600

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cgctgggttc tcccttcgat gctcccctgg acccgccgtt tgtgcctccg cggtacctgc  15720

ggcctaccgg ggggagaaac agcatccgtt actctgagtt ggcaccccta ttcgacacca  15780

cccgtgtgta cctggtggac aacaagtcaa cggatgtggc atccctgaac taccagaacg  15840

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gcacacagac catcaatctt gacgaccggt cgcactgggg cggcgacctg aaaaccatcc  15960

tgcataccaa catgccaaat gtgaacgagt tcatgtttac caataagttt aaggcgcggg  16020

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cgatcgtgga gcactacttg aaagtgggca gacagaacgg ggttctggaa agcgacatcg  16200

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accttgcata caactacggc gaccctcaga ccggaatccg ctcatggacc ctgctttgca  16860

ctcctgacgt aacctgcggc tcggagcagg tctactggtc gttgccagac atgatgcaag  16920

accccgtgac cttccgctcc acgcgccaga tcagcaactt tccggtggtg ggcgccgagc  16980

tgttgcccgt gcactccaag agcttctaca acgaccaggc cgtctactcc caactcatcc  17040

gccagtttac ctctctgacc cacgtgttca atcgctttcc cgagaaccag attttggcgc  17100

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cgagccgcac tttttgagca agcatgtcca tccttatatc gcccagcaat aacacaggct  17340

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cccgcccccc gcgcaactag attgcaagaa aaaactactt agactcgtac tgttgtatgt  17940

atccagcggc ggcggcgcgc aacgaagcta tgtccaagcg caaaatcaaa gaagagatgc  18000

tccaggtcat cgcgccggag atctatggcc ccccgaagaa ggaagagcag gattacaagc  18060

cccgaaagct aaagcgggtc aaaaagaaaa agaaagatga tgatgatgaa cttgacgacg  18120

aggtggaact gctgcacgct accgcgccca ggcgacgggt acagtggaaa ggtcgacgcg  18180

taaaacgtgt tttgcgaccc ggcaccaccg tagtctttac gcccggtgag cgctccaccc  18240

gcacctacaa gcgcgtgtat gatgaggtgt acggcgacga ggacctgctt gagcaggcca  18300

acgagcgcct cggggagttt gcctacggaa agcggcataa ggacatgctg gcgttgccgc  18360

tggacgaggg caacccaaca cctagcctaa agcccgtaac actgcagcag gtgctgcccg  18420

cgcttgcacc gtccgaagaa aagcgcggcc taaagcgcga gtctggtgac ttggcaccca  18480

ccgtgcagct gatggtaccc aagcgccagc gactggaaga tgtcttggaa aaaatgaccg  18540

tggaacctgg gctggagccc gaggtccgcg tgcggccaat caagcaggtg gcgccgggac  18600

tgggcgtgca gaccgtggac gttcagatac ccactaccag tagcaccagt attgccaccg  18660

ccacagaggg catggagaca caaacgtccc cggttgcctc agcggtggcg gatgccgcgg  18720

tgcaggcggt cgctgcggcc gcgtccaaga cctctacgga ggtgcaaacg gacccgtgga  18780

tgtttcgcgt ttcagccccc cggcgcccgc gcggttcgag gaagtacggc gccgccagcg  18840

cgctactgcc cgaatatgcc ctacatcctt ccattgcgcc tacccccggc tatcgtggct  18900

acacctaccg ccccagaaga cgagcaacta cccgacgccg aaccaccact ggaacccgcc  18960

gccgccgtcg ccgtcgccag cccgtgctgg ccccgatttc cgtgcgcagg gtggctcgcg  19020

aaggaggcag gaccctggtg ctgccaacag cgcgctacca ccccagcatc gtttaaaagc  19080

cggtctttgt ggttcttgca gatatggccc tcacctgccg cctccgtttc ccggtgccgg  19140

gattccgagg aagaatgcac cgtaggaggg gcatggccgg ccacggcctg acgggcggca  19200

tgcgtcgtgc gcaccaccgg cggcggcgcg cgtcgcaccg tcgcatgcgc ggcggtatcc  19260

tgcccctcct tattccactg atcgccgcgg cgattggcgc cgtgcccgga attgcatccg  19320

tggccttgca ggcgcagaga cactgattaa aaacaagttg catgtggaaa aatcaaaata  19380

aaaagtctgg actctcacgc tcgcttggtc ctgtaactat tttgtagaat ggaagacatc  19440

aactttgcgt ctctggcccc gcgacacggc tcgcgcccgt tcatgggaaa ctggcaagat  19500

atcggcacca gcaatatgag cggtggcgcc ttcagctggg gctcgctgtg gagcggcatt  19560

aaaaatttcg gttccaccgt taagaactat ggcagcaagg cctggaacag cagcacaggc  19620

cagatgctga gggataagtt gaaagagcaa aatttccaac aaaaggtggt agatggcctg  19680

gcctctggca ttagcggggt ggtggacctg gccaaccagg cagtgcaaaa taagattaac  19740

agtaagcttg atccccgccc tcccgtagag gagcctccac cggccgtgga gacagtgtct  19800

ccagaggggc gtggcgaaaa gcgtccgcgc cccgacaggg aagaaactct ggtgacgcaa  19860

atagacgagc ctccctcgtacgaggaggca ctaaagcaag gcctgcccac cacccgtccc   19920

atcgcgccca tggctaccgg agtgctgggc cagcacacac ccgtaacgct ggacctgcct  19980

ccccccgccg acacccagca gaaacctgtg ctgccaggcc cgaccgccgt tgttgtaacc  20040

cgtcctagcc gcgcgtccct gcgccgcgcc gccagcggtc cgcgatcgtt gcggcccgta  20100

gccagtggca actggcaaag cacactgaac agcatcgtgg gtctgggggt gcaatccctg  20160

aagcgccgac gatgcttctg aatagctaac gtgtcgtatg tgtgtcatgt atgcgtccat  20220

gtcgccgcca gaggagctgc tgagccgccg cgcgcccgct ttccaagatg gctacccctt  20280

cgatgatgcc gcagtggtct tacatgcaca tctcgggcca ggacgcctcg gagtacctga  20340

gccccgggct ggtgcagttt gcccgcgcca ccgagacgta cttcagcctg aataacaagt  20400

ttagaaaccc cacggtggcg cctacgcacg acgtgaccac agaccggtcc cagcgtttga  20460

cgctgcggtt catccctgtg gaccgtgagg atactgcgta ctcgtacaag gcgcggttca  20520

ccctagctgt gggtgataac cgtgtgctgg acatggcttc cacgtacttt gacatccgcg  20580

gcgtgctgga caggggccct acttttaagc cctactctgg cactgcctac aacgccctgg  20640

ctcccaaggg tgccccaaat ccttgcgaat gggatgaagc tgctactgct cttgaaataa  20700

acctagaaga agaggacgat gacaacgaag acgaagtaga cgagcaagct gagcagcaaa  20760

aaactcacgt atttgggcag gcgccttatt ctggtataaa tattacaaag gagggtattc  20820

aaataggtgt cgaaggtcaa acacctaaat atgccgataa aacatttcaa cctgaacctc  20880

aaataggaga atctcagtgg tacgaaactg aaattaatca tgcagctggg agagtcctta  20940

aaaagactac cccaatgaaa ccatgttacg gttcatatgc aaaacccaca aatgaaaatg  21000

gagggcaagg cattcttgta aagcaacaaa atggaaagct agaaagtcaa gtggaaatgc  21060

aatttttctc aactactgag gcgaccgcag gcaatggtga taacttgact cctaaagtgg  21120

tattgtacag tgaagatgta gatatagaaa ccccagacac tcatatttct tacatgccca  21180

ctattaagga aggtaactca cgagaactaa tgggccaaca atctatgccc aacaggccta  21240

attacattgc ttttagggac aattttattg gtctaatgta ttacaacagc acgggtaata  21300

tgggtgttct ggcgggccaa gcatcgcagt tgaatgctgt tgtagatttg caagacagaa  21360

acacagagct ttcataccag cttttgcttg attccattgg tgatagaacc aggtactttt  21420

ctatgtggaa tcaggctgtt gacagctatg atccagatgt tagaattatt gaaaatcatg  21480

gaactgaaga tgaacttcca aattactgct ttccactggg aggtgtgatt aatacagaga  21540

ctcttaccaa ggtaaaacct aaaacaggtc aggaaaatgg atgggaaaaa gatgctacag  21600

aattttcaga taaaaatgaa ataagagttg gaaataattt tgccatggaa atcaatctaa  21660

atgccaacct gtggagaaat ttcctgtact ccaacatagc gctgtatttg cccgacaagc  21720

taaagtacag tccttccaac gtaaaaattt ctgataaccc aaacacctac gactacatga  21780

acaagcgagt ggtggctccc gggttagtgg actgctacat taaccttgga gcacgctggt  21840

cccttgacta tatggacaac gtcaacccat ttaaccacca ccgcaatgct ggcctgcgct  21900

accgctcaat gttgctgggc aatggtcgct atgtgccctt ccacatccag gtgcctcaga  21960

agttctttgc cattaaaaac ctccttctcc tgccgggctc atacacctac gagtggaact  22020

tcaggaagga tgttaacatg gttctgcaga gctccctagg aaatgaccta agggttgacg  22080

gagccagcat taagtttgat agcatttgcc tttacgccac cttcttcccc atggcccaca  22140

acaccgcctc cacgcttgag gccatgctta gaaacgacac caacgaccag tcctttaacg  22200

actatctctc cgccgccaac atgctctacc ctatacccgc caacgctacc aacgtgccca  22260

tatccatccc ctcccgcaac tgggcggctt tccgcggctg ggccttcacg cgccttaaga  22320

ctaaggaaac cccatcactg ggctcgggct acgaccctta ttacacctac tctggctcta  22380

taccctacct agatggaacc ttttacctca accacacctt taagaaggtg gccattacct  22440

ttgactcttc tgtcagctgg cctggcaatg accgcctgct tacccccaac gagtttgaaa  22500

ttaagcgctc agttgacggg gagggttaca acgttgccca gtgtaacatg accaaagact  22560

ggttcctggt acaaatgcta gctaactaca acattggcta ccagggcttc tatatcccag  22620

agagctacaa ggaccgcatg tactccttct ttagaaactt ccagcccatg agccgtcagg  22680

tggtggatga tactaaatac aaggactacc aacaggtggg catcctacac caacacaaca  22740

actctggatt tgttggctac cttgccccca ccatgcgcga aggacaggcc taccctgcta  22800

acttccccta tccgcttata ggcaagaccg cagttgacag cattacccag aaaaagtttc  22860

tttgcgatcg caccctttgg cgcatcccat tctccagtaa ctttatgtcc atgggcgcac  22920

tcacagacct gggccaaaac cttctctacg ccaactccgc ccacgcgcta gacatgactt  22980

ttgaggtgga tcccatggac gagcccaccc ttctttatgt tttgtttgaa gtctttgacg  23040

tggtccgtgt gcaccggccg caccgcggcg tcatcgaaac cgtgtacctg cgcacgccct  23100

tctcggccgg caacgccaca acataaagaa gcaagcaaca tcaacaacag ctgccgccat  23160

gggctccagt gagcaggaac tgaaagccat tgtcaaagat cttggttgtg ggccatattt  23220

tttgggcacc tatgacaagc gctttccagg ctttgtttct ccacacaagc tcgcctgcgc  23280

catagtcaat acggccggtc gcgagactgg gggcgtacac tggatggcct ttgcctggaa  23340

cccgcactca aaaacatgct acctctttga gccctttggc ttttctgacc agcgactcaa  23400

gcaggtttac cagtttgagt acgagtcact cctgcgccgt agcgccattg cttcttcccc  23460

cgaccgctgt ataacgctgg aaaagtccac ccaaagcgta caggggccca actcggccgc  23520

ctgtggacta ttctgctgca tgtttctcca cgcctttgcc aactggcccc aaactcccat  23580

ggatcacaac cccaccatga accttattac cggggtaccc aactccatgc tcaacagtcc  23640

ccaggtacag cccaccctgc gtcgcaacca ggaacagctc tacagcttcc tggagcgcca  23700

ctcgccctac ttccgcagcc acagtgcgca gattaggagc gccacttctt tttgtcactt  23760

gaaaaacatg taaaaataat gtactagaga cactttcaat aaaggcaaat gcttttattt  23820

gtacactctc gggtgattat ttacccccac ccttgccgtc tgcgccgttt aaaaatcaaa  23880

ggggttctgc cgcgcatcgc tatgcgccac tggcagggac acgttgcgat actggtgttt  23940

agtgctccac ttaaactcag gcacaaccat ccgcggcagc tcggtgaagt tttcactcca  24000

caggctgcgc accatcacca acgcgtttag caggtcgggc gccgatatct tgaagtcgca  24060

gttggggcct ccgccctgcg cgcgcgagtt gcgatacaca gggttgcagc actggaacac  24120

tatcagcgcc gggtggtgca cgctggccag cacgctcttg tcggagatca gatccgcgtc  24180

caggtcctcc gcgttgctca gggcgaacgg agtcaacttt ggtagctgcc ttcccaaaaa  24240

gggcgcgtgc ccaggctttg agttgcactc gcaccgtagt ggcatcaaaa ggtgaccgtg  24300

cccggtctgg gcgttaggat acagcgcctg cataaaagcc ttgatctgct taaaagccac  24360

ctgagccttt gcgccttcag agaagaacat gccgcaagac ttgccggaaa actgattggc  24420

cggacaggcc gcgtcgtgca cgcagcacct tgcgtcggtg ttggagatct gcaccacatt  24480

tcggccccac cggttcttca cgatcttggc cttgctagac tgctccttca gcgcgcgctg  24540

cccgttttcg ctcgtcacat ccatttcaat cacgtgctcc ttatttatca taatgcttcc  24600

gtgtagacac ttaagctcgc cttcgatctc agcgcagcgg tgcagccaca acgcgcagcc  24660

cgtgggctcg tgatgcttgt aggtcacctc tgcaaacgac tgcaggtacg cctgcaggaa  24720

tcgccccatc atcgtcacaa aggtcttgtt gctggtgaag gtcagctgca acccgcggtg  24780

ctcctcgttc agccaggtct tgcatacggc cgccagagct tccacttggt caggcagtag  24840

tttgaagttc gcctttagat cgttatccac gtggtacttg tccatcagcg cgcgcgcagc  24900

ctccatgccc ttctcccacg cagacacgat cggcacactc agcgggttca tcaccgtaat  24960

ttcactttcc gcttcgctgg gctcttcctc ttcctcttgc gtccgcatac cacgcgccac  25020

tgggtcgtct tcattcagcc gccgcactgt gcgcttacct cctttgccat gcttgattag  25080

caccggtggg ttgctgaaac ccaccatttg tagcgccaca tcttctcttt cttcctcgct  25140

gtccacgatt acctctggtg atggcgggcg ctcgggcttg ggagaagggc gcttcttttt  25200

cttcttgggc gcaatggcca aatccgccgc cgaggtcgat ggccgcgggc tgggtgtgcg  25260

cggcaccagc gcgtcttgtg atgagtcttc ctcgtcctcg gactcgatac gccgcctcat  25320

ccgctttttt gggggcgccc ggggaggcgg cggcgacggg gacggggacg acacgtcctc  25380

catggttggg ggacgtcgcg ccgcaccgcg tccgcgctcg ggggtggttt cgcgctgctc  25440

ctcttcccga ctggccattt ccttctccta taggcagaaa aagatcatgg agtcagtcga  25500

gaagaaggac agcctaaccg ccccctctga gttcgccacc accgcctcca ccgatgccgc  25560

caacgcgcct accaccttcc ccgtcgaggc acccccgctt gaggaggagg aagtgattat  25620

cgagcaggac ccaggttttg taagcgaaga cgacgaggac cgctcagtac caacagagga  25680

taaaaagcaa gaccaggaca acgcagaggc aaacgaggaa caagtcgggc ggggggacga  25740

aaggcatggc gactacctag atgtgggaga cgacgtgctg ttgaagcatc tgcagcgcca  25800

gtgcgccatt atctgcgacg cgttgcaaga gcgcagcgat gtgcccctcg ccatagcgga  25860

tgtcagcctt gcctacgaac gccacctatt ctcaccgcgc gtacccccca aacgccaaga  25920

aaacggcaca tgcgagccca acccgcgcct caacttctac cccgtatttg ccgtgccaga  25980

ggtgcttgcc acctatcaca tctttttcca aaactgcaag atacccctat cctgccgtgc  26040

caaccgcagc cgagcggaca agcagctggc cttgcggcag ggcgctgtca tacctgatat  26100

cgcctcgctc aacgaagtgc caaaaatctt tgagggtctt ggacgcgacg agaagcgcgc  26160

ggcaaacgct ctgcaacagg aaaacagcga aaatgaaagt cactctggag tgttggtgga  26220

actcgagggt gacaacgcgc gcctagccgt actaaaacgc agcatcgagg tcacccactt  26280

tgcctacccg gcacttaacc taccccccaa ggtcatgagc acagtcatga gtgagctgat  26340

cgtgcgccgt gcgcagcccc tggagaggga tgcaaatttg caagaacaaa cagaggaggg  26400

cctacccgca gttggcgacg agcagctagc gcgctggctt caaacgcgcg agcctgccga  26460

cttggaggag cgacgcaaac taatgatggc cgcagtgctc gttaccgtgg agcttgagtg  26520

catgcagcgg ttctttgctg acccggagat gcagcgcaag ctagaggaaa cattgcacta  26580

cacctttcga cagggctacg tacgccaggc ctgcaagatc tccaacgtgg agctctgcaa  26640

cctggtctcc taccttggaa ttttgcacga aaaccgcctt gggcaaaacg tgcttcattc  26700

cacgctcaag ggcgaggcgc gccgcgacta cgtccgcgac tgcgtttact tatttctatg  26760

ctacacctgg cagacggcca tgggcgtttg gcagcagtgc ttggaggagt gcaacctcaa  26820

ggagctgcag aaactgctaa agcaaaactt gaaggaccta tggacggcct tcaacgagcg  26880

ctccgtggcc gcgcacctgg cggacatcat tttccccgaa cgcctgctta aaaccctgca  26940

acagggtctg ccagacttca ccagtcaaag catgttgcag aactttagga actttatcct  27000

agagcgctca ggaatcttgc ccgccacctg ctgtgcactt cctagcgact ttgtgcccat  27060

taagtaccgc gaatgccctc cgccgctttg gggccactgc taccttctgc agctagccaa  27120

ctaccttgcc taccactctg acataatgga agacgtgagc ggtgacggtc tactggagtg  27180

tcactgtcgc tgcaacctat gcaccccgca ccgctccctg gtttgcaatt cgcagctgct  27240

taacgaaagt caaattatcg gtacctttga gctgcagggt ccctcgcctg acgaaaagtc  27300

cgcggctccg gggttgaaac tcactccggg gctgtggacg tcggcttacc ttcgcaaatt  27360

tgtacctgag gactaccacg cccacgagat taggttctac gaagaccaat cccgcccgcc  27420

aaatgcggag cttaccgcct gcgtcattac ccagggccac attcttggcc aattgcaagc  27480

catcaacaaa gcccgccaag agtttctgct acgaaaggga cggggggttt acttggaccc  27540

ccagtccggc gaggagctca acccaatccc cccgccgccg cagccctatc agcagcagcc  27600

gcgggccctt gcttcccagg atggcaccca aaaagaagct gcagctgccg ccgccaccca  27660

cggacgagga ggaatactgg gacagtcagg cagaggaggt tttggacgag gaggaggagg  27720

acatgatgga agactgggag agcctagacg aggaagcttc cgaggtcgaa gaggtgtcag  27780

acgaaacacc gtcaccctcg gtcgcattcc cctcgccggc gccccagaaa tcggcaaccg  27840

gttccagcat ggctacaacc tccgctcctc aggcgccgcc ggcactgccc gttcgccgac  27900

ccaaccgtag atgggacacc actggaacca gggccggtaa gtccaagcag ccgccgccgt  27960

tagcccaaga gcaacaacag cgccaaggct accgctcatg gcgcgggcac aagaacgcca  28020

tagttgcttg cttgcaagac tgtgggggca acatctcctt cgcccgccgc tttcttctct  28080

accatcacgg cgtggccttc ccccgtaaca tcctgcatta ctaccgtcat ctctacagcc  28140

catactgcac cggcggcagc ggcagcggca gcaacagcag cggccacaca gaagcaaagg  28200

cgaccggata gcaagactct gacaaagccc aagaaatcca cagcggcggc agcagcagga  28260

ggaggagcgc tgcgtctggc gcccaacgaa cccgtatcga cccgcgagct tagaaacagg  28320

atttttccca ctctgtatgc tatatttcaa cagagcaggg gccaagaaca agagctgaaa  28380

ataaaaaaca ggtctctgcg atccctcacc cgcagctgcc tgtatcacaa aagcgaagat  28440

cagcttcggc gcacgctgga agacgcggag gctctcttca gtaaatactg cgcgctgact  28500

cttaaggact agtttcgcgc cctttctcaa atttaagcgc gaaaactacg tcatctccag  28560

cggccacacc cggcgccagc acctgtcgtc agcgccatta tgagcaagga aattcccacg  28620

ccctacatgt ggagttacca gccacaaatg ggacttgcgg ctggagctgc ccaagactac  28680

tcaacccgaa taaactacat gagcgcggga ccccacatga tatcccgggt caacggaatc  28740

cgcgcccacc gaaaccgaat tctcttggaa caggcggcta ttaccaccac acctcgtaat  28800

aaccttaatc cccgtagttg gcccgctgcc ctggtgtacc aggaaagtcc cgctcccacc  28860

actgtggtac ttcccagaga cgcccaggcc gaagttcaga tgactaactc aggggcgcag  28920

cttgcgggcg gctttcgtca cagggtgcgg tcgcccgggc agggtataac tcacctgaca  28980

atcagagggc gaggtattca gctcaacgac gagtcggtga gctcctcgct tggtctccgt  29040

ccggacggga catttcagat cggcggcgcc ggccgtcctt cattcacgcc tcgtcaggca  29100

atcctaactc tgcagacctc gtcctctgag ccgcgctctg gaggcattgg aactctgcaa  29160

tttattgagg agtttgtgcc atcggtctac tttaacccct tctcgggacc tcccggccac  29220

tatccggatc aatttattcc taactttgac gcggtaaagg actcggcgga cggctacgac  29280

tgaatgttaa gtggagaggc agagcaactg cgcctgaaac acctggtcca ctgtcgccgc  29340

cacaagtgct ttgcccgcga ctccggtgag ttttgctact ttgaattgcc cgaggatcat  29400

atcgagggcc cggcgcacgg cgtccggctt accgcccagg gagagcttgc ccgtagcctg  29460

attcgggagt ttacccagcg ccccctgcta gttgagcggg acaggggacc ctgtgttctc  29520

actgtgattt gcaactgtcc taaccttgga ttacatcaag atctttgttg ccatctctgt  29580

gctgagtata ataaatacag aaattaaaat atactggggc tcctatcgcc atcctgtaaa  29640

cgccaccgtc ttcacccgcc caagcaaacc aaggcgaacc ttacctggta cttttaacat  29700

ctctccctct gtgatttaca acagtttcaa cccagacgga gtgagtctac gagagaacct  29760

ctccgagctc agctactcca tcagaaaaaa caccaccctc cttacctgcc gggaacgtac  29820

gagtgcgtca ccggccgctg caccacacct accgcctgac cgtaaaccag actttttccg  29880

gacagacctc aataactctg tttaccagaa caggaggtga gcttagaaaa cccttagggt  29940

attaggccaa aggcgcagct actgtggggt ttatgaacaa ttcaagcaac tctacgggct  30000

attctaattc aggtttctct agaatcgggg ttggggttat tctctgtctt gtgattctct  30060

ttattcttat actaacgctt ctctgcctaa ggctcgccgc ctgctgtgtg cacatttgca  30120

tttattgtca gctttttaaa cgctggggtc gccacccaag atgattaggt acataatcct  30180

aggtttactc acccttgcgt cagcccacgg taccacccaa aaggtggatt ttaaggagcc  30240

agcctgtaat gttacattcg cagctgaagc taatgagtgc accactctta taaaatgcac  30300

cacagaacat gaaaagctgc ttattcgcca caaaaacaaa attggcaagt atgctgttta  30360

tgctatttgg cagccaggtg acactacaga gtataatgtt acagttttcc agggtaaaag  30420

tcataaaact tttatgtata cttttccatt ttatgaaatg tgcgacatta ccatgtacat  30480

gagcaaacag tataagttgt ggcccccaca aaattgtgtg gaaaacactg gcactttctg  30540

ctgcactgct atgctaatta cagtgctcgc tttggtctgt accctactct atattaaata  30600

caaaagcaga cgcagcttta ttgaggaaaa gaaaatgcct taatttacta agttacaaag  30660

ctaatgtcac cactaactgc tttactcgct gcttgcaaaa caaattcaaa aagttagcat  30720

tataattaga ataggattta aaccccccgg tcatttcctg ctcaatacca ttcccctgaa  30780

caattgactc tatgtgggat atgctccagc gctacaacct tgaagtcagg cttcctggat  30840

gtcagcatct gactttggcc agcacctgtc ccgcggattt gttccagtcc aactacagcg  30900

acccacccta acagagatga ccaacacaac caacgcggcc gccgctaccg gacttacatc  30960

taccacaaat acaccccaag tttctgcctt tgtcaataac tgggataact tgggcatgtg  31020

gtggttctcc atagcgctta tgtttgtatg ccttattatt atgtggctca tctgctgcct  31080

aaagcgcaaa cgcgcccgac cacccatcta tagtcccatc attgtgctac acccaaacaa  31140

tgatggaatc catagattgg acggactgaa acacatgttc ttttctctta cagtatgatt  31200

aaatgagaca tgattcctcg agtttttata ttactgaccc ttgttgcgct tttttgtgcg  31260

tgctccacat tggctaagta atagttaatt aagatcttat tccctttaac taataaaaaa  31320

aaataataaa gcatcactta cttaaaatca gttagcaaat ttctgtccag tttattcagc  31380

agcacctcct tgccctcctc ccagctctgg tattgcagct tcctcctggc tgcaaacttt  31440

ctccacaatc taaatggaat gtcagtttcc tcctgttcct gtccatccgc acccactatc  31500

ttcatgttgt tgcagatgaa gcgcgcaaga ccgtctgaag ataccttcaa ccccgtgtat  31560

ccatatgaca cggaaaccgg tcctccaact gtgccttttc ttactcctcc ctttgtatcc  31620

cccaatgggt ttcaagagag tccccctgga gttcttactt taaaatgttt aaccccacta  31680

acaaccacag gcggatctct acagctaaaa gtgggagggg gacttacagt ggatgacacc  31740

aacggttttt tgaaagaaaa cataagtgcc accacaccac tcgttaagac tggtcactct  31800

ataggtttac cactaggagc cggattggga acgaatgaaa ataaactttg tatcaaatta  31860

ggacaaggac ttacattcaa ttcaaacaac atttgcattg atgacaatat taacacctta  31920

tggacaggag tcaaccccac cgaagccaac tgtcaaatca tgaactccag tgaatctaat  31980

gattgcaaat taattctaac actagttaaa actggagcac tagtcactgc atttgtttat  32040

gttataggag tatctaacaa ttttaatatg ctaactacac acagaaatat aaattttact  32100

gcagagctgt ttttcgattc tactggtaat ttactaacta gactctcatc cctcaaaact  32160

ccacttaatc ataaatcagg acaaaacatg gctactggtg ccattactaa tgctaaaggt  32220

ttcatgccca gcacgactgc ctatcctttc aatgataatt ctagagaaaa agaaaactac  32280

atttacggaa cttgttacta cacagctagt gatcgcactg cttttcccat tgacatatct  32340

gtcatgctta accgaagagc aataaatgac gagacatcat attgtattcg tataacttgg  32400

tcctggaaca caggagatgc cccagaggtg caaacctctg ctacaaccct agtcacctcc  32460

ccatttacct tttactacat cagagaagac gactgagccc aagaataaag aatcgtttgt  32520

gttatgtttc aacgtgttta tttttcaatt gcagaaaatt tcaagtcatt tttcattcag  32580

tagtatagcc ccaccaccac atagcttata cagatcaccg taccttaatc aaactcacag  32640

aaccctagta ttcaacctgc cacctccctc ccaacacaca gagtacacag tcctttctcc  32700

ccggctggcc ttaaaaagca tcatatcatg ggtaacagac atattcttag gtgttatatt  32760

ccacacggtt tcctgtcgag ccaaacgctc atcagtgata ttaataaact ccccgggcag  32820

ctcacttaag ttcatgtcgc tgtccagctg ctgagccaca ggctgctgtc caacttgcgg  32880

ttgcttaacg ggcggcgaag gagaagtcca cgcctacatg ggggtagagt cataatcgtg  32940

catcaggata gggcggtggt gctgcagcag cgcgcgaata aactgctgcc gccgccgctc  33000

cgtcctgcag gaatacaaca tggcagtggt ctcctcagcg atgattcgca ccgcccgcag  33060

cataaggcgc cttgtcctcc gggcacagca gcgcaccctg atctcactta aatcagcaca  33120

gtaactgcag cacagcacca caatattgtt caaaatccca cagtgcaagg cgctgtatcc  33180

aaagctcatg gcggggacca cagaacccac gtggccatca taccacaagc gcaggtagat  33240

taagtggcga cccctcataa acacgctgga cataaacatt acctcttttg gcatgttgta  33300

attcaccacc tcccggtacc atataaacct ctgattaaac atggcgccat ccaccaccat  33360

cctaaaccag ctggccaaaa cctgcccgcc ggctatacac tgcagggaac cgggactgga  33420

acaatgacag tggagagccc aggactcgta accatggatc atcatgctcg tcatgatatc  33480

aatgttggca caacacaggc acacgtgcat acacttcctc aggattacaa gctcctcccg  33540

cgttagaacc atatcccagg gaacaaccca ttcctgaatc agcgtaaatc ccacactgca  33600

gggaagacct cgcacgtaac tcacgttgtg cattgtcaaa gtgttacatt cgggcagcag  33660

cggatgatcc tccagtatgg tagcgcgggt ttctgtctca aaaggaggta gacgatccct  33720

actgtacgga gtgcgccgag acaaccgaga tcgtgttggt cgtagtgtca tgccaaatgg  33780

aacgccggac gtagtcatat ttcctgaagc aaaaccaggt gcgggcgtga caaacagatc  33840

tgcgtctccg gtctcgccgc ttagatcgct ctgtgtagta gttgtagtat atccactctc  33900

tcaaagcatc caggcgcccc ctggcttcgg gttctatgta aactccttca tgcgccgctg  33960

ccctgataac atccaccacc gcagaataag ccacacccag ccaacctaca cattcgttct  34020

gcgagtcaca cacgggagga gcgggaagag ctggaagaac catgtttttt tttttattcc  34080

aaaagattat ccaaaacctc aaaatgaaga tctattaagt gaacgcgctc ccctccggtg  34140

gcgtggtcaa actctacagc caaagaacag ataatggcat ttgtaagatg ttgcacaatg  34200

gcttccaaaa ggcaaacggc cctcacgtcc aagtggacgt aaaggctaaa cccttcaggg  34260

tgaatctcct ctataaacat tccagcacct tcaaccatgc ccaaataatt ctcatctcgc  34320

caccttctca atatatctct aagcaaatcc cgaatattaa gtccggccat tgtaaaaatc  34380

tgctccagag cgccctccac cttcagcctc aagcagcgaa tcatgattgc aaaaattcag  34440

gttcctcaca gacctgtata agattcaaaa gcggaacatt aacaaaaata ccgcgatccc  34500

gtaggtccct tcgcagggcc agctgaacat aatcgtgcag gtctgcacgg accagcgcgg  34560

ccacttcccc gccaggaacc ttgacaaaag aacccacact gattatgaca cgcatactcg  34620

gagctatgct aaccagcgta gccccgatgt aagctttgtt gcatgggcgg cgatataaaa  34680

tgcaaggtgc tgctcaaaaa atcaggcaaa gcctcgcgca aaaaagaaag cacatcgtag  34740

tcatgctcat gcagataaag gcaggtaagc tccggaacca ccacagaaaa agacaccatt  34800

tttctctcaa acatgtctgc gggtttctgc ataaacacaa aataaaataa caaaaaaaca  34860

tttaaacatt agaagcctgt cttacaacag gaaaaacaac ccttataagc ataagacgga  34920

ctacggccat gccggcgtga ccgtaaaaaa actggtcacc gtgattaaaa agcaccaccg  34980

acagctcctc ggtcatgtcc ggagtcataa tgtaagactc ggtaaacaca tcaggttgat  35040

tcatcggtca gtgctaaaaa gcgaccgaaa tagcccgggg gaatacatac ccgcaggcgt  35100

agagacaaca ttacagcccc cataggaggt ataacaaaat taataggaga gaaaaacaca  35160

taaacacctg aaaaaccctc ctgcctaggc aaaatagcac cctcccgctc cagaacaaca  35220

tacagcgctt cacagcggca gcctaacagt cagccttacc agtaaaaaag aaaacctatt  35280

aaaaaaacac cactcgacac ggcaccagct caatcagtca cagtgtaaaa aagggccaag  35340

tgcagagcga gtatatatag gactaaaaaa tgacgtaacg gttaaagtcc acaaaaaaca  35400

cccagaaaac cgcacgcgaa cctacgccca gaaacgaaag ccaaaaaacc cacaacttcc  35460

tcaaatcgtc acttccgttt tcccacgtta cgtaacttcc cattttaaga aaactacaat  35520

tcccaacaca tacaagttac tccgccctaa aacctacgtc acccgccccg ttcccacgcc  35580

ccgcgccacg tcacaaactc caccccctca ttatcatatt ggcttcaatc caaaataagg  35640

tatattattg atgat                                                   35655

<210>3

<211>2673

<212>DNA

<213>含5型腺病毒tail序列和11型腺病毒shaft、knob序列的嵌合序列

<400>3

gccgttaatt aagatcttat tccctttaac taataaaaaa aaataataaa gcatcactta   60

cttaaaatca gttagcaaat ttctgtccag tttattcagc agcacctcct tgccctcctc   120

ccagctctgg tattgcagct tcctcctggc tgcaaacttt ctccacaatc taaatggaat   180

gtcagtttcc tcctgttcct gtccatccgc acccactatc ttcatgttgt tgcagatgaa   240

gcgcgcaaga ccgtctgaag ataccttcaa ccccgtgtat ccatatgaca cggaaaccgg   300

tcctccaact gtgccttttc ttactcctcc ctttgtatcc cccaatgggt ttcaagagag   360

tccccctgga gttcttactt taaaatgttt aaccccacta acaaccacag gcggatctct   420

acagctaaaa gtgggagggg gacttacagt ggatgacacc aacggttttt tgaaagaaaa   480

cataagtgcc accacaccac tcgttaagac tggtcactct ataggtttac cactaggagc   540

cggattggga acgaatgaaa ataaactttg tatcaaatta ggacaaggac ttacattcaa   600

ttcaaacaac atttgcattg atgacaatat taacacctta tggacaggag tcaaccccac   660

cgaagccaac tgtcaaatca tgaactccag tgaatctaat gattgcaaat taattctaac   720

actagttaaa actggagcac tagtcactgc atttgtttat gttataggag tatctaacaa   780

ttttaatatg ctaactacac acagaaatat aaattttact gcagagctgt ttttcgattc   840

tactggtaat ttactaacta gactctcatc cctcaaaact ccacttaatc ataaatcagg   900

acaaaacatg gctactggtg ccattactaa tgctaaaggt ttcatgccca gcacgactgc   960

ctatcctttc aatgataatt ctagagaaaa agaaaactac atttacggaa cttgttacta   1020

cacagctagt gatcgcactg cttttcccat tgacatatct gtcatgctta accgaagagc   1080

aataaatgac gagacatcat attgtattcg tataacttgg tcctggaaca caggagatgc   1140

cccagaggtg caaacctctg ctacaaccct agtcacctcc ccatttacct tttactacat   1200

cagagaagac gactgagccc aagaataaag aatcgtttgt gttatgtttc aacgtgttta   1260

tttttcaatt gcagaaaatt tcaagtcatt tttcattcag tagtatagcc ccaccaccac   1320

atagcttata cagatcaccg taccttaatc aaactcacag aaccctagta ttcaacctgc   1380

cacctccctc ccaacacaca gagtacacag tcctttctcc ccggctggcc ttaaaaagca   1440

tcatatcatg ggtaacagac atattcttag gtgttatatt ccacacggtt tcctgtcgag   1500

ccaaacgctc atcagtgata ttaataaact ccccgggcag ctcacttaag ttcatgtcgc   1560

tgtccagctg ctgagccaca ggctgctgtc caacttgcgg ttgcttaacg ggcggcgaag   1620

gagaagtcca cgcctacatg ggggtagagt cataatcgtg catcaggata gggcggtggt   1680

gctgcagcag cgcgcgaata aactgctgcc gccgccgctc cgtcctgcag gaatacaaca   1740

tggcagtggt ctcctcagcg atgattcgca ccgcccgcag cataaggcgc cttgtcctcc   1800

gggcacagca gcgcaccctg atctcactta aatcagcaca gtaactgcag cacagcacca   1860

caatattgtt caaaatccca cagtgcaagg cgctgtatcc aaagctcatg gcggggacca   1920

cagaacccac gtggccatca taccacaagc gcaggtagat taagtggcga cccctcataa   1980

acacgctgga cataaacatt acctcttttg gcatgttgta attcaccacc tcccggtacc   2040

atataaacct ctgattaaac atggcgccat ccaccaccat cctaaaccag ctggccaaaa   2100

cctgcccgcc ggctatacac tgcagggaac cgggactgga acaatgacag tggagagccc   2160

aggactcgta accatggatc atcatgctcg tcatgatatc aatgttggca caacacaggc   2220

acacgtgcat acacttcctc aggattacaa gctcctcccg cgttagaacc atatcccagg   2280

gaacaaccca ttcctgaatc agcgtaaatc ccacactgca gggaagacct cgcacgtaac   2340

tcacgttgtg cattgtcaaa gtgttacatt cgggcagcag cggatgatcc tccagtatgg   2400

tagcgcgggt ttctgtctca aaaggaggta gacgatccct actgtacgga gtgcgccgag   2460

acaaccgaga tcgtgttggt cgtagtgtca tgccaaatgg aacgccggac gtagtcatat   2520

ttcctgaagc aaaaccaggt gcgggcgtga caaacagatc tgcgtctccg gtctcgccgc   2580

ttagatcgct ctgtgtagta gttgtagtat atccactctc tcaaagcatc caggcgcccc   2640

ctggcttcgg gttctatgta aactaagctt cgc                                2673

<210>4

<211>51

<212>DNA

<213>引物序列

<400>4

aattgaccgg tctcgagact agtggatccg cggccgcatc tagattaatt a            51

<210>5

<211>51

<212>DNA

<213>引物序列

<400>5

agcttaatta atctagatgc ggccgcggat ccactagtct cgagaccggt c               51

<210>6

<211>1067

<212>DNA

<213>5型腺病毒ADP基因序列

<400>6

tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga    60

caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg    120

gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc    180

gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa    240

gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca    300

aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc    360

agtgaattga ccggtctcga gactagtgga tccgcggccg ccgctaccgg acttacatct    420

accacaaata caccccaagt ttctgccttt gtcaataact gggataactt gggcatgtgg    480

tggttctcca tagcgcttat gtttgtatgc cttattatta tgtggctcat ctgctgccta    540

aagcgcaaac gcgcccgacc acccatctat agtcccatca ttgtgctaca cccaaacaat    600

gatggaatcc atagattgga cggactgaaa cacatgttct tttctcttac agtatgatta    660

aatgagacat gattcctcga gtttttatat tactgaccct tgttgcgctt tttttgtgcg    720

tgctccacat tggctaagta atagttaatt aagcttggcg taatcatggt catagctgtt    780

tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa    840

gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact    900

gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc    960

ggggaagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc    1020

gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcg                  1067

<210>7

<211>271

<212>DNA

<213>hTERT启动子核心序列

<400>7

agatctcaca gacgcccagg accgcgcttc ccacgtggcg gagggactgg ggacccgggc    60

acccgtcctg ccccttcacc ttccagctcc gcctcctccg cgcggacccc gccccgtccc    120

gacccctccc gggtccccgg cccagccccc tccgggccct cccagcccct ccccttcctt    180

tccgcggccc cgccctctcc tcgcggcgcg agtttcaggc agcgctgcgt cctgctgcgc    240

acgtgggaag ccctggcccc ggccactcga g                                   271

<210>8

<211>247

<212>DNA

<213>HRE序列

<400>8

actagtccac agtgcatacg tgggctccaa caggtcctct tccacagtgc atacgtgggc    60

tccaacaggt cctcttccac agtgcatacg tgggctccaa caggtcctct tccacagtgc    120

atacgtgggc tccaacaggt cctcttccac agtgcatacg tgggctccaa caggtcctct    180

tggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat    240

cactagt                                                              247

<210>9

<211>747

<212>DNA

<213>EGFP报告基因序列

<400>9

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac    60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac    120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc    180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag    240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc    300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg    360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac    420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac    480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc    540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac    600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc    660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc    720

ggactcagat ccaccggatc taggtaa                                        747

<210>10

<211>32

<212>DNA

<213>引物序列

<400>10

gctctagaga attcaccatg gtgagcaagg gc      32

<210>11

<211>34

<212>DNA

<213>引物序列

<400>11

cgggatccgt cgacttatta cctagatccg gtgg    34

<210>12

<211>345

<212>DNA

<213>人趋化因子CCL5序列

<400>12

gaattcacca tgaaggtctc cgcggcagcc ctcgctgtca tcctcattgc tactgccctc    60

tgcgctcctg catctgcctc cccatattcc tcggacacca caccctgctg ctttgcctac    120

attgcccgcc cactgccccg tgcccacatc aaggagtatt tctacaccag tggcaagtgc    180

tccaacccag cagtcgtctt tgtcacccga aagaaccgcc aagtgtgtgc caacccagag    240

aagaaatggg ttcgggagta catcaactct ttggagatga gcttagactt ggagatgtta    300

gctccctata tcccaatgga tgatgacttc cagttatagg gatcc                    345

<210>13

<211>26

<212>DNA

<213>引物序列

<400>13

cggaattcac catgagacat attatc              26

<210>14

<211>23

<212>DNA

<213>引物序列

<400>14

gcgtcgactt atggcctggg gcg                 23

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>引物序列

<400>15

cggaattcac catgaaggtc tccgcggcag         30

<210>16

<211>34

<212>DNA

<213>引物序列

<400>16

cgggatccct ataactggaa gtcatcatcc attg     34

Claims (12)

1.一种增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于该重组腺病毒含B亚群11型腺病毒纤毛头的氨基酸编码序列；并且该病毒基因组至少一个病毒增殖必需基因被突变或者被缺失而失去功能，或所述病毒在增殖必需基因序列的转录起始位点与翻译起始位点ATG之间可操作地插入顺式作用元件，所述元件控制基因组中至少一个病毒增殖必需基因的转录。

2.权利要求1的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于该重组腺病毒纤毛头的氨基酸序列为人类B亚群11型腺病毒纤毛头的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于所述病毒在增殖必需基因序列的转录起始位点与翻译起始位点ATG之间可操作地插入的是肿瘤特异性启动子的顺式作用元件。

4.根据权利要求3所述的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于所述肿瘤特异性启动子选自：

(a)癌胚抗原启动子、增强子及其突变体序列；

(b)甲胎蛋白启动子、增强子及其突变体序列；

(c)人表皮生长因子受体家族的受体酪氨酸激酶启动子、增强子及其突变体序列；

(d)乳腺癌相关抗原DF3/MUC1启动子、增强子及其突变体序列；

(e)血管内皮生长因子受体KDR的启动子、增强子及其突变体序列；

(f)L-plastin启动子、增强子及其突变体序列；

(g)凋亡抑制蛋白家族成员的启动子、增强子及其突变体序列；

(h)前列腺素特异性抗原的启动子、增强子及其突变体序列；

(i)缺氧诱导因子-1调控的缺氧反应元件保守序列；

(j)转录因子E2F启动子、增强子及其突变体序列；和

(k)人端粒酶亚基启动子、增强子及其突变体序列

中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于所述病毒增殖必需基因是野生型的或者经过突变的编码E1a、E1b-55kDa、E1b-19kDa、E2或E4的基因。

6.根据权利要求1所述的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于所述病毒增殖必需基因是经过点突变、插入突变、插入终止密码子、完全或部分缺失而失活的E1b-55kDa或E1b-19kDa基因。

7.根据权利要求1所述的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于其还可操作地连接有外源基因表达盒。

8.根据权利要求7所述的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于所述外源基因选自：

(a)干扰素类免疫调节因子的基因；

(b)白细胞介素类免疫调节因子的基因；

(c)细胞集落刺激因子的基因；

(d)抑癌基因；

(e)原癌基因的反义序列；

(f)人肿瘤表皮生长因子受体家族的抗体基因；

(g)编码抗血管生成因子的内皮抑素、血管抑素及其片段、纤溶酶原激活因子抑制剂、Canstatin、血小板反应蛋白的核苷酸序列；

(h)细胞凋亡诱导因子家族的基因；

(i)血管内皮生长因子抗体的基因；

(j)自杀基因；和

(k)肿瘤坏死因子的基因

中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的增殖型重组溶瘤腺病毒，其特征在于所述病毒载体为选自C亚群的2型或者5型腺病毒中的至少一种。

10.权利要求1的增殖型重组溶瘤腺病毒，其保藏日为2009年1月9日，保藏编号为CCTCC-V200903，保藏地点为中国典型培养物保藏中心。

11.构建权利要求2所述的增殖型重组溶瘤腺病毒的方法，其特征在于通过基因工程方法用人类B亚群11型腺病毒纤毛头的氨基酸序列取代非11型腺病毒的纤毛头氨基酸序列；且使所述病毒的至少一个增殖必需基因被突变或者被缺失而失去功能，或使所述病毒在增殖必需基因序列的转录起始位点与翻译起始位点ATG之间可操作地插入顺式作用元件，所述元件控制基因组中至少一个病毒增殖必需基因的转录。

12.权利要求1所述增殖型重组溶瘤腺病毒载体，其作为基因的载体而用于制备基因治疗药物。

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