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CN1254719A - 一种缺陷型腺病毒及其构建方法 - Google Patents

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CN1254719A
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钱其军
岑信棠
吴孟超
车小燕
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Abstract

本发明提供一种E1b55Kda蛋白基因新型突变的缺陷型腺病毒及其构建方法,通过缺失突变联合终止密码子使该腺病毒载体E1b55Kda蛋白功能缺失,而保留腺病毒E1a、E1b、19Kda蛋白及其他腺病毒蛋白的功能。由于腺病毒E1a及其它病毒蛋白具有多种抗肿瘤作用,因此该缺陷型腺病毒载体系统可用于多种肿瘤的治疗。

Description

一种缺陷型腺病毒及其构建方法
本发明涉及生命科学领域，是一种治疗肿瘤的缺陷型腺病毒载体系统及其构建方案。
恶性肿瘤严重危及人类的生命健康。目前对恶性肿瘤的常规治疗仍为手术及放、化疗，这种常规治疗对极大多数肿瘤的治疗疗效仍不十分理想，对于极大多数化疗药物而言，其治疗指数仍较低，即其治疗剂量与毒性剂量较为接近。故这种治疗方案通常伴有明显的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制等，因此，研究选择性杀灭肿瘤细胞而不影响正常细胞的治疗方案对肿瘤治疗非常重要，这种选择性杀灭肿瘤细胞的治疗方案主要依赖于肿瘤细胞的特异性标记，其疗效也决定于该肿瘤标记是否严格限制于肿瘤细胞内。
近年来，这些肿瘤细胞上的病毒蛋白已作为免疫治疗的特异性靶目标，但由于在肿瘤发生及发展过程中，为逃避免疫监控，肿瘤细胞发生很多变化，如很多肿瘤细胞MHC 1类基因表达及抗原提呈能力下调，缺乏免疫细胞刺激的第二信号，因而不能有效激活细胞毒T细胞来杀灭肿瘤细胞，因此在临床上免疫治疗疗效并十分不理想。
本发明的目的在于提供一种E1b 55Kda蛋白基因新型突变的缺陷型腺病毒及其构建的新方法。
基因治疗是近年兴起的恶性肿瘤的治疗方案的一种新的方法。其基因转染方法分病毒法及非病毒法两种，病毒法通常采用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疹病毒及痘苗病毒。逆转录病毒的在体外具有较高的转染率，但病毒滴度偏低，在体内转染率较低，而且只能感染分裂期的细胞，同时具有整合至染色体，存在癌变的可能性的缺点。腺相关病毒具有转染分裂及静止细胞的能力，能持久的表达。与此相反，非病毒法包括脂质体及基因枪等方法，其转染基因表达时间较短，转染率较低。腺病毒是目前肿瘤基因治疗的最常见病毒载体，已广泛地应用于人体基因治疗方案中，具有容易生产及纯化的特点，它在体内及体外均能有效转染分裂及静止细胞，无致癌性。腺病毒的某些病毒蛋白具有抗肿瘤作用，如E1a具有对HER-2/neu过度表达肿瘤起抑制作用，包括下调HER-2/neu基因表达，降低致瘤性，抑制肿瘤转移，诱导肿瘤细胞凋亡及增强肿瘤的化疗敏感性等多种作用。目前常用的腺病毒载体系统其E1(包括E1a及E1b)缺失，从而使该腺病毒缺乏E1a抗肿瘤的作用。
本发明的缺陷型腺病毒是E1b 55Kda蛋白基因部分缺失并在缺失部位插入终止密码子，2809-3329bp缺失，该缺失部位插入DNA片段TAATGAGTAACTAA，该DNA片段中含有两个终止密码子，分别是TAA及TGA。
本发明的缺陷型腺病毒与化学治疗药物如顺铂、5-氟脲嘧啶丝裂霉素C等、生物毒素如蛇毒素、单克隆抗体如抗肝癌细胞抗体等一起可以组成复合物，其作为抗肿瘤药物效果更好。
本发明的缺陷型腺病毒构建方法是将两个腺病毒载体转染给会产生重组的细胞，使两个腺病毒载体中一个E1b 55Kda蛋白基因的2809-3329bp缺失，在其缺失部位插入终止密码子，即插入DNA片段TAATGAGTAACTAA，该DNA片段中含有两个终止密码子，分别是TAA及TGA。
人类腺病毒有6个不同亚属，分为A、B、C、D、E及F。它们对宿主细胞的亲嗜性、致瘤性及疾病史并不相同。下面以腺病毒C亚属5型Ad5作为例证。
腺病毒系统是由两个载体组成，一个载体提供腺病毒的左臂部分，另一个载体提供右臂，这两个载体至少有500nt的同源重组区，然而其转染细胞产生重组腺病毒，载体系统质粒pXC1，含有野生型Ad5左臂。pBHG10提供缺乏E3区Ad5右臂或pBHGE3提供Ad5右臂(含E3区)。
本发明在插入连接头两端附近位置中合成的聚合酶链式反应的引物是
CTG GCC AAT ACC AAC CTT A
ATA TGA GCT CAC AAT GCT TC
本发明将该缺陷型腺病毒转染至E1转化人胚胎肾细胞株293或E1转化的人胚胎视网膜细胞株911，能有效地制成具有抗肿瘤腺病毒。
本发明具有如下有益效果
1.本发明提供一种E1b 55Kda蛋白基因新型突变的缺陷型腺病毒，经动物实验证明该腺病毒可用于治疗多种肿瘤。
2.本发明提供一种E1b 55Kda蛋白基因新型突变的缺陷型腺病毒的构建方法。该方法可用于构建新型缺陷型腺病毒，该方法易为操作人员掌握，并可用于构建多种新型缺陷型腺病毒，为基因治疗疾病建立了良好的基础。
3.动物实验证明该重组腺病毒能选择性杀灭肿瘤细胞而不影响正常细胞的治疗，为今后用于人类肿瘤治疗打下了基础。
实施例：
例一、腺病毒E1b蛋白基因部分缺失及在缺失区插入终止密码子载体的构建
pXC.1载体购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。应用内切酶Bgl II将该载体在3329bp中切开，然后用内切酶Hind III再作部分酶切，回收9372bp DNA片段，应用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段对3’凹端补平，即为pXC.1载体中缺失2809bp-3329bp区域(具体方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)。
合成两个DNA寡核苷酸片段做一个连接头，其DNA寡核苷酸序列为
01 TAATGAGTAACTAA
02 TTAGTTACTCATTA
将两个DNA寡核苷酸片段各0.1μg混合，100℃变性5分钟，然后缓慢降温复性，复性后应用T4噬菌体多核苷酸激酸进行磷酸化。将该磷酸化后的连接头与缺失2809-3329bp区域的pXC.1载体片段进行连接，命名为pXC-del E1b(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)。在插入连接头两端附近位置中合成引物，分别为
03  CTG GCC AAT ACC AAC CTT A
04  ATA TGA GCT CAC AAT GCT TC
对pXC-del E1b进行聚合酶链式反应(PCR)进行体外扩增(方法参见分子克隆实验指南，科学出版1992出版)，其PCR产物进行测序。结果显示：CTGGCCAATACCAACCTTATCCTACACGGTGTAAGCTTAATGAGTAACTAAGATCTGGAAGGTGCTGAGGTACGATGAGACCCGCACCAGGTGCAGACCCTGCGAGTGTGGCGGTAAACTATTAGGAACCAGCCTGTGATGCTGGATGTGACCGAGGAGCTGAGGCCCGATCACTTGGTGCTGGCCTGCACCCGCGCTGAGTTTGGCTCTAGCGATGAAGATACAGATTGAGGTACTGAAATGTGTGGGCGTGGCTTAAGGGTGGGAAAGAATATATAAGGTGGGGGTCTTATGTAGTTTTGTATCTGTTTIGCAGCAGCCGCCGCCGCCATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATAT，这表明pXC-delE1b为pXC.1载体中缺失了2809-3329区域并在该区域中插入TAATGAGTAACTAA。
将本发明的缺陷型病毒转染至E1转化人胚胎肾细胞株293或E1转化的人胚胎视网膜细胞株911细胞，本发明例将其转染293细胞，293细胞株购于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA转化人胚胎肾细胞而成，它含有及表达5型腺病毒E1区，腺病毒DNA对其具有高转染率。将含有5型腺病毒左臂的质粒联合含有5型腺病毒右臂的质粒共转染293细胞，通过同源重组可产生具有感染力的腺病毒。我们将pXC-del E1b与含有5型腺病毒右臂的质粒pBHG10或pBHGE3通过Lipofectamine共转染至293细株，其具体方法参见GIBCO BRL公司的操作说明。pBHG10及pBHGE3购于加拿大Microbix Biosystems Inc.(Ontario)，pBHG10含有5型腺病毒右臂，但缺失E3区；pBHGE3含有5型腺病毒右臂，含有E3区。共转染后9-14天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，该腺病毒命名为CNHK201及CNHK202，具体方法参见GeneTransfer and Expression Protocols，Murray EJ主编，Humana Press 1991出版。
例二.病毒的产生及基因组结构
重组腺病毒方法参见例一内容。其名称见下：
病毒              名称     含Ad5左臂质粒  含Ad5右臂质粒
Ad5-del Elb E3    CNHK201  pXC-del E1b    PBHG10
Ad5-del E1b       CNHK202  pXC-del E1b    PBHGE3
腺病毒在293细胞中大量繁殖，应用氯化铯梯度离心的方法大量纯化腺病毒(具体方法参见Gene Transfer and ExpressionProtocols，Murray EJ主编，Humana Press 1991出版)。其插入序列通过测序证实。Ad5-del E1b E3(CNHK201)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，同时伴有28133-30818bp(E3区部分序列)，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。Ad5-del E1b(CNHK202)为5型腺病毒，在2809-3329bp区域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突变，并在缺失突变区域中插入含有两个终止密码子的序列TAATGAGTAACTAA，病毒其他DNA序列与5型腺病毒相同。

Claims (4)

1.一种缺陷型腺病毒，腺病毒的E1b 55Kda蛋白基因部分缺失并在缺失部位插入终止密码子，其特征为腺病毒2809-3329bp缺失，该缺失部位插入DNA片段TAATGAGTAACTAA。
2.根据权利要求1所述的缺陷型腺病毒，其特征是该重组腺病毒可以与下列化合物之一组成复合物：
(1).化学治疗药物
(2).生物毒素.
(3).单克隆抗体.
3.一种缺陷型腺病毒的构建方法，构建后转染至细胞，其特征是(1).将两个腺病毒载体中一个E1b 55Kda蛋白基因2809-3329bp部分缺失及缺失区插入终止密码子TAATGAGTAACTAA；(2).将上述两个腺病毒载体转染至重组细胞；(3).分离上述重组腺病毒。
4.根椐权利要求3所述的缺陷型腺病毒的构建方法，其特征是将其重组后腺病毒转染至E1转化人胚胎肾细胞株293或E1转化的人胚胎视网膜细胞株911细胞。
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