CN106591368A - 携带il‑15r/il‑15融合基因的b亚群腺病毒11载体及其构建和用途 - Google Patents
携带il‑15r/il‑15融合基因的b亚群腺病毒11载体及其构建和用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106591368A CN106591368A CN201610890097.7A CN201610890097A CN106591368A CN 106591368 A CN106591368 A CN 106591368A CN 201610890097 A CN201610890097 A CN 201610890097A CN 106591368 A CN106591368 A CN 106591368A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tel
- vector
- fusion gene
- promoter
- adenovirus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 title claims abstract description 104
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 title claims abstract description 104
- 102000008616 interleukin-15 receptor activity proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 65
- 108040002039 interleukin-15 receptor activity proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 65
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims abstract description 47
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 42
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 6
- 241000701190 Human adenovirus 11 Species 0.000 title abstract description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 69
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims abstract description 68
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims abstract description 68
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 49
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 38
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 15
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 claims description 13
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 101001055166 Mus musculus Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 6
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims description 4
- 230000002476 tumorcidal effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 101100179540 Homo sapiens IL15 gene Proteins 0.000 claims 3
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 claims 2
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 claims 2
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 claims 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 10
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 abstract 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 21
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 12
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 10
- 244000309459 oncolytic virus Species 0.000 description 10
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 101000961414 Homo sapiens Membrane cofactor protein Proteins 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- 101001055157 Homo sapiens Interleukin-15 Proteins 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 4
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000044446 human CD46 Human genes 0.000 description 4
- 102000056003 human IL15 Human genes 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 4
- 102100025278 Coxsackievirus and adenovirus receptor Human genes 0.000 description 3
- 101710176411 Coxsackievirus and adenovirus receptor Proteins 0.000 description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 3
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 2
- -1 bacteriostats Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 2
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 2
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 2
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 2
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 2
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 241001127714 Amomum Species 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 241000132012 Atractylodes Species 0.000 description 1
- 206010006458 Bronchitis chronic Diseases 0.000 description 1
- 244000003240 Caesalpinia gilliesii Species 0.000 description 1
- 235000014161 Caesalpinia gilliesii Nutrition 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000756943 Codonopsis Species 0.000 description 1
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 102000005707 Desmoglein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010045583 Desmoglein 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 206010050017 Lung cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101150071277 PCDHGA12 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000013557 Plantaginaceae Species 0.000 description 1
- 244000197580 Poria cocos Species 0.000 description 1
- 235000008599 Poria cocos Nutrition 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 238000011053 TCID50 method Methods 0.000 description 1
- 102100032938 Telomerase reverse transcriptase Human genes 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003915 air pollution Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 235000011472 cat’s claw Nutrition 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000007451 chronic bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003905 indoor air pollution Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007056 liver toxicity Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000011242 molecular targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000004719 natural immunity Effects 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5443—IL-15
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及携带IL‑15R/IL‑15融合基因的B亚群腺病毒11载体及其构建和用途，该病毒其E1A的启动子区域由端粒酶基因启动子所替换，其E318.5K由治疗基因mIL‑15R/IL‑15所替换。本发明的Ad11‑Tel‑mIL‑15R/IL‑15载体具有肺癌特异性、安全性和高效性，能通过肿瘤特异性的端粒酶启动子靶向肿瘤，可用于肺癌的治疗。本发明的Ad11‑Tel‑mIL‑15R/IL‑15载体，采用高效的融合基因mIL‑15R/IL‑15作为治疗基因，具有肿瘤靶向性和抗肿瘤效果，为该重组的基因工程产品向临床转化奠定基础，有望为肺癌病人提供一种有效的治疗方法。
Description
技术领域
本发明涉及了一种携带IL-15R/IL-15融合基因的B亚群溶肿瘤腺病毒11载体及其构建和在靶向治疗肺癌中的用途。
技术背景
世界卫生组织(WHO)公布数据显示，2020年全球癌症发病率将比现在增加50％，全球新增癌症患者人数将达到1500万人/每年。肺癌(lung cancer)是目前全球肿瘤死亡的首要原因。据了解，从1985年以来，肺癌已成为全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。影响肺癌发病的首位危险因素是吸烟，90％以上的肺癌被认为是由于主动吸烟或被动吸“二手”烟所致，和吸烟者生活在一起，吸二手烟的人群患肺癌的风险上升20％～30％。此外，环境污染，如：大气污染、居室空气污染、烹调油烟等也是诱发肺癌的因素。另外，一些肺部慢性疾病患者，如：慢性支气管炎,肺结核、弥漫性肺间质纤维化等人群肺癌的发生率也高于其他人群。
鉴于肺癌已经属于全球性的高发恶性肿瘤性疾病，目前，已经发展出了针对肺癌的各种检测和治疗以及预后相关的方法和技术。
中国发明专利申请CN201110328294.7公开了一种有关肺癌诊断试剂盒用于肺癌的检测方法，通过基因重组技术纯化生产S100A2蛋白，纯化的S100A2蛋白，注射于动物体内以诱导产生特异性结合S100A2蛋白的多克隆抗体。同时，该申请也提供了一种肺癌的诊断试剂盒，该试剂盒含有容器，容器中含有S100A2蛋白；标签，所述标签说明所述试剂盒用于诊断肺癌；以及抗S100A2蛋白的特异性抗体。所述试剂盒中还含有免疫组化相关试剂：PBS缓冲液，或0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液，或3％H2O2溶液，或辣根酶检测试剂。该发明对肺癌进行诊断及为患者提供个体化辅助治疗方法。
韩国专利申请PCT/KR2009/000777涉及使用肺癌特异性生物标记物检测肺癌的方法，尤其是肺癌诊断的生物标记物，其可检测其5’UTR或者外显子1区域是在肺癌细胞中特异性甲基化的PCDHGA12基因的甲基化；和使用所述生物标记物检测肺癌和它的发展阶段的方法。该诊断试 剂盒使得相比于传统方法，在早期以准确和快速的方式诊断肺癌成为可能，可用于肺癌和它的发展阶段的预后和监测。
专利申请201610490191.3涉及一种治疗肺癌的中药组合物，所述中药组合物由下述重量配比的原料药组成：党参20-40克、生白术25-35克、茯苓10-20克、陈皮5-15克、法夏6-14克、广木香7-13克、砂仁2-10克、白芍15-25克、瓜萎壳10-20克、玄参9-18克、猫爪草10-18克。该药物组合物对肺癌的治疗起到减毒增效，改善病人临床症状，延长患者生存时间，提高患者生存质量。
尽管近年来肺癌的治疗有很大的进展，然而肺癌病人的预后仍很低，5年生存率不到15％，因此，开发新的有效的治疗方案具有十分重要的意义。生物治疗成为手术、化疗和放疗等传统治疗方法之后的第四大肿瘤治疗模式。
溶瘤病毒(oncolytic virus)，是一类具有复制能力的肿瘤杀伤性病毒，世界上最早出现溶瘤病毒的报道是缘于当时发现一名子宫颈癌患者在感染狂犬病病毒后肿瘤随之消退。溶瘤病毒药以其独特的杀瘤功效日益受到行业人士关注。新城疫病毒(newcastledisease virus，NDV)、单纯疱疹病毒-1(herpes simplex virus-1，HSV-1)、呼肠孤病毒(reovirus)、腺病毒(adenovirus)等因具有天然的嗜肿瘤特性而被用来改造成溶瘤病毒，它们能感染癌细胞而最终摧毁癌细胞。
复制选择性溶肿瘤腺病毒(replication-selective oncolytic adenovirus，RSOA)是生物治疗中发展较快的、具有独特优势的一种新型肿瘤治疗方法。RSOAs不仅本身可以杀伤肿瘤细胞，而且可以通过多种不同的作用模式靶向肿瘤内信号途径发挥作用，并能破坏肿瘤免疫抑制的微环境诱导长期的肿瘤特异性免疫反应。此外，RSOAs而且还可以携带治疗基因，使治疗基因通过病毒选择性在肿瘤细胞中的复制达到高水平、长时间的表达，并且还能广泛感染大量邻近的肿瘤细胞，克服非复制型载体的不足。尽管我国首次在世界上批准了第一个溶肿瘤5型腺病毒(Adenovirus type 5，Ad5)的突变体(H101)用于头颈部肿瘤治疗。但是单独使用时，其抗肿瘤效果非常有限，不能高剂量静脉给药。目前，以Ad5为骨架的RSOA有如下缺点：(1)Ad5黏附的受体为柯萨奇病毒和腺病毒受体(coxsackievirusand adenovirus receptor，CAR)，但CAR在一些肿瘤细胞中表达缺失或低表达；(2)超过90％的人群中已存在高水平抗Ad5的中和抗体；(3)Ad5静脉注射常引起严重的肝脏毒性；(4) Ad5能引起长期的腹腔内炎症反应；这些因素严重限制了基于Ad5的溶肿瘤病毒基因工程药物的临床应用。
简而言之，尽管全世界范围内的对生物疗法投入了大量的精力，但是目前仍然缺少有效的治疗癌症，尤其是肺癌的生物疗法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15及其构建方法以及该载体在治疗肺癌中的用途。该载体通过IL-15R/IL-15介导的天然免疫和适应性免疫发挥抗肿瘤效果，具有靶向性、安全、高效和/或适于静脉注射的特点。
11型腺病毒(Adenovirus type 11，Ad11)，属于B亚群腺病毒，能克服Ad5所具有的上述缺点，具有明显的优势：(1)Ad11能通过补体调节受体CD46感染细胞，该受体在人类恶性肿瘤细胞中广泛高表达，Ad11也能利用受体X、免疫调节分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)以及Desmoglein 2作为受体黏附细胞；(2)人群中Ad11中和抗体的出现率较低；(3)当静脉注射人CD46转基因小鼠时，几乎完全缺乏肝转导和肝毒性，因此，Ad11对于系统性给药具有更大的优越性；(4)Ad11比Ad5具有更少的炎症反应。因此，通过基因工程改造而制备的肿瘤靶向性溶肿瘤病毒Ad11突变体将成为下一代肿瘤生物治疗的新型溶肿瘤病毒。我们课题组前期结果证实，野生型Ad11比Ad5有更高的感染性，尽管野生型Ad11能完全进入肿瘤细胞内，并非对所有肿瘤细胞都有强的杀伤能力，其杀伤性取决于早期基因E1A的转录水平，进一步发现采用Ad5启动子驱动Ad11E1A表达的突变体Ad11-Ad5-P或采用Ad5增强子与启动子联合驱动Ad11E1A表达的突变体Ad11-Ad5-EP病毒具有广泛的肿瘤杀伤性，但缺乏肿瘤选择性。因此，为了提高其对肿瘤细胞的选择性，我们选择了一种端粒酶启动子，该启动子因其无可争辩的高肿瘤特异性、较强的活性以及广泛的分布性，而成为肿瘤靶向治疗极其理想的启动子，将端粒酶启动子替换Ad11-Ad5-P E1A的启动子或Ad11-Ad5-EP E1A的启动子产生新的复制选择性溶肿瘤病毒Ad11-Tel-GFP，从而大大提高其对肿瘤的选择性。
白细胞介素15(interleukin 15，IL-15)一方面能刺激NK细胞的发育、增殖和活化，另一方面能刺激CD8+T细胞的增殖和活化，也是NKT细胞、γδT细胞和B细胞的主要活化因子，并增加B细胞分泌抗体的能 力。由于它的多效性作用，IL-15成为先天免疫系统和适应性免疫系统之间的桥梁，是一种具有潜能的抗肿瘤分子。然而，IL-15单体在体内半衰期很短(少于40min)，但当其与受体连接能显著延长IL-15在体内的半衰期，具有更强的抗肿瘤效果。
基于上述原因，本发明以靶向性的骨架载体Ad11-Tel-GFP为基础，构建一种新型的复制选择性的溶肿瘤病毒Ad11-Tel-IL-15R/IL-15，并证实其在肺癌体内外中均具有显著的抗肿瘤效果，因此可能为肺癌的分子靶向治疗提供一种新的治疗方法。
本发明第一方面提供了提供一种肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15，其特征是：该病毒为B亚群腺病毒，端粒酶启动子(Tel)替换11型腺病毒(Ad11)的E1A的启动子，同时IL-15R/IL-15融合基因替换11型腺病毒(Ad11)的E3区。
在本发明的第一方面中，IL-15R/IL-15融合基因是哺乳动物IL-15R与哺乳动物IL-15的融合基因，例如是人IL-15R和人IL-15的融合基因，或者是小鼠IL-15R和小鼠IL-15的融合基因。其中所述的IL-15R可以是完整的IL-15R或IL-15R的片段，例如IL-15Rα或IL-15Rα的sushi结构域。
优选地，在本发明的第一方面中，端粒酶启动子是人端粒酶启动子。
本发明第二方面提供了肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建靶向E1A的穿梭载体pSSA1A4EME1A，将穿梭载体pSSA1A4EME1A和野生型病毒Ad11按1:2-10的比例转化到大肠杆菌BJ5183中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，获得Ad11-Tel病毒载体；
(2)用PCR方法从ptt3-mIL-15R/IL-15载体中扩增出IL-15R/IL-15融合基因，将靶向E3区的载体pSSNRALA3RFP和IL-15R/IL-15融合基因均采用Swa I和Nco I进行双酶切，利用T4DNA连接酶将片段进行连接构建新型的穿梭载体pSS-IL-15R/IL-15；将穿梭载体pSS-IL-15R/IL-15和Ad11-Tel病毒载体按1:2-10的比例转化到大肠杆菌BJ5183中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，获得Ad11-Tel-IL-15R/IL-15病毒载体；将上述病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15转染到JH293细胞中，生产所述病毒Ad11-Tel-IL-15R/IL-15。
在本发明的第二方面中，IL-15R/IL-15融合基因是哺乳动物IL-15R与哺乳动物IL-15的融合基因，例如是人IL-15R和人IL-15的融合基因，或者是小鼠IL-15R和小鼠IL-15的融合基因。其中所述的IL-15R可以是完整的IL-15R或IL-15R的片段，例如IL-15Rα或IL-15Rα的sushi结构域。
优选地，在本发明的第二方面中，端粒酶启动子是人端粒酶启动子。
本发明的第三方面提供了一种药物，其包含肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15，所述载体的特征在于：该病毒为B亚群腺病毒，端粒酶启动子替换11型腺病毒(Ad11)的E1A的启动子，同时IL-15R/IL-15融合基因替换11型腺病毒(Ad11)的E3区。
在本发明的第三方面中，IL-15R/IL-15融合基因是哺乳动物IL-15R与哺乳动物IL-15的融合基因，例如是人IL-15R和人IL-15的融合基因，或者是小鼠IL-15R和小鼠IL-15的融合基因。其中所述的IL-15R可以是完整的IL-15R或IL-15R的片段，例如IL-15Rα或IL-15Rα的sushi结构域。
优选地，在本发明的第三方面中，端粒酶启动子是人端粒酶启动子。
优选地，所述药物是适于静脉注射的剂型，例如静脉注射液。
进一步优选地，所述的药物在施用于受试者之前被配制成静脉注射液的形式。
配制注射剂时，可加入适宜的附加剂。如渗透压调节剂、pH值调节剂、增溶剂、助溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、助悬剂等。所用附加剂应不影响药物疗效，使用浓度不得引起毒性或明显的刺激。其中抗氧剂可以为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和焦亚硫酸钠等，浓度可为0.1％～0.2％；抑菌剂可为0.5％苯酚、0.3％甲酚和0.5％三氯叔丁醇等。
本发明的第四方面提供了肺癌靶向性腺病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15在制备用于治疗肺癌的药物中的用途，其特征是：该病毒为B亚群腺病毒，其中端粒酶启动子替换11型腺病毒(Ad11)的E1A的启动子，同时IL-15R/IL-15融合基因替换11型腺病毒(Ad11)的E3区。
在本发明的第四方面中，IL-15R/IL-15融合基因是哺乳动物IL-15R与哺乳动物IL-15的融合基因，例如是人IL-15R和人IL-15的融合基因，或者是小鼠IL-15R和小鼠IL-15的融合基因。其中所述的IL-15R可以是完整的IL-15R或IL-15R的片段，例如IL-15Rα或者IL-15Rα的sushi结构域。
优选地，在本发明的第四方面中，端粒酶启动子是人端粒酶启动子。
优选地，所述药物是适于静脉注射的剂型，例如静脉注射液。
进一步优选地，所述的药物在施用于受试者之前被配制成静脉注射液的形式。
配制注射剂时，可加入适宜的附加剂。如渗透压调节剂、pH值调节剂、增溶剂、助溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、助悬剂等。所用附加剂应不影响药物疗效，使用浓度不得引起毒性或明显的刺激。其中抗氧剂可以为亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和焦亚硫酸钠等，浓度可为0.1％～0.2％；抑菌剂可为0.5％苯酚、0.3％甲酚和0.5％三氯叔丁醇等。
本发明的新型病毒载体的有效量可为治疗癌症、或缓解癌症症状或抑制癌细胞的任何量，其可以是相当于约0.1-10mg病毒载体，优选0.5-8mg活性成分的剂量单位。更优选地，剂量单位包括约2-6mg的活性成分。最优选地，剂量单位包括约3-4mg的活性成分。有效量的测定在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文提供的公开内容的启示下。
根据本发明，本发明的药物可以以任意有效剂量数施用给药受试者。优选地，本发明的药物可以以多次剂量给药，例如从约2至约15次剂量，更优选从约4-10次剂量，最优选约6次剂量。在特别优选的实施方案，在给药过程中，以隔天给药约一次的频率将本发明的药物给药至受试者，例如输注或瘤内或静脉注射。在特别优选的实施方案，给药为通过静脉注射。
应当理解本发明的药物可以按用于通过任意适宜的途径给药的任意适宜的方式配制。
本发明的药物的剂量单位是基于常规进行给药受试者。例如，剂量单位可以给药多于每日一次、每两天一次、每周一次、每月一次等。剂量单位可以是以两次/周为基础给药，即每周两次，例如每三天一次。
本发明的药物可包含产品的说明书，且所述说明书可以含有如下 内容：适应症(癌症，例如胰腺癌)、施用剂量(例如上述所示例性说明的)以及可能产生的副作用等等。
如本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。
本发明的积极有益效果：
(1)本发明提供的肺癌靶向性B亚群腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15，利用肿瘤特异性启动子端粒酶启动子，使其增加了肿瘤靶向中的特异性、安全性和高效性，且该载体可用于静脉注射施用。因此，Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15可作为一种治疗肿瘤的有效的、安全的基因治疗载体系统。
(2)本发明的肺癌靶向性B亚群腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15，利用mIL-15R/IL-15作为治疗基因，在端粒酶启动子的引导下，能够在肿瘤部位高效表达IL-15R/IL-15融合蛋白，从而发挥很好的抗肿瘤效果。
(3)本发明的肺癌靶向性B亚群腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15，通过适应性免疫发挥极好的抗肿瘤效果，该病毒作为一种肿瘤靶向性基因工程药物推向临床应用打下基础，将为肺癌病人患者提供一种有效的治疗方法，将会产生较好的社会效益和经济效益。
附图说明：
图1：Ad11-Ad5-EP、Ad11-Tel-GFP及Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15的结构图。
图2：融合基因mIL-15R/IL-15在人肺癌细胞系和小鼠肺癌细胞系中的表达。图中可以看出融合基因mIL-15R/IL-15在细胞系中的表达呈现时间依赖性关系。
图3：Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15在人肺癌细胞系和小鼠肺癌细胞系中的复制和杀伤潜能的检测。图中A为病毒复制的研究，B为病毒对肿瘤细胞杀伤的研究。
图4：肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15对肺癌TC1-CD46转基因小鼠的治疗效果——肿瘤生长曲线和生存分析比较图。
图5：肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15对肺癌TC1-CD46转基因小鼠的治疗效果——肿瘤清除率比较图。
图6：不同病毒对小鼠生存时间的影响。
图7：静脉注射后不同病毒的mIL-15R/IL-15表达情况。
具体实施方式：
以下实例只是对本发明的进一步说明，并不限定本发明的保护范围。
实验方法：
肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15对肺癌体内外抗肿瘤效果评价手段包括如下：
(1)Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15病毒在肺癌细胞中的复制和杀伤：将腺病毒Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15感染JH293细胞，大量增殖、纯化和鉴定后，将不同的肿瘤细胞系铺6孔板，分别以5PFU/孔的病毒剂量感染不同的肿瘤细胞，分别在24h、48h、72h和96h收集上清和细胞，每个时间点设置3个复孔，反复冻融3次后，采用TCID50方法评估腺病毒在不同肿瘤细胞系中的复制能力；
将上述不同的肿瘤细胞铺96孔板，每孔2000个细胞，以1×104PFU/mL为起始浓度，稀释9个病毒梯度，于第6d，加入MTS和PMS(20：1)，采用酶标仪测定492nm的吸光度，采用EC50法计算病毒对不同肿瘤细胞的杀伤能力。
(2)Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15病毒在肺癌小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤效果评价：
将5×105TC1-CD46细胞皮下接种人CD46转基因小鼠，当体积大约为100mm3时，将100μl的5×108PFU的Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15、Ad11-Tel-GFP以及PBS于第1d、3d、5d和7d采用肿瘤内注射，在注射的第1d开始监测肿瘤的大小。测量结束后，汇制肿瘤生长曲线从而评估病毒的治疗效果。
实施例1、肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15的构建。步骤如下：
(1)构建靶向E1A的穿梭载体pSSA1A4EME1A(将PBR322的复制子OriR(两端引入PmeI的酶切位点)，E1A启动子两端的序列，其中左臂连入端粒酶逆转录酶的启动子序列，以及氯霉素抗性基因通过基因工程手段采用T4DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌，在氯霉素抗性中筛选阳性克隆，从而构建pSSA1A4EME1A穿梭载体)，将穿梭载体pSSA1A4EME1A和野生型病毒Ad11按1:2-10的比例转化到大肠杆菌BJ5183中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，获得Ad11-Tel病毒载体；
(2)用PCR方法从ptt3-mIL-15R/IL-15载体(Cheng L,Du X,Wang Z,Ju J,Jia M,Huang Q,Xing Q,Xu M,Tan Y,Liu M,Du P,Su L,Wang S.Hyper-IL-15suppressesmetastatic and autochthonous liver cancer by promoting tumour-specific CD8+Tcell responses.J Hepatol.2014Dec；61(6):1297-303.)中扩增出mIL-15R/IL-15融合基因，将靶向E3区的载体pSSNRALA3RFP和mIL-15R/IL-15融合基因均采用Swa I和Nco I进行双酶切，利用T4DNA连接酶将片段进行连接构建新型的穿梭载体pSS-mIL-15R/IL-15；将穿梭载体pSS-mIL-15R/IL-15和Ad11-Tel病毒载体按1:2-10的比例转化到大肠杆菌BJ5183中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，获得Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15病毒载体；将上述病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15转染到JH293细胞中，生产所述病毒Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15，其结构如图1所示。
实施例2、肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15感染不同肺癌细胞后融合基因mIL-15R/IL-15在细胞内的特异性表达。
在不同时间点收集不同滴度的病毒感染的肿瘤细胞的上清，采用ELISA检测试剂盒Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go分析mIL-15R/IL-15融合蛋白在不同肺癌细胞系中的表达。结果如附图2 所示。
实施例3、肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15在肺癌细胞系中的复制和杀伤能力的检测。
将腺病毒Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15和对照病毒Ad11-Tel-GFP感染JH293细胞，大量增殖、纯化和鉴定后，将不同的肿瘤细胞系铺6孔板，分别以5PFU/孔的病毒剂量感染不同的肿瘤细胞，分别在24h、48h、72h和96h收集上清和细胞，每个时间点设置3个复孔，反复冻融3次后，采用TCID50方法评估腺病毒在不同肿瘤细胞系中的复制能力。由附图3A可知两种病毒均能在肿瘤细胞系中大量复制，特别是在CD46受体介导的细胞中的复制水平显著高于无CD46受体的细胞。
将上述不同的肿瘤细胞铺96孔板，每孔2000个细胞，以1×104PFU/mL为起始浓度，稀释9个病毒梯度，于第6d，加入MTS和PMS(20：1)，采用酶标仪测定492nm的吸光度，采用EC50法计算病毒对不同肿瘤细胞的杀伤能力(EC50越低，表明该病毒杀伤能力更强)。由附图3B可知，Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15与对照病毒相比，其对肿瘤细胞的杀伤潜能均有所下降。
实施例4、肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15对肺癌TC1-CD46荷瘤小鼠的治疗效果。
将6-8周龄的人CD46转基因小鼠右侧背部皮下接种肺癌TC1-CD46细胞，每只小鼠接种细胞数为5×105个细胞，7天后肿瘤达到100mm3左右时进行分组，治疗组5×108pfu/只的Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15进行治疗(瘤内注射)，对照组为磷酸盐缓冲液(PBS)和Ad11-Tel-GFP，实验结果如图4和5所示。
由图4中的左图可知，Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15比对照病毒Ad11-Tel-GFP(图1)具有更强的抗肿瘤效果。
由图4中的右图可知，Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15比对照病毒Ad11-Tel-GFP显著延长小鼠的生存时间。
由图5可知，Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15能使小鼠57.1％的肿瘤完全消除，而对照病毒Ad11-Tel-GFP只能引起小鼠28.6％的肿瘤消除。
实施例5、肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15对转移性肺癌TC1-CD46的治疗效果。
将2×10E6的TC1-CD46细胞通过尾静脉接种于人CD46转基因C57小鼠，在第7d开始治疗，共计3次(第7d、9d和11d)，每组7只，将2×10E8PFU的Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15和Ad11-Tel-GFP病毒通过尾静脉进行注射，记录小鼠死亡时间，采用Kaplan-Meier评估不同病毒对小鼠生存时间的影响，实验结果如图6和图7。
由图6可知，新型的溶肿瘤病毒Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15能显著延长小鼠的存活时间，与PBS组和Ad11-Tel-GFP组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。
由图7可知，Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15病毒静脉注射后，mIL-15R/IL-15的表达在第1d迅速增加，显著高于第3d和第5d，差异具有统计学意义(P<0.05)。相反，PBS和对照病毒Ad11-Tel-GFP静脉注射的小鼠后所有的时间点基本没有mIL-15R/IL-15的表达。
另外，将不同剂量(1×10E8PFU；2×10E8PFU；4×10E8PFU；8×10E8PFU)的本发明的Ad11-Tel-mIL-15R/IL-15病毒静脉注射至不同类型的小鼠肿瘤模型，发现在不同剂量下本发明的病毒载体均能最显著地延长了患肺癌小鼠的存活期(高达对照的3倍)。
虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.肿瘤靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15，其特征是：端粒酶启动子替换11型腺病毒的E1A的启动子，同时IL-15R/IL-15融合基因替换替换11型腺病毒的E3区。
2.如权利要求1所述的载体，其中IL-15R/IL-15融合基因是哺乳动物IL-15R与哺乳动物IL-15的融合基因，例如是人IL-15R和人IL-15的融合基因，或者是小鼠IL-15R和小鼠IL-15的融合基因。
3.如权利要求1或2所述的载体，其中所述的IL-15R可以是完整的IL-15R或IL-15R的片段，例如IL-15Rα；且优选端粒酶启动子是人端粒酶启动子。
4.肿瘤靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建靶向E1A的穿梭载体pSSA1A4EME1A，将穿梭载体pSSA1A4EME1A和野生型病毒Ad11按1:2-10的比例转化到大肠杆菌BJ5183中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，获得Ad11-Tel病毒载体；
(2)用PCR方法从ptt3-mIL-15R/IL-15载体中扩增出IL-15R/IL-15融合基因，将靶向E3区的载体pSSNRALA3RFP和IL-15R/IL-15融合基因均采用SwaI和NcoI进行双酶切，利用T4DNA连接酶将片段进行连接构建新型的穿梭载体pSS-IL-15R/IL-15；将穿梭载体pSS-IL-15R/IL-15和Ad11-Tel病毒载体按1:2-10的比例转化到大肠杆菌BJ5183中，进行同源重组；用PCR方法鉴定阳性重组菌，提取重组质粒，获得Ad11-Tel-IL-15R/IL-15病毒载体；将上述病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15转染到JH293细胞中，生产所述病毒Ad11-Tel-IL-15R/IL-15。
5.药物，其包含肺癌靶向性B亚群溶肿瘤腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15，所述载体的特征在于：端粒酶启动子替换11型腺病毒的E1A的启动子，同时IL-15R/IL-15融合基因替换替换11型腺病毒的E3区。
6.如权利要求5所述的药物，其中IL-15R/IL-15融合基因是哺乳动物IL-15R与哺乳动物IL-15的融合基因，例如是人IL-15R和人IL-15的融合基因，或者是小鼠IL-15R和小鼠IL-15的融合基因。
7.如权利要求5或6所述的药物，其中所述的IL-15R可以是完整的IL-15R或IL-15R的片段，例如IL-15Rα；且优选端粒酶启动子是人端粒酶启动子。
8.如权利要求7所述的药物，其是适于静脉注射的剂型，例如静脉注射液。
9.肺癌靶向性腺病毒载体Ad11-Tel-IL-15R/IL-15在制备用于治疗肺癌的药物中的用途，其特征是：该病毒为B亚群腺病毒，其中端粒酶启动子替换11型腺病毒的E1A的启动子，同时IL-15R/IL-15融合基因替换11型腺病毒的E3区。
10.如权利要求9所述的用途，其中IL-15R/IL-15融合基因是哺乳动物IL-15R与哺乳动物IL-15的融合基因，例如是人IL-15R和人IL-15的融合基因，或者是小鼠IL-15R和小鼠IL-15的融合基因。其中所述的IL-15R可以是完整的IL-15R或IL-15R的片段，例如IL-15Rα，优选地端粒酶启动子是人端粒酶启动子，更优选地，所述药物是适于静脉注射的剂型，例如静脉注射液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610890097.7A CN106591368A (zh) | 2016-10-12 | 2016-10-12 | 携带il‑15r/il‑15融合基因的b亚群腺病毒11载体及其构建和用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610890097.7A CN106591368A (zh) | 2016-10-12 | 2016-10-12 | 携带il‑15r/il‑15融合基因的b亚群腺病毒11载体及其构建和用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106591368A true CN106591368A (zh) | 2017-04-26 |
Family
ID=58555863
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610890097.7A Pending CN106591368A (zh) | 2016-10-12 | 2016-10-12 | 携带il‑15r/il‑15融合基因的b亚群腺病毒11载体及其构建和用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106591368A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113186151A (zh) * | 2021-03-03 | 2021-07-30 | 郑州大学 | 一种提高腺病毒产毒能力的单克隆细胞、细胞库及制备方法 |
Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1478098A (zh) * | 2000-09-14 | 2004-02-25 | ��˹��ɫ�л���ҽ����������˾ | Il-2-和il-15-介导的t细胞应答的调节 |
| WO2005103272A2 (en) * | 2004-03-25 | 2005-11-03 | Cell Genesys, Inc. | Pan cancer oncolytic vectors and methods of use thereof |
| JP2007015997A (ja) * | 2005-07-11 | 2007-01-25 | Oncolys Biopharma Inc | テロメライシン含有抗腫瘍剤耐性克服剤 |
| CN100430476C (zh) * | 2002-07-08 | 2008-11-05 | 关西Tlo株式会社 | 在肿瘤细胞中选择性增殖的肿瘤溶解病毒 |
| CN101565718A (zh) * | 2009-06-11 | 2009-10-28 | 浙江理工大学 | 三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11载体的构建方法及其应用 |
| CN101781636A (zh) * | 2009-01-19 | 2010-07-21 | 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 | 一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒、其构建方法及其用途 |
| CN102174479A (zh) * | 2011-03-02 | 2011-09-07 | 郑州大学 | 靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒及其应用 |
| CN102260712A (zh) * | 2011-05-31 | 2011-11-30 | 郑州大学 | 溶肿瘤能力增强的B型人腺病毒Ad11突变体的构建和应用 |
| CN102821790A (zh) * | 2009-09-14 | 2012-12-12 | 宾夕法尼亚大学托管会 | 包含IL-15受体α和/或编码IL-15受体α的核酸分子的疫苗和免疫治疗剂,以及其使用方法 |
| CN103038343A (zh) * | 2010-03-23 | 2013-04-10 | 英特瑞克斯顿股份有限公司 | 条件表达治疗蛋白的载体，包含所述载体的宿主细胞，及其应用 |
| CN103110939A (zh) * | 2012-10-23 | 2013-05-22 | 郑州大学 | 诱导肿瘤特异性免疫的疫苗及其应用 |
| CN103221423A (zh) * | 2010-09-24 | 2013-07-24 | 昂克斯治疗有限公司 | 溶瘤腺病毒载体及与其相关的方法和用途 |
| CN105177045A (zh) * | 2014-05-21 | 2015-12-23 | 晏阳 | 表达人白介素15的重组溶瘤腺病毒及其构建方法 |
-
2016
- 2016-10-12 CN CN201610890097.7A patent/CN106591368A/zh active Pending
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1478098A (zh) * | 2000-09-14 | 2004-02-25 | ��˹��ɫ�л���ҽ����������˾ | Il-2-和il-15-介导的t细胞应答的调节 |
| CN100430476C (zh) * | 2002-07-08 | 2008-11-05 | 关西Tlo株式会社 | 在肿瘤细胞中选择性增殖的肿瘤溶解病毒 |
| WO2005103272A2 (en) * | 2004-03-25 | 2005-11-03 | Cell Genesys, Inc. | Pan cancer oncolytic vectors and methods of use thereof |
| JP2007015997A (ja) * | 2005-07-11 | 2007-01-25 | Oncolys Biopharma Inc | テロメライシン含有抗腫瘍剤耐性克服剤 |
| CN101781636A (zh) * | 2009-01-19 | 2010-07-21 | 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 | 一种含11型腺病毒纤毛蛋白基因的增殖型重组溶瘤腺病毒、其构建方法及其用途 |
| CN101565718A (zh) * | 2009-06-11 | 2009-10-28 | 浙江理工大学 | 三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11载体的构建方法及其应用 |
| CN102821790A (zh) * | 2009-09-14 | 2012-12-12 | 宾夕法尼亚大学托管会 | 包含IL-15受体α和/或编码IL-15受体α的核酸分子的疫苗和免疫治疗剂,以及其使用方法 |
| CN103038343A (zh) * | 2010-03-23 | 2013-04-10 | 英特瑞克斯顿股份有限公司 | 条件表达治疗蛋白的载体，包含所述载体的宿主细胞，及其应用 |
| CN103221423A (zh) * | 2010-09-24 | 2013-07-24 | 昂克斯治疗有限公司 | 溶瘤腺病毒载体及与其相关的方法和用途 |
| CN102174479A (zh) * | 2011-03-02 | 2011-09-07 | 郑州大学 | 靶向性治疗人肿瘤的溶肿瘤腺病毒及其应用 |
| CN102260712A (zh) * | 2011-05-31 | 2011-11-30 | 郑州大学 | 溶肿瘤能力增强的B型人腺病毒Ad11突变体的构建和应用 |
| CN103110939A (zh) * | 2012-10-23 | 2013-05-22 | 郑州大学 | 诱导肿瘤特异性免疫的疫苗及其应用 |
| CN105177045A (zh) * | 2014-05-21 | 2015-12-23 | 晏阳 | 表达人白介素15的重组溶瘤腺病毒及其构建方法 |
Non-Patent Citations (12)
| Title |
|---|
| ERWAN MORTIER 等: "Soluble interleukin-15 receptor alpha (IL-15Rα)-sushi as a selective and potent agonist of IL-15 action through IL-15Rβ/γ Hyperagonist IL-15•IL-15Rα fusion proteins", 《JBC》 * |
| LIANG CHENG 等: "Immunotherapy of metastatic and autochthonous liver cancer with IL-15-IL-15Rα fusion protein", 《ONCOIMMUNOLOGY》 * |
| STOKLASEK TA 等: "Combined IL-15/IL-15Rα Immunotherapy Maximizes IL-15 Activity In Vivo", 《J IMMUNOL》 * |
| 倪芳 等: "hTERT核心启动子驱动的条件复制型腺病毒载体的构建及鉴定", 《安徽医科大学学报》 * |
| 刘维华 等: "人肺癌和乳腺癌组织IL-15的表达与临床病例因素相关分析", 《免疫学杂志》 * |
| 唐云霞 等: "Ad.TERT-TRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用及其机理", 《癌症》 * |
| 李文新 等: "可溶性白细胞介素15受体α亚单位的原核表达、纯化及生物学活性鉴定", 《中国免疫学杂志》 * |
| 汪小华 等: "人端粒酶逆转录酶启动子介导的E1A和IL-24表达及其对肝癌细胞生长的抑制作用", 《苏州大学学报(医学版)》 * |
| 程亮 等: "超级白细胞介素15（Hyper-IL-15）打破T细胞耐受抑制肝脏转移肿瘤和自发性肝癌的生长（810）", 《第八届全国免疫学学术大会论文集》 * |
| 邱薇 等: "犬2型腺病毒E3区缺失性表达载体的构建及外源基因表达", 《中国兽医学报》 * |
| 闻玉梅 主编: "《现代医学微生物学》", 30 June 1996, 上海医科大学出版社 * |
| 韩瑞发 等主编: "《浅表膀胱肿瘤的基础与临床》", 31 March 2004, 天津科学技术出版社 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113186151A (zh) * | 2021-03-03 | 2021-07-30 | 郑州大学 | 一种提高腺病毒产毒能力的单克隆细胞、细胞库及制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mondal et al. | Recent advances of oncolytic virus in cancer therapy | |
| Zeng et al. | Oncolytic viro-immunotherapy: an emerging option in the treatment of gliomas | |
| JP7030867B2 (ja) | 癌ワクチン開発のための改変アデノウイルス | |
| Aghi et al. | Oncolytic viral therapies–the clinical experience | |
| Cerullo et al. | Oncolytic adenovirus coding for granulocyte macrophage colony-stimulating factor induces antitumoral immunity in cancer patients | |
| Pesonen et al. | Integrin targeted oncolytic adenoviruses Ad5‐D24‐RGD and Ad5‐RGD‐D24‐GMCSF for treatment of patients with advanced chemotherapy refractory solid tumors | |
| Nemunaitis et al. | Phase II trial of intratumoral administration of ONYX-015, a replication-selective adenovirus, in patients with refractory head and neck cancer | |
| JP5296983B2 (ja) | Ｒｎａウイルスが導入された樹状細胞を含む抗癌剤 | |
| AU2023203000A1 (en) | Oncolytic virus therapy | |
| Taguchi et al. | Current status of clinical trials assessing oncolytic virus therapy for urological cancers | |
| Wang et al. | Treating tumors with a vaccinia virus expressing IFNβ illustrates the complex relationships between oncolytic ability and immunogenicity | |
| Lech et al. | Use of attenuated paramyxoviruses for cancer therapy | |
| Jebar et al. | Progress in clinical oncolytic virus-based therapy for hepatocellular carcinoma | |
| Zhao et al. | Newcastle disease virus: a promising agent for tumour immunotherapy | |
| Fu et al. | Combination therapy with oncolytic virus and T cells or mRNA vaccine amplifies antitumor effects | |
| Alvarez-Breckenridge et al. | Potentiating oncolytic viral therapy through an understanding of the initial immune responses to oncolytic viral infection | |
| Lei et al. | A recombinant influenza virus with a CTLA4‐specific scFv inhibits tumor growth in a mouse model | |
| Zhang et al. | Pulmonary resident memory T cells in respiratory virus infection and their inspiration on therapeutic strategies | |
| Silberhumer et al. | Genetically engineered oncolytic Newcastle disease virus effectively induces sustained remission of malignant pleural mesothelioma | |
| Raus et al. | Adenovirus as a new agent for multiple myeloma therapies: Opportunities and restrictions | |
| CN106591368A (zh) | 携带il‑15r/il‑15融合基因的b亚群腺病毒11载体及其构建和用途 | |
| CN105367661B (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化her1靶向性的nkt细胞及其应用 | |
| Lettieri et al. | Progress of oncolytic viruses in sarcomas | |
| Nistal-Villan et al. | Enhanced therapeutic effect using sequential administration of antigenically distinct oncolytic viruses expressing oncostatin M in a Syrian hamster orthotopic pancreatic cancer model | |
| CN117660368A (zh) | 表达趋化因子ccl19的重组溶瘤流感病毒及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170426 |