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CN101646459B - 慢性排斥反应抑制剂 - Google Patents

慢性排斥反应抑制剂 Download PDF

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CN101646459B
CN101646459B CN200880002822.6A CN200880002822A CN101646459B CN 101646459 B CN101646459 B CN 101646459B CN 200880002822 A CN200880002822 A CN 200880002822A CN 101646459 B CN101646459 B CN 101646459B
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Abstract

本发明人对于抗IL-6受体抗体抑制慢性排斥反应的效果进行了研究。使用小鼠心脏移植慢性排斥模型，研究了给予抗小鼠IL-6受体抗体(MR16-1)产生的抑制慢性排斥反应的效果。对移植后60天摘除的移植心脏进行病理组织学分析，结果，在MR16-1治疗组中，慢性排斥反应的特征性的病态——心肌的纤维化和血管狭窄病变与对照组相比得到显著抑制，由此确认给予MR16-1的抑制慢性排斥反应的效果。即首次发现：通过给予抗IL-6受体抗体，可以抑制器官移植后慢性期的排斥反应。

Description

慢性排斥反应抑制剂
技术领域
本发明涉及含有IL-6抑制剂作为有效成分的慢性排斥反应的抑制剂及其应用。还涉及抑制慢性排斥反应的方法，该方法包含将IL-6抑制剂给予对象的步骤。
背景技术
IL-6是被称为B细胞刺激因子2(BSF2)或干扰素β2的细胞因子。IL-6作为与参与B淋巴细胞系细胞的活化的分化因子被发现(非专利文献1)，之后了解到它是对各种细胞功能产具有影响的多功能细胞因子(非专利文献2)。有报道称IL-6诱导T淋巴细胞系细胞的成熟(非专利文献3)。
IL-6在细胞上经由两种蛋白传递其生物学活性。一种是IL-6所结合的分子量约80kD的配体结合性蛋白质-IL-6受体(非专利文献4、5)。IL-6受体除跨细胞膜、在细胞膜上表达的膜结合型之外，还以主要含有由其胞外区的可溶性IL-6受体的形式存在。
另一种是与非配体结合性的信号传递相关的分子量约130kD的膜蛋白gp130。IL-6和IL-6受体形成IL-6/IL-6受体复合物，接着与gp130结合，由此，IL-6的生物学活性在细胞内传递(非专利文献6)。
IL-6抑制剂是抑制IL-6的生物学活性传递的物质。目前已知有IL-6的抗体(抗IL-6抗体)、IL-6受体的抗体(抗IL-6受体抗体)、gp130的抗体(抗gp130抗体)、IL-6变异体、IL-6或IL-6受体部分肽等。
关于抗IL-6受体抗体已经有几种报道(非专利文献7、8、专利文献1-3)，已知其中之一是将小鼠抗体PM-1(非专利文献9)的互补决定区(CDR；complementarity determining region)移植到人抗体中得到的人源化PM-1抗体(专利文献4)。
由于各种免疫抑制剂的临床应用和多剂联合疗法的发展，器官移植后急性排斥反应的治疗方针目前基本确立，各种器官移植后的一年存活率得到显著改善。但是，移植一年以后出现的慢性排斥反应即使在通过以往的免疫抑制疗法克服急性排斥反应、并长期持续免疫抑制疗法的病例中也可见发病，有效的预防方法和治疗方法尚未确立。并且，其病态机理的全部情况尚未清楚，与急性排斥反应相比较难诊断等，因此，作为左右受体长期预后的并发症而为人广泛已知(非专利文献10、11)。
慢性排斥反应中特征性的病理组织现象是：移植器官间质的纤维化和管腔组织内膜肥厚导致的内腔狭窄。特别是血管狭窄是重要的病理现象，表现为移植后血管病变或移植后动脉硬化。该病态的进展中，细胞性免疫和体液免疫两种导致的排斥反应的迁延、器官的缺血再灌流损伤、血管内皮功能损伤、受体中的常规动脉硬化危险因子(糖尿病、高血脂、高血压等)、免疫抑制剂的副作用、遗传性因素、移植后巨细胞病毒感染症等多种因素产生复杂的影响(非专利文献12、13)。
以往的药物中，特别是环孢菌素或他克莫司等神经钙蛋白抑制药对慢性排斥反应无效，高血压、高血脂、糖尿病等副作用出现问题，特别是儿童受体中，移植后必须进行长时间的免疫抑制疗法，因此，人们期待副作用少、对慢性排斥反应有效的药物的开发(非专利文献13、14)。
如上所述，抑制慢性排斥反应的新型免疫抑制疗法开发的必要性成为本研究的重要背景。
本申请的发明相关的先行技术文献信息如下。
专利文献1：国际专利申请公开号WO95-09873
专利文献2：法国专利申请公开号FR 2694767
专利文献3：美国专利编号US 5216128
专利文献4：国际专利申请公开号WO 92-19759
非专利文献1：Hirano，T.等人.，Nature(1986)324，73-76
非专利文献2：Akira，S.等人.，Adv.in Immunology(1993)54，1-78
非专利文献3：Lotz，M.等人.，J.Exp.Med.(1988)167，1253-1258
非专利文献4：Taga，T.等人.，J.Exp.Med.(1987)166，967-981
非专利文献5：Yamasaki，K.等人.，Science(1988)241，825-828
非专利文献6：Taga，T.等人.，Cell(1989)58，573-581
非专利文献7：Novick，D.等人.，Hybridoma(1991)10，137-146
非专利文献8：Huang，Y.W.等人.，Hybridoma(1993)12，621-630
非专利文献9：Hirata，Y.等人.，J.Immunol.(1989)143，2900-2906
非专利文献10：Wong，B.W.等人.，Cardiovasc.Pathol.(2005)14，176-80
非专利文献11：Hornick，P.等人.，Methods Mol.Biol.(2006)333，131-44
非专利文献12：Ramzy，D.等人.，Can.J.Surg.(2005)48，319-327
非专利文献13：Valantine，H.，J.Heart Lung Transplant(2004)23(5Suppl)，S187-93
非专利文献14：Webber，S.A.等人.，Lancet(2006)368，53-69
非专利文献15：Izawa，A.，等人.，Circ.J.(2007)71(Suppl I)，392(Annual Scientific Meeting of the Japanese Circulation Society，Kobe，Mar15-Mar 17，2007；Abstract PE-269)
非专利文献16：Izawa，A.，等人.，Am.J.Transplant.(2007)7(Suppl11)，426(American Transplant Congress，San Francisco，CA，Mar 5-Mar 9，2007；Abstract 1084)
发明内容
本发明针对上述状况而设，其目的在于提供含有IL-6抑制剂作为有效成分的慢性排斥反应的抑制剂。
本发明的又一课题在于提供抑制慢性排斥反应的方法，该方法包含将IL-6抑制剂给予对象的步骤。
本发明人为解决上述课题，对于抗IL-6受体抗体抑制慢性排斥反应的效果进行了研究。
发明人使用小鼠心脏移植慢性排斥模型，对于给予抗小鼠IL-6受体抗体(MR16-1)带来的抑制慢性排斥反应的效果进行了研究。对于移植后60天摘除的移植心脏进行病理组织学分析，结果，在MR16-1治疗组中，慢性排斥反应特征性病态——心肌的纤维化和血管狭窄病变与对照组相比得到显著抑制，由此确认给予MR16-1带来的抑制慢性排斥反应的效果。
即，本发明人首次发现：通过给予抗IL-6受体抗体，可抑制器官移植后慢性期的排斥反应，由此完成了本发明。
更具体地说，本发明提供以下的[1]-[23]。
慢性排斥反应的抑制剂，该抑制剂含有IL-6抑制剂作为有效成分。
[1]所述的慢性排斥反应的抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6的抗体。
[1]所述的慢性排斥反应的抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6受体的抗体。
[2]或[3]所述的慢性排斥反应的抑制剂，其中，抗体是单克隆抗体。
[2]或[3]所述的慢性排斥反应的抑制剂，其中，抗体是识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
[2]或[3]所述的慢性排斥反应的抑制剂，其中，抗体是重组型抗体。
[2]-[6]中任一项所述的慢性排斥反应的抑制剂，其特征在于：抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[1]-[7]中任一项所述的慢性排斥反应的抑制剂，其中，该抑制剂用于抑制心脏移植中的慢性排斥反应。
抑制慢性排斥反应的方法，该方法包含将IL-6抑制剂给予对象的步骤。
[9]所述的方法，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6的抗体。
[9]所述的方法，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6受体的抗体。
[10]或[11]所述的抑制慢性排斥反应的方法，其中，抗体是单克隆抗体。
[10]或[11]所述的方法，其中，抗体是识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
[10]或[11]所述的方法，其中，抗体是重组型抗体。
[10]-[14]中任一项所述的方法，其特征在于：抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[9]-[15]中任一项所述的方法，其特征在于：其中，该方法是抑制心脏移植中的慢性排斥反应。
IL-6抑制剂在制备慢性排斥反应抑制剂中的应用。
[17]所述的应用，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6的抗体。
[17]所述的应用，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6受体的抗体。
[18]或[19]所述的应用，其中，抗体是单克隆抗体。
[18]或[19]所述的应用，其中，抗体是识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
[18]或[19]所述的应用，其中，抗体是重组型抗体。
[18]-[22]中任一项所述的应用，其特征在于：抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
：IL-6抑制剂，该抑制剂用于抑制慢性排斥反应。
具体实施方式
本发明人发现：通过给予抗IL-6受体抗体，可以抑制慢性排斥反应。本发明根据该认识完成。
本发明涉及慢性排斥反应的抑制剂，该抑制剂含有IL-6抑制剂作为有效成分。
本发明中，“IL-6抑制剂”是阻断IL-6的信号传递、抑制IL-6的生物学活性的物质。IL-6抑制剂优选为对于IL-6、IL-6受体和gp130之间的结合具有抑制作用的物质。
本发明的IL-6抑制剂例如有：抗IL-6抗体、抗IL-6受体抗体、抗gp130抗体、IL-6变异体、可溶性IL-6受体变异体或者IL-6或IL-6受体的部分肽、以及与它们显示同样的活性的蛋白质(例如C326 Avimer(Nature Biotechnology(2005)23，1556-61))或低分子物质等，没有特别限定。本发明的IL-6抑制剂优选例举识别IL-6受体的抗体。
本发明的抗体的来源没有特别限定，优选来自哺乳动物，更优选来自人的抗体。
本发明中使用的抗IL-6抗体可以采用公知的方法制成多克隆或单克隆抗体获得。本发明使用的抗IL-6抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体有：在杂交瘤生成的单克隆抗体，以及在通过基因工程方法、用含有抗体基因的表达载体转化的宿主中生成的单克隆抗体。该抗体通过与IL-6结合，可抑制IL-6与IL-6受体的结合，阻断IL-6的生物学活性向细胞内的传递。
上述抗体有MH166(Matsuda，T.等人.，Eur.J.Immunol.(1988)18，951-956)、或SK2抗体(Sato，K.等人.，第21回  日本免疫学会总会，学术记录(1991)21，166)等。
生成抗IL-6抗体的杂交瘤基本上可采用公知技术，如下制备。即，使用IL-6作为致敏抗原，将其按照常规的免疫方法进行免疫，将所得免疫细胞通过通常的细胞融合法与公知的母细胞融合，通过通常的筛选法筛选单克隆的抗体生成细胞。
具体来说，制备抗IL-6抗体的方法可如下进行。例如，作为获得抗体的致敏抗原使用的人IL-6可通过使用Eur.J.Biochem.(1987)168，543-550、J.Immunol.(1988)140，1534-1541或Agr.Biol.Chem.(1990)54，2685-2688中公开的IL-6基因/氨基酸序列来获得。
将IL-6的基因序列插入到公知的表达载体系统中，转化适当的宿主细胞，然后通过公知的方法，从该宿主细胞中或培养上清中纯化目标IL-6蛋白，可以使用该纯化IL-6蛋白作为致敏抗原。还可以使用IL-6蛋白与其它蛋白质的融合蛋白作为致敏抗原。
本发明中使用的抗IL-6受体抗体可使用公知的方法制成多克隆或单克隆抗体获得。本发明使用的抗IL-6受体抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体可以是杂交瘤生成的单克隆抗体，以及在通过基因工程的方法、用含有抗体基因的表达载体转化的宿主中生成的单克隆抗体。该抗体与IL-6受体结合，由此可以抑制IL-6与IL-6受体的结合，阻断IL-6的生物学活性向细胞内的传递。
上述抗体有：MR16-1抗体(Tamura，T.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，11924-11928)、PM-1抗体(Hirata，Y.等人.，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)、AUK12-20抗体、AUK64-7抗体或AUK146-15抗体(国际专利申请公开号WO92-19759号)等。其中，人IL-6受体的优选的单克隆抗体可例举PM-1抗体，而小鼠IL-6受体的优选的单克隆抗体则有MR16-1抗体。
生成抗IL-6受体单克隆抗体的杂交瘤基本上可采用公知技术如下制备。即，使用IL-6受体作为致敏抗原，按照通常的免疫方法用其免疫，将所得免疫细胞按照通常的细胞融合方法与公知的母细胞融合，按照通常的筛选方法筛选单克隆的抗体生成细胞。
具体来说，制备抗IL-6受体抗体可如下进行。例如，作为获得抗体的致敏抗原使用的人IL-6受体可使用欧洲专利申请公开号EP 325474、小鼠IL-6受体可使用日本专利申请公开号日本特开平3-155795中公开的IL-6受体基因/氨基酸序列获得。
IL-6受体蛋白有在细胞膜上表达的、和从细胞膜上脱离的(可溶性IL-6受体)(Yasukawa，K.等人.，J.Biochem.(1990)108，673-676)两种。可溶性IL-6受体由与细胞膜结合的IL-6受体的实质性的胞外区构成，跨细胞膜区或者跨细胞膜区域和胞内区缺损，这一点与膜结合型IL-6受体不同。IL-6受体蛋白只要是可作为制备本发明中使用的抗IL-6受体抗体的致敏抗原使用即可，可使用任何IL-6受体。
将IL-6受体的基因序列插入到公知的表达载体中，转化适当的宿主细胞，然后按照公知的方法，从该宿主细胞中或培养上清中纯化目标IL-6受体蛋白，可使用该纯化IL-6受体蛋白作为致敏抗原。还可以使用表达IL-6受体的细胞或IL-6受体蛋白与其它蛋白的融合蛋白作为致敏抗原。
本发明中使用的抗gp130抗体可使用公知的方法制成多克隆或单克隆抗体获得。本发明使用的抗gp130抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体可以是杂交瘤生成的单克隆抗体，以及在通过基因工程的方法、用含有抗体基因的表达载体转化的宿主中生成的单克隆抗体。该抗体与gp130结合，由此可以抑制IL-6/IL-6受体复合体与gp130的结合，阻断IL-6的生物学活性向细胞内的传递。
上述抗体有AM64抗体(日本特开平3-219894)、4B11抗体和2H4抗体(US5571513)、B-S12抗体以及B-P8抗体(日本特开平8-291199)等。
生成抗gp130单克隆抗体的杂交瘤基本上可采用公知技术如下制备。即，使用gp130作为致敏抗原，按照通常的免疫方法用其免疫，将所得免疫细胞按照通常的细胞融合方法与公知的母细胞融合，按照通常的筛选方法筛选生成单克隆抗体的细胞。
具体来说，制备单克隆抗体可如下进行。例如，作为获得抗体的致敏抗原使用的gp130可使用欧洲专利申请公开号EP 411946中公开的gp130基因/氨基酸序列获得。
将gp130的基因序列插入到公知的表达载体系统中，转化适当的宿主细胞，然后按照公知的方法，从该宿主细胞中或培养上清中纯化目标gp130蛋白，可使用该纯化gp130蛋白作为致敏抗原。还可以使用表达gp130的细胞或gp130蛋白与其它蛋白的融合蛋白作为致敏抗原。
用致敏抗原免疫的哺乳动物没有特别限定，优选考虑与细胞融合时所使用的母细胞的相容性进行选择，通常使用啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠等。
将致敏抗原免疫动物时可按照公知的方法进行，例如通常的方法是将致敏抗原注射到哺乳动物的腹腔内或皮下进行。具体来说，将致敏抗原用PBS(磷酸缓冲盐)或生理盐水等稀释成适当量，并使其悬浮，将其根据需要与通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂适当混合，乳化，然后每隔4-21天分数次给予哺乳动物。致敏抗原免疫时可使用适当的载体。
进行上述免疫，确认血清中所需抗体水平升高，然后由哺乳动物中取得免疫细胞，进行细胞融合。细胞融合所优选的免疫细胞特别可列举出脾细胞。
作为与上述免疫细胞融合的另一种母细胞是哺乳动物的骨髓瘤细胞，可以使用已公知的各种细胞株，例如P3X63Ag8.653(Kearney，J.F.等人.，J.Immunol(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topicsin Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler，G.和Milstein，C.，Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies，D.H.等人.，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.等人.，Nature(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.等人.，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.，J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.等人.，Nature(1979)277，131-133)等。
上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合基本上可按照公知方法、例如Milstein等人(Kohler，G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)的方法等进行。
更具体地说，上述细胞融合例如可在细胞融合促进剂的存在下，在通常的营养培养液中实施。融合促进剂例如可使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，还可以根据需要，为了提高融合效率而进一步添加二甲基亚砜等辅助剂使用。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例例如优选相对于骨髓瘤细胞，使免疫细胞为1-10倍。上述细胞融合中使用的培养液例如可使用上述骨髓瘤细胞株增殖所优选的RPMI1640培养液、MEM培养液、其它该种细胞培养中使用的通常的培养液，并且可以结合使用胎牛血清(FCS)等的血清补充液。
细胞融合是将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的规定量在上述培养液中充分混合，以通常30-60％(w/v)的浓度添加预先加温至37℃左右的PEG溶液、例如平均分子量为1000-6000左右的PEG溶液，混合，由此形成目标融合细胞(杂交瘤)。接着，依次反复进行添加适当的培养液、离心、除去上清的操作，可以除去杂交瘤生长中不优选的细胞融合剂等。
该杂交瘤可以通过在常规的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)中培养来选择。在该HAT培养液中的培养是持续培养至目标杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡所足够的时间，通常持续数天-数周。接着实施通常的极限稀释法，进行生成目标抗体的杂交瘤的筛选和克隆。
对人以外的动物免疫抗原，获得上述杂交瘤，除此之外可以通过体外用所需抗原蛋白或抗原表达细胞致敏人淋巴细胞，将致敏B淋巴细胞与人骨髓瘤细胞例如U266融合，获得与所需抗原或抗原表达细胞具有结合活性的所需的人抗体(参照日本特公平1-59878)。并且还可以将抗原或抗原表达细胞给予具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物，按照上述方法取得所需的人抗体(参照国际专利申请公开号WO93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO96/33735)。
上述制备的生成单克隆抗体的杂交瘤可在通常培养液中继代培养，也可以在液氮中长期保存。
由该杂交瘤获得单克隆抗体时可采取以下的方法：按照常规方法培养该杂交瘤，以其培养上清的形式获得；或者是将杂交瘤给予与其具有相容性的哺乳动物，使其增殖，以其腹水的方式获得等。前者的方法适合获得高纯度的抗体，而后者的方法适合抗体的大量生产。
例如，生成抗IL-6受体抗体的杂交瘤的制备可按照日本特开平3-139293中公开的方法进行。可按照以下的方法进行：将生成PM-1抗体的杂交瘤注入到BALB/c小鼠的腹腔内，获得腹水，由该腹水纯化该PM-1抗体地方法；或者将该杂交瘤在适当的培养基、例如含10％胎牛血清、5％BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim制备)的RPMI1640培养基、杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL制备)、PFHM-II培养基(GIBCO-BRL制备)等中培养，由该培养上清中纯化PM-1抗体的方法。
本发明中，作为单克隆抗体，可以使用从杂交瘤中克隆抗体基因、掺入到适当的载体中、将其导入宿主、采用基因重组技术生成的重组型抗体(例如参照Borrebaeck，C.A.K.and Larrick，J.W.，TherapeuticMonoclonal Antibodies，published in the United Kingdom by MacmillanPublishers Ltd，1990)。
具体来说，从生成目标抗体的细胞、例如杂交瘤中分离编码抗体的可变(V)区的mRNA。mRNA的分离可按照公知的方法、例如胍超离心法(Chirgwin，J.M.等人.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.等.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制备总RNA，使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制备)等制备mRNA。还可使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制备)，直接制备mRNA。
使用反转录酶，由所得mRNA合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成可使用AMV反转录第一链cDNA合成试剂盒等进行。进行cDNA的合成和扩增时，可以采用5′-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech制备)和使用PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.等人.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)。由所得PCR产物纯化目标DNA片段，与载体DNA连接。进一步由此制备重组载体，导入到大肠杆菌中，选择集落，制备所需重组载体。可通过公知的方法例如脱氧法确认目标DNA的碱基序列。
如果获得了编码目标抗体的V区的DNA，则可以将其与编码所需抗体恒定区(C区)的DNA连接，将其掺入表达载体中。或者将编码抗体V区的DNA掺入到含有抗体C区的DNA的表达载体中。
制备本发明中使用的抗体时，如后所述，可以将抗体基因掺入到表达载体，使其在表达控制区、例如在增强子、启动子的控制下进行表达。接着，通过该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。
本发明中，为了降低人的异种抗原性等，可使用人工变异的基因重组型抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体。这些变异抗体可采用已知的方法制备。
嵌合抗体如前所述，可以将编码上述所得抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将其掺入表达载体中，导入宿主，生成(参照欧洲专利申请公开号EP125023、国际专利申请公开号WO92-19759)。使用该已知方法，可获得本发明有用的嵌合抗体。
人源化抗体也称为重构人抗体或人化抗体，是将人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的互补决定区所得，其常规的基因重组方法已经公知(参照欧洲专利申请公开号EP125023、国际专利申请公开号WO92-19759)。
具体来说，通过PCR法，由制备成末端具有重叠部分的多个寡核苷酸合成DNA序列，该DNA序列是设计成小鼠抗体的CDR与人抗体的支架区(FR)连接。将所得DNA与编码人抗体C区的DNA连接，接着，掺入到表达载体中，将其导入宿主，生成并获得(参照欧洲专利申请公开号EP239400、国际专利申请公开号WO92-19759)。
经由CDR连接而成的人抗体的FR可选择互补决定区形成了良好的抗原结合部位的FR。可根据需要置换抗体可变区的支架区的氨基酸，使重构人抗体的互补决定区形成适当的抗原结合部位(Sato，K.等人.，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
嵌合抗体、人源化抗体可以使用人抗体C区。人抗体C区有Cγ，例如可使用Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。为了改善抗体及其生成的稳定性，还可以对人抗体C区进行改性。
嵌合抗体含有来自人以外的哺乳动物的抗体可变区和来自人抗体的C区，人源化抗体还含有来自人以外的哺乳动物的抗体的互补决定区、和来自人抗体的支架区以及C区，两者在人体内的抗原性低，因此可作为本发明中使用的抗体使用。
本发明中使用的人源化抗体的优选的具体例子有：人源化PM-1抗体(参照国利专利申请公开号WO 92-19759)。
人抗体的取得方法除之前所述的方法之外，还已知有使用人抗体文库，通过淘选获得人抗体的技术。例如，可将人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)，通过噬菌体展示法在噬菌体的表面表达，选择与抗原结合的噬菌体。对所选择的噬菌体的基因进行分析，则可以确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。如果了解了与抗原结合的scFv的DNA序列，则可以制备含有该序列的适当的表达载体，获得人抗体。这些方法都是已知的，可参考WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438和WO 95/15388。
如上所述构建的抗体基因可通过公知的方法表达。采用哺乳类细胞时，可以通过常用的有效启动子、要表达的抗体基因、在其3′下游一侧功能性结合polyA信号的DNA或含有该DNA的载体表达。例如，启动子/增强子可以是人巨细胞病毒早期启动子/增强子。
除此之外，可在本发明中使用、用于抗体表达的启动子/增强子可使用反转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等的病毒启动子/增强子，或者是人延伸因子1α(HEF1α)等来自哺乳类细胞的启动子/增强子。
例如使用SV40启动子/增强子时，可以按照Mulligan等人的方法(Mulligan，R.C.等人.，Nature(1979)277，108-114)，使用HEF1α启动子/增强子时，可按照Mizushima等人的方法(Mizushima，S.和Nagata S.，Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)容易地实施。
采用大肠杆菌时，可以将常用的有效启动子、用于抗体分泌的信号序列、要表达的抗体基因功能性结合，使其表达。例如，启动子可以是lacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时，可按照Ward等人的方法(Ward，E.S.等人.，Nature(1989)341，544-546；Ward，E.S.等人.，FASEB J.(1992)6，2422-2427)进行，使用araB启动子时，可按照Better等人的方法(Better，M.等人.，Science(1988)240，1041-1043)进行。
在大肠杆菌的周质中生成时，抗体分泌的信号序列可使用pelB信号序列(Lei，S.P.等人.，J.Bacteriol.(1987)169，4379-4383)。将周质中生成的抗体进行分离，然后将抗体的结构适当重折叠使用(例如参照WO96/30394)。
作为复制起源，可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的病毒，并且，为了在宿主细胞系统中扩增基因拷贝数，表达载体可以含有氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标志。
本发明中使用的抗体的制备中，可使用任意的生成系统。用于制备抗体的生产系统有体外和体内的生产系统。体外的生产系统有：使用真核细胞的生产系统和使用原核细胞的生产系统。
使用真核细胞时，有使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞的生产系统。动物细胞已知有：(1)哺乳类细胞例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼地鼠肾细胞)、HeLa、Vero等，(2)两栖类细胞例如非洲爪蟾卵母细胞，或者(3)昆虫细胞例如sf9、sf21、Tn5等。植物细胞已知有来自烟草(Nicotiana tabacum)的细胞，可以将其进行愈伤组织培养。真菌细胞已知有酵母、例如糖酵母属(Saccharomyces)、例如啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)，霉菌、例如曲霉属(Aspergillus)、例如黑曲霉(Aspergillus niger)等。
使用原核细胞时，有使用细菌细胞的生产系统。细菌细胞已知有大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌。
将目标抗体基因通过转化导入到这些细胞中，将转化的细胞在体外培养，可获得抗体。培养可按照公知的方法进行。例如，培养液可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以结合使用胎牛血清(FCS)等的血清补充液。通过将导入了抗体基因的细胞转移至动物的腹腔等，可在体内生成抗体。
另一方面，体内生产系统有使用动物的生产系统或使用植物的生产系统。使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的生产系统等。
哺乳类动物可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotechnology Applications，1993)。昆虫可以使用蚕。采用植物时，例如可以使用烟草。
向这些动物或植物中导入抗体基因，在动物或植物的体内生成抗体，回收。例如，将抗体基因插入到编码山羊β酪蛋白等乳汁中特性生产的蛋白质的基因的中间，制备成融合基因。将含有插入了了抗体基因的融合基因的DNA片段注入到山羊的胚胎中，将该胚胎导入到雌山羊体内。从接受了胚胎的山羊生产的转基因山羊或其子孙所生产的乳汁中可获得所需抗体。为了增加由转基因山羊生产的含有所需抗体的乳汁量，可以对转基因山羊使用适当的激素(Ebert，K.M.等人.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
使用蚕时，将插入了目标抗体基因的杆状病毒感染蚕，由该蚕的体液获得所需抗体(Maeda，S.等人.，Nature(1985)315，592-594)。并且，使用烟草时，将目标抗体基因插入到植物表达用载体例如pMON530中，将该载体导入到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)等的细菌中。将该细菌感染烟草例如烟草(Nicotiana tabacum)，可由该烟草叶片获得所需抗体(Julian，K.-C.Ma等人.，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。
如上所述，通过体外或体内生产系统生产抗体时，可以将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别掺入到表达载体中，同时转化宿主，或者将编码H链和L链的DNA掺入到单一的表达载体中，转化宿主(参照国际专利申请公开号WO94-11523)。
本发明中使用的抗体只要适合本发明中使用即可，可以是抗体片段或其改性物。抗体的片段有：Fab、F(ab′)2、Fv、或将H链和L链的Fv用适当的接头连接而成的单链Fv(scFv)。
具体来说，将抗体用酶、例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行处理，生成抗体片段，或者构建编码这些抗体片段的基因，将其导入表达载体中，然后在适当的宿主细胞中表达(参照Co，M.S.等人.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976、Better，M.和Horwitz，A.H.，Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Plueckthun，A.和Skerra，A.，Methods in Enzymology(1989)178，497-515、Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663、Rousseaux，J.等人.，Methods in Enzymology(1989)121，663-666、Bird，R.E.等人.，TIBTECH(1991)9，132-137)。
scFv可通过将抗体的H链V区和L链V区连接获得。该scFv中，H链V区和L链V区经由接头、优选肽接头连接(Huston，J.S.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，5879-5883)。scFv中的H链V区和L链V区可以是作为上述抗体的任意来源。连接V区的肽接头例如可使用含有氨基酸12-19个残基的任意的单链肽。
编码scFv的DNA如下获得：以编码上述抗体的H链或H链V区的DNA、以及编码L链或L链V区的DNA为模板，用规定了其两端的引物对、通过PCR法扩增这些序列中编码所需氨基酸序列的DNA部分，接着，进一步将编码肽接头部分的DNA以及规定将其两端与各H链、L链连接而成的引物对组合进行扩增。
如果一旦制备了编码scFv的DNA，则可以按照常规方法获得含有它们的表达载体、以及由该表达载体转化的宿主，还可使用该宿主，按照常规方法获得scFv。
这些抗体的片段可以与上述同样获得其基因并使其表达，通过宿主生成。本发明中所述的“抗体”也包含这些抗体的片段。
抗体的改性物可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。本发明所述的“抗体”中也包含这些抗体改性物。为获得上述抗体改性物，可以通过对所得抗体实施化学改性获得。这些方法在该领域中已得到建立。
如上所述，生成并表达的抗体可以由细胞内外、宿主中分离并纯化至均匀。本发明中使用的抗体的分离、纯化可通过亲和层析进行。
亲和层析中使用的柱例如有蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱中使用的载体例如有HyperD、POROS、SepharoseF.F.等。除此之外可以使用在通常的蛋白质中使用的分离、纯化方法，没有任何限定。
例如，将上述亲和层析以外的色谱、过滤、超滤、盐析、透析等适当选择并组合，可以分离并纯化本发明所使用的抗体。色谱例如有离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤等。这些色谱可应用于HPLC(高效液相色谱)。还可以使用反相HPLC。
上述所得抗体的浓度测定可通过吸光度的测定或ELISA等进行。即，进行吸光度测定时，可以用PBS(-)适当稀释，然后测定280nm的吸光度，以1mg/mL为1.35 OD计算。通过ELISA进行时，可如下测定。即，将100μL用0.1M重碳酸缓冲液(pH 9.6)稀释为1μg/mL的山羊抗人IgG(TAG制备)加入到96孔板(Nunc制备)中，在4℃下温育过夜，固定抗体。封闭后添加100μL含有适当稀释的本发明使用的抗体或含抗体的样品、或者人IgG(CAPPEL制备)作为标准品，在室温下温育1小时。
清洗后加入100μL稀释为5000倍的碱性磷酸酶标记抗人IgG(BIOSOURCE制备)，在室温下温育1小时。清洗后加入底物溶液，温育，然后使用微量板读板器型号3550(Bio-Rad制造)测定405nm的吸光度，计算目标抗体的浓度。
本发明中使用的IL-6变异体是具有与IL-6受体的结合活性、且不传递IL-6的生物学活性的物质。即，IL-6变异体和IL-6竞争性地与IL-6结合，但不传递IL-6的生物学活性，因此可以阻断IL-6的信号传递。
IL-6变异体是通过置换IL-6的氨基酸序列的氨基酸残基来导入变异。作为IL-6变异体原型的IL-6，不管其来源，但考虑到抗原性等，优选人IL-6。
具体来说，使用公知的分子建模程序、例如WHATIF(Vriend等.，J.Mol.Graphics(1990)8，52-56)，预测IL-6的氨基酸序列的二次结构，进一步评价置换的氨基酸残基对全体的影响。确定了适当的置换氨基酸残基之后，以含有编码人IL-6基因的碱基序列的载体作为模板，通过通常进行的PCR法导入变异，进行氨基酸置换，由此可得到编码IL-6变异体的基因。可将其根据需要掺入适当的表达载体中，根据上述重组型抗体的表达、生产和纯化方法获得IL-6变异体。
IL-6变异体的具体例子在Brakenhoff等人.，J.Biol.Chem.(1994)269，86-93、以及Savino等人.，EMBO J.(1994)13，1357-1367，WO96/18648、WO 96/17869中有公开。
本发明中使用的IL-6部分肽或IL-6受体部分肽是分别具有与IL-6受体或与IL-6的结合活性、且不传递IL-6生物学活性的物质。即，IL-6部分肽或IL-6受体部分肽与IL-6受体或IL-6结合，捕获它们，由此特异性地抑制IL-6与IL-6受体的特异性结合。结果不传递IL-6的生物学活性，因此阻断IL-6的信号传递。
IL-6部分肽或IL-6受体部分肽是在IL-6或IL-6受体的氨基酸序列中，含有与IL-6和IL-6受体结合相关的区域的一部分或全部氨基酸序列的肽。上述肽通常含有10-80、优选20-50、更优选20-40个氨基酸残基。
IL-6部分肽或IL-6受体部分肽可如下制备：在IL-6或IL-6受体的氨基酸序列中，确定与IL-6或IL-6受体结合相关的区域，按照通常已知的方法例如基因工程方法或肽合成方法，根据该确定的区域的一部分或全部氨基酸序列制备。
通过基因工程方法制备IL-6部分肽或IL-6受体部分肽时，可以将编码所需肽的DNA序列掺入到表达载体中，按照上述重组型抗体的表达、生产和纯化方法获得。
按照肽的合成方法制备IL-6部分肽或IL-6受体部分肽时，可以采用肽合成中通常使用的方法、例如固相合成法或液相合成法。
具体来说，可按照续医药品的开发第14卷肽合成监修矢岛治明广川书店1991年记载的方法进行。固相合成法例如可采用以下的方法：使要在不溶解于有机溶剂的支撑体上合成的肽的C末端所对应的氨基酸结合，将α-氨基和支链官能基团用适当的保护基保护了的氨基酸按照由C末端至N末端的方向依次进行一个一个氨基酸缩合的反应；再进行使与树脂结合的氨基酸或肽的α-氨基的该保护基团脱离的反应，将上述两种反应交替反复进行，使肽链伸长。固相肽合成法根据所使用的保护基团的种类大致分为Boc法和Fmoc法。
这样，在合成了目标肽之后进行脱保护反应和肽链从支撑体上切断的反应。肽链的切断反应中，Boc法通常可使用氟化氢或者三氟甲磺酸，Fmoc法通常可使用TFA。Boc法中，例如可在氟化氢中、在茴香醚的存在下，对上述保护肽的树脂进行处理。接着，进行保护基团的脱离和支撑体上的切断，回收肽。将其冷冻干燥，由此可得到粗制肽。而在Fmoc法中，例如可在TFA中、按照与上述同样的操作进行脱保护反应和肽链从支撑体上切断的反应。
所得粗制肽可以通过HPLC来进行分离、纯化。在其洗脱时，可使用蛋白质纯化中通常使用的水-乙腈系溶剂，在最佳条件下进行。获得所得色谱的谱图峰的组分，将其冷冻干燥。通过质谱的分子量分析、氨基酸组成分析或氨基酸序列分析等对这样纯化的肽组分进行鉴定。
IL-6部分肽或IL-6受体部分肽的具体例子在日本特开平2-188600、日本特开平7-324097、日本特开平8-311098和美国专利公报US5210075中有公开。
本发明中使用的抗体可以是与聚乙二醇(PEG)、放射性物质、毒素等各种分子结合的螯合抗体。上述螯合抗体可通过对所得抗体进行化学改性获得。抗体的改性方法在该领域中已经确立。本发明的“抗体”也包含这些螯合抗体。
本发明的含有IL-6抑制剂作为有效成分的慢性排斥反应的抑制剂可在慢性排斥反应的治疗中使用。本发明还提供含有IL-6抑制剂作为有效成分的心脏移植中的慢性排斥反应的抑制剂。
本发明的抑制剂所抑制的排斥反应优选在实际的移植医疗中出现问题的慢性排斥反应。该慢性排斥反应是以移植一年以后出现问题的以血管内膜肥厚和间质纤维化为特征的、左右受体长期预后的并发症，是急性排斥反应在临床上被克服后也会缓慢进展的反应。
本发明人已经发现了IL-6抑制剂在小鼠心脏移植急性排斥模型中的治疗效果(WO2007/058194)，慢性排斥反应的病态机理与主要是经由细胞损伤性T细胞的急性排斥反应不同。具体来说，慢性排斥反应与急性排斥反应不同的根据可列举出：
1)呈现移植器官的间质纤维化和管腔组织的内膜肥厚导致狭窄病变的、伴有细胞增殖的特有的病态；
2)对抑制急性排斥反应有效的以往的免疫治疗法无法抑制发病；
3)是临床克服了急性排斥之后仍潜在进行的免疫反应；
4)有慢性排斥反应发病的特征性危险因子。
1)慢性排斥反应的特征性病理组织学观察中，已知有起因于血管内皮损伤、伴有血管平滑肌细胞增殖的血管狭窄病变。这也表现为移植后血管病变或移植后动脉硬化，移植器官的血流降低导致循环损伤，移植器官陷于功能衰竭，由此出现慢性期的严重的并发症。移植器官的血管损伤的原因包含移植手术时缺血再灌流损伤、氧化应激、急性排斥反应，因此，急性排斥反应的抑制或急性期器官保存技术等的进步确实在对慢性排斥反应的抑制方面可见一定的效果，但是尚未有确定性的预防方法；另外，2)对于慢性排斥反应有效的免疫抑制疗法尚未确立。3)潜在性发展的排斥反应中包含同种抗体的体液免疫、和巨噬细胞的浸润或各种细胞因子介导的各种细胞免疫的迁延。4)作为慢性排斥反应的危险因子，已知除了受体的常规动脉硬化的危险因子(糖尿病、高血脂、高血压)之外，还有免疫抑制剂的副作用、遗传因素、移植后感染症(巨细胞病毒等)、抗体在组织中的沉淀等多种因素。这样，由于各种因素的复杂地参与，导致移植器官的功能损伤。
本发明中，“移植后的慢性排斥反应的抑制”是指抑制移植的器官的间质纤维化、管腔组织内膜肥厚导致的狭窄等、抑制上述慢性排斥反应的各种症状。
使用本发明的抑制剂的器官移植中，器官移植并没有特别限定。为本发明的对象的器官移植的优选例子有：心脏、肝脏、肾脏、胰脏、肺、小肠等实质器官，还可应用于心脏瓣膜、血管、皮肤、骨骼、角膜等的组织移植。
本发明中使用的IL-6抑制剂的抑制IL-6信号传递的活性可按照通常使用的方法进行评价。具体来说，培养IL-6依赖性人骨髓瘤株(S6B45、KPMM2)、人Lennert T淋巴瘤细胞株KT3、或IL-6依赖性细胞MH60.BSF2，向其中添加IL-6，同时使IL-6抑制剂共存，由此可以测定IL-6依赖性细胞的3H-胸苷的摄入。培养作为IL-6受体表达细胞的U266，添加125I标记的IL-6，同时加入IL-6抑制剂，测定与IL-6受体表达细胞结合的125I标记的IL-6。上述测定系统中，除存在IL-6抑制剂的组之外，还设置不含有IL-6抑制剂的阴性对照组，将两者所得结果进行比较，可以评价IL-6抑制剂的IL-6抑制活性。
关于移植后的排斥反应是否受到抑制的确认，如果结果是器官的存活性提高，则也可视为在器官移植中“移植损伤受到抑制”。器官的存活可根据各器官的功能在移植后是否正常来判定。
如后述实施例所示，可见通过给予抗IL-6受体抗体，可以抑制心脏移植的慢性排斥反应，因此抗IL-6受体抗体等IL-6抑制剂显示可用作慢性排斥反应抑制剂。
本发明的抑制剂所给予的对象为哺乳动物。哺乳动物优选人。
本发明的抑制剂可以以药物的形式给予，可以口服或非口服、全身或局部给予。例如可选择点滴等静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射、栓剂、灌肠剂、口服性肠溶剂等，可根据患者的年龄、症状选择适当的给予方法。有效给予量可以是每次每1kg体重在0.01mg-100mg的范围内选择。或者每位患者可选择1-1000mg、优选5-50mg的给予量。例如为抗IL-6受体抗体时，优选的给予量、给予方法是血液中存在游离抗体程度的量为有效给予量，具体例子有以下的方法等：1kg体重1个月(4周)可1次至多次给予0.5mg-40mg，优选1mg-20mg，例如可按照2次/周、1次/周、1次/2周、1次/4周等的给予日程，通过点滴等静脉内注射、皮下注射等方法给予。给予日程可以一边观察移植后的状态和血液检查值的动向，一边由2次/周或1次/周至1次/2周、1次/3周、1次/4周，逐渐延长给予间隔等调节给予。
本发明中，抑制剂中可以添加防腐剂或稳定剂等制剂中可接受的载体。制剂可接受的载体可以是其本身可具有上述慢性排斥反应抑制效果的材料，也可以是不具有该抑制效果的材料，是指可以与上述抑制剂一起给予的材料。还可以是：虽然是不具有慢性排斥反应抑制效果的材料、但通过与IL-6抑制剂结合使用，具有协同或相加的稳定化效果的材料。
制剂可接受的材料例如有灭菌水或生理盐水、稳定剂、赋型剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、螯合剂(EDTA)等、粘合剂等。
本发明中，表面活性剂可例举非离子表面活性剂，例如典型的例子有：失水山梨醇单辛酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、失水山梨醇单棕榈酸酯等失水山梨醇脂肪酸酯；甘油单辛酸酯、甘油单肉豆蔻酸酯、甘油单硬脂酸酯等甘油脂肪酸酯；十甘油单硬脂酸酯、十甘油二硬脂酸酯、十甘油一亚油酸酯等聚甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇三硬脂酸酯等聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸酯等聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油基单硬脂酸酯等聚氧乙烯甘油脂肪酸酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯鲸蜡基醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油等聚氧乙烯氢化蓖麻油；聚氧乙烯山梨醇蜜蜡等聚氧乙烯蜜蜡衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酸酰胺等聚氧乙烯脂肪酸酰胺等的具有HLB6-18的等。
表面活性剂有阴离子表面活性剂，例如典型的例子有：鲸蜡基硫酸钠、月桂基硫酸钠、油基硫酸钠等具有碳原子数10-18的烷基的烷基硫酸盐；聚氧乙烯月桂基硫酸钠等环氧乙烷平均加成摩尔数为2-4、烷基的碳原子数为10-18的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐；月桂基硫代琥珀酸酯钠等烷基的碳原子数为8-18的烷基硫代琥珀酸酯盐；天然系的表面活性剂、例如卵磷脂、甘油磷脂；鞘磷脂等鞘磷脂；碳原子数12-18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等。
可以将上述表面活性剂的1种或2种或以上组合添加到本发明的抑制剂中。本发明的制剂中使用的优选的表面活性剂是聚山梨醇20、40、60或80等的聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，特别优选聚山梨醇20和80。还优选以泊洛沙姆(Pluronic F-68(注册商标)等)为代表的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇。
表面活性剂的添加量根据所使用的表面活性剂的种类而不同，采用聚山梨醇20或聚山梨醇80时，通常为0.001-100mg/mL，优选0.003-50mg/mL，进一步优选0.005-2mg/mL。
本发明中，缓冲剂有磷酸、柠檬酸缓冲液、乙酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、磷酸钾、乙醇酸、辛酸、脱氧胆酸、水杨酸、三乙醇胺、富马酸等有机酸等，或者碳酸缓冲液、Tris缓冲液、组氨酸缓冲液、咪唑缓冲液等。
在溶液制剂的领域中，通过溶解于公知的水性缓冲液中，可制备溶液制剂。缓冲液的浓度通常为1-500mM，优选5-100mM，进一步优选10-20mM。
本发明的抑制剂可以含有其它低分子量的多肽、血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质，氨基酸，多糖和单糖等糖类或碳水化合物，糖醇。
本发明中，氨基酸有碱性氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸等，或者这些氨基酸的无机盐(优选盐酸盐、磷酸盐的形式，即磷酸氨基酸)。使用游离氨基酸时，优选的pH值可通过添加适当的生理学可接受的缓冲物质、例如无机酸、特别是盐酸、磷酸、硫酸、乙酸、甲酸或它们的盐来调节。这种情况下，磷酸盐的使用特别可获得稳定的冻干物，因此特别有利。制备物基本不含有机酸、例如苹果酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸等时，或者是不存在对应的阴离子(苹果酸离子、酒石酸离子、柠檬酸离子、琥珀酸离子、富马酸离子等)时特别有利。优选的氨基酸是：精氨酸、赖氨酸、组氨酸或鸟氨酸。可进一步使用酸性氨基酸、例如谷氨酸和天冬氨酸、及其盐的形式(优选钠盐)，或中性氨基酸、例如异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸或丙氨酸，或者芳族氨基酸、例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或衍生物N-乙酰基色氨酸。
本发明中，多糖和单糖等糖类或碳水化合物例如有葡聚糖、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖等。
本发明中，糖醇例如可以是甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇等。
将本发明的药物制成注射用的水溶液时，例如可以混合含有生理盐水、葡萄糖或其它辅助试剂(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、D-麦芽糖醇、氯化钠)的等渗液。该水溶液可以与适当的溶解助剂(例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非离子性表面活性剂(聚山梨醇80、HCO-50)等)结合使用。
根据需要，可以进一步含有稀释剂、溶解助剂、pH调节剂、止痛剂、含硫还原剂、抗氧化剂等。
本发明中，含硫还原剂例如有：N-乙酰基半胱氨酸、N-乙酰基高半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、硫代乙醇酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、以及碳原子数1-7的硫代链烷酸等具有硫化氢基的化合物。
本发明中，抗氧化剂例如有：异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、α-生育酚、乙酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯或乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等螯合剂。
还可以根据需要封入到微囊(羟甲基纤维素、明胶、聚[甲基丙烯酸甲酯]等的微囊)中，制成胶体药物传递系统(脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊等)(参照“Remington’s Pharmaceutical Science16th edition”，Oslo Ed.，1980)。并且，将药物制成缓释性药物的方法也是公知的，可应用于本发明(Langer等人.，J.Biomed.Mater.Res.(1981)15，167-277；Langer，Chem.Tech.(1982)12，98-105；美国专利第3,773,919号；欧洲专利申请公开(EP)第58,481号；Sidman等人.，Biopolymers(1983)22，547-556；EP第133，988)。
所使用的制剂可接受的载体可以根据剂型，从上述中适当或者组合选择，但并不限于此。
本发明涉及抑制慢性排斥反应的方法，该方法包含将IL6-抑制剂给予对象的步骤。
本发明还涉及抑制心脏移植中慢性排斥反应的方法，该方法包含将IL-6抑制剂给予对象的步骤。
本发明中，“对象”是指给予本发明的IL-6抑制剂的生物体、该生物体体内的一部分。生物体没有特别限定，包含动物(例如人、家畜动物、野生动物)。对于上述的“生物体的体内的一部分”没有特别限定。
本发明中，“给予”包含口服或非口服给予。口服给予是以口服制剂的形式给予，口服制剂可以选择颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、溶剂、乳剂、或混悬剂等剂型。
非口服性给予有注射剂形式的给予，注射剂有静脉注射剂、皮下注射剂、肌肉注射剂或腹腔内注射剂等。另外，采用基因治疗的方法，将要给予的含有寡核苷酸的基因导入到生物体内，由此可实现本发明的方法的效果。还可以将本发明的药物局部给予要实施处置的区域。例如，可以通过手术中的局部注入、导管的使用或编码本发明的肽的DNA的靶基因传递来给予。
本发明的抑制剂对对象的给予可以在器官移植之前，也可以在器官移植的同时或器官移植之后进行。另外抑制剂的给予可以是一次也可以是连续给予。
对从生物体中摘除的或排出的生物体的一部分进行给予时，可以使本发明的抑制剂与生物体的一部分“接触”。
本发明中，“接触”根据生物体的状态进行。例如可以是将本抑制剂散布到生物体的一部分、或者将本抑制剂添加到生物体的一部分的破碎物中等，但并不限于这些方法。生物体的一部分为培养细胞时，可以通过将本抑制剂添加到该细胞的培养液中，或者将本发明的含有寡核苷酸的DNA导入到构成生物体一部分的细胞中，由此可进行上述“接触”。
实践本发明的方法时，本发明的药物可以与至少一种已知的化学疗法制剂共同作为药学组合物的一部分给予。或者，本发明的药物可以与至少一种已知的免疫抑制剂同时给予。一种方案是：本发明的抑制剂和已知的化学疗法制剂实质上同时给予。
本发明的慢性排斥反应抑制剂优选在器官移植之后全身给予，也可以对移植了器官的部位给予，还可以与器官同时对靶进行给予。对于要移植的器官，可以离体(ex vivo)给予。
本说明书中引用的所有现有技术文献均作为参照引用到本说明书中。
附图简述
图1是表示移植60天后移植心脏病理组织切片中，通过排斥评分进行的比较研究结果和纤维化区域的比例的照片和图。
图2是表示移植后心血管病变中，分析血管狭窄率的结果的照片和图。
实施例
以下通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。
用作供体的B6.C-H2bm12小鼠经由日本チヤ一ルズ·リバ一株式会社购自美国The Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)，受体C57BL/6小鼠购自日本SLC株式会社。各小鼠MHC抗原是次要错配(II类错配)，因此移植心脏并没有发生急性排斥反应，而是在移植后约2个月时呈现与人的慢性排斥反应一致的病理组织现象，因此确立了慢性排斥反应的动物模型。小鼠在信州大学动物实验设施(正式名称：信洲大学人类环境科学研究支援中心生命科学领域动物实验部门)饲养，按照该设施的动物实验说明进行饲养。使用6-8周龄的小鼠，将过去已有报道的小鼠异位心脏移植模型(Corry，R.J等人.，Transplantation(1973)16，343-350)进行一些改变，按照以下顺序，通过显微镜下手术实施小鼠心脏移植。
供体和受体小鼠均通过腹腔内注射70mg/kg戊巴比妥钠(Nembutal(注册商标))实施麻醉。移植心脏是留有用于吻合的升主动脉和肺动脉2根，其它血管一并结扎摘除。移植心脏在冰上的添加7.5％肝素的冷生理盐水中保存。受体的正中部切开腹部，翻转肠管，使腹部腹主动脉和下腔静脉露出，用微血管用显微血管夹阻断血流，然后分别将该表面切开约1mm，制成吻合口。将移植心脏的主动脉和受体的腹主动脉、移植心脏的肺动脉和受体的下腔静脉分别用10-0尼龙线连接缝合，进行吻合。缓慢打开显微血管夹，使血流重新开放，确认移植心脏的复跳。确认止血后缝合腹壁和皮肤，关闭腹腔。一个手术时间约45分钟，成功率为95％以上。
治疗组是以0.5mg/小鼠/次的给予量将MR16-腹腔内注射，每周2次。对照治疗组是同样给予大鼠IgG(对照IgG)。移植60天后从受体中摘除移植心脏，使用以下的三种病理学指标评价慢性排斥反应。
(1)以细胞浸润和心肌坏死或脱落为指标，按照0-4的五个等级的基准(Billingham，M.E等人.，J.Heart Transplant(1990)9，587-593；Rodriguez，E.R.，J.Heart Lung Transplant(2003)22，3-15)，通过打分的排斥评分，来比较研究苏木精-伊红染色标本中排斥反应的程度。
移植60天后，制备移植心脏的病理组织切片，进行苏木精-伊红染色(图1)。对照治疗组(图1a)中可见广泛的炎症细胞浸润和心肌坏死。MR16-1治疗组(图1b)中，炎症细胞浸润只是轻度，较好地保有心肌组织结构。另外MR16-1给予组的排斥评分与对照治疗组相比受到显著抑制(图1c：对照治疗组3.1±0.3，MR16-1给予组1.4±0.3，p＝0.0013)。
(2)通过MASSON氏三色染色来鉴定慢性排斥的特征性的心肌间质纤维化监定，通过图像分析软件(NIHimage，version 1.62)测量各视野中纤维化区域的比例(％)。
结果，与对照治疗组(图1b)相比，MR16-1治疗组(图1e)中，纤维化区域得到显著抑制(图1f：对照治疗组46.5±4.1％，MR16-1给予组19.0±2.1％，p＝0.0001)。
(3)为了对以内膜肥厚导致的血管狭窄为特征的移植后血管病变进行分析，使内弹性片与原本的血管腔近似，使用同样的图像分析软件，按照Suzuki，J等人.Nat.Med.3，900-903.，1997的方法，通过下式测定血管狭窄率。
狭窄率(％)＝(内弹性片区域-内腔)/内弹性片区域×100
对移植后心血管病变进行分析，结果，与对照治疗组(图2a)相比，在MR16-1治疗组(图2b)中，内膜肥厚受到抑制，血管内腔狭窄受到显著抑制(图2c：对照治疗组59.6±6.0％，MR16-1给予组23.7±4.2％，p＝0.0019)。
以上，在小鼠心脏移植模型中，对受体给予MR16-1可抑制移植心脏的慢性排斥反应，显著抑制特征性病理组织现象——移植心脏的纤维化和血管内膜肥厚。慢性排斥反应是左右受体长期预后的并发症，本药物的临床应用有望开发新的免疫抑制疗法。
产业实用性
根据本发明，提供含有IL-6抑制剂作为有效成分的慢性排斥反应的抑制剂、以及抑制慢性排斥反应的方法，该方法包含将IL-6抑制剂给予对象的步骤。
通过各种免疫抑制剂使得急性期的排斥反应克服后，慢性排斥反应仍会缓慢进展，其病态复杂，且与急性排斥反应不同之处较多。现有的药物慢性排斥反应的预防和治疗效果尚未确立，本发明由于IL-6抑制剂的抑制慢性排斥的效果而提供了新的治疗上的有效性。并且，通过选择性抑制炎症性细胞因子IL-6的作用，因此作为比现有药物的副作用少的免疫抑制剂，其优越性值得期待。

Claims (5)

1.识别IL-6受体且抑制IL-6结合到IL-6受体的抗体在制备心脏移植中的慢性排斥反应抑制剂中的应用。
2.权利要求1所述的应用，其中，所述抗体是单克隆抗体。
3.权利要求1所述的应用，其中，所述抗体是识别人IL-6受体的抗体。
4.权利要求1所述的应用，其中，所述抗体是重组型抗体。
5.权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于：所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
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