CN101531723A

CN101531723A - 一种用生物酶对肝素进行选择性结构修饰制备肝素衍生物的方法

Info

Publication number: CN101531723A
Application number: CN200910024844A
Authority: CN
Inventors: 陈敬华; 金坚; 许正宏
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2009-02-27
Filing date: 2009-02-27
Publication date: 2009-09-16

Abstract

本发明建立了一种通过生物酶对肝素进行选择性结构修饰，提高其抗凝血活性，减少其结合血小板因子等血液蛋白，降低其毒副作用的方法。本发明属于生物医药领域。该方法制备的肝素衍生物，抗栓、抗凝活性都比普通肝素药物高2－3倍，2－O－硫酸基和6－O－硫酸基含量约为普通肝素的20％，与血小板因子的结合能力约为普通肝素的20％。这种新型肝素衍生物抗凝血活性高，副作用低。

Description

一种用生物酶对肝素进行选择性结构修饰制备肝素衍生物的方法

技术领域

本发明涉及一种用生物酶对肝素进行选择性结构修饰制备肝素衍生物的方法，属于生物医药领域。

背景技术

肝素是由高度硫酸化糖醛酸与氨基葡萄糖交替共聚形成的硫酸化多糖，主要从哺乳动物的肥大细胞中分离得到。肝素的优点在于其同时具有较高的抗栓及抗凝活性，皮下注射后能迅速产生抗凝血作用，价格相对便宜，且可以用鱼精蛋白(Protamine)来中和体内过量使用的肝素[8]。但是，肝素的临床使用具有较大的局限性。主要表现在以下几个方面：(1)肝素是从动物内脏中分离得到，因此，不同来源的肝素在组成、分子量、结构上存在较大差异，使质量控制非常困难，因此，缺乏统一的质量标准，不同产品无法替换使用；(2)由于肝素结构的多样性和分子量的多分散性，导致肝素与血浆蛋白、血小板分泌的蛋白及上皮细胞之间的非特异性相互作用，并且与AT-III竞争活性中心，因此，量效关系因人而异，使用前需要通过化验测试来确定剂量；(3)肝素皮下注射时，治疗窗很窄，生物利用度低，半衰期短，药动学和药效学性质都很差；(4)此外肝素可能造成出血和诱导血小板减少(HIT)、骨质疏松等副作用[9]。这些原因限制了肝素在临床上的应用。

理想的抗凝血药物不仅要有统一的质量标准、活性可控、副作用小、剂量小且半衰期长。为了开发这种新型抗凝血药物，国内外药物研究人员尝试用化学法对肝素的结构改造。化学法去硫酸化可以在一定的程度上降低肝素的副作用，但由于缺乏选择性，导致活性中心数量降低，抗凝血活性大幅降低；化学法使肝素过硫酸化，理论上可能提高抗凝血活性中心的数量，从而提高其抗凝血活性。但是，由于硫酸化程度过高，导致其电荷密度过大，使其与血液蛋白非特异性相互作用大幅增加。结果，不仅未能增加其抗凝血活性，反而造成了更严重的毒副作用。

通过选择性酶反应，增加抗凝血活性中心的数量，可大幅度提高低分子量肝素的抗凝血活性。现有的研究表明，肝素的抗凝血活性取决于其戊糖活性中心的数量。戊糖结构中N-，6-O-及3-O-位硫酸基参与结合AT-III，与抗凝血活性有关，而2-O-位硫酸基和艾杜醛酸的作用尚不清楚[13]。其中3-O-位硫酸基尤其重要：如果缺少3-O-位硫酸基，肝素的抗凝血活性则会降低1000倍以上；相反，增加一个3-O-位硫酸基，则可以将肝素的抗凝血活性提高数倍。因此，用3-OST-1和3-OST-5对肝素进行选择修饰，使80％不具有戊糖活性中心的肝素经过反应后拥有戊糖活性中心，就可以大幅度提高肝素的戊糖活性中心的数量，从而提高其抗凝血活性(理论上可以同时提高抗栓和抗凝活性3-5倍)。

通过去硫酸化酶，选择性去除与抗凝血活性无关的硫酸基，降低其电荷密度，可以大幅度降低其毒副作用。肝素类多糖是迄今为止发现的结构最为复杂的分子之一。它由32种不同结构的二糖组成。与结构复杂性相对应的是它的功能复杂性。肝素能结合多种蛋白，在血液凝固、伤口愈合、病毒感染、胚胎发育及肿瘤等生理过程中起着重要作用[17]。肝素的功能取决于它的硫酸基取代情况(sulfation pattern，硫酸化图案)。不同位置的硫酸基发挥的作用不同[18]。比如，抗凝血时，氨基葡萄糖的N-位硫酸基以及非还原末端连接葡萄糖醛酸的氨基葡萄糖的6-O-，3-O-是必需的，而其它的硫酸基则不重要。又如，结合生长因子，促进细胞生长时，2-O-，6-O-位的硫酸基则是必需的[19]。因此，去掉一些不必要的硫酸基，就有可能合成功能专一性的肝素衍生物。这种衍生物将有两个优点：首先，结构较肝素简单、均一，具有功能专一性；其次，其它蛋白竞争活性中心的能力降低，使其药理学性质更为稳定。同时，电荷密度的变化，会降低肝素与血浆、血小板蛋白质间的非特异性结合，比如，降低与PF4的结合能力，从而使血小板减少症等副作用降低。

用生物酶选择性改造肝素的结构，在提高抗凝血活性中心数量的同时，降低与活性无关的2-O-硫酸基和6-O-硫酸基的含量，迄今国内外尚未见任何相关报道。

发明内容

本发明建立了一种用生物酶选择性改造肝素结构制备肝素衍生物的方法。本发明的独到之处有两点：首先将用3-OST-1酶(或3-OST-5)对现有肝素药物进行选择性修饰，最大限度地提高抗凝血活性中心的数量，从而大幅度提高其肝素的抗凝血活性。其次用2-O-sulfatase和6-O-sulfatase酶选择性去除与抗凝血活性无关的硫酸基，降低其电荷密度。这种肝素衍生物临床使用的剂量和毒副作用将大幅度降低，适应症范围将更广。本发明将有助于开发出有自主知识产权的新一代抗凝血药物。我国是肝素生产大国，但是我国的肝素类产品大多只能作为原料出口，每年仅能创造数百万美元的市场价值。我国目前缺乏具有自主知识产权的肝素类药物，国内的市场也大部分被欧美公司所占有。目前，全球每年销售的肝素类抗凝血药物市场价值约为50亿美元。随着人口老龄化的到来，心血管类疾病患者将会逐步增多，我国心血管病发病率每年以近30％的速度增加[2]。因此，本项目不仅具有科学研究价值，而且将具有较大的社会价值和经济价值。

本发明的具体内容分为以下五个部分：

1.用硫酸乙酰肝素3-OH硫酸基转移酶，对肝素3-OH基进行选择性硫酸化，增加活性中心含量，合成产物I。

2.用硫酸乙酰肝素2-OH硫酸基转移酶，对合成产物I 2-OH硫酸基进行选择性去硫酸化，降低与活性无关的2-O-硫酸基含量，合成产物II。

3.用硫酸乙酰肝素2-OH硫酸基转移酶，对合成产物II 2-OH硫酸基进行选择性去硫酸化，降低与活性无关的2-O-硫酸基含量合成产物III。

4.用显色发光底物分析法测定肝素和合成产物III的体外抗栓及抗凝活性。

5.用梯度洗脱法测定肝素和合成产物III与血小板因子PF4的结合能力。

附图说明

图1.肝素及合成产物I的双糖组成的HPLC图谱

图2.肝素及产物II的双糖组成的HPLC图谱

图3.肝素及产物III的双糖组成的HPLC图谱

图4.肝素及产物III与PF4的结合能力

具体实施方式

下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。

实例一

用硫酸乙酰肝素3-OH硫酸基转移酶，合成产物I。通常的硫酸化反应条件为1mg肝素在20ml反应液中于室温下震荡(300rpm)反应6h。反应液包含50mM Tris-HCl(pH7.2)，1％Triton X-100，1％ BSA，1mM MgCl₂，1mM MnCl₂，1mM PNPS，40μM PAP，8mg 3-OST-1(或3-OST-5)及4mg AST-IV。反应产物经DEAE树脂分离、透析、冻干得到合成产物I。用混合肝素降解酶将肝素及合成产物I完全降解成双糖，用C₁₈反相柱HPLC法分析它们的双糖组成和含量。结果示于图1，表明产物I的3-O-硫酸基双糖含量为肝素的3倍左右，揭示其抗凝血活性中心数量提高了3倍。

实例二

用硫酸乙酰肝素2-O去硫酸基酶，合成产物II。通常的去硫酸化反应条件为产物I在20ml反应液中于室温下震荡(300rpm)反应6h。反应液包含50mM Tris-HCl(pH7.2)，1％Triton X-100，1％ BSA，1mM MgCl₂，1mM MnCl₂，1mM CaCl₂，5mg 2-O-sulfatase。反应产物经DEAE树脂分离、透析、冻干得到合成产物II。用混合肝素降解酶将肝素及合成产物II完全降解成双糖，用C₁₈反相柱HPLC法分析它们的双糖组成和含量。结果示于图2，表明产物II的2-O-硫酸基双糖含量为肝素的20％左右。

实例三

用硫酸乙酰肝素6-O去硫酸基酶，合成产物III。通常的去硫酸化反应条件为产物II在20ml反应液中于室温下震荡(300rpm)反应6h。反应液包含50mM Tris-HCl(pH7.2)，1％Triton X-100，1％ BSA，1mM MgCl₂，1mM MnCl₂，1mM CaCl₂，5mg 6-O-sulfatase。反应产物经DEAE树脂分离、透析、冻干得到合成产物III。用混合肝素降解酶将肝素及合成产物III完全降解成双糖，用C₁₈反相柱HPLC法分析它们的双糖组成和含量。结果示于图3，表明产物III的6-O-硫酸基双糖含量为肝素的20％左右。

实例四

用底物显色法测定肝素和产物III的体外抗栓和抗凝活性。首先，用含1mg/ml BSA的PBS将凝血因子Xa、thrombin及抗凝血酶AT-III稀释分别稀释为1U/ml、8U/ml及27μM备用。显色底物S-2765和S-2238分别用PBS配成1mM的溶液。肝素和产物III用含50mM Tris-HCl(pH8.4)，7.5mM Na₂EDTA，175mM NaCl的缓冲液配成系列浓度(1-1000ng/ml)的溶液。测试时，首先将25μl的多糖溶液和25μl的AT-III溶液混合均匀，于37℃保持2分钟。然后加入25μl的凝血因子Xa或thrombin溶液，混合均匀，于37℃保持4分钟。最后，加入25μl的显色底物S-2765或S-2238，混合均匀，并连续测定10分钟内405nm处的吸光度变化，比较并计算凝血因子Xa和thrombin半抑制值IC50。结果列于表1，表明，产物III的体外抗栓活性提高了3倍，抗凝活性提高了2.5倍。

表1.肝素和产物III的体外抗栓、抗凝活性

实例五

先将PF4固定在CNBr-activated Sepharose 4B树脂(Pharmacia)上。在4℃时测定PF4与肝素和产物III的结合能力。PF4-Speharose 4B树脂填装在色谱柱中，分别加入肝素和产物III，然后进行梯度洗脱收集级分，然后用紫外测定每一级分在232nm处的吸光度，并作出相应的洗脱曲线，通过测定洗脱浓度确定PF4与不同级分结合能力。结果示于图4，表明产物III结合的PF4的量大为减少，约为肝素结合量的20％，且结合力降低。

Claims

1.一种用生物酶对肝素进行选择性结构修饰制备肝素衍生物，提高其抗凝血活性、降低其结合血小板因子能力的方法。

2.如权利要求1所述的肝素衍生物的制备方法，该方法由下列步骤组成：

(1)用硫酸乙酰肝素3-O-硫酸基转移酶，通过酶硫酸化反应，将PAPS的硫酸基选择性的转移到肝素氨基葡萄糖3-OH位置，提高3-O-硫酸基含量，合成产物I；

(2)用硫酸乙酰肝素6-O-脱硫酸基酶处理合成产物I，通过酶去硫酸化反应，选择性脱掉非还原末端为艾杜糖醛酸的氨基葡萄糖6-O硫酸基，降低6-O-硫酸基含量，合成产物II；

(3)用硫酸乙酰肝素2-O-脱硫酸基酶处理合成产物I，通过酶反应，选择性脱掉艾杜糖醛酸2-O硫酸基，降低2-O-硫酸基含量，合成产物III；

(4)对合成产物III进行脱盐、透析、干燥，得到白色粉末，极为本方法制备的肝素衍生物。

所宣称的肝素，指从动物内脏的肥大细胞中分离纯化出的肝素钠盐。

所宣称的硫酸乙酰肝素3-O-硫酸基转移酶、6-O-脱硫酸基酶、2-O-脱硫酸基酶指与硫酸乙酰肝素生物合成有关的酶，可以从人、动物或微生物中分离得到，也可以通过分子生物学的技术制备。

所宣称的酶反应，指在一定的pH、缓冲液、温度，用特定的酶催化进行的反应。

所宣称的肝素衍生物是一种硫酸化多糖的钠盐，为白色粉末，分子量在5000-8000，糖醛酸和氨基葡萄糖的组成为1：1，每个糖单元约含1.5个硫酸基，其中3-O-硫酸基含量占整个硫酸基含量的5-10％，N-硫酸基含量为50-60％，2-O-硫酸基硫酸基含量为10-15％，6-O-硫酸基硫酸基含量为10-15％。

3.权利要求2中宣称的酶硫酸化反应，指在由50mM Tris-HCl(pH7.2)，1％ Triton X-100，1％BSA，1mMMgCl₂，1mM MnCl₂，1mM PNPS，40μM PAP，8mg 3-OST-1(或3-OST-5)及4mg AST-IV组成的反应液中进行的反应，于20-40℃下震荡反应2-6h。

4.权利要求2中宣称的酶硫酸化反应，指在由50mM Tris-HCl(pH7.2)，1％Triton X-100，1％BSA，1mMMgCl₂，ImM MnCl₂，1mM CaCl₂组成的反应液中进行的反应，于20-40℃下震荡反应2-6h。

5.权利要求2中宣称的干燥，可以是真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。