CN101605549A - 包括至少一个与生物素或生物素衍生物的共价键的肝素、其制备和用途 - Google Patents
包括至少一个与生物素或生物素衍生物的共价键的肝素、其制备和用途 Download PDFInfo
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Abstract
生物素化肝素，其特征在于所述肝素的构成多糖在它们的还原端具有与基团－(R1)i－Biot的共价键并符合通式(I)：其中i等于0或1，R1代表式－CO－(CH2)j－NH或－CO－(CH2)j－NH－CO－(CH2)k－NH－的链区，其中j和k是可以取1至10的任何值的整数，Biot代表生物素基团或生物素衍生物，对于平均分子量为15000Da的肝素，n代表平均值为大约25的整数，X代表H或SO3Na，Y代表COCH3或SO3Na，波形线是指位于与其相连的吡喃糖环的平面下方或上方的键。它们的制备方法和它们的治疗用途。
Description
本发明涉及含有至少一个与生物素或生物素衍生物的共价键的肝素，还涉及它们的制备方法、含有它们的药物组合物和它们的治疗用途。
肝素是分子量为大约15000道尔顿(Da)的动物来源的硫酸化粘多糖混合物。下文中会提到肝素(héparine或héparines)：肝素的多糖链的结构、平均分子量和多分散性实际上随动物物种和生成肝素的器官而变(例如：猪粘液肝素、牛肠肝素等)。
肝素尤其通过抗凝血酶III(ATIII)催化参与凝血级联反应(cascade dela coagulation du sang)的两种酶，即Xa因子和IIa因子(或凝血酶)的抑制。其因此因其抗凝血和抗血栓形成性质而用于治疗。
但是，肝素具有限制其使用条件的缺陷。特别地，其高抗凝血活性(尤其是其高的抗IIa因子的活性)可造成出血(Seminars in Thrombosisand Hemostasis，第5卷，sup.3，1999)，所述肝素由于这些不合意的出血副作用是已知的。
在治疗血栓形成的领域中，目标是在避免诱发出血的同时重建或维持血液流动性。实际上，公知的是，任何意外原因都可能在治疗的患者中触发出血。也可以需要对处于抗血栓形成治疗中的患者进行外科手术。此外，在某些外科手术过程中，可高剂量使用抗凝血剂以防止血液凝结，在手术最后中和它们是合意的。因此需要可中和的抗血栓形成剂以随时终止抗凝血活性。
在专利申请WO 02/24754和WO 06/030104中已经描述了可中和的抗血栓形成剂，如生物素化的合成多糖。它们的合成，尤其包括在上文提到的多糖的被护等价物上而非在这些多糖本身上进行的生物素或生物素衍生物的接枝，不适用于本发明的化合物。原因在于，希望在最终产品上进行生物素化，该最终产品是多糖的混合物并因此是异质产品，如上述专利申请中所述的生物素在其上的接枝不能诱发接枝位置的充足区域选择性并且不能实现肝素的所有可官能化多糖链的生物素化。
Osmond等人的团队在Analytical Biochemistry，31(2002)199-207中描述了将猪肝素生物素化的几种技术，其中之一被描述为经由还原性氨基化然后与生物素偶联在肝素的还原端偶联生物素。但是，所述文献中描述的操作条件不能完全和可再现地获得生物素化肝素：它们未考虑肝素的结构多样性和如在市售肝素中存在的多糖链的实际结构。市售肝素包含大比例的在其还原端含有根据Osmond等人所述的规程用生物素不能官能化的降解的糖丝氨酸(glycosérine)的多糖链。因此，所述出版物中描述的用于猪肝素生物素化的操作条件不能完全和可再现地获得具有预期特征(如足以实现有效中和的生物素化率)的生物素化肝素。
Tseng等人的团队在Biomaterials，27(2006)，2627-2636中描述了通过与抗生物素蛋白相互作用然后用生物素将肝素官能化的将肝素固定在薄膜上的技术。通过用碘氧化然后形成内酯然后与生物素的2-(4-氨基苯基)乙胺衍生物偶联，进行肝素的生物素化。但是，Tseng等人提出的操作条件没有假定在还原端完全和可再现获得被生物素化的肝素：具体而言，没有表明该氧化步骤在还原端上可以是选择性的，也没有表明在这种处理后保持肝素的生物活性。
Kett等人的团队在Biochimica et Biophysica Acta，1620(2003)，225-234中描述了抗生物素蛋白与各种糖胺聚糖之间的亲合力研究，并证实抗生物素蛋白对肝素表现出强亲合力。在这些亲合力研究中，肝素可以用生物素衍生化，但没有指出在肝素的多糖链中哪个是生物素化的位置。
因此，申请人的目标是提供可用抗生物素蛋白或链霉亲和素中和的并具有与天然(native)肝素相当的生物性质的新型肝素。
本发明目的是新型的改性肝素，在下文被称作“生物素化肝素”，其特征在于所述肝素的构成多糖(polysaccharides constitutifs)在它们的还原端具有与基团(R1)i-Biot的共价键并符合通式(I)：
其中：
-i等于0或1，
-R1代表式(a)或(b)的链区：
其中j和k，相同或不同，是可以取1至10的任何值的整数，
-Biot代表生物素基团或生物素衍生物，
-对于平均分子量为15000Da的肝素，n代表平均值为大约25的整数，
-X代表H或SO3Na，
-Y代表COCH3或SO3Na，
-波形线是指位于与其相连的吡喃糖环的平面下方或上方的键，
及其可药用盐。
令人惊讶地，在多糖链的还原端引入生物素或生物素衍生物不会改变该肝素的药理活性。具体而言，作为本发明的主题的所述新型生物素化肝素具有与天然肝素，即生物素化之前的肝素相当的抗血栓形成活性。
它们具有优于天然肝素的显著优点：在紧急情况下，它们可以用特异性解毒剂迅速中和。这种特异性解毒剂是四聚或单体形式的抗生物素蛋白，或链霉亲和素，各自质量等于大约66000、16400和60000Da(TheMerck Index，Twelfth edition，1996，M.N.920，第151-152页，RevuePierce Avidin-Biotin Handbook)。
它们的优点还在于，可用于一些治疗适应症(indicationsthérapeutiques)中，对于该适应症使用的剂量是更高的，同时降低出血危险；它们因此可用在动脉领域中的治疗中。
上文提到的生物素基团(Biot)是来自六氢-2-氧代-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-戊酸的基团。有利地，根据本发明的通式(I)中的Biot基团符合式(c)：
该生物素衍生物可商业购得(“Pierce”生物素-抗生物素蛋白产品目录，2005，第7-11页)或可以使用本领域技术人员已知的传统方法制备。尤其可以提到专利申请WO 02/24754中提到的生物素衍生物。
在本发明的生物素化肝素中，指数i可以等于0，在这种情况下，在多糖链的还原端的糖单元所带的胺官能上直接进行与生物素或生物素衍生物的键合。
或者，i可以等于1，与生物素基团或生物素衍生物的键可以例如由上式(a)的链区(其中j等于5)或由上式(b)的链区(其中j和k是相同的并等于5)构成。因此，在上式(I)中，R1可以代表例如，式-CO-(CH2)5-NH或-CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-的链区。
在本发明范围内，术语“还原端”是指多糖链端，其中末端葡糖胺(glucosamine)或甘露糖胺(mannosamine)(甘露糖胺来自葡糖胺在碱性介质中的差向异构化)具有符合下式(II)的环形半缩醛官能：
其中
-X代表H或SO3Na，
-Y代表COCH3或SO3Na，且
-波形线是指位于与其相连的吡喃糖环的平面下方或上方的键(下方：葡糖胺，上方：甘露糖胺)。
术语“肝素的构成多糖”是指以含有糖醛酸残基(D-葡糖醛酸或L-艾杜糖醛酸)和D-葡糖胺残基的二糖单元的重复为特征的多糖，该二糖单元可以是N-硫酸化或N-乙酰化的。该二糖单元也可以在D-葡糖胺的C6和/或C3位置和在糖醛酸的C2位置被O-硫酸化(Heparin-bindingproteins，H.Edward Conrad，1998，第1页)。
如上所述，肝素是动物来源的硫酸化粘多糖的混合物。天然肝素，即生物素化之前的原料肝素，被称作“肝素”。
本发明中所用的肝素可以尤其来源于牛、羊或猪；更具体地，它们可以来自牛肺、来自牛的肠粘膜、来自猪的肠粘膜或来自绵羊的肠粘膜。有利地，本发明中所用的肝素来自猪，例如来自猪的肠粘膜。
本发明的生物素化肝素使得所述肝素的构成多糖的至少60％，有利地至少64％在其还原端上具有与基团-(R1)i-Biot的共价键并符合如上定义的式(I)，无论该肝素的原始结构如何；有利地，所述肝素的至少80％的构成多糖在其还原端上具有与基团-(R1)i-Biot的共价键。
本发明包括呈其可药用盐任一种的形式的生物素化肝素。
本发明的主题还包括制备上述生物素化肝素的方法，其特征在于：
a)用肝素酶3处理肝素，
b)然后在胺盐和还原剂存在下，在20至80℃的温度下，对前面获得的产品进行还原性氨基化，
c)最后在水性介质或在有机介质中在碱存在下用活化基团-(R1)i-Biot进行酰化，其中R1、i和Biot如上文针对式(I)所定义。
在肝素酶1、2和3的混合物存在下，由肝素得到的混合物的成分解聚后，可以通过HPLC(尤其是SAX类型，更特别是CTA-SAX类型)分析监测来控制上述制备方法的步骤。这种分析监测可以例如使用专利申请US 2005/0186679A1中所述的方法进行。
尤其证实，在还原性氨基化步骤b)后，所述肝素的构成多糖的至少80％，有利地至少90％在其还原端带有-NH2官能(氨基还原多糖)。
尤其证实，在酰化步骤c)后，所述氨基还原多糖的至少80％，有利地至少90％被生物素化。
本发明的生物素化肝素的制备方法的总收率因此为至少60％和有利地至少64％。有利地，该收率为至少80％。
下列术语如下定义：
-肝素酶1：来自肝素黄杆菌(Flavobacterium heparnum)的肝素裂合酶I(EC 4.2.2.7)
-肝素酶2：来自肝素黄杆菌的肝素裂合酶II
-肝素酶3：来自肝素黄杆菌的肝素裂合酶III(EC 4.2.2.8)
肝素酶3能够除去肝素的多糖链的用于结合到蛋白质(糖丝氨酸)上的区域，并且能够获得还原端不含糖丝氨酸残基的链。肝素酶1和2能使多糖链裂解成低分子量的片段(肝素解聚反应)。
本发明的化合物的制备方法使用之前如文献所报道制成的低肝素作为原料肝素(“天然”肝素)。尤其参考出版物“L’héparine，fabrication，structure，propriétés，analyses”，J.P.Duclos，Masson出版，1984。肝素尤其可根据专利申请US 2005/0215519A1中所述的方法进行制备。
在上述制备法的还原性氨基化步骤b)中，胺盐可以是季胺盐；其有利地的是符合式NH4Z(其中Z代表卤素原子，如氯、氟、溴或碘原子)的卤化铵盐。
在上述制备法的还原性氨基化步骤b)中，还原剂可以是硼氢化物盐，例如氰基硼氢化物盐。
在上述制备法的还原性氨基化步骤b)中，温度有利地为50至80℃。
在上述制备法的酰化步骤c)中，碱可以是碳酸盐或碳酸氢盐，尤其是钠或钾盐形式，或本领域技术人员已知的任何水溶性的或有机介质中可溶的有机碱。
在上述制备法的酰化步骤c)中，术语“有机介质”是指例如二氯甲烷或二甲基甲酰胺。
本发明的生物素化肝素的制备方法有利地包括下列步骤：
a)用肝素酶3处理肝素，
b)然后在卤化铵盐和硼氢化物盐存在下，在50至80℃的温度，对前面获得的产品进行还原性氨基化，
c)最后在水性介质中在碱存在下用活化酯形式的如上定义的基团-(R1)i-Biot进行酰化。
如上定义的生物素化衍生物-(R1)i-Biot可直接以活化酯形式用在酰化反应中，所述活化酯使用本领域技术人员已知的传统偶联条件原位预先形成或生成。尤其可以使用N-羟基琥珀酰亚胺衍生物或3-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺衍生物形式的活化酯。
本发明的制备法在流程图1中举例说明。
流程图1
根据流程图1，用肝素酶3处理肝素以除去残留蛋白质键(即天然或降解的糖丝氨酸)并获得包含不含糖丝氨酸残基的还原端的化合物1。随后在胺盐和还原剂(如硼氢化物盐)存在下使这种肝素(化合物1)经受还原性氨基化以获得在还原端具有游离胺官能的化合物2。
该化合物可随后通过在碱存在下与如上定义的生物素的活化衍生物-(R1)i-Biot的反应来酰化以提供生物素化化合物3。当R1代表链区-CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)5-NH-时，可以例如用3-磺基琥珀酰亚胺基的6-生物素酰氨基己酰己酸酯的钠盐(sel de sodium de l’ester de6-biotinamidohexanoyl hexanoate de 3-sulfosuccinimidyl)进行这种反应，或当R1代表链区-CO-(CH2)5-NH-时用3-磺基琥珀酰亚胺基的6-生物素酰氨基己酸酯(ester de 6-biotinamido hexanoate de 3-sulfosuccinimidyl)的钠盐进行这种反应，或当R1不存在(i＝0)时用生物素酰基-3-磺基琥珀酰亚胺基酯(ester de biotinoyl-3-sulfosccinimidyl)的钠盐进行这种反应。
在流程图1中，要理解的是，化合物1、2和3是理论示意图，因为其实际上是多糖链的混合物作为肝素衍生物。
在下文中，举例详述本发明的生物素化肝素和可用于获得它们的各种中间体的合成例。
使用下列缩写：
EPB肝素：Bioiberica公司出售的肝素；
HPLC：“高效液相色谱”；
SAX：“强阴离子交换色谱”；
CTA：“十六烷基三甲基铵”；
Q.S.P.：“足量至”；
LC：“长链”(对应于6-氨基己酰基链区)；
磺基-NHS：3-磺基琥珀酰亚胺基酯的钠盐；
肝素酶1：来自肝素黄杆菌的肝素裂合酶I酶(EC 4.2.2.7)
肝素酶2：来自肝素黄杆菌的肝素裂合酶II酶
肝素酶3：来自肝素黄杆菌的肝素裂合酶III酶(EC 4.2.2.8)
实施例1：
1.1通过用肝素酶3的解聚而提纯的EPB肝素：
在大约20℃的温度，将1克EPB粗制肝素溶解在15毫升调节至pH7.0±0.1的5mM磷酸钠水溶液、20mM氯化钠和1毫克/毫升BSA中。向该肝素溶液中加入0.5UI肝素酶3。将所得反应混合物搅拌5天。向反应混合物中加入1克氯化钠和45毫升甲醇。所得悬浮液经0.45微米膜过滤，滤饼用甲醇和用二乙醚洗涤，然后在真空下干燥。获得0.98克白色固体。观测到的收率为98％。
产物可使用肝素酶1、2和3的混合物通过解聚进行控制，并使用专利申请US 2005/0186679A1中所述的方法通过HPLC-SAX进行分析。结果表明该原料肝素中存在的糖丝氨酸物类的至少80％消失。
该多糖混合物在D2O中的1H NMR谱(25℃，δ(ppm))，主要信号：
2.05(CH3CO，s)，3.28(CH，m)，3.65(CH，m)，3.77(CH，m)，4.05(CH，m)，4.10(CH，s)，4.20(CH，s)，4.25(CH，d，12Hz)，4.35(CH，s)，4.42(CH，m)，4.88(CH，s)，5.22(CH，s)，5.42(CH，s).
1.2用氨基-还原肝素酶3解聚的肝素：
将0.5克用肝素酶3提纯的肝素溶解在5M氯化铵水溶液中。将0.5克氰基硼氢化钠添加到该肝素溶液中。将该混合物在70℃下保持24小时。将该溶液冷却至大约20℃的温度，用水稀释(Q.S.P.50毫升)，然后在Séphadex G10柱上脱盐。注入到将所得馏分注入到Q-Sépharose柱上。产物用水洗脱，然后用高氯酸钠梯度洗脱。将所得产物在Séphadex G10柱上脱盐，然后冻干。获得444毫克白色冻干产物。观测到的收率为89％。该产物原样用在后面酰化步骤中。
该多糖混合物在D2O中的1H NMR谱(25℃，δ(ppm))，主要信号：
2.05(CH3CO，s)，3.28(CH，m)，3.65(CH，m)，3.77(CH，m)，4.05(CH，m)，4.10(CH，s)，4.20(CH，s)，4.25(CH，d，12Hz)，4.35(CH，s)，4.42(CH，m)，4.88(CH，s)，5.22(CH，s)，5.42(CH，s).
1.3：用肝素酶3解聚的、生物素化并氨基还原的肝素
将200毫克氨基还原的解聚肝素在大约20℃下溶解在2毫升0.5M碳酸氢钠溶液中。将37毫克磺基-NHS-LC-生物素添加到所得溶液中。将所得溶液在大约20℃下搅拌1小时。该溶液用4毫升0.5M碳酸氢钠溶液稀释。加入37毫克磺基-NHS-LC-生物素，并将所得混合物搅拌2小时。再加入37毫克磺基-NHS-LC-生物素并将反应混合物搅拌16小时。所得反应介质用水(Q.S.P.200毫升)稀释，在0.45μm膜上过滤，并注入到Q-Sépharose柱上。产物用水洗脱，然后用高氯酸钠梯度洗脱。将所得产物在Séphadex G10柱上脱盐，然后冻干。获得188毫克白色冻干产物。观测到的收率为94％。
该产物可以使用肝素酶1、2和3的混合物通过解聚进行控制，并使用专利申请US 2005/0186679A1中所述的方法通过HPLC-SAX进行分析。
该多糖混合物在D2O中的1H NMR谱(25℃，δ(ppm))，主要信号：
1.3-1.8(CH2生物素，m)，2.05(CH3CO，s)，2.25(CH2CO生物素，t，7Hz)，2.79(1H，d，12Hz)，3.00(1H，dd，12et 5Hz)，3.20(NCH2生物素，m)，3.30(CH，m)，3.68(CH，m)，3.80(CH，m)，4.05(CH，m)，4.10(CH，s)，4.20(CH，s)，4.25(CH，m)，4.35(CH，s)，4.45(CH，m)，4.63(NCH生物素，m)，4.85(CH，s)，5.22(CH，s)，5.42(CH，s).
实施例2：
2.1根据US 2005/0215519A1获得的肝素，用肝素酶3解聚：
在大约20℃的温度下，将1克根据US 2005/0215519A1的肝素溶解在15毫升调节至pH 7.0±0.1的5mM磷酸钠水溶液、20mM氯化钠和1毫克/毫升BSA中。向该肝素溶液中加入0.5UI肝素酶。将所得反应混合物搅拌7天。向反应混合物中加入1克氯化钠和45毫升甲醇。所得悬浮液经0.45微米膜过滤，滤饼用甲醇和用二乙醚洗涤，然后在真空下干燥。获得0.96克白色固体。观测到的收率为96％。
该产物使用肝素酶1、2和3的混合物通过解聚进行控制，并使用专利申请US 2005/0186679A1中所述的方法通过HPLC-SAX进行分析。结果表明该原料肝素中存在的糖丝氨酸物类的至少80％消失。
该多糖混合物在D2O中的1H NMR谱(25℃，δ(ppm))，主要信号：
2.05(CH3CO，s)，3.28(CH，m)，3.65(CH，m)，3.77(CH，m)，4.05(CH，m)，4.10(CH，s)，4.20(CH，s)，4.25(CH，d，12Hz)，4.35(CH，s)，4.42(CH，m)，4.88(CH，s)，5.22(CH，s)，5.42(CH，s).
2.2用肝素酶3解聚并氨基-还原的根据US 2005/0215519A1的肝素：
将0.5克用肝素酶3处理过的根据US 2005/0215519A1的肝素溶解在20毫升5M氯化铵水溶液中。将0.5克氰基硼氢化钠添加到该肝素溶液中。将该混合物在70℃下保持24小时。将该溶液冷却至大约20℃，用水(Q.S.P.50毫升)稀释，然后在Séphadex G10柱上脱盐。将收集的馏分冻干。获得446毫克白色冻干产物。观测到的收率为89％。该产物原样用在下一酰化步骤中。
该多糖混合物在D2O中的1H NMR谱(25℃，δ(ppm))，主要信号：
2.05(CH3CO，s)，3.28(CH，m)，3.65(CH，m)，3.77(CH，m)，4.05(CH，m)，4.10(CH，s)，4.20(CH，s)，4.25(CH，d，12Hz)，4.35(CH，s)，4.42(CH，m)，4.88(CH，s)，5.22(CH，s)，5.42(CH，s).
2.3：用肝素酶3解聚的生物素化并氨基还原的根据US 2005/0215519A1的肝素
将200毫克氨基还原的解聚肝素在大约20℃温度溶解在2毫升0.5M碳酸氢钠溶液中。将37毫克磺基-NHS-LC-生物素添加到所得溶液中。将该溶液在大约20℃下搅拌1小时。所得悬浮液用4毫升0.5M碳酸氢钠溶液稀释。加入37毫克磺基-NHS-LC-生物素，并将该混合物搅拌2小时。再加入37毫克磺基-NHS-LC-生物素并将反应混合物搅拌16小时。所得反应介质用水(Q.S.P.200毫升)稀释，经0.45μm膜过滤，并注入到Q-Sépharose柱上。产物用水洗脱，然后用高氯酸钠梯度洗脱。将所得产物在Séphadex G10柱上脱盐，然后冻干。获得188毫克白色冻干产物。观测到的收率为94％。
该产物可以使用肝素酶1、2和3的混合物通过解聚进行控制，并使用专利申请US 2005/0186679A1中所述的方法通过HPLC-SAX进行分析。
该多糖混合物在D2O中的1H NMR谱(25℃，δ(ppm))，主要信号：
1，3-1，8(CH2生物素，m)，2，05(CH3CO，s)，2，25(CH2CO生物素，t，7Hz)，2，79(1H，d，12Hz)，3，00(1H，dd，12et 5Hz)，3，20(NCH2生物素，m)，3，30(CH，m)，3，68(CH，m)，3，80(CH，m)，4，05(CH，m)，4，10(CH，s)，4，20(CH，s)，4，25(CH，m)，4，35(CH，s)，4，45(CH，m)，4，63(NCH生物素，m)，4，85(CH，s)，5，22(CH，s)，5，42(CH，s).
本发明的化合物作为生物化学和药理学研究的对象。
抗IIa因子活性和抗Xa因子活性的测量
经由显色法分析在人血浆或缓冲体系中的抗IIa因子(抗-FIIa)活性和抗Xa因子(抗-FXa)活性：借助含有发色底物S-2238、α-凝血酶和人ATIII(抗凝血酶III)的Actichrome肝素的抗IIa因子试剂盒(Americandiagnostica)测试抗IIa因子活性。使用含有ATIII、Xa因子和发色底物S-2765的Heparin试剂盒(Instrumentation Laboratory)，用自动血凝仪ACL7000(Instrumentation Laboratory)测定抗-FXa活性。完全根据制造商的指示进行两次分析。
使用下列标样以建立用于测量生物素化肝素馏分在人血浆和缓冲体系中的体外活性的标准校准曲线：
-低分子量肝素的第一国际标样(National Institute for BiologicalStandards and Control，Londres，R-U，在1987年建立，编号No.85/600)
-低分子量肝素的第二国际标样(National Institute for BiologicalStandards and Control，Londres，R-U，在1987年建立，编号No.01/608，自2006年6月起使用)
-依诺肝素(enoxaparine)(sanofi-aventis，France)用作内标。
为了测定抗-FIIa活性，将10微升样品或低分子量肝素国际标样用在人血浆或含有0.05M Tris HCl、0.154M NaCl的缓冲体系(pH 7.4)中的抗凝血酶稀释至1∶16。将10微升该溶液添加到96孔微量滴定板中。一式三份地重复该测量(在3个孔上)。在300转/分钟下搅动的同时，将该微量滴定板保持在37℃下。将40微升凝血酶添加到所述孔的每一个孔中并正好培养2分钟。加入40微升Spectrozyme。90秒后，通过添加40微升乙酸，终止反应。使用SpectraMax 340(Molecular Devices)在405nm下测量吸收。
为了测量抗-FXa活性，将样品或低分子量肝素的国际标样在人血浆或含有0.05M Tris HCl、0.154M NaCl的缓冲体系(pH 7.4)中稀释。将在血浆或该缓冲液中含有类肝素
的样品再用含ATIII的工作缓冲液稀释至1∶20，并一式两份地装在探针转子(rotor de sondage)中。将Xa因子试剂和发色底物倒入自动血凝仪ACL 7000的所指示的储器中。
用集成到ACL 7000软件中的“Héparine”程序进行抗-FXa活性的测量。在分析过程中，将50微升样品(用工作缓冲液稀释)与50微升Xa因子试剂混合。在37℃下60秒培养时间后，加入50微升浓度1.1mM的发色底物，并在405nm波长下测量作为时间的函数的吸收变化。
所得结果尤其描述在下表中。
| 抗-FXa活性(UI/mg) | |
| EPB肝素 | 235 |
| 用肝素酶3提纯的EPB肝素 | 251 |
| 用肝素酶3提纯并氨基还原的EPB肝素 | 217 |
| 用肝素酶3提纯、氨基还原并生物素化的EPB肝素 | 218 |
| 根据US 2005/0 215 519 A1的肝素 | 214 |
| 用肝素酶3提纯的根据US 2005/0 215 519 A1的肝素 | 257 |
| 用肝素酶3提纯并氨基还原的根据US 2005/0 215 519 A1的肝素 | 203 |
| 用肝素酶3提纯、氨基还原并生物素化的根据US 2005/0 215 519 A1的肝素 | 214 |
由此看出，与原料天然肝素相比，本发明的生物素化肝素保持抗-FXa活性。
本发明的生物素化肝素可用于制备药物。它们尤其可用作抗血栓形成剂。因此，根据其另一方面，本发明的一个主题是包含如上定义的生物素化肝素的药物。这些药物用于治疗，特别是用于治疗和预防静脉血栓形成、动脉血栓形成事件(accidents thrombotiques artéreils)(尤其是在心肌梗塞或不稳定心绞痛的情况下)、周围动脉血栓形成，如下肢动脉病、缺血性脑卒中(thromboses artérielles cérébrales)和中风(accidentsvasculaires cérébraux)。它们也可用于预防和治疗平滑肌细胞增殖、血管生成和用作动脉粥样硬化和动脉硬化的神经保护药。
根据其另一方面，本发明还涉及上述病状的治疗方法，包括向患者给药有效剂量的本发明的化合物或其可药用盐。如上定义的生物素化肝素用于治疗和预防上述病状的用途因此构成本发明的一部分，以及所述生物素化肝素用于制造用于治疗或预防这些病状的药物的用途也构成本发明的一部分。
根据其另一方面，本发明的主题是包含，作为活性成分，本发明的生物素化肝素或其可药用盐以及至少一种可药用惰性赋形剂的药物组合物。根据所希望的药物形式和给药模式(例如口服、舌下、皮下、肌肉内、静脉内、经皮、经粘膜、局部或直肠途径)选择所述赋形剂。
在每单位剂量中，活性成分以适合所设计的每日剂量的量存在以获得所需预防和治疗作用。每单位剂量可以含有25至150毫克，有利地30至100毫克活性成分。这些抗凝血剂化合物可以用抗生物素蛋白或链霉亲和素进行中和。
在具体情况中，更高或更低剂量可能适当；这类剂量不超出本发明的范围。根据一般实践，由医生根据给药模式和所述患者的体重和反应决定适合各患者的剂量。
本发明的化合物也可以与一种或多种可用于所希望治疗的其它活性成分，如抗血栓形成剂、抗凝血剂或抗血小板凝集药组合使用。
本发明的主题还包括使用抗生物素蛋白或链霉亲和素的方法，其特征在于，其能够中和本发明的生物素化肝素。因此，该抗生物素蛋白或链霉亲和素可用于制备用于中和本发明的生物素化肝素的药物。
Claims (17)
1.生物素化肝素，其特征在于所述肝素的构成多糖在它们的还原端具有与基团-(R1)i-Biot的共价键并符合通式(I)：
其中：
-i等于0或1，
-R1代表式(a)或(b)的链区：
其中j和k，相同或不同，是可以取1至10的任何值的整数，
-Biot代表生物素基团或生物素衍生物，
-对于平均分子量为15000Da的肝素，n代表平均值为大约25的整数，
-X代表H或SO3Na，
-Y代表COCH3或SO3Na，
-波形线是指位于与其相连的吡喃糖环的平面下方或上方的键，
及其可药用盐。
2.根据权利要求1的肝素，其特征在于i等于0，
及其可药用盐。
3.根据权利要求1的肝素，其特征在于i等于1且R1代表式(a)的链区，其中j等于5，
及其可药用盐。
4.根据权利要求1的肝素，其特征在于i等于1且R1代表式(b)的链区，其中j和k是相同的并等于5，
及其可药用盐。
5.根据权利要求1至4任一项的肝素，其特征在于Biot代表式(c)的生物素基团：
及其可药用盐。
6.根据权利要求1至5任一项的肝素，其特征在于所述肝素的构成多糖的至少64％在其还原端上具有与基团-(R1)i-Biot的共价键，
及其可药用盐。
7.根据权利要求6的肝素，其特征在于所述肝素的构成多糖的至少80％在其还原端上具有与基团-(R1)i-Biot的共价键，
及其可药用盐。
8.根据权利要求1至7任一项的肝素，其特征在于所述肝素来源于猪。
9.根据权利要求8的肝素，其特征在于所述肝素来自猪的肠粘膜。
10.制备如权利要求1至9任一项所定义的生物素化肝素的方法，其特征在于其包括下列步骤：
a)用肝素酶3处理肝素，
b)然后在胺盐和还原剂存在下，在20至80℃的温度下，对前面获得的产品进行还原性氨基化，
c)最后在水性介质或在有机介质中在碱存在下用活化基团-(R1)i-Biot进行酰化，其中R1、i和Biot如权利要求1至5任一项中所定义。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于其包括下列步骤：
a)用肝素酶3处理肝素，
b)然后在卤化铵盐和硼氢化物盐存在下，在50至80℃的温度下，对前面获得的产品进行还原性氨基化，
b)最后在水性介质中在碱存在下用呈活化酯形式的基团-(R1)i-Biot进行酰化。
12.药物，其特征在于其包含根据权利要求1至9任一项的生物素化肝素或所述生物素化肝素的可药用盐。
13.药物组合物，其特征在于其包含，作为活性成分，根据权利要求1至9任一项的生物素化肝素或所述生物素化肝素的可药用盐，以及至少一种可药用赋形剂。
14.根据权利要求1至9任一项的生物素化肝素作为抗血栓形成剂的用途。
15.根据权利要求14的用途，其用于治疗和预防静脉血栓形成、动脉血栓形成事件，尤其是在心肌梗塞或不稳定心绞痛的情况下，周围动脉血栓形成，如下肢动脉病、缺血性脑卒中和中风，用于预防和治疗平滑肌细胞增殖、血管生成和用作动脉粥样硬化和动脉硬化的神经保护剂。
16.使用抗生物素蛋白或链霉亲和素的方法，其特征在于其能够中和根据权利要求1至9任一项的生物素化肝素。
17.抗生物素蛋白或链霉亲和素用于制备用于中和根据权利要求1至9任一项的生物素化肝素的药物的用途。
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20091216 |
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