CN102660610A - 一种酶法制备高活性低分子量肝素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法制备高活性低分子量肝素的方法。本发明制备高活性低分子量肝素的方法，是以肝素为底物，用HepI(组氨酸标签肝素酶I)控制性降解后，再采用PAPS(3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸)再生系统，以肝素生物合成酶3-O-硫酸基转移酶对其进行选择性修饰，增加抗凝活性中心的数量，得到高抗凝活性的低分子量肝素。本发明方法所采用的HepI、3-O-硫酸基转移酶、AST-Ⅳ可通过高密度发酵高产量制备；所述PAPS再生系统，以PNPS(对硝基苯酚磺酸钾盐)作为酶修饰反应的硫酸基供体，极大地降低了生产成本。本发明为高活性低分子量肝素的酶法工业化提供了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶法制备高活性低分子量肝素的方法。属生物医药领域。
背景技术
肝素是有己糖醛酸(L-艾杜糖醛酸、D-葡萄糖醛酸)和D-硫酸氨基葡萄糖以1→4糖苷键交替形成的粘多糖，其分子量在3000-40000Da之间，平均分子量为15000Da；肝素作为抗凝试剂和抗栓试剂已有60多年的历史。肝素的抗凝血活性主要通过含有3-位硫酸基氨基葡萄糖的戊糖活性中心结合抗凝血酶(AT-Ⅲ)，诱导其发生构象改变，从而先是抗凝血活性。肝素的抗凝血活性包括抗栓活性(anti-factor Xa)和抗凝活性(anti-factor Ⅱa)。抗凝血活性还和甘肃的分子量有关。但是由于肝素具有抗凝血活性，所以大量的使用会引起出血和诱导性血小板减少、骨质疏松等副作用，从而大大的限制了肝素在临床上的应用。此外，肝素肝素还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调血脂等方面的生活功能。
低分子量肝素是由肝素通过化学法或酶法降解得到的小分子片段，分子量在3000-8000Da之间，平均分子量约为5000Da。低分子量肝素具有较高的抗栓活性，其抗凝活性则大大降低，表现出抗血栓形成时对凝血系统影响小，因而在临床中得到广泛的应用。与未分级肝素相比，低分子量肝素具有分子量小，按体重给药，药理学性质稳定，不需住院治疗，生物利用度高，副作用小，体内半衰期长等优点。
目前，LMWHs的制备方法(张万忠，王云山，马润宇，苏志国，生化药物杂志，2001，22(1)：48-51)主要有化学裂解法和酶降解法。化学降解法是工业上常采用的方法，主要有亚硝酸将揭发、β-消除降解法、过氧化氢降解法、高碘酸、次氯酸、硫酸-氯磺酸和γ-照射法等。但是化学降解法肝素反应剧烈，使得肝素分子中的某些功能基团在反映过程中或多或少被破坏，因而某些生物活性功能在不同程度被破坏。而酶法降解由于反应条件温和、对环境友好，且便于检测，成为进年来的研究热点。美国专利(Nielsen，US5106734，1992)利用控制232nm处吸光值对肝素控制性降解，制备出分子量相对均以的低分子量产品。于广利等(于广利，王群，管华诗，徐家敏，Robert J，Linhardt，青岛海洋大学学报，2002，32(2)：231-235)利用肝素酶对牛肺肝素进行控制酶解，得到聚合度2-20的寡糖纯品。主要此外研究还表明，肝素的抗凝血活性取决于其戊糖活性中心的数量。戊糖结构中N-，6-O-及3-O-位硫酸基参与结合AT-Ⅲ，与抗凝血活性有关，而2-O-位硫酸基和艾杜糖醛酸的作用尚不清楚(I.Capila，R.J.Linhardt，Angew.Chem.Int.Ed.，2002，41：390-412.)。其中3-O-位硫酸基尤为重要：如果缺少3-O-位硫酸基，噶怒视的抗凝血活性则会降低1000倍以上；相反，增加一个3-O-位硫酸基，则可以将肝素的抗凝血活性提高数倍。肝素由多种生物合成酶在线粒体内合成。合成过程中会涉及多种合成酶，如：2-O-，6-O-，3-O-硫酸基转移酶(2-OST，6-OST，3-OST)分别对主链不同位置上的羟基进行部分硫酸化(U.Lindahl，M.Kusche-Gullberg，L.kJellen，J.Biol.Chem，1998，273：24979-24982.)，其中3-O-位硫酸化由3-OST完成。这些硫酸基转移酶大多具有多种异构型式，如3-OST就具有六种异构体。其中，3-OST-1和3-OST-5能合成肝素戊糖活性中心。现有研究表明肝素及低分子量肝素都是3-OST-1和3-OST-5很好的底物(J.Chen，M.B.Duncan，K.Carrick et.，Glycobiology，2003，13：785-794)。因此，用3-OST-1和3-OST-5对低分子量肝素选择性修饰，使80％不具有戊糖活性中心的低分子量肝素经过反映后拥有戊糖活性中心，就可以大幅度提高低分子量肝素的戊糖活性中心的数量，从而提高其抗凝血活性(理论上可以同时提高抗栓和抗凝活性3-5倍)。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶法制备高抗凝血活性低分子量肝素的方法
本发明所提供的制备高抗凝血活性低分子量肝素的方法，是以肝素为底物，用HepI(组氨酸标签肝素酶I)控制性降解后，再采用PAPS(3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸)再生系统，以肝素生物合成酶3-O-硫酸基转移酶对其进行选择性修饰，增加抗凝活性中心的数量，得到高抗凝活性的低分子量肝素。本发明方法所采用的HepI、3-O-硫酸基转移酶、AST-Ⅳ均可通过高密度发酵制备；所述PAPS再生系统，以PNPS(对硝基苯酚磺酸钾盐)作为酶修饰反应的硫酸基供体，极大地降低了生产成本。本发明为高活性低分子量肝素的酶法工业化提供了新的途径。
所述肝素是市售的未分级肝素。
所述方法中，肝素初始为浓度1-100mg/mL；优选50mg/mL。
所述方法中，肝素酶I的用量0.1-10IU/g肝素，优选3IU/g肝素。
所述方法中，肝素酶解反应液为25mM醋酸铵，25μMCaCl2，0.25μg/mLBSA，pH7.4的Digestion buffer缓冲液。
所述PAPS再生系统中，反应液为含1％Triton X-100，1％BSA，1mM MgCL2，1mM MnCL2，pH为5.0-8.0的50mM Tris-HCL缓冲液。
所述PAPS再生系统中，PNPS的浓度为0.1-10mM，PAP的浓度为0.1-50uM。
所述方法中，AST-Ⅳ的用量为0.1-50mg/mL；优选5-10mg/mL。
所述方法中，肝素生物合成酶3-O-硫酸基转移酶的用量为0.1-50mg/mg底物；优选1-20mg/mL底物。
所述方法中，反应温度为10-40℃，优选30-40℃。
所述方法中，酶促反应的时间为1-20小时，优选5-10小时。
所述方法中，按照以下方法纯化低分子量肝素：终止反应后，离心分离得到上清液，将此上清液与两倍提及的缓冲液A混合，对DEAE柱上样；依次以缓冲液A和缓冲液B进行梯度洗脱，收集第二次洗脱所得洗脱液，得到高活性低分子量肝素；所述DEAE分离所用的缓冲液A为喊质量百分含量为0.5-2.5％的NaCL水溶液，缓冲液B为含质量百分含量为2.5-5.0％的NaCL水溶液。
本发明的方法采用具有高效酶活性的肝素酶I和肝素生物合成酶3-O-硫酸基转移酶制备高抗凝血活性低分子量肝素。重组的HepI、AST-Ⅳ及3-OST-1均可通过高密度发酵高产量获得，且均携带6个组氨酸标签，一步纯化就可得到90％以上的蛋白酶。利用AST-Ⅳ对PNPS以及PAP的双底物进行硫酸基酶促反应，实现了PNPS的再生系统，从而可以使用极为廉价的PNPS作为硫酸基供体，降低了高抗凝血活性低分子量肝素的成本。本发明通过控制HepI反应条件和作用时间，得到分子量分布范围窄的低分子量肝素(平均分子量5500)。再以用3-OST-1对其进行选择性修饰，得到了高抗凝血活性的低分子量肝(抗凝血活性比现有低分子量肝素提高3-5倍)，具有巨大的工业应用价值。
具体实施方式
下述实施例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、PAPS再生系统
PAPS再生系统组分浓度为：PNPS的浓度为5mM，PAP的浓度为20uM；PAPS再生系统中AST-Ⅳ的用量为10mg/mM PAPS。按以上组成所制备的溶液加入制备高活性低分子量肝素的溶液，作为肝素生物合成酶3-O-硫酸基转移酶修饰反应的硫酸基供体。
实施例2、工具酶HepI、AST-Ⅳ及3-OST-1的制备
1、重组大肠杆菌的摇瓶表达
分别挑取HepI、AST-Ⅳ及3-OST-1重组菌株单菌落于10mL LB培养基中，每10mL培养基中加入10μL氨苄青霉素(50mg/mL，终浓度为50μg/mL)，37℃，200rpm培养过夜。然后按1∶100接种量，取4mL菌液接种至400mL LB中，加入400μL卡那霉素。37℃，200rpm。大约4h，其OD 600大约到达0.6至0.8之间，加入诱导剂IPTG 2mL(0.2M，使其终浓度为1mM)，22℃，200rpm，诱导12h。将上述培养物于8000rpm，4℃，离心10min，收集菌体，用预冷4℃的BufferA(25mM Tris，0.5M NaCl，10mM咪唑，pH 7.4)重悬至20mL，冰浴超声，条件为：400W，工作5s，间歇10s，200个循环。超声破碎充分后，菌液变得澄清，12000rpm，4℃，离心30min，收集上清液，得粗酶液。
2、HepI、AST-Ⅳ及3-OST-1工具酶的一步纯化
用Buffer A缓冲液平衡柱子后，将粗酶液透过0.45um滤膜过滤后上柱，上清液以0.7mL/min的速度通过Ni-NTA Agarose Fast Flow柱子，结合30min后，Buffer A冲柱子5-10个柱体积，最后用Buffer B(25mM Tris，0.5M NaCl，250mM咪唑，pH 7.4)洗脱收集酶活性部分，然后测算酶活。
实施例3、低分子量肝素寡糖的制备
以上海生工技术服务公司的未分级肝素为原料，反映条件为10mg未分级肝素溶解在1mL的反应液中，30℃振荡(300)反应。反应液包含50mg/mL的肝素，25mM醋酸铵，25μMCaCl2，0.25μg/mL BSA，3IU/g肝素，pH 7.4。A232至80左右，100℃下加热反应液5分钟终止反应，P10柱子分离纯化得到分子量在3000-8000的肝素寡糖溶液，透析脱盐后冻干。
实施例4、肝素的3-O-位的选择性硫酸化修饰
以酶解得到的肝素寡糖为原料，反映条件为1mg肝素寡糖溶解在20mL反应液中于室温振荡(300)反应6h。反应液包含50mM的Tris-HCl(pH 7.2)，1％Triton X-100，1％BSA，1mM MgCl2，1mM MnCl2，1mM PNPS，40uM PAP，8mg 3-OST-1及4mgAST-Ⅳ。100℃下加热反应5分钟终止反应，分离得到上清液，将上清液雨量被提及的2.0％的NaCl水溶液混合，对DEAE柱上样；一次以2.0％的NaCL水溶液和3.0％的NaCl水溶液进行梯度洗脱，收集第二次洗脱所得洗脱液，得到高活性低分子量肝素。所得溶液用去离子水透析24小时，冻干得高活性低分子量肝素冻干粉。
Claims (5)
1.一种制备高抗凝活性低分子量肝素的方法，是以肝素为底物，用HepI(组氨酸标签肝素酶I)控制性降解肝素，得到低分子量肝素，再采用PAPS(3’-磷酸腺苷-5’-磷酸硫酸)再生系统，以肝素生物合成酶3-O-硫酸基转移酶对其进行选择性修饰，增加抗凝活性中心的数量，得到高抗凝活性的低分子量肝素。
2.根据权利要求1所述方法，其特点在于：所述组氨酸标签肝素酶I制备方法如下：将重组质粒pET-15b-HepI转化大肠杆菌BL21，得到可溶性表达HepI的工程菌，培养工程菌BL21(pET-15b-HepI)，诱导表达，得到C端携带6个组氨酸标签的HepI。
3.根据权利要求1所述方法，其特点在于：所述肝素生物合成酶3-O-硫酸基转移酶是携带6个组氨酸标签的融合蛋白。
4.根据权利要求1所述方法，其特点在于：所述肝素浓度1-100mg/mL，优选10-50mg/mL；肝素酶I的用量0.1-10IU/g肝素，优选3IU/g肝素；所述用于降解肝素的反应液为25mM醋酸铵，25μMCaCl2，0.25μg/mL BSA，pH7.4的Digestion buffer缓冲液，反应温度为10-40℃，优选30-40℃。
5.根据权利要求1所述方法，其特点在于：所述PAPS再生系统中，反应液为含1％Triton X-100，1％BSA，1mM MgCI2，1mM MnCI2，pH为5.0-8.0的50mM Tris-HCI缓冲液，PNPS的浓度为0.1-10mM，PAP的浓度为0.1-50uM，AST-Ⅳ的用量为0.1-50mg/mL，优选5-10mg/mL；所述方法中，3-O-硫酸基转移酶的用量为0.1-50mg/mg底物，优选1-20mg/mL底物，反应温度为10-40℃，优选30-40℃，酶促反应的时间为1-20小时，优选5-10小时。
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