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CN101528876B - 聚合物涂层及其形成方法 - Google Patents

聚合物涂层及其形成方法 Download PDF

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CN101528876B CN2007800389770A CN200780038977A CN101528876B CN 101528876 B CN101528876 B CN 101528876B CN 2007800389770 A CN2007800389770 A CN 2007800389770A CN 200780038977 A CN200780038977 A CN 200780038977A CN 101528876 B CN101528876 B CN 101528876B
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Abstract

本发明涉及一种含有高分子的可控聚合物表面涂层，该可控聚合物表面涂层与基材表面共价地连接，所述高分子含有多个聚合引发子和多个表面结合基团；并且含有从至少一些聚合引发子上接枝出的侧链聚合物。

Description

聚合物涂层及其形成方法
技术领域
本发明涉及对各种基材材料(包括有机和无机基材)的表面进行改性的方法和工艺。更具体而言，本发明涉及利用聚合物来至少部分地涂覆基材表面以便为基材表面赋予与该基材其余部分的功能性质明显不同的功能性质。例如，在生物医学应用中，赋予基材表面的功能性质可以是诱导特定生物应答的能力。
背景技术
在许多应用中，重要的是使材料或装置的主体特性与该材料或装置的表面特性之间有所区别。主体或基材材料提供了一组适用于预期应用的主体性质，如机械性质或折射性质。然而，在许多应用中，基材材料的表面性质对于预期应用来说并不适合或者并不理想。因此，对于这些基材材料，需要进行表面改性以掩蔽可能会妨碍基材使用的基材表面性质。
例如，在生物医学应用中，掩蔽主体材料性质的表面改性是有用的。诸如聚合物角膜覆盖物或金属髋部植入物等植入体的主体材料是针对折射和/或机械性质来选择的。然而，主体材料的表面性质可能会妨碍所需的生物应答(如细胞附着)，或者可能会激起不需要的生物应答(如蛋白质结垢)。此外，表面改性可用于实现对所述材料或装置的生物应答的一定程度的控制，这种控制是通过主体材料的自身性质所不能实现的。能够实现对生物应答的控制的途径的例子包括在装置表面上展示诸如肽或药物等特定生物活性信号，或者阻止装置表面与周围生物介质之间的非特异性相互作用。
一种开发出用于掩蔽主体材料表面性质的表面改性技术是在基材表面上固定聚合物。通常，这已经通过吸附或共价连接而以不同程度的成功度和完成度实现。
吸附是将高分子固定在表面上的最简单的方法。然而，吸附涂层可能会在某些条件下脱附，这限制了吸附在诸多生物医学应用中作为表面改性技术的适用性。例如，诸如植入体等的设计为在生理条件下保持较长时间的装置可能会失去其功能性表面涂层，使得聚合物流失到其环境中。此外，简单吸附并不易适用于很多种类的基材材料，这是因为基材的性质并不适合吸引和保持涂层聚合物。基材性质是否合适也取决于所要涂覆的聚合物类型。
WO03/042724描述了一种基于吸附的更复杂的材料表面涂覆工艺，该工艺包括以下步骤：a)提供无机或有机主体材料；b)提供一种或多种多离子分子(polyionic molecule)，这些多离子分子中的至少一个具有共价连接的自由基聚合引发子侧链部分(pendant covalently boundinitiator moieties for radical polymerization)；c)将步骤(b)的多离子材料涂覆到步骤(a)的主体材料上，由此在主体材料表面上形成亲水层；和d)将亲水性的单体或大分子单体接枝聚合到所述多离子材料上。该方法的缺点包括如对吸附表面改性技术所描述的涂层脱附的可能性。此外，对接枝聚合物涂层结构的控制是有限的。
另一种可选方式，聚合物通过共价键接来固定在基材表面上。已经描述了多种不同的在固体基材上得到接枝聚合物涂层的工艺。此技术的一些例子包括：
1)EP 1 095 711 A2描述了可用于生物医学基材材料涂层的传统自由基聚合物引发子对基材的共价附着。该方法通常导致引发子在整个基材表面上的密度不确定和不一致，而这通常是不希望的。此外，不利地是，用该方法能够实现的引发子密度是有限的。最后，对随后的接枝涂层结构的控制仅仅是有限的。
2)也已使用含有引发子的自组装单层。例如，Boven等，[Boven，G.，Folkersma，R.，Challa，G.，Schouten，A.J.，Polym.Commun.32(1991)50]用3-氨基丙基三乙氧基硅烷处理玻璃小珠以在表面上得到氨基官能团。然后，通过在g-APS改性的表面和酰氯官能化的含氮引发子之间形成酰胺键来将含氮引发子固定在表面上。随后的表面引发自由基聚合反应生成了系留PMMA链(tethered PMMA chain)。该方法的缺点也包括在基材整个表面上的引发子密度不确定、不一致和受限制。此外，该方法采用多步表面涂覆方法，这限制了其对二氧化硅材料的适用性和有效性。
3)Sugawara，T.，Matsuda，T.，Macromolecules 27(1994)7809描述了在聚(对苯二甲酸乙烯酯)(PET)基材上接枝聚(丙烯酰胺)。首先，使用已经用光反应性苯基叠氮基基团进行部分衍生化的聚(烯丙胺)来涂覆基材。胺化聚合物随后经UV辐射而结合到PET基材表面上。然后通过缩合反应将羧基化含氮引发子固定在聚胺改性表面上。单体溶液中的自由基聚合最后形成系留聚合物(tethered polymer)。该技术也采用了限制其适用性的多步表面涂覆方法。该方法的其它缺点也包括在基材整个表面上的引发子密度不确定、不一致和受限制，以及对接枝涂层结构的控制有限。
4)通过在含有引发子的溶液中简单的溶胀并随后在含有引发子的溶液中接枝聚合也可将接枝聚合引发子固定在固体基材上。美国专利6,358,557公开了这种原理。此外，WO 03/083040教导了掺入引发子的底漆涂层的使用。该方法也可用于不能溶胀的固体基材。除基材依赖性问题，此方法的缺点也包括在基材整个表面上的引发子密度不确定、不一致和受限制，以及对接枝涂层结构的控制有限。此外，缺乏共价连接将导致涂层的部分脱附。
通过与表面羟基基团进行的硅烷反应已将ATRP引发子共价地连接到二氧化硅表面，且通过含有硫醇基团的ATRP引发子与金表面的反应已将ATRP引发子共价地连接到金表面[Pyun，J.，Kowalewski，T.Matyjaszewski，K.，Macromolecular Rapid Communications，24(2003)1043]。然而，对使用诸如二氧化硅和金等基材的依赖限制了该技术的适用性。此外，其它缺点包括，由硅烷形成的自组装层显示出一定的不稳定性[Wang，A.等，Journal of Colloid and Interface Science，291(2005)438]和不可再现性[Halliwell，CM.，Cass，A.E.G.，AnalyticalChemistry 73(2001)2476]，并且在金和硫醇(非共价相互作用)之间形成的自组装层已显示出随时间而不稳定[Willey，T.M.等，Surface Science576(2005)188]。此外，这些改性表面的形成相对复杂(要求基材完全清洁和干燥)，且表面涂层可能在基材上分布不均。诸如引发转移终止剂(iniferter)等其它引发子的共价连接也已用于在诸如二氧化硅(通过硅烷)[Lee，H.J.，Nakayama，Y.，Masuda，T.，Macromolecules 32(1999)6989]和聚苯乙烯(通过衍生化反应)[Nakayama，Y.，Matsuda，T.，Langmuir15(1999)5560；Kawaguchi，H.，Isono，Y.Tsugi，S.，MacromolecularSymposia 179(2002)75]之类的基材上形成接枝聚合物层。然而，正如之前所讨论的，为诸如二氧化硅和聚苯乙烯等特定基材设计的表面改性方案严重地限制了该技术的适用性。
在本说明书中，对任何现有技术的提及都不是也不应被认为是确认或以任何形式暗示该现有技术构成澳大利亚或任何其它司法管辖区域中的公知常识的一部分或者本领域技术人员能合理地预计到该现有技术是确定的、可被理解的或者被认为是相关的。
发明内容
本发明涉及一种替代性的、稳定的、广泛适用的在基材表面上形成聚合物涂层的方法。
有利的是，本发明涉及一种形成聚合物表面涂层的方法，其可靠地实现预定的表面涂层特征，诸如密度、均匀度和厚度。该优点在第一水平上通过对与基材表面共价连接的高分子上的聚合引发子的密度和分布加以控制，且在第二水平上通过对由通过自聚合引发子接枝而进行的侧链聚合物的形成加以控制来实现。
因此，在第一方面，本发明提供了一种将聚合引发子可控地定位在基材表面上的方法，所述方法包括将高分子共价地连接到所述表面，其中所述高分子含有多个聚合引发子和多个表面结合基团。
优选所述高分子含有至少1％的预定摩尔比的聚合引发子。
优选所述聚合引发子是受控的自由基聚合引发子。
在另一个方面，本发明提供了一种将聚合引发子可控地定位于基材表面上的方法，所述方法包括通过大量共价键来将高分子共价地连接到所述表面，其中所述高分子含有多个聚合引发子。
优选所述高分子含有至少1％的预定摩尔比的聚合引发子。
优选所述聚合引发子是受控的自由基聚合引发子。
在还一个方面，本发明提供了一种将聚合引发子可控地定位于基材表面上的方法，所述方法包括将其上共价连接有预定摩尔比的聚合引发子的高分子共价连接到所述基材表面上。
优选所述高分子含有至少1％的预定摩尔比的聚合引发子。
优选所述聚合引发子是受控的自由基聚合引发子。
本说明书和权利要求书中使用的与将聚合引发子定位在表面上有关的术语“可控(controllable)”是指应用所述方法来指导引发子在表面上的位置或相对位置特征(如均匀度、密度和引发子可接近性)的能力。调节或调控诸如此类的因素的能力的限制是在本领域中改进基材表面改性的常见限制。当这些因素在某种程度上可受控制时(就较低密度或可接近性而言)，这将倾向于降低最终产品的相关性质。本发明涉及有利地调控这些因素以提高最终产品性质。
本说明书和权利要求书中使用的术语“聚合引发子(polymerizationinitiator)”或“引发子(initiator)”是指引发聚合或能够产生引发聚合的反应性物种的任何化合物。
本说明书和权利要求书中使用的术语“预定”是指选择足以实现所希望的聚合引发剂在与基材表面共价连接的高分子上的密度和分布的聚合引发子的摩尔比。预定摩尔比表明引发子比例是可控的，并且，如实施例所示，可以是变化的和预先确定的。
术语“摩尔比”是高分子上聚合引发子密度的量度。该术语用于指代高分子中每稀释剂单体单元中聚合引发子的数目的比例。
在高分子中控制引发子基团的摩尔比使得可以在具有该高分子涂层的基材上控制引发子的表面密度。因此，高分子涂层中引发子的密度可由高分子中引发子基团的预定摩尔比来控制。由于这提供了对随后的聚合物涂层的更高水平的控制，能够可靠地由可预测的引发子表面密度来产生聚合物涂层的密度，因此这是有利的。另一种可选方式，可通过在基材上沿梯度改变与所述表面连接的高分子的量来控制存在于基材表面上的引发子基团的密度，这将影响随后的侧链聚合物分子的性质。
高分子可通过大量共价键连接到基材表面。采用大量共价键将高分子连接到基材表面能提高高分子涂层的稳定性。另一种可选方式，可采用层对层连接技术来将高分子涂覆至基材上，随后交联以形成层间共价键和与基材表面的共价键。与简单的层对层涂覆相比，这样的工艺提高了高分子涂层的稳定性和不溶性。
高分子可以是适用于预期的基材最终用途并适用于所选的涂覆高分子的方法的任何高分子。
聚合引发子可以是阴离子、阳离子或自由基引发子。优选所述引发子是活性聚合引发子(living polymerization initiator)。更优选所述引发子是受控的自由基聚合引发子(controlled free radical polymerizationinitiator)。这样的引发子包括引发转移终止剂、衍生的RAFT试剂、ATRP、三芳基甲烷和烷氧基胺(硝基氧介导的)引发子。
可通过在聚合时引入，例如通过与稀释剂单体(diluent monomer)共聚从而将聚合引发子共价地连接到高分子。另一种可选方式，引发子可以与预先形成的高分子上的侧链官能团(functional pendant group)反应形成共价键。在高分子共价地连接到基材表面之前进行引发子的引入。
任选地，所述方法还包括确定一种或多种聚合引发子位置特征的初始步骤。例如，可确定高分子涂层中引发子的期望密度，这随后将指导高分子中聚合引发子的合适摩尔比的确定。
本发明的再一个方面提供了一种在基材表面上制备可控聚合物表面涂层的方法，所述方法包括将高分子共价地连接到表面，其中所述高分子含有多个聚合引发子和多个表面结合基团；并且含有从至少一些聚合引发子上接枝出的侧链聚合物。
优选所述高分子含有至少1％的预定摩尔比的聚合引发子。
优选所述聚合引发子是受控的自由基聚合引发子。
优选通过受控的自由基活性聚合而由聚合引发子接枝出侧链聚合物。
在一个实施方式中，所述方法还包括提供接枝到侧链聚合物的其它聚合物。
本发明的再一个方面提供了一种在基材表面上制备可控聚合物表面的方法，所述方法包括通过大量共价键将高分子共价地连接到所述表面，其中所述高分子含有多个聚合引发子；并且含有从至少一些聚合引发子上接枝出的侧链聚合物。
优选所述高分子含有至少1％的预定摩尔比的聚合引发子。
优选所述聚合引发子是受控的自由基聚合引发子。
优选通过受控的自由基活性聚合而从聚合引发子接枝出侧链聚合物。
在一个实施方式中，所述方法还包括提供接枝到侧链聚合物的其它聚合物。
本发明的再一个方面提供了一种在基材表面上制备可控聚合物表面涂层的方法，所述方法包括将其上共价连接有预定摩尔比的聚合引发子的高分子共价连接到所述基材表面上；并且从至少一些聚合引发子上接枝出侧链聚合物。
优选所述高分子含有至少1％的预定摩尔比的聚合引发子。
优选所述聚合引发子是受控的自由基聚合引发子。
优选通过受控的自由基活性聚合而从聚合引发子接枝出侧链聚合物。
在一个实施方式中，所述方法还包括提供接枝到侧链聚合物的其它聚合物。
本说明书和权利要求书中使用的与将聚合引发子定位在基材表面上相关的术语“可控”是指通过如上所论述般指导引发子在表面上的定位以及指导侧链聚合物和所得涂层的特征(如密度、厚度、均匀度、化学和结构)来应用所述方法指导聚合物表面涂层的特征的能力。调节或调控诸如此类的因素的能力的限制是在本领域中改进基材表面改性的常见限制。本发明涉及有利地调控这些因素以提高最终产品性质。
优选聚合引发子是活性聚合引发子，而从聚合引发子接枝的聚合过程是活性聚合过程。并且更优选所述聚合引发子是受控的自由基聚合引发子，而所述从聚合引发子接枝的聚合过程是受控的自由基活性聚合过程。有利的是，采用活性聚合为使用该方法的人提供了更大程度的对所得聚合物涂层的控制，这是活性聚合特性的结果。例如，活性聚合提供了对侧链聚合物的多分散性的更大程度的控制。这点与从基材表面上的引发子接枝相结合，提供了指导具有受控厚度的均匀致密涂层的能力，所述受控厚度足以掩蔽位于其下的基材的主体性质。活性聚合也使人们能够有利地调控或调节侧链聚合物层的结构。例如，活性聚合可用于形成侧链聚合物层中的嵌段或梯度，从而为单一涂层赋予多重性质或特征。结果为，在由基材接枝侧链聚合物中使用活性聚合提供了制备高度受控涂层(包括受控的侧链聚合物结构)的能力。
任选地，所述方法还包括确定一种或多种聚合物表面涂层特征的初始步骤。例如，聚合物涂层的所需密度、所需梯度(即，一片区域里密度的变化)或涂层厚度。
在本发明的再一个方面提供了一种含有高分子的可控聚合物表面涂层，所述可控聚合物表面涂层与基材表面共价地连接，所述高分子含有多个聚合引发子和多个表面结合基团；并且含有从至少一些聚合引发子上接枝出的侧链聚合物
优选所述高分子含有至少1％的预定摩尔比的聚合引发子。
优选所述聚合引发子是受控的自由基聚合引发子。
优选通过受控的自由基活性聚合而从聚合引发子接枝出侧链聚合物。
所述可控聚合物表面还可含有接枝到侧链聚合物的其它聚合物。
所述可控聚合物表面涂层还包括连接到侧链聚合物的至少一种生物活性成分。当超过一种的生物活性成分连接到侧链聚合物时，所述生物活性成分可具有协同作用或互补作用。
优选所述侧链聚合物具有受控结构。
优选所述侧链聚合物调控生物应答。最优选所述侧链聚合物调控细胞附着。
优选所述可控聚合物表面涂层在使用(包括存储)环境中在长时间内稳定。如本领域技术人员将能理解的，术语“稳定”是在表面涂层使用环境的背景下使用的，而并非必须指所述表面涂层是不确定地稳定。
在本发明的再一个方面提供了一种含有高分子的可控聚合物表面，其通过大量共价键共价地连接到基材表面，所述高分子含有多个聚合引发子；并且含有从至少一些聚合引发子接枝的侧链聚合物。
优选所述高分子含有至少1％的预定摩尔比的聚合引发子。
优选所述聚合引发子是受控的自由基聚合引发子。
优选通过受控的自由基活性聚合而从聚合引发子接枝侧链聚合物。
所述可控聚合物表面还可含有接枝到侧链聚合物的其它聚合物。
所述可控聚合物表面涂层还包括连接到侧链聚合物的至少一种生物活性成分。当超过一种的生物活性成分连接到侧链聚合物时，所述生物活性成分可具有协同作用或互补作用。
优选所述侧链聚合物具有受控结构。
优选所述侧链聚合物调控生物应答。最优选所述侧链聚合物调控细胞附着。
优选所述可控聚合物表面涂层在使用(包括存储)环境中在长时间内稳定。如本领域技术人员将能理解的，术语“稳定”是在表面涂层使用环境的背景下使用的，而并非必须指所述表面涂层是不确定地稳定。
在本发明的在一个方面提供了一种含有其上共价连接有预定摩尔比的聚合引发子的高分子的可控聚合物表面涂层，其中所述高分子共价连接到基材表面；侧链聚合物通过聚合引发子而共价连接到高分子，其中所述侧链聚合物形成均匀、致密和/或厚的层。
优选所述高分子含有至少1％的预定摩尔比的聚合引发子。
优选所述聚合引发子是受控的自由基聚合引发子。
优选通过受控的自由基活性聚合而从聚合引发子接枝侧链聚合物。
所述可控聚合物表面还可含有接枝到侧链聚合物的其它聚合物。
所述可控聚合物表面涂层还包括连接到侧链聚合物的至少一种生物活性成分。当超过一种的生物活性成分连接到侧链聚合物时，所述生物活性成分可具有协同作用或互补作用。
优选所述侧链聚合物具有受控结构。
优选所述侧链聚合物调控生物应答。最优选所述侧链聚合物调控细胞附着。
优选所述可控聚合物表面涂层在使用(包括存储)环境中在长时间内稳定。如本领域技术人员将能理解的，术语“稳定”是在表面涂层使用环境的背景下使用的，而并非必须指所述表面涂层是不确定地稳定。
术语“受控结构”是指通过控制聚合以形成不同类型聚合物的能力。如本领域技术人员所知的，具有受控结构的聚合物可设计为具有形态学上的各种类型或变化(包括但不限于直链、支链、星形、组合网络)；组成上的变化(包括但不限于嵌段共聚物、无规共聚物、均聚物、接枝共聚物、标记或梯度共聚物)；交联密度的变化；和/或功能性的变化(包括但不限于末端、位点、特异、远螯、多官能大分子单体)。
本说明书和权利要求书中使用的术语“生物应答”是指受控聚合物表面中侧链聚合物调控生物应答的性质。这样的应答包括但不限于抗生素应答(antibiotic response)、抗微生物剂应答、促进或抑制细胞附着、促进或抑制蛋白质吸附。
任选为，所述可控聚合物表面涂层提供至少一种预定的生物作用。
术语“受控的自由基聚合引发子”是指引发受控或活性的自由基聚合或者能够产生引发可控或活性的自由基聚合的反应性物种的任何化合物。
在本发明的另一方面提供了一种可控聚合物表面涂层，所述可控聚合物表面涂层含有能够通过大量共价键与基材表面共价连接的高分子，所述高分子含有多个聚合引发子；并且含有从至少一些聚合引发子接枝的侧链聚合物。
术语“从......接枝”是指从系留聚合引发子(tether polymerizationinitiator)来生长聚合物链。“从......接枝”区别于“接枝到”，后者涵盖将预先形成的聚合物连接到基材表面的官能团上。
在以下讨论中，术语“聚合物涂层”是指包括具有聚合引发子的高分子层和接枝于其上的侧链聚合物的涂层。相反，术语“高分子层”仅指在发生侧链聚合物接枝之前就涂覆在基材上并共价连接到基材表面上的含有聚合引发子的高分子层。
在本说明书全文中，术语“活性聚合”和“受控聚合”可互换使用。活性聚合和受控聚合是本领域的术语。此形式的聚合的有用参考文献是Moad，G.，Solomon，D.H.，The Chemistry of RadicalPolymerisation，2nd Ed.(fully revised)，Elsevier：Boston，2006。
本说明书和权利要求书中使用的术语“包括”(或其语法变化)等价于术语“包含”，并且不应当被认为是排除存在其它元素或特征。
附图说明
图1：由Si-HAPP样品表面获得的代表性高解析度(a)C 1s和(b)N 1sXPS谱图。
图2：由Si-HAPP-PI样品表面获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。
图3：由Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))样品表面获得的代表性C 1s高解析度XPS谱图。
图4：由Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)表面获得的代表性高解析度C 1sXPS谱图。
图5：由Si-HAPP-PI-P(葡糖苷MA)样品表面获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。
图6：由Si-HAPP-PI-P(季胺MA)样品获得的代表性高解析度C 1sXPS谱图。
图7：显示在24小时培养之后，HeLa细胞结合至(a)Si-HAPP-PI-P(葡糖苷MA)和(b)TCPS对照表面的代表性区域。
图8：由(-)Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))和(---)Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-华法林MA)样品表面获得的代表性高解析度C 1sXPS谱图。
图9：由(-)Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))和(---)Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))-b-P(丙烯酰胺)样品表面获得的代表性高解析度C 1sXPS谱图。
图10：由(-)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)和(---)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-b-PEGMA(475))涂覆样品表面获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。
图11：由(-)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)和(---)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-b-季胺MA)样品表面获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。
图12：由(-)Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))和(---)Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))-b-(P(丙烯酰胺)-共-P(PEGMA(475)))样品表面获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。
图13：由(-)Si-ALAPP和(---)Si-ALAPP-PI样品表面获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。
图14：(a)在过夜暴露于NeutrAvidinTM(NA)生物素结合蛋白溶液(在HEPES缓冲液中50μg/ml)之后由(-)Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)、(---)Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-5％生物素MA)、(......)Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)样品以及(- - -)Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)样品表面的代表性高解析度C 1s XPS谱图；和(b)在暴露于(- - -)人类血清白蛋白(HAS，PBS中100μg/ml，37℃，2小时)和(......)NeutrAvidinTM(在HEPES缓冲液中50μg/ml，室温，过夜)之前和之后由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)(-)获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。
图15：由(-)Si-HAPP、(---)Si-HAPP-PATRPI和(- - -)Si-HAPP-PATRPI-P(PEGMA(475))样品表面获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。
图16：由(-)Si-HAPP-PI(PI)(该曲线下的虚线表示曲线拟合部分)、(......)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)(PAAm)、(---)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％NHS A)(10％NHS)和(- - -)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％NHSA)(20％NHS)表面获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。标记A和B指分别与C＝O/N-C＝O和O-C＝O相关的结合能。
图17：显示在24小时培养之后，BCEp细胞结合至(a)与KDGEA肽共价偶联的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％ NHS A)，(b)与KDGAA肽共价偶联的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％ NHS A)，(c)水解后的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％ NHS A)和(d)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)表面的示范性区域。
图18：显示在24小时培养之后，BCEp细胞结合至TCPS对照表面的示范性区域。
图19：由Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)样品在高温加压之前(-)和之后(---)获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。也包括在内的是由非高温加压样品获得的曲线拟合谱图部分(......)。
图20：由(A)PET和(B)PET-PI(叠氮化物)共价-P(丙烯酰胺)样品获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。
图21：由(a)Si-ALAPP，(b)Si-ALAPP-HDI，(c)Si-ALAPP-星形-PEG-PI和(d)Si-ALAPP-HD1-星形-PEG-PI-P(丙烯酰胺)样品表面获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。
图22：由(a)Si-ALAPP-PI-P(点击-MA)和(b)Si-ALAPP-PI-P(点击-MA)-TFAB样品表面获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。
图23：在Si-ALAPP-PI涂覆玻璃载物片上PTFE圆形掩模(阴影圆形)的示意性指示位置。
图24(a)：由PTFE半球下区域获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图和(b)：由PTFE半球周围区域获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。
图25：显示在由Si-ALAPP-PI涂覆玻璃载物片表面上P(PEGMA(475))的接枝聚合期间，HeLa细胞结合至(■)掩蔽和(□)区域的示范性区域(4倍物镜放大)。灰色方块指示与整个载物片比较的图像区域。
图26：由(a)Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)和(b)Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)-HDI样品表面获得的代表性高解析度C 1sXPS谱图。
图27：由(a)Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))和(b)Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-MA-GlyGly)样品表面获得的代表性高解析度C 1sXPS谱图。
图28：由(a)Si-ALAPP，(b)Si-ALAPP-PI和(c)Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))样品表面获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。
图29：由(a)PS，(b)PS-ALAPP，(c)PS-ALAPP-PI，(d)PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)，(e)PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)，(f)PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)-NA样品表面获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。
图30：由含有PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)的孔的ABTS显影溶液得到的吸收值(405nm)，其中加入有(i)NeutrAvidinTM生物素结合蛋白、生物素化IgG和Ig-HRP轭合物(+NA、+1°Ab、+2°Ab)，(ii)生物素化IgG和Ig-HRP轭合物(-NA、+1°Ab、+2°Ab)和(iii)仅有Ig-HRP轭合物(-NA、-1°Ab、+2°Ab)。
图31：在UV辐射期间，在Si-ALAPP-PI涂覆玻璃载物片(空白)上UV非透明掩模(阴影矩形)的示意性指示位置。箭头指示移动掩模的方向以进行后续UV辐射步骤。
图32：作为UV辐射时间的函数的由梯度聚合物涂覆的Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))纤维载物片的XPS分析测定的元素比(°)O/C和(·)N/C。
图33(a)：由载物片的区域(a)未接受任何UV辐射(7cm)，(b)接受10分钟UV照射的含有Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))梯度接枝聚合物涂层(5cm)和(c)接受15分钟UV照射的含有Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))梯度接枝聚合物涂层(4cm)获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图。
图34：显示在细胞培养中18小时之后，HeLa细胞结合到梯度接枝聚合Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))表面上的示范性区域(4倍物镜放大)。所述区域代表暴露于UV辐射(a)5分钟，(b)10分钟，(c)20分钟以及(d)TCPS对照表面的区域。
具体实施方式
现在参考具体实施方式和实施例描述本发明。以下讨论中无一旨在限制本发明的范围。
本发明的聚合物涂层可应用于大范围的基材。适合的基材的例子包括但不限于无机或有机基材，诸如玻璃、石英、陶瓷、二氧化硅矿物、硅胶、金属、金属氧化物、诸如石墨等木碳材料或玻璃碳、天然或合成的有机聚合物。聚合物基材包括但不限于由链增长或逐步增长聚合制成的那些聚合物基材。链增长聚合物包括但不限于由自由基、基团转移、阳离子或阴离子方法制成的那些。链增长聚合物的例子是由丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯或苯乙烯型单体或它们的混合物制成的那些聚合物。逐步增长聚合物包括但不限于诸如聚酯、聚酰胺、聚碳酸酯、环氧树脂、硫醇-烯聚合物和聚氨酯。这些有机聚合物可含有相当数量的无机成分，如硅氧烷形式的硅。基材可以是上述材料的复合物、层压物或掺合物。
要被涂覆的基材可以采用较宽范围内的任何形式。例如，基材可以是任何类型和尺寸的模制品，如生物医学模制品或工业模制品、小珠、微粒、包括纳米颗粒和微颗粒的颗粒、胶囊、管子、纤维、薄膜或膜。基材也可以是多孔材料，如支架、织造或非织造纤维、多孔聚合块料或交联水凝胶。基材的表面可以是平整、不平整或弯曲的。
聚合物涂层与基材共价连接。基材表面的官能团可用于与高分子上的互补官能团反应。如果基材不具有合适的表面官能团，基材表面可用本领域内已知的引入官能团的方法进行官能化。这些方法包括等离子处理和等离子聚合。通过这些方法引入到表面的官能团可任选地按需要进行修饰，从而使得高分子上的官能团与基材表面上的官能团共价键合(直接或通过其它分子)。
适用于本发明的高分子化合物含有共价连接的聚合引发子。所述高分子也可以含有用于将高分子与基材表面共价连接的稀释剂单体和官能团。聚合引发子在所述高分子与基材表面共价连接之前与高分子共价连接。
当存在于所述高分子中时，稀释剂单体可以是(甲基)丙烯酸烷基酯、(甲基)丙烯酸羟烷基酯、(甲基)丙烯酸卤代烷基酯、(甲基)丙烯酸烷氧基烷基酯、任选地单-N-取代或双-N-取代的氨基烷醇(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸环烷基酯、(甲基)丙烯酸苯氧基酯、烷基二醇(甲基)丙烯酸酯、聚烷基二醇(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酰胺衍生物、富马酸酯、马来酸和马来酸酐和马来酸酯、N-乙烯咔唑、N-乙烯吡咯烷酮、乙烯吡啶、丙烯酸苯甲酯、甲基丙烯酸苯甲酯及两种或两种以上单体的共聚物。术语(甲基)丙烯酸酯既包括丙烯酸酯也包括甲基丙烯酸酯。
适合的稀释剂单体包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸己酯、丙烯酸异己酯、丙烯酸环己酯、丙烯酸异冰片酯、丙烯酸乙氧基乙酯、丙烯酸烯丙酯、丙烯醛、丙烯酰胺、丙烯酰氯、聚(乙二醇)丙烯酸酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸己酯、甲基丙烯酸异己酯、甲基丙烯酸环己酯、甲基丙烯酸异冰片酯、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酰氯、甲基丙烯酸烯丙酯、甲基丙烯酸1H，1H，2H，2H-全氟代癸酯(及其它甲基丙烯酸氟化烷基酯)、甲基丙烯酸1H，1H，2H，2H-全氟代癸酯、甲基丙烯酸4，4，5，5，6，6，7，7，8，9，9，9-十二氟-2-羟基-8-(三氟甲基)壬酯、甲基丙烯酸3，3，4，4，5，5，6，6，7，8，8，8-十二氟-7-(三氟甲基)辛酯、甲基丙烯酸3，3，4，4，5，5，6，6，7，7，8，8，9，9，10，10，11，12，12，12-二十氟-11-(三氟甲基)十二烷基酯、甲基丙烯酸苯甲酯、甲基丙烯酸2-丁氧基乙酯、甲基丙烯酸2-(叔丁基氨基)乙酯、3-丁氧基甲基丙烯酸丁酯、9H-咔唑-9-乙基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸3-氯-2-羟基丙酯、甲基丙烯酸环己酯、甲基丙烯酸癸酯、甲基丙烯酸3-(二乙氧基甲基甲硅烷基)丙酯、甲基丙烯酸2-(二乙基氨基乙酯)、甲基丙烯酸2-(二甲基氨基)乙酯、甲基丙烯酸3-(二甲基氯甲硅烷基)丙酯、分散红1甲基丙烯酸酯、分散红13甲基丙烯酸酯、分散黄7甲基丙烯酸酯、乙二醇二环戊烯基醚甲基丙烯酸酯、乙二醇甲基丙烯酸酯磷酸酯、乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯、乙二醇单乙酰乙酸酯单甲基丙烯酸酯、荧光-O-甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、3-[(3，5，7，9，11，13，15-七环戊基五环[9.5.1.13，9.15，15.17，13]八硅氧烷-1-基氧)-二甲基甲硅烷基]丙基甲基丙烯酸酯(二甲基甲硅烷基氧(丙基)甲基丙烯酸酯-POSS)、甲基丙烯酸2-羟基乙酯、甲基丙烯酸羟基乙酯、甲基丙烯酸羟基丙酯、甲基丙烯酸异冰片酯、甲基丙烯酸异癸酯、甲基丙烯酸月桂酸酯、乙酰乙酸2-(甲基丙烯酰氧基)乙酯、[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]二甲基-(3-硫丙基)氢氧化铵、甲基丙烯酸酯2-萘酯、甲基丙烯酸2-(4-硝基苯氧基)乙酯、甲基丙烯酸五溴苯甲酯、甲基丙烯酸2，2，3，3，3-五氟丙酯、甲基丙烯酸3-硫丙酯钾盐、甲基丙烯酸2-(叔丁基氨基)-乙酯、甲基丙烯酸四氢糠酯、甲基丙烯酸2，4，6-三溴苯酯、甲基丙烯酸三癸酯、甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯、甲基丙烯酸3，3，5-三甲基环己酯、甲基丙烯酸三甲基甲硅烷酯、甲基丙烯酸3-[三(三甲基硅氧基)甲硅烷基]丙酯、甲基丙烯酸3-[三(三甲基硅氧基)甲硅烷基]丙酯、
Figure G2007800389770D00161
氟单体、2-甲基丙烯酰胺甲基丙烯醛、乙烯基甲基酮、3-甲基-3-丁-2-酮、2-甲基丙烯酰氯、(聚乙二醇)山嵛醚甲基丙烯酸酯、(聚乙二醇)甲基丙烯酸酯、(聚乙二醇)甲基醚、马来酰亚胺、苯乙烯、苯乙烯类、丙烯腈、甲基丙烯腈、二甲基丙烯酰胺马来酸酐及其两种或两种以上单体的共聚物。
适用于本发明的聚合引发子包括但不限于那些导致自由基、阴离子或阳离子增殖步骤的聚合引发子。进一步，所述聚合引发子包括但不限于其中引发(initiation)由光化学、化学或热刺激触发(triggered)的化合物。优选聚合引发子是自由基引发子。更优选所述自由基引发子是受控或活性的自由基聚合引发子。受控的自由基聚合引发子包括原子转移自由基聚合(ATRP)引发子、RAFT试剂衍生引发子、引发转移终止剂、三丙烯基甲烷和烷氧基胺(氮氧化物调节)控制剂。引发转移终止剂包括硫代羰基化合物诸如二硫酯、三硫碳酸酯、硫代氨基甲酸酯、二硫代氨基甲酸酯诸如N，N-二乙基二硫代氨基甲酸酯三水合物和黄酸盐。受控的自由基引发子在明确条件下有利地被活化。例如，引发转移终止剂是可由UV光辐射触发的光引发转移终止剂。ATRP引发子是由铜催化体系触发。这些引发子在本领域内已知。
聚合引发子可通过聚合而共价地引入到高分子中。在该方法中，聚合引发子与诸如乙烯类不饱和基团的可聚合基团相偶联，经修饰的单体通过与稀释剂单体的共聚引入到高分子中。聚合引发子通过共同反应官能团与以上列出的适用于此目的的稀释剂单体共价连接。例如，引发转移终止剂可以与甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯基团连接。为了将引发子共聚用单体引入到高分子中，本领域中已知的聚合方法可用于将引发子共聚用单体与稀释剂单体，以及与任选的带有用于共价连接表面的官能团的单体进行共聚。例如，引发转移终止剂-甲基丙烯酸单体和丙烯酸酯稀释剂单体的聚合可以采用偶氮二异丁腈(AIBN)引发子进行热引发。
如果以此方式引入聚合引发子，优选为侧链聚合引发子在高分子聚合条件下不被活化。例如，如果通过热引发合成高分子，则选定的侧链引发子将是热稳定的。另一种可选方式，如果高分子的聚合是光引发的，则侧链聚合引发子是非光活化的。使受控的自由基引发子活化的确定条件有助于在聚合高分子时避免引发子的活化。例如，如果聚合引发子与甲基丙烯酸使用AIBN在温和条件下共聚，则适合的聚合引发子将包括ATRP、烷氧基胺和引发转移终止剂，优于大多数RAFT试剂衍生的引发子。所得聚合物将含有沿高分子骨架分布的活性聚合引发子。
另一种可选方式，高分子聚合条件可经选择使得侧链聚合引发子被活化。这些条件将形成具有分枝结构的高分子。这样的方法与传统引发子相比更适合侧链活性聚合引发子。在那样的情况下，即使侧链引发子在高分子聚合期间反应，高分子涂层的最终功能性也不受影响，这是因为引发子一旦合成将大量地重新连接到高分子上，并因此可继续提供给后续活化。
采用这种将聚合引发子引入到高分子中的方法，高分子中的引发子的摩尔比可通过典型共聚技术进行控制。优选高分子的化学计量为高分子链上1至50mol％的侧链基团被引发子部分取代。更优选所述化学计量为1至25mol％，并再更优选为2至15mol％。
用于将共价连接的引发子引入高分子的另一种方法是合成具有聚合引发子结合位点的高分子。这些通常是能与聚合引发子上的互补官能团反应的侧链官能团。通过将预先形成的高分子上的官能团与聚合引发子反应，所述引发子能够共价地连接至高分子。采用该方法，可通过在高分子聚合期间控制具有官能团的单体的摩尔比从而控制高分子中的引发子基团的摩尔比。
高分子也含有用于将所述高分子共价连接到基材表面的官能团。这些官能团可位于稀释剂单体上，或者位于引入所述高分子的其它单体上。用于将高分子共价连接到基材的合适基团包括但不限于氨基、羧基、羟基、苯基叠氮基、硫基、卤化、活化羧酸酯(如N-羟基琥珀酰亚胺酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯)、缩水甘油基、炔基、醛基或酮基或者它们的衍生物，或者能参与到“点击(click)”反应中的基团。这些官能团可以与诸如碳二亚胺等其它偶联试剂一起使用。另一种可选方式，可使用催化剂以有助于将高分子与基材相结合。
所述高分子可以合成为直链、星形或支链聚合物。它可以是无规共聚物或嵌段共聚物，用于连接高分子的官能团和引发子位于不同的嵌段中。
所述高分子可以通过大量共价键共价地连接至基材。在基材和高分子之间存在大量的共价键提供了高分子涂层的稳定性。高分子和基材之间的共价键可在特别为此目的的特殊反应中形成。
用于将高分子涂覆到基材上的合适方法的例子是采用叠氮活化聚(乙烯亚胺)(PEI-A)和聚(丙烯酸共二乙基二硫代氨基甲酸4-乙烯基-苯甲酯)共聚物的多层涂层的构建。在黑暗中，在固体聚合基材材料上由PEI-A开始，随后是聚(丙烯酸共二乙基二硫代氨基甲酸4-乙烯基-苯甲酯)共聚物从而构建逐层(LBL)涂层。在多层涂层的构建后，对基材材料进行辐射，所采用的波长能诱发由于叠氮-硝基苯甲酸残基的光分解导致的交联以及LBL层的共价表面固定，但却不活化引入到高分子中的引发转移终止剂分子。
相同方法的另一个例子包括仅在LBL涂层组装的最后涂覆步骤中使用引发子修饰高分子。
另一种可选方式，可在侧链聚合物形成的同时将高分子共价地连接至基材。例如，具有特定摩尔比的受控的自由基聚合引发子的衍生化高分子如聚(乙烯亚胺)(PEI)或聚(丙烯酸)(PAAC)也可以经衍生化使得它们带有特定摩尔比的光反应基团。后述衍生化的例子是能产生叠氮活化的PEI(PEI-A)或带有苯基叠氮苯胺的PAAC衍生化的聚(乙烯亚胺)(PEI)与5-叠氮-2-硝基苯甲酸A/-羟基琥珀酰亚胺酯的反应。在黑暗中将这样的高分子吸附到固体基材上和后续的清洗步骤之后，高分子涂覆基材材料转移到单体溶液中并进行辐射，所采用的波长能诱导通过在此过程中产生的氮烯基团进行的高分子的共价表面固定。此外，辐射将引起基材表面上的受控的自由基聚合。
聚合引发子连接至高分子以及随后结合至基材避免了基材上官能团与引发子的必需的1∶1的比例。高分子上与基材的多点结合可将大量引发子连接至基材。该优点使得能够更好地用引发子覆盖基材。此外，由于高分子可穿过孔或其它表面起伏，即使在整个多孔基材上也能得到一致的平整涂层。
一旦按照上述讨论的各种方式涂覆高分子涂层，可通过从与高分子结合的聚合引发子接枝来形成侧链聚合物。从系留引发子接枝的技术，与接枝到表面上的官能团相比，能够得到更致密更厚的聚合物涂层，这是由于从引发子接枝无需通过提高密度的聚合物膜的预形成聚合物的扩散。
因此，采用从引发子接枝的技术提供了对所得聚合物涂层的更高程度的控制。
优选聚合物涂层的最终结构是低多分散性的聚合物刷(polymerbrush)的结构。另一种可选方式，可在接枝聚合溶液中采用会导致侧链聚合物交联的多官能单体。
侧链聚合物的平均分子量优选为1,000至2,000,000。然而，侧链聚合物的最优选平均分子量将取决于聚合物涂覆基材的最终用途。3,000至1,000,000或者3,000至500,000的平均分子量通常是有用的。
聚合物涂层的平均厚度为干燥状态下2nm至1μm。然而，聚合物涂层的最优选厚度也将取决于基材的最终用途。干燥状态下3nm至500nm的厚度或者干燥状态下5nm至100nm的平均厚度通常是有用的。
在其中活性聚合物引发子共价连接至高分子的应用中，由分子量与分子数量之比(Mw/Mn)确定的侧链聚合物链的多分散性优选为小于5。更优选所述多分散性小于3，并且最优选小于1.5。
优选采用活性聚合来从高分子涂层接枝侧链聚合物。在侧链聚合物的生长中采用活性聚合是有利的，这是因为允许更大程度地控制侧链聚合物的分子量和多分散性。活性聚合也能控制侧链聚合物链的末端基团。在活性聚合中，末端基团是由引发子(或RADT试剂衍生引发子)的结构确定。对末端基团的控制使得活性聚合技术提供了对聚合物涂层特殊结构的控制。例如，可通过在侧链聚合物链末端生长另外的聚合物嵌段来合成多嵌段涂层，优选三个以下的嵌段。这样的结构使得能够将多官能涂层结构涂覆到基材上。例如，多嵌段涂层允许形成这样的涂层，该涂层包括与基材相邻并防止蛋白吸附和细胞附着的第一嵌段和存在特定生物活性部分的第二嵌段。另一种可选方式，也可以合成梯度共聚物。
受控的自由基聚合引发子的另一个优点在于特殊分子能与其共价偶联。由于引发子位于侧链聚合物的末端，在侧链聚合物链末端引入的生物活性化合物远离基材表面。
用于形成侧链聚合物的单体的选择取决于所需的涂层特性和活性，而这决定于涂覆基材的最终用途。
本发明的一种用途是涂覆基材的三维或二维图案。例如，不透明材料的表面化学的三维图案可如下进行，即使用不透明的多孔3D材料并共价地将含有引发子的高分子锚定到3D结构的表面上，或者贯穿整个结构或者仅在表面上(通过辐射)。后续的在单体中浸泡以及辐射仅仅导致在所述3D装置的外表面上形成聚合物涂层。
采用光掩模的基材表面化学的二维或三维图案在本领域中已知，并可与本发明的聚合物涂层联合使用。如此的一种应用是使用光掩模，分别沿x和y方向在二维基材上移动光掩模，在随后使用不同单体或共聚单体的自由基接枝反应中，可形成二维梯度表面。
本发明的方法也可用于将梯度涂层涂覆至基材。用高分子进行表面改性的基材可随后在允许梯度聚合物涂层接枝的条件下进行单体的共聚，所述高分子具有用于锚定在基材表面上的合适官能团和用于后续的受控自由基聚合的侧链引发子。这样的条件包括在聚合中改变单体浴的组成从而使得聚合物链在靠近基材材料一侧富含一种成分，在涂层的周边富含其它成分。这样的涂覆能用于在表面涂层内形成梯度交联密度。在这样的涂覆中，至少一种共聚单体带有能被随后的交联反应接触到的官能团，从而形成位于基材表面的法向上的交联密度梯度。
本发明的再一种用途是通过表面固定信号分子来控制细胞附着。可进行含有诸如活性酯基团或环氧基团等活性官能团的单体的聚合或共聚以形成带有这些官能团的涂层。在后续步骤中，带有用于形成共价键的合适官能团的肽、蛋白和其它生物分子可与涂层中存在的反应性官能团反应。另一种可选方式，生物分子可经化学修饰从而含有聚合基团，并在共聚过程中引入到侧链聚合物中(例如在实施例中描述的可聚合生物素衍生物)。在此情况下，通过在可聚合基团和生物分子之间提供共价连接的间隔子分子能提高生物分子的活性。
生物分子是产生所需生物效果的分子。在一个实施方式中，生物分子是肽、抗生素、抗微生物剂或细胞信号分子。
另一种用途是形成可聚合生物素涂层。基材材料是用高分子修饰的表面，所述高分子具有用于共价锚定的合适官能团和用于后续的受控自由基聚合的侧链引发子。含有特征为与诸如生物素等的另一种分子的高结合常数的基团的单体的后续聚合/共聚形成带有这些基团的涂层。在后续步骤中，匹配化合物(matching compound)与涂层一起保温形成稳定键。一个例子是在生物素化涂层和链亲合素之间形成键。通过这些特定分子固定在匹配化合物(如链亲合素)上，或者通过使用能够与表面结合的匹配化合物(如链亲合素)连接的生物素化特定化合物，则可能将特定分子结合到涂层上。所述涂层可通过表面结合的匹配化合物(如抗微生物蛋白)或特定化合物的量化而在体外进行表征。这可通过例如匹配化合物(如链亲合素)的铕标记或生物素化特定化合物的铕标记而实现。
以下实施例提供了本发明的更进一步的非限制性范例。
简言之，实施例1描述了使官能团分布在基材上以制备用于高分子结合的表面。实施例2是具有共价连接的可聚合基团的引发子(引发转移终止剂)的合成，其与稀释剂单体共聚为实施例3中的高分子。实施例4示范了将实施例3的高分子共价连接到实施例1的功能化基材上。
实施例5至8例举了从实施例4的高分子涂覆基材上接枝不同的均聚物。所得涂覆基材然后在实施例9中使用，以示范所述涂层提供可控生物应答(即减少细胞附着)的能力。
实施例10至14例举了从实施例4的高分子涂覆基材上接枝不同的共聚物。具体而言，这些实施例示范了可采用本发明来实现受控结构。
实施例15示范了含有可共聚生物素的另一种涂层，其包括用于制备涂层的可聚合生物素衍生物的合成。
实施例16例举了根据本发明的一个实施方式采用通过共聚引入到高分子中的ATRP引发子来制造涂层的方法。
实施例17示范了含有可共聚的N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的另一种涂层的合成，以及使用这样的涂层结合五肽从而调控涂覆基材的细胞结合性质。
实施例18提供了由含有不同密度的引发子部分的高分子涂层合成的聚合物涂层间的比较。
实施例19示范了根据本发明制造的涂层的稳定性。
实施例20例举了用于将高分子结合到基材上从而形成高分子涂层的另一种方法。
实施例21示范了采用可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合的另一种涂层的合成。
实施例22示范了采用星形聚合物引发子的另一种涂层的合成。
实施例23示范了可用于采用点击化学轭合分子的另一种涂层的合成。
实施例24示范了进行接枝聚合的同时掩蔽样品的效果。
实施例25示范了引入交联的涂层的合成。
实施例26示范了含有共聚寡肽的另一种涂层的合成。
实施例27示范了根据本发明制备的涂层的一致性和均匀性。
实施例28示范了含有共聚生物素的涂层以及在ELISA试验中使用这种涂层。
实施例29示范了表面梯度接枝聚合物涂层的合成。
实施例
实施例1
在硅晶片基材上沉积正庚胺射频辉光放电(RFGD)薄膜
在2％RBS表面活性剂溶液中超声30分钟，随后用Milli-QTM水和乙醇彻底冲洗，从而清洁尺寸为1cm×1cm的硅晶片(Si)。在用高速纯N2气流干燥后，立即将晶片放入在他处已描述的射频辉光放电等离子反应器中[Griesser HJ.，Vacuum 39(1989)485]。在20W功率，200KHz频率和0.150Torr起始单体压力下，进行30秒的正庚胺等离子聚合物(HAPP)薄膜的沉积。表1中列出的是HAPP薄膜沉积前后的元素比。由采用X-射线光电子谱(XPS)得到的两个样品的表面组成计算元素比。第一关注点是Si/C比例在表面改性后由12.10减少至0.00，表明HAPP薄膜至少与XPS取样深度(约10nm)一样厚，并且涂层没有针孔。由于在从等离子室中取出时自由基的猝灭使得薄膜中存在氮(N/C比例为0.086)以及少量氧。与改性前在Si晶片表面上的原有氧化物涂层中存在的O/C比例相比，由于在薄膜中存在的少量氧原子而使表面改性后的O/C比例减小。HPAA薄膜本质上主要是碳质的，并且碳主要是脂肪族的(由高解析度C1s谱推断(参见图1(a))，其中主要部分集中在285eV的结合能)。膜中存在的氮几乎全部源自于表面氨基基团。这可由高解析度N 1s谱的结合能，即399.39eV(参见图1(b))进行推断。HAPP薄膜表面上存在氨基可用于后续高分子的共价连接。
表1：由XPS分析测定的原子组成计算而得的经HAPP薄膜沉积进行硅晶片样品表面改性前后的元素比例
  样品   O/C   N/C   Si/C
  Si   2.33   0.000   12.10
  Si-HAPP   0.040   0.086   0.000
实施例2
二乙基二硫代氨基甲酸4-乙烯基-苯甲酯的合成
将三水合二乙基二硫代氨基甲酸钠(3.5g，1.55×10-2mol)在20ml乙醇中的溶液加入到配有搅拌器、滴液漏斗和回流冷凝器的烧瓶中。在0℃经过0.5小时的时间，向此溶液中逐滴加入4-乙烯基苯甲酰氯(3.0g，1.96×10-2mol)和乙醇(5ml)。所得溶液在室温搅拌24小时，然后导入大量水中，并用二乙基醚萃取。醚相用水清洗三次，硫酸钠干燥，并最终经蒸发除去二乙基醚。残留物从甲醇中重结晶三次得到2.6克的产率(83％)。1H NMR(CDCl3)57.36(s，4H，C6H4)，6.70(dd，J＝11.6和17.5Hz，1H，CH＝CH2)，5.73(d，J＝17.5Hz，1H，CH＝CH2)，5.24(d，J＝11.5Hz，1H，CH＝CH2)，4.54(s，2H，CH2S)，4.04(q，J＝7.3Hz，2H，NCH2)，3.73(q，J＝6.6Hz，2H，NCH2)，1.19(t，J＝ca.7.0Hz，6H，CH2CH3).
实施例3
含有羧酸部分和引发转移终止剂部分的聚合物的合成
丙烯酸(3.0g，4.16×10-2mol，无水，Fluka)溶解在6ml二甲基甲酰胺(DMF)(BDH chemicals)中，随后将溶液通过含有抑制剂去除剂的柱子(Aldrich)从而除去抑制剂。向所述丙烯酸溶液中加入1.1g二乙基二硫代苯甲酸4-乙烯基苯甲酯(4.38×10-2mol)(来自实施例2)和150mg AIBN，随后所述溶液用氮吹扫10min并密封。在60℃加热过夜，导致形成不透明的粘性凝胶，随后再加入20ml的DMF稀释。含有共聚物的溶液针对DMF透析(Spectrum Spectra/Por 1分子多孔膜管，截至MW6000-8000)过夜。在透析期间更换两次DMF。透析管中内容物随后转移到烧瓶中并补足至50mL最终体积。
最终的聚(丙烯酸-共-二乙基-二硫代苯甲酸4-乙烯基苯甲酯)共聚物(PI)经定量13C NMR进行表征。(13C NMR(DMFH7/DMFD7，500MHz；δ10.7，11.4，32.7，39.78，40.66，41.01，41.44，46.03，48.59，127.41，128.61，133.5，142.6，169.7(C＝O)，171.55(C＝O)，173.79(C＝O)，175.67(C＝O)，193.66(C＝S))。通过对应于C＝S(来自二乙基-二硫代苯甲酸4-乙烯基苯甲酯)和C＝O(来自丙烯酸)残基的峰积分，得到二乙基-二硫代苯甲酸4-乙烯基苯甲酯与丙烯酸残基的相对比例。该方法给出1.0∶10.7的C＝S∶C＝O比例，这对应于含有8.5∶91.5mol％的二乙基-二硫代苯甲酸4-乙烯基苯甲酯∶丙烯酸的聚合物。
实施例4
聚(丙烯酸-共-二乙基-二硫代苯甲酸4-乙烯基苯甲酯)与HAPP修饰硅晶片的共价偶联(Si-HAPP-PI)
经合成具有大约9∶91mol％的二乙基-二硫代苯甲酸4-乙烯基苯甲酯∶丙烯酸的来自实施例3的PI共聚物的共价固定是通过将实施例1的HAPP涂覆硅晶片与PI共聚物溶液进行保温而实现的(参见以下内容)。向含有6mL DMF和1mL Milli-QTM水的混合物中加入2mL含有8.2％(w/v)共聚物(PI)的DMF溶液。然后将100mg N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(Sigma)(EDC)溶解在所述溶液中，并加入新制的HAPP涂覆硅晶片。在室温保温过夜，随后在DMF和Milli-QTM水中仔细清洗。
表2中列出在PI共聚物的共价固定之后通过HAPP修饰硅晶片的XPS分析得到的元素比例，与HAPP修饰的硅晶片相比。O/C比例明显高于HAPP修饰硅晶片。这部分由于HAPP层的氧化，并且也由于在共价偶联的PI共聚物中存在丙烯酸残基。此外，N/C比例减小并且在PI共聚物层中检测到硫。
表2：由Si-HAPP和Si-HAPP-PI样品的XPS分析得到的元素比例。
  样品   O/C   N/C   S/C
  Si-HAPP   0.040   0.086   0.000
  Si-HAPP-PI   0.385   0.055   0.028
在图2中也显示了由Si-HAPP-PI样品表面获得的代表性高解析度C1s谱图，其含有位于下方的HAPP基材和共价固定PI共聚物层的典型特征，尤其是由于羧酸残基的存在而在C 1s谱图中存在特征部分(289.2eV结合能)。
实施例5
Si-HAPP-PI表面上PEGMA(475)单体的接枝聚合
将实施例4的Si-HAPP-PI样品转移到用户定制的配有石英玻璃盖的PVDF室中。小室中充满了分子量为475的聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯(PEGMA(475))在Milli-QTM水中的10％(v/v)溶液，已从其中除去引发子，并将纯氮气导入其中以从单体溶液中除去氧气。然后将小室以10cm的距离放置在Electro-lite EL-C800 UV/可见光源下。UV聚合进行30分钟(30mWcm-2强度；主要为365nm波长)。在辐射后，从小室中取出样品并在Milli-QTM水中仔细清洗。表3列出了在表面接枝P(PEGMA(475))之前和之后由Si-HAPP-PI样品的XPS分析得到的元素比例。此处，接枝后的O/C比例由于P(PEGMA(475))组成中大量的氧(理论O/C＝0.667)而明显增加。还检测到由于在Si-HAPP-PI基材顶部存在P(PEGMA(475))层则N/C比例下降。
表3：由Si-HAPP-PI和Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))样品的XPS分析测定的元素比例。
  样品   O/C   N/C   S/C
  Si-HAPP-PI   0.385   0.055   0.028
  Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))   0.476   0.001   0.000
通过高解析度C 1s谱图中大量分布的醚(C-O)碳(参见图3中286.6eV的结合能)可以确定P(PEGMA(475))涂层的存在，其厚度在此情况下非常接近于XPS取样深度。
实施例6
Si-HAPP-PI表面上丙烯酰胺单体的接枝聚合
将实施例4的Si-HAPP-PI样品转移到用户定制的配有石英玻璃盖的PVDF室中。小室中充满了丙烯酰胺在Milli-QTM水中的5％(v/v)溶液。将小室以10cm的距离放置在Spectroline SB-100C/F UV/可见光源下。UV聚合进行20分钟(大约280mWcm-2强度)。此后，从小室中取出样品并在Milli-QTM水中仔细清洗。
表4：经P(丙烯酰胺)接枝进行表面改性之前和之后的Si-HAPP-PI样品的XPS分析得到的元素比例。
  样品   O/C   N/C   S/C
  Si-HAPP-PI   0.385   0.055   0.028
  Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)   0.317   0.277   0.001
实施例7
Si-HAPP-PI表面上葡糖苷MA单体的接枝聚合
将实施例4的Si-HAPP-PI样品转移到用户定制的配有石英玻璃盖的PVDF室中。小室中充满了2-甲基丙烯酰氧基乙基葡糖苷(葡糖苷MA，Polysciences)在Milli-QTM水中的10％(v/v)溶液，已从其中除去引发子。将小室以10cm的距离放置在Spectroline SB-100C/F UV/可见光源下。UV聚合进行20分钟(大约280mWcm-2强度)。此后，从小室中取出样品并在Milli-QTM水中仔细清洗。
表5：经P(葡糖苷MA)接枝进行表面改性之前和之后的Si-HAPP-PI样品的XPS分析得到的元素比例。
  样品   O/C   N/C   S/C
  Si-HAPP-PI   0.385   0.055   0.028
  Si-HAPP-PI-P(葡糖苷MA)   0.603   0.004   0.001
表5中列出的是经P(葡糖苷MA)接枝进行表面改性之前和之后的Si-HAPP-PI样品表面得到的元素比例。接枝反应对表面元素比例的影响清楚地表现为O/C比例的显著增加(由于涂层中大量的位于每个葡萄糖残基上的羟基)以及由于Si-HAPP-PI基材顶部存在P(葡糖苷MA)涂层导致的N/C比例下降。通过获得高解析度C 1s谱图可确认涂覆过程的成功，谱图的代表性例子显示在图5中。所述谱图包含位于286.7eV结合能的由于键接于羟基的碳形成的特征部分。
实施例8
Si-HAPP-PI表面上季胺MA单体的接枝聚合
将实施例4的Si-HAPP-PI样品放置在用户定制的配有石英玻璃盖的PVDF室中。小室中充满了[3-(甲基丙烯酰氧基氨基)丙基]-三甲基氯化铵(季胺MA，Aldrich)在Milli-QTM水中的10％(v/v)溶液，已从其中除去引发子。在通入10分钟氮气以从单体溶液中除去溶解的氧之后，将小室以10cm的距离放置在Spectroline SB-100C/F UV/可见光源下。UV聚合进行20分钟(大约280mWcm-2强度)。此后，从小室中取出样品并在Milli-QTM水中仔细清洗。
表6中列出的是经P(季胺MA)接枝进行表面改性之前和之后的Si-HAPP-PI样品表面得到的元素比例。接枝反应对表面元素比例的影响清楚地表现为O/C比例的显著增加以及由于Si-HAPP-PI基材顶部的P(季胺MA)涂层中存在氮导致的N/C比例下降。
表6：经P(季胺MA)接枝聚合进行表面改性之前和之后的Si-HAPP-PI样品的XPS得到的元素比例。
  样品   O/C   N/C   S/C
  Si-HAPP-PI   0.385   0.055   0.028
  Si-HAPP-PI-P(季胺MA)   0.203   0.139   0.004
通过获得高解析度C 1s谱图可确认涂覆过程的成功，谱图的代表性例子显示在图6中。所述谱图包含位于286.6eV结合能的接枝层中的C-N键形成的特征部分，以及N 1s谱图中季胺所特有的高结合能部分(数据未示出)。
实施例9
细胞培养试验
将HeLa细胞接种在一系列尺寸为1cm×1cm的硅晶片上。每种表面改性采用三份重复样品。在细胞附着试验之前，4℃，将样品浸在24-孔组织培养支架的单独孔中的2×pen/strep(100/200μg/mL)中过夜。然后将HeLa细胞以每孔2×105细胞的密度进行接种并培养24小时。在培养的最后四小时用MTT代谢地标记三份重复样品。细胞附着结果以相对于标准细胞培养底物组织培养聚苯乙烯(TCPS)进行表示。
如表7所示，对于所有接枝聚合物实现了所希望的受控生物应答，即，与TCPS对照表面相比细胞附着的明显降低。不仅在接枝聚合物上细胞数目减少，而且保持附着的那些细胞也不能有效铺展，如其圆形形态所表明(图7)。此外，还应注意到Si、Si-HAPP和Si-HAPP-PI对照表面均显示出相对于TCPS的高细胞附着(75.2％和86.5％之间)。
表7：24小时后以％表示的相对于TCPS的HeLa细胞附着结果。
  表面   ％附着   SD
  TCPS   100.0   4.6
  Si   83.4   6.2
  Si-HAPP(实施例1)   75.2   12.5
  Si-HAPP-PI(实施例4)   86.5   2.4
  Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))(实施例5)   22.7   4.5
  Si-HAPP-PI-P(AAM)(实施例6)   16.6   5.6
  Si-HAPP-PI-P(葡糖苷MA)(实施例7)   18.4   3.1
实施例10
Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-华法林MA)共聚物涂层的制备
部分A：可聚合华法林(Warfarin)衍生物(琥珀酸2-[2-(2-{2-[2-(2-甲基-丙烯酰氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙氧基]-乙基酯2-氧-3-(3-氧-1-苯基-丁基)-2H-色烯-4-基酯)(华法林MA)的合成。
华法林(3.93g，12.8mmol)在室温悬浮于二氯甲烷(50mL)中。加入三乙胺(1.9mL，1.4g，13.9mmol)导致华法林的溶解。在二氯甲烷(ca.10-15mL)中的聚(乙二醇(360))甲基丙烯酸酯琥珀酸酯(5.43g，11.6mmol)的盐酸化物在室温逐滴加入到华法林溶液中，搅拌约1小时。反应混合物用水清洗(除去未反应的华法林)，在干燥(硫酸镁)前用盐酸和盐水稀释。经蒸发除去溶剂得到浅色油状产品(9.1g)。这似乎含有痕量的未反应华法林和二氯甲烷。油状物溶解在醚和最少量的二氯甲烷中，用1M氢氧化钠清洗两次，用稀盐酸清洗两次并用盐水清洗一次，随后干燥并通过蒸发除去溶剂。1H MNR(CDCl3，200MHz)5.93(s，甲基丙烯酸甲酯，3H)，2.14(s.甲基，3H)，2.82(mult，2H)，3.06(mult，H)，3.44(d，J 7.3Hz，华法林CH2，2H)，3.62(s，PEG CH2)，3.72(br.s，PEGCH2，2H)，4.26(表观上t.J ca.5Hz，PEG CH2，2H)，4.80(br s，1H)，5.54(br，s，CH，1H)，6.10(br，s，＝CH，1H)，7.16-7.40(multi，芳香氢)，7.43-7.53(multi.芳香氢)ppm。
部分B：Si-IAPP-PI表面上PEGMA(475)和华法林MA的混合物的接枝聚合
将Si-HAPP-PI样品转移到用户定制的配有石英玻璃盖的PVDF室中。小室中充满了在20mL DMF中含有1.06g(2.23×10-3mol)PEGMA(475)、0.41g(5.66×10-4mol)华法林MA的溶液(PEGMA(475)与华法林MA的摩尔比为8∶2)。在通入15分钟氮气后，将小室以10cm的距离放置在Electro-lite EL-C800 UV/可见光源下。利用UV辐射进行30分钟聚合(30mWcm-2强度，主要为365nm)。然后从小室中取出样品并在Milli-QTM水中仔细清洗。
表8：经Si-HAPP-PI、Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))和Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-华法林MA)样品的XPS分析得到的元素比例。
  样品   O/C   N/C   S/C
  Si-HAPP-PI   0.385   0.055   0.028
  Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))   0.476   0.001   0.000
  Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-华法林MA)   0.436   0.004   0.000
表8中列出的是在表面上接枝P(PEGMA(475)-共-华法林MA)涂层之前和之后，Si-HAPP-PI样品的XPS分析得到的元素比例。还包括在内进行比较的是由接枝P(PEGMA(475))均聚物涂层获得的数据。所得O/C比例处在由Si-HAPP-PI和Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-华法林MA)样品获得的O/C比例之间，正如可由同时含有PEGMA(475)(理论O/C＝0.477)和华法林MA(理论O/C＝0.359)的接枝共聚物层所预测的。根据N/C比例，P(PEGMA(475)-共-华法林MA)层的脱水厚度似乎略小于P(PEGMA(475))层。
图8中显示的是由Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))和Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-华法林MA)样品表面获得的高解析度C 1s XPS谱图。至于O/C比例，由Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-华法林MA)样品获得的C 1s谱图特性应处于由Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))和Si-HAPP-PI样品获得的特性(参见实施例4)之间。区别于图7中所显示的谱图的特征是对由Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-华法林MA)样品获得的谱图有贡献的脂肪族烃类和酯的相对强度的增加。对谱图的各种贡献的更详细分析指出PEGMA(475)与华法林MA的摩尔比接近于在单体原料中存在的摩尔比。
实施例11
Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-b-丙烯酰胺)双嵌段共聚物涂层的制备
将Si-HAPP-PI样品转移到用户定制的配有石英玻璃盖的PVDF室中。小室中充满了在Milli-QTM水中的PEGMA(475)的10％(v/v)溶液，已从其中除去引发子。在通入10分钟氮气后，将小室以10cm的距离放置在Electro-lite EL-C800 UV/可见光源下。UV聚合进行30分钟(约30mWcm-2强度)。然后从小室中取出样品并在Milli-TM水中仔细清洗。对于第二阶段聚合，Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))样品再次放置在干净小室中，并充满在Milli-QTM水中的丙烯酰胺的5％(w/v)溶液。在通入10分钟氮气后，再次将小室以10cm的距离放置在Electro-lite EL-C800 UV/可见光源下。UV聚合进行30分钟(约30mWcm-2强度)。最后从小室中取出样品并在Milli-QTM水中仔细清洗。
表9：Si-HAPP-PI、Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))和Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))-b-P(丙烯酰胺)样品的XPS分析测定的元素比例。
  样品   O/C   N/C   S/C
  Si-HAPP-PI   0.385   0.055   0.028
  Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))   0.476   0.001   0.000
  Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))-b-P(丙烯酰胺)   0.395   0.168   0.000
表9中列出的是由XPS分析测定的样品表面组成计算而得的元素比例。此处我们可以看到两阶段涂覆过程形成初步P(PEGMA(475))涂层(增加的O/C，减少的N/C)，随后是第二成功的P(丙烯酰胺)涂层(减少的O/C和增加的N/C)。在第一层顶部形成第二聚合层的能力证实了在此情况下聚合的活性性质(即，在涂覆过程的第一阶段中引发子位于P(PEGMA(475))链的末端并可供用于引发第二阶段中P(丙烯酰胺)链的聚合。在图9中显示的是相比纯P(PEGMA)均聚物涂层的代表性高解析度C 1s XPS谱图。此处我们可以看到由Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-b-AAm)获得的谱图是P(丙烯酰胺)涂层的合理表示，但来自位于下方的P(PEGMA(475))涂层的特征(醚碳)依然是明显的，表明XPS对位于P(丙烯酰胺)层以下的P(PEGMA(475))涂层进行了取样。
实施例12
Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-6-PEGMA(475))双嵌段聚合物涂层的制备
将Si-HAPP-PI样品转移到用户定制的配有石英玻璃盖的PVDF室中。小室中充满了在Milli-QTM水中的丙烯酰胺的5％(v/v)溶液。在通入10分钟氮气后，将小室以10cm的距离放置在Spectroline SB-100C/F UV/可见光源下。UV聚合进行20分钟(约280mWcm-2强度)。此后，从小室中取出样品并在Milli-QTM水中仔细清洗。对于第二阶段聚合，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)样品再次放置在干净小室中，所述干净小室充满了在Milli-QTM水中的PEGMA(475)的10％(w/v)溶液，已从其中除去引发子。在通入10分钟氮气后，再次将小室以10cm的距离放置在Spectroline SB-100C/F UV/可见光源下。UV聚合进行20分钟(约280mWcm-2强度)。此后，从小室中取出样品并在Milli-QTM水中仔细清洗。
表10：由Si-HAPP-PI、Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)和Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-b-PEGMA(475))样品的XPS分析测定的元素比例。
  样品   O/C   N/C   S/C
  Si-HAPP-PI   0.385   0.055   0.028
  Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)   0.317   0.277   0.001
  Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-b-PEGMA(475))   0.452   0.090   0.001
以与以上实施例11中所示的类似方式，在表10中列出的是通过对制备Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-b-PEGMA(475))双嵌段聚合物涂层的两阶段涂覆过程的XPS分析测定的元素比例。在此情况下，涂覆过程的顺序与实施例11中所述的相反。在丙烯酰胺单体溶液中的表面引发聚合形成初始P(丙烯酰胺)涂层(减少的O/C和增加的N/C)。用P(PEGMA(475))的第二阶段涂层导致增加的O/C和减少的N/C值。在第一层顶部形成第二聚合层的能力证实了在此情况下聚合的活性性质(即，在涂覆过程的第一阶段中引发子位于P(丙烯酰胺)链的末端并可供用于引发第二阶段中P(PEGMA(475))链的聚合。在图10中显示的是由Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-b-PEGMA(475))涂层获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图，并且与P(丙烯酰胺)涂层相比。此处我们可以看到所述谱图是P(PEGMA(475))涂层的合理表示，但来自位于下方的P(丙烯酰胺)涂层的特征依然是明显的(较高的较低结合能脂肪族和酰胺碳部分)，表明XPS对位于P(PEGMA)层以下的P(丙烯酰胺)涂层进行了取样。
实施例13
Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-b-季胺MA)双嵌段聚合物涂层的制备
将Si-HAPP-PI样品转移到用户定制的配有石英玻璃盖的PVDF室中。小室中充满了在Milli-QTM水中的丙烯酰胺的5％(v/v)溶液。在通入10分钟氮气后，将小室以10cm的距离放置在Spectroline SB-100C/F UV/可见光源下。UV聚合进行20分钟(约280mWcm-2强度)。此后，从小室中取出样品并在Milli-QTM水中仔细清洗。对于第二阶段聚合，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)样品再次放置在干净小室中，所述干净小室充满了在Milli-QTM水中的[3-(甲基丙烯酰氧基氨基)丙基]-三甲基氯化铵(季胺MA，Aldrich)的10％(w/v)溶液。在通入10分钟氮气后，再次将小室以10cm的距离放置在Spectroline SB-100C/F UV/可见光源下。UV聚合再次进行20分钟(约280mWcm-2强度)。此后，从小室中取出样品并在Milli-QTM水中仔细清洗。
表11：由Si-HAPP-PI、Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)和Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-b-季胺MA)样品的XPS分析测定的元素比例。
  样品   O/C   N/C   S/C
  Si-HAPP-PI   0.385   0.055   0.028
  Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)   0.296   0.214   0.001
  Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-b-季胺MA)   0.181   0.158   0.004
考虑表11中所列的数据，表明实现了P(丙烯酰胺)的成功接枝，在第一步中脱水层厚度为10nm量级，由接枝后N/C从0.055增加至0.228，以及O/C值减少所表明。根据降低的O/C和N/C比例，第二阶段聚(季胺MA)层的聚合物接枝也是成功的。然而，元素比例表明P(季胺MA)脱水层厚度小于10nm。由于显示了P(丙烯酰胺)和P(季胺MA)层的特征部分(酰胺和C-N碳)，如图11所示的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-b-季胺MA)表面C 1s高解析度谱图支持根据表面涂层各个阶段的元素比例得出的结论。包含酰胺(来自P(丙烯酰胺)层)和季胺(来自P(季胺MA)层)特征部分的高解析度XPS N 1s谱图(未示出)也提供了进一步的证据。
实施例14
Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-b-(丙烯酰胺-共-PEGMA(475)))双嵌段共聚物涂层的制备
将Si-HAPP-PI样品转移到用户定制的配有石英玻璃盖的PVDF室中。小室中充满了在Milli-QTM水中的PEGMA(475)的10％(v/v)溶液，已从其中除去引发子。在通入10分钟氮气后，将小室以10cm的距离放置在Electro-lite EL-C800 UV/可见光源下。UV聚合进行30分钟(约30mWcm-2强度；主要为365nm波长)。此后，从小室中取出样品并在Milli-QTM水中仔细清洗。对于第二阶段聚合，Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))样品再次放置在干净小室中，所述干净小室充满了在Milli-QTM水中的摩尔比为8∶2的丙烯酰胺和PEGMA(475)的5％(w/v)溶液。在通入10分钟氮气后，再次将小室以10cm的距离放置在Electro-lite EL-C800 UV/可见光源下。UV聚合再次进行30分钟(约30mWcm-2强度；主要为365nm波长)。此后，从小室中取出样品并在Milli-QTM水中仔细清洗。
表12：由Si-HAPP-PI、Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))和Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-b-(丙烯酰胺-共-PEGMA(475)))样品的XPS分析测定的元素比例。
  样品   O/C   N/C   S/C
  Si-HAPP-PI   0.341   0.079   0.011
  Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))   0.515   0.000   0.000
  Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475)-b-(丙烯酰胺-共-PEGMA(475)))   0.410   0.039   0.000
在表2中列出的是从接枝聚合物表面改性的两个阶段的样品的XPS分析得到的原子比例。对于第一阶段，即Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))均聚物涂层的制备，所得的O/C和N/C比例表明得到的P(PEGMA(475))涂层具有XPS取样深度量级的脱水厚度。第二阶段是摩尔比为80∶20的丙烯酰胺和PEGMA(475)的共聚。得到的N/C比例增加和O/C比例减少表明在初始P(PEGMA)层顶部的第二嵌段的成功聚合，并且该层具有掺入其中的丙烯酰胺。由于在两层中均存在PEGMA，因此不可能估计第二嵌段的厚度。基于元素比例数据的结论可由两个样品的高解析度C 1s谱图(参见图12)的对比而确认。由第二阶段获得的谱图清楚地包含可由PEGMA(强的醚贡献)和丙烯酰胺(增加的脂肪族烃类和酰胺贡献)预期到的特征。
实施例15
Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)共聚物涂层的制备
部分A：可聚合生物素衍生物(2-甲基-丙烯酸2-{2-[5-(2-氧-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)-戊酰氨基]-乙氧基}-乙基醚)(生物素MA)的合成。
6-(5-乙基-2-氧-咪唑啉-4-基)-6-巯基-己酸[2-(2-羟基-乙氧基)-乙基]-酰胺(生物素化醇)按照文献中报道的方式合成(Qi，K等，J.Am.Chem.Soc，2004，126，6599，补充信息部分)。将该化合物(1.60g，4.85mmol)、甲基丙烯酸(0.927g，10.77mmol)、4-(二甲基氨基)吡啶(1.347g，11.02mmol)、1，3-二环己基碳二亚胺(4.056g，15.29mmol)(DCC)和二氯甲烷(125mL)放入配备有磁力搅拌器的250mL圆底烧瓶。反应在35℃，N2下搅拌5天。反应混合物经过滤，滤出液在氯仿(200mL)和盐水(200mL)间分配。分离氯仿层，干燥(MgSO4)并蒸发至干得到白色糊状物。该白色糊状物用二乙基醚很好地进行清洗，并弃去清洗物。剩余固体还有产物和一些DCC-尿素副产物。然后将该固体产物溶解在最少量的二氯甲烷中并通过含有硅胶(硅胶8385)的色谱柱，所述色谱柱用5％甲醇的氯仿溶液进行预处理。DCC-尿素副产物先被洗脱，随后是所需的可聚合生物素衍生物。所使用的洗脱溶剂系统是5％甲醇的氯仿溶液。收集的所有馏分经薄层色谱(硅胶，含有可聚合生物素的馏分碘染色后呈淡棕色)分析。在合并含有纯净产物的馏分前获取所有单独馏分的1H NMR谱图以检查纯度。在蒸发至干得到白色固体之前，于该阶段中将稳定剂(4-甲氧基苯酚，2mg于二氯甲烷中)加入到纯产物中(1.30g，产率66.4％)。1H NMR(MeOD，400MHz)δ1.39-1.78(m，6H，CH2CH2CH2CH2CON)，1.94(s，3H，CH3)，2.20(t，J＝7.27Hz，2H，CH2CON)，2.70(d，J＝12.73Hz，1H，生物素单元中的一个CH2S)，2.90(dd，J＝4.60Hz和12.73Hz，1H，生物素单元中的一个CH2S)，3.173-3.221(m，1H，生物素单元的CHS)，3.34-3.37(m，2H，CH2N)，3.55-3.57(m，2H，CH2O)，3.70-3.73(m，2H，CH2O)，4.27-4.31(m，3H，生物素单元的CHCHS和CH2O)，4.47-4.50(m，1H，生物素单元的CHCH2S)，5.63(br.s，1H，CH乙烯基)，6.11(br.s，1H，CH乙烯基)ppm。13C NMR(MeOD，400MHz)δ18.59，26.99，29.64，29.89，36.88，40.46，41.18，48.51，48.73，48.94，49.15，49.36，49.58，49.79，57.14，61.78，63.52，65.23，70.06，70.77ppm.
部分B：Si-ALAPP-PI表面上丙烯酰胺和生物素MA的混合物的接枝聚合。
除使用丙烯胺替代正庚胺之外，按照实施例1(针对Si-HAPP)制备Si-ALAPP表面。在20W功率，200kHz和0.25Torr起始单体压力，进行30秒丙烯胺等离子聚合物(ALAPP)薄膜的沉积。按照实施例4进行PI共聚物的共价固定以制造Si-ALAPP-PI表面。将其放入用户定制的配有石英玻璃盖的PVDF室中。向小室中加入含有(i)82mg可聚合生物素、300mg丙烯酰胺和6ml DMF(5mol.％；Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-5％生物素MA))或(ii)174mg可聚合生物素，300mg丙烯酰胺和6mL DMF(10mol.％；Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA))的溶液。在每种情况下的单体溶液中鼓入纯净氮气10分钟以除去溶解的氧。在鼓气后，关闭入口和出口阀门。使用EXFO Articure 400灯将样品暴露于UV辐射(320-500nm波长；50mWcm-2强度)30分钟。在辐射后，取出样品在DMF中清洗三次，2小时，浸泡在新鲜DMF中过夜，然后放置于新鲜DMF中两天，偶尔进行晃动。最后，在5小时的时间段里，将样品在MilliQTM水中清洗五次。在室温，将Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)样品液过夜暴露于生物素结合蛋白(50μg/mL，HEPES缓冲液中)，随后用1M NaCl(两小时内两次，然后过夜)和HEPES缓冲液(两小时内3次)，并最终在干燥前，在半小时时间段里，在MilliQTM水中冲洗五次。HEPES缓冲液含有150mM NaCl和20mM[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸，钠盐](HEPES)并用1M NaOH溶液调至pH 7.2。
表13中列出的是由Si-ALAPP样品和Si-ALAPP-PI样品的XPS分析得到的元素比例。可以观察到Si-ALAPP样品仅含有C、O和N，且所得到的O/C比例极低。Si-ALAPP表面上含有引发转移终止剂部分(聚(丙烯酸-共-二乙基-二硫代苯甲酸4-乙烯基苯甲酯))的高分子的共价偶联导致加入明显更多的氧(O/C＝0.186)，减少的氮含量以及由于存在引发转移终止剂部分而加入的硫。由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-5％生物素MA)和Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)表面得到的O/C和N/C元素比例明显高于Si-ALAPP-PI表面，这表明在两种情况下聚合反应都是成功的。此外，由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)获得的N/C比例低于Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-5％生物素MA)，这表明正如预测一样在聚合中更少的丙烯酰胺加入到聚合物链中。由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-5％生物素MA)和Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)表面获得的元素比例明显不同于Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)表面，表明生物素成功地加入到涂层中。还包括在表13中的是在暴露于生物素结合蛋白NeutrAvidinTM之后的Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)表面获得的元素比例。如果加入到接枝聚合物链中的生物素部分是生物活性的(即能通过配体受体相互作用与NeutrAvidin分子相互作用)，则在与NeutrAvidin溶液保温后，NeutrAvidinTM分子将非常强地结合至Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)表面。在与NeutrAvidinTM保温前后由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)样品得到的元素比例的比较(增加的O/C、N/C和减小的S/C)清楚地表明有大量与聚合物涂层相结合的NeutrAvidinTM，并且在大量冲洗过程后依然存在。
由样品的高解析度XPS分析能得到更多的信息。由Si-ALAPP和Si-ALAPP-PI样品表面获得的代表性高解析度C 1s谱图显示在图13中。对于两个样品所获得的峰形非常不同。具体而言，在Si-ALAPP-PI的谱图中存在较高结合能特征部分，是羧酸的典型特征，表明含有引发转移终止剂部分(PI共聚物)的高分子偶联至Si-ALAPP表面是成功的，支持了以上叙述的低解析度分析(参见表13)。此外，不同高解析度C 1s谱图之间的差异可通过经曲线拟合程序进行的各种谱图特征部分的去卷积而进行量化(见表14)。在此表中，各种谱图贡献部分标为C1+C2/C(烃)，C3(C-O/C-N)，C4(C＝O)和C5(O-C＝O)，具有相应越来越高的结合能。在表14(a)中列出由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)、Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-5％生物素MA)、Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)样品以及过夜暴露于NeutrAvidinTM(NA)生物素MA结合蛋白溶液(50μ/mL，HEPES缓冲液中)之后的Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)样品得到的谱图的比较。
表13：由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)、Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-5％生物素MA)、Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)样品以及过夜暴露于NeutrAvidinTM(NA)生物素MA结合蛋白溶液(50μ/mL，HEPES缓冲液中)之后的Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)样品的XPS分析测定的元素比例
  样品   O/C   ″N/C   S/C
  Si-ALAPP   0.036   0.176   0.000
  Si-ALAPP-PI   0.167   0.120   0.001
  Si-ALAPP-P(丙烯酰胺)   0.290   0.237   0.001
  Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-5％生物素MA)   0.291   0.237   0.014
  Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)   0.317   0.188   0.023
  Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)-NA   0.315   0.240   0.007
在由每个样品获得并显示在图14(a)中的谱图的形状之间都有明显不同。例如，Si-ALAPP-P(丙烯酰胺)样品在285和288.2eV具有两个主要的特征部分。生物素部分的加入导致C3特征部分的增加，这在加入的生物素量由5mol％增加至10mol％时更加显著。Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)样品暴露于NeutrAvidinTM溶液导致C3和C4特征部分的增加，这是存在蛋白质的典型结果。这些差异已经过曲线拟合程序进行量化，并列在表14中便于比较。对于Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)样品，暴露于NeutrAvidinTM溶液(室温过夜，50μg/mL，HEPES缓冲液中)未明显改变高解析度C 1s谱图(参见图14(b))，指出是由于存在生物素部分而导致NeutrAvidinTM的结合。此外，通过暴露于人血清白蛋白(HAS，100μg/mL，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，37℃，2小时)进一步说明了Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)对蛋白吸附的抵抗。由图14(b)可以看到三张谱图(Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)样品，暴露于人血清白蛋白(HSA)前后的样品，暴露于NeutrAvidinTM前后的样品)几乎完美地重合，指出用XPS技术没有蛋白吸附可被检测到(＜～10ng/cm2)。
表14：由Si-ALAPP，Si-ALAPP-PI，Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)，Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-5％生物素MA)，Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)样品以及过夜暴露于NeutrAvidinTM(NA)生物素MA结合蛋白溶液(50μ/mL，HEPES缓冲液中)之后的Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)样品得到的曲线拟合C 1s XPS谱图得到的高解析度C 1s谱图特征部分。
  样品   (C1+C2)/C   C3/C   C4/C   C5/C
  Si-ALAPP   0.720   0.260   0.020   0.010
  Si-ALAPP-PI   0.550   0.197   0.227   0.026
  Si-ALAPP-P(丙烯酰胺)   0.677   0.085   0.221   0.017
  Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-5％生物素MA)   0.622   0.141   0.180   0.057
  Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)   0.604   0.204   0.150   0.041
  Si-ALAPP-P(丙烯酰胺-共-10％生物素MA)-NA   0.504   0.264   0.204   0.028
实施例16
采用ATRP引发的Si-ALAPP-PATRPI-P(PEGMA(475))涂层的制备
部分A：可聚合ATRP引发子(2-甲基-丙烯酸-(2-溴-2-甲基-丙酰氧基)-乙基酯)的合成
将2-溴异丁酰溴(5.79g，0.0252mol，1.1摩尔当量(ME))的乙酸乙酯溶液(15mL)逐滴加入到预先在N2下冷却至0℃的三颈圆底烧瓶中的甲基丙烯酸2-羟基乙酯(HEMA)(2.978g，0.02289mol，1ME)和三乙胺(2.77g，0.0275mol，1.2ME)的乙酸乙酯溶液(50mL)。反应混合物加热至室温并搅拌过夜。然后将反应混合物蒸发至干，溶解在二氯甲烷(50mL)中，清洗(2％ K2CO3)并通过硅胶圆柱体(1.09385.1000，Merck)。滤出液蒸发至干得到透明无色油状产物(4.3g，67.4％产率)。加入4-甲氧基苯酚(MEHQ)(1mg)作为抑制剂。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ1.91(s，6H，(CH3)2C(Br)COO-)，1.93(s，3H，CH3C(CH2)COO-)，4.40(br.s，4H，-OCH2CH2O-)，5.57(s，1H，乙烯基CH)，6.12(s，1H，乙烯基CH)ppm。13C NMR(CDCl3，400MHz)18.17，30.59，30.68，55.29，61.84，63.46，126.06，135.81，166.90，171.34ppm。
部分B：含有羧酸和ATRP引发子部分的共聚物(PATRPI共聚物)的合成
将丙烯酸(1.5g，2.08×10-2摩尔，无水)加入到5mL二甲基甲酰胺(DMF)中，随后通过将溶液流经含有抑制剂去除剂(Aldrich)的柱子除去抑制剂。在加入0.581g(2.0815×10-3mol)2-甲基-丙烯酸-(2-溴-2-甲基-丙酰氧基)-乙基酯(10mol％)和75mg 2-2′-偶氮二异丁腈(AIBN)之后，溶液中鼓入氮气10分钟并密封。在60℃加热过夜形成白色沉淀，通过再加入10ml DMF而溶解。含有共聚物的溶液随后针对DMF透析(Spectrum Spectra/Por 1分子多孔膜管，截至MW6000-8000)过夜。在透析期间更换两次DMF。透析管中内容物随后转移到烧瓶中并补足至25mL最终体积。得到所得共聚物的定量13CNMR谱图：13C NMR(DMFH7/DMFD7，500MHz)δ18.10，19.44，41.32，45.91，56.94，60.15，62.03，63.65，171.07，171.87，176.05。通过获得在171.87(0＝C-O)和176.05(O＝C-OH)ppm的羰基峰的积分比例，共聚物的化学计量为92.8∶7.2丙烯酸∶ATRP引发子
部分C：聚(丙烯酸-共-ATRP引发子)共价偶联至Si-HAPP表面(Si-HAPP-PATRPI)。
制备含有20∶70 H2O(pH 5)∶二甲基甲酰胺(DME)和2mg/mLPATRPI共聚物的溶液，并均分到一系列清洁玻璃小瓶中。向每个小瓶中加入经称重的合适量的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)以制得浓度为2.07mg/mL的溶液。轻微晃动小瓶以确保EDC完全溶解，并将Si-HAPP样品(参见实施例1)置于小瓶中(HAPP膜是刚沉积的)。小瓶轻微晃动过夜，然后用2∶7 H2O∶DMF(v/v)溶液冲洗六次(冲洗间隔为至少15分钟)，随后用pH 4的MilliQTM纯净水冲洗，并最终用MilliQTM水冲洗三次。
Si-HAPP和Si-HAPP-PATRPI的XPS分析结果列在表15中。此处，显而易见的是PATRPI共聚物接枝到Si-HAPP表面上导致引入大量的氧(O/C由0.188变至0.394)以及溴，引入的大部分氧来自于聚合物中的丙烯酸残基，溴来自于ATRP引发子。由Si-HAPP和Si-HAPP-PATRPI样品获得的代表性高解析度C 1s XPS谱图的例子显示在图15中。此处，可以清楚地看到，来自Si-HAPP和Si-HAPP-PATRPI样品的谱图的形状差异，具体而言，存在对应于引入到表面的丙烯酸残基的高结合能谱图特征部分(约289eV的结合能)，证实了偶联反应是成功的。
部分D：Si-HAPP-PATRPI表面上聚(聚(乙二醇甲基丙烯酸酯)(475))的接枝聚合
Si-HAPP-PATRPI表面上聚(聚(乙二醇甲基丙烯酸酯)(475)的接枝聚合过程主要来自于文献(Feng，W.等，Macromol.Rapid Commun.2005，26，1383)，有少量轻微变化。PEGMA(475)按收到时原样使用；然而，经过含有抑制剂去除树脂(Aldrich)的色谱柱除去抑制剂。制备PEGMA(475)甲醇溶液(2M)(总共16mL)，含有23.0mg Cu(1)Br(0.16mmol)和4.6mg 2，2′-联吡啶(0.03mmol)。在转移到充满高纯度N2的手套箱之前通过鼓入20分钟的N2气泡除去溶液中的氧气。轻微搅拌下向该溶液中加入氮气饱和的2-溴异丁酸乙酯(23.5mL，0.16mmol)。该溶液的等分试样转移到装有Si-HAPP-PATRPI表面的玻璃管中，用塞子塞上试管，并使接枝反应在室温下反应两小时。通过从手套箱中取出试管并导入O2从而终止反应。样品用甲醇冲洗四次，用MilliQTM水冲洗四次，随后用高纯度N2气流干燥以用于XPS分析。
列在表15和图15中的是由Si-HAPP-PATRPI-P(PEGMA(475))样品的XPS分析得到的元素比例和高解析度C 1s XPS谱图。根据所观察到的O/C比例的增加和N/C比例的减少，接枝反应是成功的。然而，存在的氮信号表明所形成的涂层在真空干燥时厚度小于10nm。该论断可由Si-HAPP-PATRPI-P(PEGMA(475))样品的高解析度C 1s谱图的形状证实，当与由Si-HAPP和Si-HAPP-PATRPI得到的谱图相比，由于涂层中C-O基团的存在而引入明显的特征部分(结合能286.6eV)。
表15：由Si-HAPP和Si-HAPP-PATRPI和Si-HAPP-PATRPI-P(PEGMA(475))表面的XPS分析测定的元素比例
  样品   O/C   N/C   Br/C
  Si-HAPP   0.188   0.055   0.000
  Si-HAPP-PATRPI   0.394   0.042   0.009
  Si-HAPP-PATRPI-P(PEGMA(475))   0.421   0.019   0.000
实施例17
采用可聚合NHS酯的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-NHS A)涂层的制备
部分A：Si-HAPP-PI表面上聚(丙烯酰胺-共-NHS A)的接枝聚合
按照实施例1制备了Si-HAPP表面。按照实施例4进行PI共聚物(来自实施例3)的共价固定从而制成Si-HAPP-PI表面。将这些放入用户定制的带有石英玻璃盖的PVDF室中。向小室中加入含有(i)59mg N-丙酰氧基琥珀酰亚胺(NHS A)，250mg丙烯酰胺和5mL DMF(10mol.％；Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％ NHS A))或(ii)120mg NHS A，250mg丙烯酰胺和5mL DMF(20mol.％；Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％NHS A))的溶液。每种情况下的单体溶液中鼓入10分钟的纯氮气已除去溶解的氧。在鼓气后，关闭入口和出口阀门，使用EXFO Articure 400灯将样品暴露于UV辐射(320-500nm波长；50mWcm-2强度)30分钟。在辐射后，取出样品在DMF中清洗三次，2小时，浸泡在新鲜DMF中过夜，然后再放置于新鲜DMF中一天，偶尔进行晃动。最后，样品经干燥用于XPS分析和细胞培养试验(参见部分B)。
列在表16中的是由Si-HAPP-PI样品，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％ NHS A)和Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％ NHS A)样品，以及用作XPS分析和细胞培养试验对照的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)均聚物样品的XPS分析得到的元素比例。由两个NHS A涂层得到的元素比例与由Si-HAPP-PI样品得到的元素比例的比较表明样品的接枝涂覆是成功的，例如N/C比例增加(由Si-HAPP-PI样品的0.055分别增加至10％和20％ NHS A情况下的0.220和0.202，以及增加至丙烯酰胺情况下的0.274)。对于10％的情况而言N/C值也更高，这表明所述涂层相比20％ NHS A样品含有更多的丙烯酰胺，并且两种含有NHS A的涂层具有比聚(丙烯酰胺)均聚物更低的N/C。
表16：由Si-HAPP-PI，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％ NHS A)，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％ NHS A)和Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)样品的XPS分析测定的元素比例。
  样品   O/C   N/C   S/C
  Si-HAPP-PI   0.385   0.055   0.028
  Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)   0.281   0.274   0.000
  Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％NHS A)   0.342   0.220   0.000
  Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％NHS A)   0.358   0.202   0.000
为了得到关于涂层的更多信息，也获取了高解析度C 1s XPS谱图。在图15中显示了由Si-HAPP-PI，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％ NHSA)，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％NHS A)和Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)样品获得的代表性谱图。在Si-HAPP-PI谱图的情况下，也包括了通过曲线拟合程序得到的去卷积谱图特征部分。谱图特征部分按结合能增加标为C1至C5。在图16中可以观察到不同谱图间的显著不同。例如，Si-HAPP-PI样品具有非常独特的高结合能特征部分(C5BE＝289.25eV)，对应于O-C＝O基团。另一方面，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)谱图具有独特的特征部分(C4，BE＝288.1eV)，对应于C＝O/N-C＝O基团(后者对于聚(丙烯酰胺)更加重要)。NHS A涂层当然含有两种官能类型的元素。在NHS A涂层的谱图中，可以观察到C4和C5特征部分的相对强度根据涂层中或多或少的丙烯酰胺或NHS A而变化。高解析度C 1s谱图的谱图特征部分的量化也包括在表17中。
表17：由Si-HAPP-PI，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)，Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％ NHS A)和Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％ NHS A)得到的曲线拟合C 1s XPS谱图得到的高解析度C 1s谱图特征部分。
  样品   (C1+C2)/C   C3/C   C4/C   C5/C
  Si-HAPP-PI   0.630   0.183   0.017   0.170
  Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)   0.550   0.197   0.227   0.026
  Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-10％NHS A)   0.677   0.085   0.221   0.017
  Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％NHS A)   0.622   0.141   0.180   0.057
在具有可控非特异性吸附性质，可控接枝密度、分子量和结构聚合物的聚合物涂层中提供NHS反应性基团使之能固定诸如肽等含有胺的化合物。在涂层中含有这些肽可提供培养细胞对表面的应答的控制(参见部分B)
部分B：细胞培养试验
为测试N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NHS A)共聚到P(丙烯酰胺)涂层中之后NHS部分的反应性的功效，选择了五肽Lys-Asp-Gly-Glu-Ala(KDGEA)。KDGEA是在I和IV型胶原质中找到的a2p1整合素的细胞结合识别序列，并且已显示出有效阻断牛角膜上皮(BCEp)细胞附着至胶原质模拟表面。通过采用NHS部分将KDGEA固定至P(丙烯酰胺)表面，细胞附着的不良载体上，可以预计接种到该表面上的BCEp细胞将能通过锚定的五肽进行附着和扩散。KDGEA的非细胞支持性类似物，Lys-Asp-Gly-Ala-Ala(KDGAA)用作比较。尤其重要的是为了区分KDGEA和KDGAA对细胞附着的作用，在聚合支架上的附着必须低。这可通过采用其中简便地控制聚合物链的聚合链接枝密度、分子量、多分散性、组成和构象的方法学制造支架从而最好地实现。其中所描述的方法学将理想地适用于实现该控制。
Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％ NHS A)样品转移到组织培养聚苯乙烯培养板(TCPS，24孔)，然后测试按照以下方式中的一种进行处理后其支持24小时附着的能力以及牛角膜上皮(BCEp)细胞的扩散：(a)37℃，浸没在含有500μg/mL五肽Lys-Asp-Gly-Glu-Ala(KDGEA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)溶液中1小时；(b)37℃，浸没在含有500μg/mL五肽Lys-Asp-Gly-Ala-Ala(KDGAA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)溶液中1小时；(c)37℃，浸没在PBS(pH 8.0)溶液中1小时使NHS部分失活，和(d)Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)对照样品也在37℃浸没在pH 7.4或pH 8.0的PBS中，同时，TCPS用作参比对照表面。
在各种浸没方式之后，移去溶液，并用无菌PBS(pH 7.4)清洗每个样品。然后将浓度为2×105细胞/孔的BCEp细胞加入到每个样品孔中由添加有10％(v/v)牛胚胎血清(FBS)的Dulbecco′s Modified EaglesMedium/Ham′s F12(DMEM/F12，50∶50)组成的培养基中。在37℃，空气中含有5％ CO2的潮湿氛围中将细胞保温24小时。
为了显现出不透明Si-晶片类样品上的细胞，在保温的最后一小时用CellTrackerTM绿(Invitrogen Corp.)对其进行标记。在用吸收波长488nm的荧光显微镜观察之前用4％甲醛-盐水溶液固定细胞。数字记录每个样品上细胞的代表性图像。
在Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％ NHS A)-KDGEA表面(图17a，KDGEA)上观察到具有很好的分布形态学的优异细胞附着，类似于TCPS对照表面(图18a和b)。相比KDGEA样品，在Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％ NHS A)-KDGAA样品(图17b，KDGAA)上观察到最小的细胞附着，但略微多于没有使用肽的对照表面上的细胞数目(图17c和d)。然而，存在的这些细胞均显示出圆形形态。这是未曾预料到的，因为在序列中仅有一个氨基酸发生变化，应当存在BCEp细胞膜a2p1整合素对KDGAA的微弱亲合力。在pH 8.0进行水解的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％ NHS A)样品上观察到非常低的细胞附着(图17c，NHS pH 8.0)。在暴露于pH 8.0的PBS的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)对照表面上发现最少的细胞附着(图17d，pAAm pH[8.0])。
这些结果表明Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％ NHS A)表面的表面密度和构象完整足够以提供该表面上的良好细胞附着的方式共价固定KDGEA肽。不仅BCEp大量附着，而且它们在培养24小时后保持良好分散形态的同时仍大量附着。非细胞结合类似物KDGAA未能提供相似的BCEp细胞附着锚定点，并有效地等同于无非支持的，水解的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-20％ NHS A)和Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)对照。
实施例18
由含有不同组成的羧酸部分和引发转移终止剂部分的共价偶联高分子制备Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)
部分A：具有不同摩尔比的二乙基二硫代氨基甲酸4-乙烯基-苯甲酯和丙烯酸的聚(丙烯酸-共-二乙基-二硫代苯甲酸4-乙烯基苯甲酯)聚合物(对比实施例3)。
根据实施例3(PI(2))中概述的方法合成了比实施例3中概述的更低摩尔比的丙烯酸-共-二乙基-二硫代苯甲酸4-乙烯基苯甲酯。丙烯酸(4.0g，5.55×10-2摩尔，无水，Fluka)溶解在8mL二甲基甲酰胺(DMF)(BDHchemicals)中，随后通过将溶液流经含有抑制剂去除剂(Aldrich)的柱子除去抑制剂。向丙烯酸溶液中加入0.60g二乙基-二硫代氨基甲酸4-乙烯基-苯甲酯(2.26×10-3mol)(来自实施例2)和200mg AIBN，随后所述溶液中鼓入氮气10分钟，并密封。在60℃加热过夜导致不透明粘性凝胶的形成，进一步加入20mL DMF而溶解。含有共聚物的溶液针对DMF透析(Spectrum Spectra/Por 1分子多孔膜管，截至MW6000-8000)过夜。在透析期间更换两次DMF。透析管中内容物随后转移到烧瓶中并补足至100mL最终体积。
PI(2)共聚物经定量13C NMR进行表征。该组成对应于含有3.4∶96.6mol.％二乙基-二硫代氨基甲酸4-乙烯基-苯甲酯∶丙烯酸的共聚物。该组成可与实施例3中合成的组成为8.5∶91.5mol％二乙基-二硫代氨基甲酸4-乙烯基-苯甲酯∶丙烯酸的共聚物(PI(1))相比较。
部分B：聚(丙烯酸-共-二乙基-二硫代苯甲酸4-乙烯基苯甲酯)共聚物与HAPP修饰硅晶片的共价偶联(Si-HAPP-PI)
按照实施例4中概述的方法进行PI(2)共聚物与实施例1的HAPP涂覆硅晶片的偶联。
列在表18中的是Si-HAPP，Si-HAPP-PI(1)(来自实施例4)和Si-HAPP-PI(2)样品的XPS分析测定的元素比例。由增加的O/C和减少的N/C比例(相比于Si-HAPP样品)，与Si-HAPP-PI(1)样品相近的N/C以及硫的存在(由S/C比例表明)可以表明，该共聚物的共价偶联是成功的。对于Si-HAPP-PI(2)样品所得的S/C比例低于Si-HAPP-PI(1)样品，表面共价接枝层含有更少的加入的引发转移终止剂部分。假定两种共聚物在Si-HAPP样品表面上均匀覆盖，在共价偶联共聚物中减少的摩尔比的二乙基-二硫代苯甲酸4-乙烯基苯甲酯将导致用于接枝聚合的引发位点之间的更大间距。
部分C：Si-HAPP-PI(1)和Si-HAPP-PI(2)表面上丙烯酰胺单体的接枝聚合
按照实施例6中概述的方法进行Si-HAPP-PI(2)样品表面上聚(丙烯酰胺)的接枝聚合，然而，在向单体溶液中鼓入氮气流之后，入口和出口阀门关闭，采用EXFO Articure 400灯将样品暴露于UV辐射(320-500nm波长，强度为50mWcm-2)30分钟。
列在表18中的是由Si-HAPP-PI(2)-P(丙烯酰胺)样品的XPS分析得到的元素比例，相比于Si-HAPP-PI(1)-P(丙烯酰胺)样品。如以上概述，两个Si-HAPP-PI(1)和(2)样品将有用于接枝聚合引发位点间距之间的差异。假定聚合反应形成具有相近分子量的聚合物，在Si-HAPP-PI(2)-P(丙烯酰胺)样品的情况下接枝链之间的距离小于Si-HAPP-PI(1)-P(丙烯酰胺)样品，接枝到Si-HAPP-PI(2)的聚(丙烯酰胺)的质量将低于由Si-HAPP-PI(1)样品得到的那些聚(丙烯酰胺)。在干燥样品并放置于XPS仪器的超高真空室中后，Si-HAPP-PI(2)样品上的接枝层的厚度将小于接枝到Si-HAPP-PI(1)样品的那些接枝层。在表18中列出的XPS元素比例结果的分析也证实了该效果。此处，可以看到由Si-HAPP-PI(2)-P(丙烯酰胺)样品获得的O/C和N/C比例低于由Si-HAPP-PI(1)-P(丙烯酰胺)样品获得的O/C和N/C比例，与Si-HAPP-PI(2)样品上的聚(丙烯酰胺)接枝层的厚度实际上小于由Si-HAPP-PI(1)样品获得的接枝层的厚度相一致。
表18：由Si-HAPP，Si-HAPP-PI(1)(来自实施例4)，Si-HAPP-PI(2)，Si-HAPP-PI(1)-P(丙烯酰胺)和Si-HAPP-PI(2)-P(丙烯酰胺)样品的XPS分析得到的元素比例。
  样品   .O/C   N/C   S/C
  Si-HAPP   0.040   0.086   0.000
  Si-HAPP-PI(1)   0.385   0.055   0.028
  Si-HAPP-PI(2)   0.323   0.050   0.007
  Si-HAPP-PI(1)-P(丙烯酰胺)   0.317   0.277   0.001
  Si-HAPP-PI(2)-P(丙烯酰胺)   0.245   0.125   0.000
实施例19
涂层稳定性：高压加热的作用
按照实施例6中所描述的方法制备Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)涂层。涂覆表面的样品放置在高压釜中，并将高压釜置于正常灭菌循环中。取出样品并用MilliQTM水冲洗八次，随后干燥用于XPS分析。也经MilliQ水充分冲洗的未经高压加热处理的样品也经干燥并用XPS分析以进行比较。从表19中列出的数据清楚地看到由高压加热处理前后的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)表面得到的元素比例非常相近。由于样品在高压加热期间经受了高温和高压，且组成没有变化，这是很好的证据证实涂层是稳定的并且在灭菌时例如不会分层。
表19：由高压加热处理前后的Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)涂层的XPS分析测定的元素比例。
  样品   O/C   N/C
  Si-HAPP-P(丙烯酰胺)   0.332   0.222
  高压加热后的Si-HAPP-P(丙烯酰胺)   0.359   0.238
显示在图19中的是由高压加热处理前后的Si-HAPP-PI(丙烯酰胺)样品获得的高解析度C 1s XPS谱图。在两种情况下得到的谱图非常相似，证实了所述样品对高压加热过程稳定。还包括在图19中的是由高压加热前Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)样品获得的C 1s谱图的曲线拟合谱图特征部分。该过程使之能量化与不同官能团或化学环境相关的化学变化所引起的对整个谱图的贡献。出于清楚的目的未在图19中包括由高压加热后样品获得的C 1s谱图的曲线拟合谱图特征部分。然而，两种样品均列在表20中。再次，两个样品的相应特征部分非常相似，证实了高压加热时涂层的稳定性。
表20：由高压加热前后Si-HAPP-PI-P(丙烯酰胺)涂层的曲线拟合程序获得高解析度XPS C 1s谱图特征部分。由最低结合能至最高结合能，C1和C2来自于烃类，C3来自于C-O/C-N，C4来自于C＝O/N-C＝O，而C5来自于O-C＝O物种。
 样品   (C1+C2)/C   C3/C   C4/C   C5/C
 Si-HAPP-P(丙烯酰胺)   0.655   0.076   0.236   0.033
 高压加热后的Si-HAPP-P(丙烯酰胺)   0.645   0.079   0.226   0.051
实施例20
聚合基材的涂层：叠氮化物类表面固定
部分A：采用叠氮苯胺盐酸盐的PI共聚物的衍生化
在黑暗室内条件下进行，5.0mL含有4.1％ PI共聚物(在实施例3中所述)的DMF溶液与0.5mL PBS缓冲溶液相混合。向此溶液中加入100mg叠氮苯胺盐酸盐和200mg N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。在室温黑暗室内条件下，反应混合物用磁力搅拌器搅拌1小时。所得叠氮苯胺修饰PI[PI(叠氮化物)]共聚物溶液可无需进一步纯化而用于后续试验。
部分B：PI(叠氮化物)共聚物的表面固定
聚(对苯二甲酸乙二酯)(PET)膜用作PI(叠氮化物)共聚物的表面固定的基材。PET膜按收到时原样使用并切割为1cm×1.5cm尺寸。然后按照实施例15b所描述的过程沉积丙烯胺等离子聚合物。
然后室温黑暗中，样品与上述含有PI(叠氮化物)的溶液保温30分钟。共价固定[PET-PI(叠氮化物)共价]样品用9∶1(v/v)DMF/水溶液简要地清洗，干燥并暴露于辐射(EXFO Articure 400，400-500nm滤镜，50W)10秒。在UV暴露期间，由于高反应性氮烯基团的形成及其与PET基材聚合物的反应，PI(叠氮化物)聚合物共价地锚定在基材表面。
对照样品包括用9∶1(v/v)DMF/水溶液(30分钟5次)和用水(30分钟5次)反复清洗，在如上PI(叠氮化物)吸附后干燥的样品[PET-PI(叠氮化物)吸附]。
部分C：PET-PI(叠氮化物)共价表面上丙烯酰胺单体的接枝聚合。
PET-PI(叠氮化物)共价样品装入到充满5％(w/v)丙烯酰胺水溶液的聚合室中(如前述实施例所描述)。随后通过UV辐射(EXFO Articure400，320-500nm滤镜，50W)30分钟进行连接有引发转移终止剂部分的表面上的丙烯酰胺的接枝聚合。UV聚合后，用水(30分钟，3次，以及额外16小时)清洗样品，随后干燥(PET-PI(叠氮化物)共价-P(丙烯酰胺))。
列在表12中的是由这些样品的XPS获得的元素比例。
表21：由PET，PET-PI(叠氮化物)吸附，PET-PI(叠氮化物)共价和PET-PI(叠氮化物)共价-P(丙烯酰胺)样品的XPS分析获得的元素比例。
  样品   O/C   N/C   S/C
  PET   0.385   0.000   0.000
  PET-PI(叠氮化物)吸附   0.366   0.000   0.000
  PET-PI(叠氮化物)共价   0.256   0.119   0.008
  PET-PI(叠氮化物)共价-P(丙烯酰胺)   0.282   0.272   0.000
结果显示PET的典型组成，并且清楚地表明如果样品未经辐射则吸附的PI(叠氮化物)被完全清洗掉。PET-PI(叠氮化物)共价样品相比而言则显示出N/C比例的显著增加和O/C比例显著减少，正如由Pl(叠氮化物)共聚物的结构所预测。该样品中出现硫则给出了PI(叠氮化物)共聚物成功共价固定的另一证据。由高O/C和N/C比例以及不存在硫信号所预示，PET-PI(叠氮化物)共价-P(丙烯酰胺)样品得到的分析结果则表明涂层厚度超过10nm(XPS方法的分析深度)的P(丙烯酰胺)成功接枝。
该结果进一步由上述样品的C 1s高解析度XPS谱图所支持。由PET-PI(叠氮化物)共价-P(丙烯酰胺)样品表面得到的代表性高解析度C1s谱图(在图20(A)显示)显示了厚P(丙烯酰胺)涂层的典型特征。用于比较在图20(B)中显示了由PET得到的代表性高解析度C 1s谱图。
由0.016或更少的N/C比例所预示，通过在丙烯酰胺溶液中PET和PET-PI(叠氮化物)吸附样品的辐射而进行的对照试验(数据未在此处示出)未导致任何明显的接枝。
实施例21
采用可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合制备Si-ALAPP-PRAFT-P(丙烯酰胺)接枝涂层
部分A：含有羧酸部分和4-氧甲基苯乙烯部分的共聚物的合成
将丙烯酸(4.0g，5.6×10-2mol，无水，Fluka)溶解在12mL二甲基甲酰胺(DMF，BDH Chemicals)中，随后将溶液通过含有抑制剂去除剂的柱子(Aldrich)。向该溶液中加入1-(氯甲基)-4-乙烯基苯(CMVB，0.84g，5.5×10-3mol，Aldrich)。该溶液中鼓入干燥氮气十分钟，随后加入0.2g偶氮二异丁腈(AIBN)。装有反应混合物的烧瓶用橡胶膜密封，再鼓入五分钟干燥氮气并最终在60℃加热过夜。在聚合溶液冷却后，将其转移到透析管(Spectrum Spectra/Por 1分子多孔膜管，截至MW6-8kDa)中，并针对DMF进行透析两天，期间多次更换DMF。该溶液放入10mmNMR管并获得定量13C谱图：13C NMR(125.77MHz，DMF-h7)δ177.9-172.2(8.3C，C＝O)，145.3-143.8(1C，ArC)，136.2(1H，ArC)，129.2(2C，ArCH)，128.5(2C，ArCH)，46.6(1C，CH2Cl)，42.4-40.9，(9.3C，VBC骨架CH，AA骨架CH2)，38.5-34.8(AA骨架CH，VBC骨架CH2，被DMF部分掩蔽)。由各个峰得到的积分分析表明聚合物的组成为89∶11丙烯酸∶CMVB残基，与所用的单体原料比例很好地相符。
部分B：乙基三硫代氨基甲酸阴离子的合成
在氮气氛围下，乙硫醇(1.46g，23.5×10-3mol，Aldrich)和二硫化碳(2.69g，35.4×10-3mol，Ajax Chemicals)加入到圆底烧瓶中的20mL氯仿中。向该溶液中逐滴加入三乙胺(2.80g，27.7×10-3mol，Aldrich)。反应混合物搅拌两小时，然后放置在室温反应过夜。
部分C：含有羧酸部分和可逆加成-断裂链转移剂部分的共聚物(PMFT共聚物)的合成
向以上部分A中形成的共聚物溶液中加入14mL在部分B中形成的乙基三硫代氨基甲酸盐溶液。反应混合物在室温搅拌两小时，随后转移至透析膜(Spectrum Spectra/Por 1分子多孔膜管，截至MW6-8kDa)中，并针对DMF进行透析两天，期间多次更换DMF。透析管中的聚合物溶液为黄色。该颜色在透析期间保持。在透析时间段结束时，透析液中未观察到黄色。移取透析管中的聚合物溶液并加入DMF补足至40mL总体积。取一份该聚合物溶液的样品进行定量13C NMR分析：13CNMR(125.77MHz，DMF-h7)δ225.2(1C，C＝S)，178.2-173.4(9.3C，C＝O)，146.4-144.0(1C，ArC)，133.6(1H，ArC)，130.2(2C，ArCH)，129.1(2C，ArCH)，46.6(1C，CH2Cl)，43.4-41.2，(VBR骨架CH，AA骨架CH2，CH2CH3)，38-35(AA骨架CH，VBR骨架CH2，partially obscured by DMF)，13.7(1C，CH3).
由谱图得到的积分分析表明(i)共聚物链上CMVB部分和乙基三硫代氨基甲酸阴离子之间的反应几乎是定量的，(ii)共聚物链上丙烯酸和乙基三硫代氨基甲酸残基之间的化学计量与在部分A中得到的丙烯酸∶CMVB残基比例相同。
部分D：ALAPP修饰硅晶片(Si-ALAPP-PRAFT)上PRAFT共聚物的共价偶联
按照实施例15制备Si-ALAPP表面，并按照实施例14进行将PRAFT共聚物共价偶联到Si-ALAPP表面上。简言之，将五片ALAPP处理硅晶片(大约1cm×1cm)放置在含有1.5mL的在部分C中制备的PRAFT共聚物溶液、H2O(0.8mL)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，0.075g，Sigma)的溶液中。反应进行过夜，随后在DMF(一天内两次，随后清洗过夜)和水(一天内三次)中清洗硅晶片，随后在层流柜中干燥。
通过XPS分析确认PRAFT共聚物共价地偶联至Si-ALAPP基材。在表22中，可以看到由Si-ALAPP-PRAFT样品获得的O/C比例明显高于由Si-ALAPP对照样品获得O/C比例(源自于在PRAFT共聚物中存在高比例的羧酸残基)。此外，Si-ALAPP-PRAFT样品的N/C比例减少(表明在Si-ALAPP顶部存在不含有N的覆盖层)以及S的存在(来自于共聚物中的三硫代氨基甲酸酯)。此外，XPS高解析度谱图分析表明在表面上存在羧酸基团，与存在含有丙烯酸基团的高分子涂层相一致。
部分E：Si-ALAPP-PRAFT表面上丙烯酰胺的接枝聚合(Si-ALAPP-PRAFT-P(丙烯酰胺))
将Si-ALAPP-PRAFT处理硅晶片放入装有10mL 5重量％丙烯酰胺单体溶液的小瓶中。在加入2，2′-偶氮二-(2-咪基丙烷)二盐酸盐(50，0.025g)之前用氮气脱气5分钟。溶液中再鼓入五分钟氮，随后密封小瓶并在35℃加热30分钟。样品清洗三次，浸没在水中两天，随后在MilliQTM纯净水中进行最后冲洗。最后，在XPS分析之前，样品在层流柜中用干燥经过滤的高速氮气流干燥。
列在表22中的是由Si-ALAPP-PRAFT-P(丙烯酰胺)样品的XPS分析得到的结果。由N/C原子比例从0.046增加至数值0.114证实Si-ALAPP-PRAFT样品表面上聚(丙烯酰胺)的成功接枝。应当注意的是，在聚(丙烯酰胺)接枝之前和之后，所得S/C比例非常接近，表明相近量的S依然存在于涂层中。这证实了聚合反应通过RAFT机理进行，这是由于丙烯酰胺单体以将活性RAFT基团留在聚合物链末端的方式加到聚合物链上。由于在XPS分析中释放的光电子强度由于覆盖层的存在而被削弱，S必须位于聚合物链的末端(即，在聚(丙烯酰胺)涂层的最外面。
表22：由Si-ALAPP，Si-ALAPP-PRAFT和Si-ALAPP-PRAFT-P(丙烯酰胺)样品的XPS分析测定的元素比例
  样品   O/C   N/C   S/C
  Si-ALAPP   0.036   0.176   0.000
  Si-ALAPP-PRAFT   0.245   0.046   0.043
  Si-ALAPP-PRAFT-P(丙烯酰胺)   0.252   0.114   0.047
聚(丙烯酰胺)接枝反应成功的再一个证据是由高解析度XPS分析获得。对于Si-ALAPP-PRAFT-P(丙烯酰胺)样品，高解析度C 1s XPS谱图含有由于酰胺官能性的存在而形成的特征部分，而其并不存在于由Si-ALAPP-PRAFT样品获得的谱图中。应当注意的是，聚(丙烯酰胺)接枝涂层的厚度小于XPS取样深度的厚度，这可能是由于相比引发转移终止剂(参见实施例6)而言，RAFT聚合动力学更慢。
实施例22
Si-ALAPP-HDI-星形-PEG-PI-P(丙烯酰胺)涂层的制备Coatings
部分A：1-((二乙基氨基甲硫酰硫)甲基)苯甲酸的合成
4-氯甲基苯甲酸(4g，0.0234mol，1.0当量)溶解在温热乙醇(20mL)中。三水合二乙基二硫代氨基甲酸钠盐(7.92g，0.0328mol，1.5当量)也独立地溶解在温热乙醇(20mL)中。然后将氨基甲酸溶液加入到羧酸溶液中。所得化合物随后在40-50℃加热2小时，然后在室温搅拌过夜。反应混合物蒸发至干并在二氯甲烷和盐水中分离。分离水相并用浓HCl酸化至pH值2。酸化中形成的沉淀经过滤和空气干燥得到白色固体，4.1g(产率62％)。1H NMR(丙酮-d6，400MHz)δ1.26，br.s，6H，2×CH3；3.82，br.s，2H，CH2N；4.5，br.s，2H，CH2N；4.67，s，2H，CH2S；7.56(d，J＝8Hz，2H，芳香氢)；7.98(d，J＝8Hz，2H，芳香氢)ppm。13C NMR(丙酮-d6，400MHz)δ11.78，12.98，41.53，47.55，50.45，130.26，130.45，130.69，143.74，167.40，194.94ppm.
部分B：1-((二乙基氨基甲硫酰硫)甲基)苯甲酰氯的合成
1-((二乙基氨基甲硫酰硫)甲基)苯甲酸(0.1g)在thionyl chloride(1mL，过量)和二氯甲烷(10mL)的溶液中回流2小时。反应随后蒸发至干并得到为淡黄色液体的产物(产率100％)。产物用二氯甲烷稀释至1.00mL体积(0.353M标准溶液)以备后续与OH端终止星形-PEG MW116,000(见下文)的反应。由观察到起始材料是在二氯甲烷中部分不溶解的白色固体，而产物是在二氯甲烷中完全溶解的淡黄色液体可进一步证实羧酸至酰氯的转变。1H NMR(CD2Cl2，400MHz)δ1.27-1.29(br.m，6H，2×CH3)，3.76(br.q，J＝7.0Hz，2H，CH2N)，4.04(br.q，J＝7.0Hz，2H，CH2N)，4.66(s，2H，CH2S)，7.53(d，J＝8.4Hz，2H，芳香氢，8.04(d，J＝8.4Hz，2H，芳香氢)ppm。13C(CD2Cl2，400MHz)δ11.8，12.9，41.3，47.5，50.5，53.5，53.7，54.0，54.3，54.5，130.4，132.0，132.5，146.6，168.4，194.3ppm.
部分C：OH-端终止星形-PEG的化学修饰以加入引发转移终止剂部分(星形-PEG-PI)
羟基端终止星形-PEG，MW 116,000(星形-462，24臂，ShearwaterPolymers，Inc.)(0.5g，0.0043mmol聚合物)在N2氛围下溶解于二氯甲烷(15mL)。所得溶液在冰浴中冷却并加入三乙胺(0.0053g，12.6当量)。然后将1-((二乙基氨基甲硫酰硫)甲基)苯甲酰氯(160.5μL含有0.00171g的0.0353M溶液)逐滴加入到容器中。反应搅拌过夜并蒸发至干得到淡橙色粉末。该粉末经FTIR分析并由仅在反应产物谱图中存在的酯C＝O伸缩吸收峰(1720cm-1)确认星形-PEG的端OH基团和酰氯之间的反应。应当注意到，根据星形-PEG中的羟基摩尔数，大约0.5当量的1-((二乙基氨基甲硫酰硫)甲基)苯甲酰氯加入到反应混合物中，留下大约一半的端羟基供其它反应(见下文)。
部分D：Si-ALAPP-HDI-星形-PEG-PI表面上的丙烯酰胺单体接枝聚合(Si-ALAPP-HDI-Star-PE G-PI-P(丙烯酰胺))
尺寸为1cm×1cm的硅晶片(Si)按实施例15B用ALAPP薄膜涂覆(Si-ALAPP)。ALAPP沉积前后的样品的XPS分析的数据(元素比例)列在表23中用于比较。应当注意的是在表面改性后Si/C比例由12.10减少至0.00，表明HAPP薄膜至少与XPS取样深度(约10nm)一样厚，并且涂层没有针孔。由于在从等离子室中取出时自由基的猝灭使得薄膜中存在氮(N/C比例为0.149)以及氧。相比改性前在Si晶片表面上的原有氧化物涂层中存在的O/C比例，由于在薄膜中存在的少量氧原子使得表面改性后的O/C比例减小。HPAA薄膜本质上主要是碳质的，并且碳主要是脂肪族的(由高解析度C 1s谱推断(参见图21(a))，其中主要部分集中在285eV的结合能)。膜中存在的氮几乎全部源自于表面氨基基团。这可由高结合能的高解析度N 1s峰(399.4eV)(数据未示出)进行推断。
所述方法中的下一阶段是将分子共价连接到既能与Si-ALAPP表面上的游离氨基也能与引发转移终止剂修饰的星形-PEG(星形-PEG-PI)上的羟基反应的官能团。至此，Si-ALAPP样品在形成后立即放入六亚甲基二异氰酸酯(HDI，Fluka)。室温，样品在不含水的密封容器中放置过夜。随后，样品用干燥乙腈(Merck)清洗三次十分钟，并在氮气流下干燥。经HDI修饰的Si-ALAPP基材(Si-ALAPP-HDI)的XPS分析得到的元素比例证实HDI与Si-ALAPP表面的成功共价偶联。例如，观察到N/C比例的微小增加(由0.149至0.160)。由于在表面上仅存在一薄层的HDI，当比较由Si-ALAPP和Si-ALAPP-HDI表面获得的XPS C 1s高解析度谱图(参见图21(a)和21(b))时，几乎没有观察到变化。
通过将在乙腈(Merck)中含有星形-PEG-PI聚合物(4mg/mL)的溶液在45℃与刚制备的Si-ALAPP-HDI表面保温16小时从而进行来自部分C的星形-PEG-PI在Si-ALAPP-HDI样品表面上的共价表面固定。为清洗掉未结合的聚合物，随后用MilliQTM纯净水清洗两次达1小时并过夜，随后在氮气流下干燥。
由Si-ALAPP-HDI-星形-PEG-PI表面的XPS分析得到的元素组成计算而得的元素比例(表23)描述了相比Si-ALAPP-HDI表面，O/C比例的显著增加(由0.155至0.222)和N/C比例的显著减少(0.160至0.108)，表明星形-PEG-PI聚合物的成功表面固定。(i)星形-PEG的确被引发转移终止剂部分官能化和(ii)星形-PEG-PI共价固定在Si-ALAPP-HDI样品表面的进一步证据由星形-PEG-PI固定后在表面上存在S(S/C比例0.003)而给出。
表23：硅晶片样品经ALAPP薄膜沉积进行表面改性前后，由XPS分析测定的原子组成计算而得的元素比例。
  样品   O/C   N/C   Si/C   S/C
  Si   2.33   0.000   12.10   0.000
  Si-ALAPP   0.142   0.149   0.000   0.000
  SI-ALAPP-HDI   0.155   0.160   0.000   0.000
  Si-ALAPP-HDI-星形-PEG-PI   0.222   0.108   0.000   0.003
  Si-ALAPP-HDI-星形-PEG-PI-P(丙烯酰胺)   0.296   0.169   0.000   0.000
由Si-ALAPP-HDI-星形-PEG-PI样品表面获得的代表性高解析度C1s谱图也证实星形-PEG-PI聚合物在Si-ALAPP-HDI样品表面上的共价固定(图21(c))，具体描绘了C-O特征部分(286.5eV结合能)的明显增加。
上述Si-ALAPP-HDI-星形-PEG-PI样品随后转移到用户定制的用O型环密封并配有石英玻璃盖的不锈钢室中。小室中充满5％(w/v)丙烯酰胺(AAM)的Milli-QTM水溶液。然后单体溶液中鼓入氮气15分钟已从溶液中除去溶解的氧，并关闭入口和出口阀门。小室中的样品随后暴露于UV辐射(320-500nm波长；50mWcm-2强度)30分钟。此后，从小室中取出样品并在Milli-QTM水中清洗三次，并最终在Milli-QTM水中过夜除去未结合的聚合物和残留的单体，随后在XPS分析之前用氮气流干燥。
在表23中列出的是由Si-ALAPP-HDI-星形-PEG-PI-P(丙烯酰胺)样品的XPS分析得到的表面组成计算而得的元素比例。Si-ALA-HDI-星形-PEG-PI样品表面上P(丙烯酰胺)的接枝聚合后，N/C比例增加(由0.108至0.169)和O/C比例也增加(由0.222至0.296)，指示了成功的接枝聚合。也由高解析度C 1s XPS谱图(参见图21(d))得到进一步证据。此处，C-O峰(结合能286.5eV)的强度的减小以及出现在接枝聚合反应之前不存在的对应于酰胺的峰(结合能288eV)表明了P(丙烯酰胺)接枝层的存在。
实施例23
Si-ALAPP-PI-P(点击-MA)涂层的制备
部分A：4-(2-(甲基丙烯酰氧基)乙氧基)-4-氧丁酸的合成
甲基丙烯酸2-羟基乙酯(25g，0.195mol)和琥珀酸苷(19.5g，0.195mol)在氮气下加入到二氯甲烷(200mL)中。随后经20分钟逐滴加入三乙胺(28.5ml，20.72g，1.05当量equiv.)，反应混合物回流1.5小时。反应混合物随后用二氯甲烷(200mL)稀释，用2M HCl(150mL)洗涤，并最后用盐水(100mL)洗涤。将有机相与水相分离，干燥(MgSO4和Na2SO4)并蒸发至干，形成粘稠无色液体(34.9g，77.8％产率)。1H NMRδ1.89(s，3H，CH3)，2.59-2.67(m，4H，2×CH2CO)，4.31(br.s，4H，2×CH2OCO)，5.55(s，1H，乙烯基CH)，6.08(s，1H，乙烯基CH)。13C NMRδ17.96，28.64，28.73，62.15，62.29，126.12，135.79，167.11，171.90，177.73。
部分B：4-氯-4-氧丁酸2-(甲基丙烯酰氧基)乙酯
在以上部分A中得到的油状产物(4-(2-(甲基丙烯酰氧基)乙氧基)-4-氧丁酸)与thionyl chloride(54g，33mL，0.454mol.，3当量)在二氯甲烷(200mL)中回流2小时。反应混合物蒸发至干从而形成澄清淡黄色液体(37.5g，99.6％产率)。1H NMRδ1.92(s，3H，CH3)，2.68(t，J＝6.6Hz，2H，CH2COO)，3.20(t，J＝6.6Hz，2H，CH2COCl)，4.33(br.s，4H，2×CH2O)，5.58(s，1H，乙烯基CH)，6.10(s，1H，乙烯基CH)。13C NMRδ18.12，29.16，41.60，62.11，62.74，126.06，135.79，166.96，170.59，172.82ppm。
部分C：2-(甲基丙烯酰氧基)乙基丙-2-炔基琥珀酸酯的合成(点击-MA)
丙炔醇(0.903g，1.0当量，0.937mL)溶解在二氯甲烷(30mL)中。随后将三乙胺(1.795g，1.1当量，2.47mL)加入到溶液中。溶液冷却至＜0℃，并逐滴加入CH2Cl2(10mL)中的4-氯-4-氧丁酸2-(甲基丙烯酰氧基)乙酯(4.0g，0.01613mol，1当量)到溶液中。反应混合物在室温搅拌过夜，利用薄层色谱监测反应进程。得到的粗反应混合物随后过滤，滤除物蒸发至干。所得暗黄色油状物溶解在CH2Cl2中，用水(2×20mL)、稀释HCl(2×20mL)和盐水(2×20mL)清洗，干燥(Na2SO4)并蒸发至干得到澄清无色油状物。该油状物进一步经过径向色谱(硅胶)纯化得到为澄清无色油状物的所需产物(2.5g)。1H NMRδ1.91(s，3H，CH3)，2.46(t，J＝2.4Hz，1H，炔CH)，2.65(s，4H，2×(CH2CO)，4.32(s，4H，2×CH2OCO)，4.66(d，J＝2.4Hz，2H，OCH2CCH)，5.56(br.s，1H，乙烯基CH)，6.09(s，1H，乙烯基CH)。13C NMRδ18.19，28.76，28.78，52.16，62.26，62.41，74.99，77.40，126.01，135.87，167.02，171.31，171.74ppm。
部分D：三氟-4-(叠氮甲基)苯甲酸酯(TFAB)的合成
三氟乙醇(1.01g，0.72mL，0.010mol，1当量)在N2氛围下溶解在二氯甲烷(20mL)中。溶液冷却至0℃并加入三乙胺(1.07g，1.48mL)。逐滴加入二氯甲烷(10mL)中的4-(氯甲基)苯甲酰氯(2.0g，0.0106mol，1.05当量)，反应搅拌过夜。随后反应混合物用水(20mL)和盐水(20mL)清洗。分离有机层，干燥(MgSO4)并蒸发至干得到白色固体(2.40g)，经1H NMR测定为95％纯。1H NMR(CDCl3，400MHz)54.62(s，2H，CH2Cl)，4.70(q，J＝8.4Hz，2H，CH2O)，7.50(d，J＝8.4Hz，2H，芳香氢)，8.07(d，J＝8.4Hz，2H，芳香氢)ppm。13C NMR(CDCl3，400MHz)545.41(CH2Cl)，61.12(q，JCF＝37.23Hz，CH20)，123.33(q，JCF＝276.72Hz，CF3)，128.57(芳香碳)，128.94(芳香碳)，130.70(芳香碳)，143.59(芳香碳)，164.68(-COO-)ppm。
以上获得的白色固体溶解在DMSO(30mL)中并加入KI(0.005g)。反应在室温搅拌并分批加入叠氮化钠(2.18g，0.0336mol)。反应然后搅拌过夜。通过加入水(200mL)逐渐反应。用二氯甲烷(3×50mL)萃取有机部分，干燥(MgSO4)并蒸除溶剂得到澄清无色油状物。该油状物经径向色谱(硅胶，汽油精∶二氯甲烷，1∶1)进一步纯化得到澄清无色油状物。该油状物最终经径向色谱(溶剂梯度，开始为汽油精40-60°∶二氯甲烷，1∶1并结束为二氯甲烷(100％)纯化。得到的产物是澄清无色液体(2.05g)。1H NMR(CDCl3，400MHz)54.44(s，2H，CH2N3)，4.71(q，J＝8.4Hz，2H，CH2O)，7.43(d，J＝8.4Hz，2H，芳香氢)，8.10(d，J＝8.4Hz，2H，芳香氢)。13C NMR(CDCl3，400MHz)554.16(-CH2N3)，60.83(q，JCF＝36.74，-CH2O-)，123.04(q，JCF＝277.31，-CF3)，128.06(芳香碳)，128.24(芳香碳)，130.52(芳香碳)，141.82(芳香碳)，164.74(-COO-)ppm。
部分E：Si-ALAPP-PI表面上点击-MA单体的接枝聚合(Si-ALAPP-PI-P(点击-MA))
尺寸为1cm×1cm的Si-ALAPP-PI表面按照实施例15进行制备。新制备的Si-ALAPP-PI样品转移到用户定制的用O型环密封并配有石英玻璃盖的不锈钢室中。小室中充满10％(w/v)点击-MA单体的二甲亚砜(DMSO)溶液。然后单体溶液中鼓入氮气15分钟已从溶液中除去溶解的氧，并关闭入口和出口阀门。小室中的样品随后暴露于UV辐射(320-500nm波长；50mWcm-2强度)30分钟。此后，从小室中取出样品并在DMSO中清洗三次，随后用Milli-QTM清洗两次，并最终在Milli-QTM水中过夜除去未结合的聚合物和残留的单体，随后用氮气流干燥。
由Si-ALAPP-PI-P(点击-MA)表面的XPS分析得到的元素组成计算而得的元素比例(表24)描述了相比Si-ALAPP-PI表面的O/C比例的明显增加(由0.161至0.390)和N/C比例的明显减少(0.133至0.034)，表明点击-MA单体的成功接枝聚合。
由高解析度C 1s XPS谱图(参见图22(a))得到点击-MA单体的成功接枝聚合的进一步证据。此处，在接枝聚合反应前均未存在的C-O峰(结合能286.7eV)以及O-C＝O(酯)峰(结合能289.1eV)的出现表明接枝聚合物层的存在。
表24：XPS分析测定的原子组成计算得到的元素比例。
  样品   O/C   N/C   S/C   F/C
  SI-ALAPP-PI   0.161   0.133   0.007   0.000
  Si-ALAPP-PI-P(点击-MA)   0.390   0.034   0.000   0.000
  Si-ALAPP-PI-P(点击-MA)-TFAB   0.371   0.105   0.000   0.118
部分F：Si-ALAPP-PI-P(点击-MA)表面上TFAB的表面固定(Si-ALAPP-PI-P(点击-MA)-TFAB)
如上所述制备新制Si-ALAPP-PI-P(点击-MA))样品。样品浸没在含有抗坏血酸钠(40mM)、硫酸铜(II)(20mM)以及三氟-4-(叠氮甲基)苯甲酸酯(TFAB)的4∶1(v/v)Milli-QTM水∶DMSO溶液中。在向溶液中鼓入15分钟氮气以除去溶解的氧之后，将反应容器密封并在50℃，黑暗中保温48小时。在反应后，样品在4∶1(v/v)Milli-QTM水∶DMSO溶液中清洗三次两小时，用Milli-TM水清洗两次30分钟，最后在Milli-QTM水中过夜，随后用氮气流干燥。
由Si-ALAPP-PI-P(点击-MA)-TFAB表面的XPS分析得到的元素组成计算而得的元素比例(表24)明确地描述了铜媒介的表面上的端炔与溶液中的三氟-4-(偶氮甲基)苯甲酸酯的叠氮基团的1，3-偶极环加成。相比Si-ALAPP-PI-P(点击-MA)表面，N/C比例的明显增加(由0.034至0.105)和F/C比例的明显增加(0.000至0.118)说明了成功的反应。
由高解析度C 1s XPS谱图(参见图22(b))得到成功环加成反应的进一步证据。由于表面固定TFAB的三氟基团出现在高结合能处的事实，该基团在XPS C 1s高解析度谱图中清晰可见并可用作分析表面固定的标记。此处，在固定反应前未存在的CF3峰(结合能293.2eV)的出现清楚地表明TFAB标记的表面固定。
实施例24
掩蔽和未掩蔽Si-ALAPP-PI表面上PEGMA(475)的接枝聚合
部分A：掩蔽和未掩蔽Si-ALAPP-PI表面上的PEGMA(475)接枝聚合
按照实施例15制备Si-ALAPP表面，按照实施例4进行将PI共聚物共价偶联到Si-ALAPP表面上。然而，在本实施例中，干净玻璃显微镜载玻片替代硅晶片用作基材。简言之，六片ALAPP处理的玻璃显微镜载玻片放置在含有9mL PI溶液(参见实施例3)，DMF(27mL)，MilliQTM纯化H2O(4.5mL)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，0.45g，Sigma)的溶液中。反应在室温进行过夜，随后玻璃显微镜载玻片在DMF(一日内两次，随后过夜清洗)和纯净水(一日内三次)中清洗，随后在层流柜中干燥。
以上制备的Si-ALAPP-PI载玻片随后放入配有o-环密封石英玻璃盖的用户定制不锈钢室。向该室中加入已经用氮脱气30分钟的单体溶液(去抑制的PEGMA(475)，10％ w/v)。然后如图23所示，在每片显微镜载玻片的中心放置干净的PTFE(18mm直径)圆形掩模(适用于防护位于下方的表面的UV辐射)。然后将小室密封并采用EXFO Articure 400灯使样品暴露于UV辐射(320-500nm波长；50mWcm-2强度)30分钟。在辐射后，取出样品，用MilliQ纯化水充分地清洗，在MilliQTM纯化水中浸泡两天，其中间歇地更换，最后再用MilliQTM纯化水冲洗。在XPS分析前，将样品在层流柜中干燥。
列在表25中的是由直接位于圆形PTFE掩模之下的区域以及由所述圆形PTFE掩模四周区域的XPS分析测定的元素比例。由此数据清楚可见在两块区域得到的数据相差很大(即对于掩模下和掩模周围，O/C；0.202相比0.447：N/C；0.122相比0.013)。此外，正如预期，Si-ALAPP-PI(来自于实施例15)和Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))(来自于实施例5)样品得到的元素比例。
表25：由Si-ALAPP-PI(来自实施例15)，Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))，PTFE半圆形掩模以下区域和PTFE半圆形压模周围区域的XPS分析测定的元素比例。
  样品   O/C   N/C   S/C
  掩模以下   0.202   0.122   0.004
  Si-HAPP-PI-(P(PEGMA(475))(来自实施例5)   0.476   0.001   0.000
  掩模周围   0.447   0.013   0.000
因此可以得出结论，Si-ALAPP-PI表面上P(PEGMA(475))的接枝聚合仅在PTFE掩模周围发生。还可以得出结论，接枝聚合发生需要UV辐射，证实了共价连接至Si-ALAPP表面的PI共聚物上引发转移终止剂基团的存在导致引发了接枝聚合反应。接枝聚合仅在这些区域发生的其它证据获得自样品两块不同区域的高解析度XPS分析。显示在图24(a)和(b)中的分别是由半圆形PTFE掩模以下和周围区域得到的高解析度C1s谱图。由得到的C 1s形状的比较可以容易地观察到它们相差巨大。具体而言，来自掩模周围区域的谱图主要是在结合能286.5eV的谱图贡献，这对应于存在大量的C-O官能性(即，来自于P(PEGMA(475))接枝聚合物涂层的醚。另一方面，由掩模以下区域得到的谱图主要是中心位于结合能285.0eV的谱图贡献，这主要来自于ALAPP涂层的烃类。
部分B：掩蔽和未掩蔽Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))表面区域中HeLa细胞附着差异的测定。
具有掩蔽和未掩蔽区域的接枝聚合物涂覆玻璃载玻片(Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475)))转移到4-室培养盘(Nunc，Roskilde，Denmark)并且在室温，每片载玻片浸没在含有青霉素和链霉素(分别为120μg/mL和200μg/mL)的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)无菌溶液中四小时。
取出以上步骤的无菌溶液，并将HeLa细胞以1×106细胞/室的密度接种在由添加有10％(v/v)牛胚胎血清(FBS)的Dulbecco′s ModifiedEagles Medium/Ham′s F12(DMEM/F12，50∶50)构成的培养基中。细胞在37℃，含有5％CO2的潮湿空气中保温24小时。
在18和24小时保温后，通过相差显微镜(Olympus 1×81，奥林巴斯，日本)观察HeLa细胞并电子记录代表性图像。
显示在图25中的是演示了18小时细胞培养后HeLa细胞在位于圆形PTFE掩膜以下的区域(a)和掩膜周围区域(b)中的细胞附着的代表性区域。由这些图像清楚可见的是在P(PEGMA(475))接枝聚合期间被掩蔽的玻璃载玻片区域中存在高细胞附着密度，而在接枝聚合反应期间未被掩蔽的区域中非常低的细胞附着。在被掩蔽区域的细胞附着和形态非常类似于用TCPS对照得到的(见过图W(d)-梯度接枝聚合物实施例29)。回顾部分A，通过不同区域的XPS分析，证实了在接枝聚合期间位于掩膜之下的表面非常类似于Si-ALAPP-PI表面的组成和高解析度C1s谱图，而在接枝聚合期间掩膜周围的区域的组成和高解析度C 1s谱图非常类似于Si-ALAPP-P(PEGMA(475))表面。此外，此前在实施例9中已证实HeLa细胞容易地在Si-HAPP-PI表面上上附着和扩展，但不在Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))接枝聚合物表面上附着或扩展。因此，可以得出结论，由于缺少接枝P(PEGMA(475))涂层而HeLa细胞在被掩蔽区域中附着和扩展，由于存在厚(干燥状态下～10nm)接枝P(PEGMA(475))涂层而不在未掩蔽区域中附着和扩展。
实施例25
Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)共聚物涂层的制备以及涂层中引入交联
按照实施例15制备Si-ALAPP表面，按照实施例4进行将PI共聚物共价偶联到Si-ALAPP表面上。ALAPP涂覆的硅晶片(1x1cm)放置在含有6mL PI溶液(参见实施例3)，DMF(18mL)，MilliQTM纯化H2O(3mL)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，0.30g，Sigma)的溶液中。反应在室温进行过夜，随后硅晶片在DMF(一日内两次，随后过夜清洗)和纯净水(一日内三次)中清洗，随后在层流柜中干燥。
以上制备的Si-ALAPP-PI载玻片随后放入配有o-环密封石英玻璃盖的用户定制不锈钢室。向该室中加入单体溶液(丙烯酰胺和丙烯酸，总共为5％ w/v，摩尔比丙烯酰胺∶丙烯酸 90∶10)。单体溶液然后用氮气脱氧15分钟，入口和出口阀门关闭，使用EXFO Articure 400灯进行十五分钟样品的UV辐射(320-500nm波长；50mWcm-2)。辐射后，取出样品，用MilliQ纯化水充分地清洗，在MilliQTM纯化水中浸泡两天，其中间歇地更换，最后再用MilliQTM纯化水冲洗。一部分Si-ALAPPi-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)样品进一步与六亚甲基二异氰酸酯(HDI)(Fluka)反应从而形成接枝聚合物链之间的交联。来自上述(Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸))的样品交换到干燥DMF(每份样品总体积1mL)中，加入HDI(0.5mL)，反应在45℃反应过夜。向其加入HDI的样品随后在DMF(×3)中清洗，然后在DMF中浸泡8小时，不时搅拌。最后样品在水中充分地清洗。随后XPS分析前在层流柜中干燥样品。
表26：由Si-ALAPP-PI，Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)和Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)-HDI样品的XPS分析测定的元素比例。
  样品   O/C   N/C   S/C
  Si-ALAPP-PI   0.158   0.132   0.004
  Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)   0.284   0.251   0.000
  Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)-HDI   0.280   0.275   0.000
列在表26中的是经Si-ALAPP-PI，Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)和Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)-HDI的XPS分析测定的元素比例。元素比例分析使之确认Si-ALAPP-PI样品表面上的P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)接枝共聚是成功的。相比由Si-ALAPP-PI样品获得的数值(O/C 0.158，N/C 0.132)，由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)样品得到增加的O/C和N/C值(分别为0.284和0.251)。成功接枝聚合的进一步证据获得自高解析度C 1s XPS谱图分析。在此情况下，观察到在Si-ALAPP-PI样品上不存在的(参见图13，Si-ALAPP-PI样品的代表性高解析度C 1s XPS谱图)由于存在酰胺官能性而出现的谱图特征部分(参见图26(a))。
在HDI加到Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)样品上后，注意到N/C比例的少量增加(值为0.275，相比HDI加入前得到的值，即值0.251)。该观察到的增加与源自于HDI的异氰酸酯基团与接枝聚合物链中的丙烯酸的酸基团反应的向所述涂层中加入N相一致。也注意到O/C比例的少量下降，与向涂层中引入更多的中性碳(来自于HDI的六亚甲基链)相一致。由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)-HDI样品获得的高解析度C 1s谱图非常类似于由Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-丙烯酸)获得的谱图，这是由于在与HDI交联之后仅引入了酰胺和烃，二者均在原先的涂层中存在。
实施例26
采用寡肽单体形成的Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-寡肽)接枝涂层的制备
部分A：寡肽单体(甲基丙烯酰氧基-glygly或MA-glygly)的合成
采用Drobnik，等(Drobnfk，J.等，Makromol.Chem.，1976，Ml，2833)的方法合成可聚合寡肽。简言之，将氢氧化钠(0.1515g，0.0038mol，1.0当量)加入到甘氨酰甘氨酸(glygly)，(0.50g，0.0038mol，1.0当量)水溶液(3mL)中。所得溶液冷却至0℃。然后将甲基丙烯酰氯(0.396g，0.0038mol，1.0当量)和氢氧化钠(0.1515g，0.0038mol，1.0当量，在3mL水中)同时逐滴加入到冷却溶液中。反应混合物在室温再搅拌一小时，然后用浓HCl逐滴酸化至pH值2。加入乙酸乙酯(20mL)和水(10mL)并在分液漏斗中晃动混合物。在分液漏斗中两相界面处由溶液中沉淀出无色晶体。这些晶体经过滤，用水清洗并空气干燥。得到少量所需产物(0.06g)(产率8％)。从水相中回收未反应的甘氨酰甘氨酸。1HNMR(DMSO-d6，200MHz)δ1.86(s，3H，CH3)，3.73(s，2H，CH2)，3.76(s，2H，CH2)，5.36(s，1H，乙烯基CH)，5.72(s，1H，乙烯基CH)，8.05-8.17(br.s，2H，2×NH)，12.53(br.s，1H，COOH)ppm。13C(DMSO-d6，200MHz)δ18.97，41.04，42.56，120.15，139.89，168.00，169.77，171.58ppm。
部分B：Si-ALAPP-PI表面上P(PEGMA(475)-共甲基丙烯酰-glygly)共聚物涂层的接枝聚合(Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-MA-glygly)
按照实施例15制备Si-ALAPP表面，按照实施例4进行PI共聚物的共价偶联。所得Si-ALAPP-PI表面然后转移到载玻片随后放入配有o-环密封石英玻璃盖的用户定制不锈钢室。向该室中加入含有42mgMA-glygly，900mg去抑制PEGMA(475)，10mL纯净水和1和mL DMF的溶液，得到单体摩尔比为10∶90 MA-glygly∶PEG MA(475)。在配置单体溶液和加入到UV聚合室之前，PEGMA(475)单体通过含有抑制剂去除剂树脂(Aldrich)的柱子去抑制。单体溶液用高纯度氮鼓气15分钟以除去溶解的氧。在鼓气后，入口和出口阀门关闭，使用EXFO Articure400灯将样品暴露于UV辐射(320-500nm波长，50mWcm-2强度)30分钟。在辐射后，从单体溶液中取出样品，用纯净水(3×)清洗三次，浸没在水中过夜，并最后再冲洗三次。在清洗后，用高速经过滤的高纯度N2流吹干样品并在XPS分析前保存在层流柜中。此外，如上制备了Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))对照样品，即没有MA-glygly单体。
表27：(PEGMA(475)-共-MA-glygly)和Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))的XPS分析测定的元素比例。
  比例   O/C   N/C   S/C
  Si-ALAPP-PI   0.158   0.132   0.004
  Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-MA-glygIy)   0.472   0.009   0.000
  Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))   0.470   0.000   0.000
列在表27中的元素比例分析使之能确认两种接枝聚合均成功。在Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))对照样品的情况下，得到的O/C和N/C比例非常接近于在其它实施例(例如参见实施例5)中得到的那些，表明干燥状态下接枝聚合物涂层厚于XPS取样深度。此外，得到的高解析度C1s XPS谱图非常接近于之前得到的那些，并且是厚度超过10nm(干燥状态下)的P(PEGMA(475))涂层的指示。具体而言，在结合能286.5eV处的主要谱图特征部分是含有高比例C-O的涂层的指示。由Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-MA-glygly)接枝共聚物涂覆样品得到的元素比例不同于由P(PEGMA(475))接枝共聚物涂覆样品得到的那些元素比例，N/C比例明显增加。这是在接枝聚合反应中将肽单体(MA-glygly)引入到聚合物链中的证据。正如根据元素组成和比例所预期的，由Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475)-共-MA-glygly)接枝共聚物涂覆样品的高解析度C 1s XPS谱图(参见图27(b))非常类似于由Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))涂层得到的那些谱图。谱图之间，在中性烃类区域(在285eV)存在一些细微差异。
实施例27
Si-ALAPP，Si-ALAPP-PI和Si-ALAPP-P(PEGMA(475))表面的制备：均匀性和平整性的研究
按照实施例15制备Si-ALAPP表面，并按照实施例4进行将PI共聚物共价偶联到Si-ALAPP表面上。简言之，通过在表面活性剂溶液(2％RBS 35，Pierce Biotechnology，Inc.)中超声一小时从而清洁硅晶片，在MilliQTM纯化水中充分地冲洗并使用高速经过滤的氮气流吹干。然后按照实施例15B用ALAPP薄膜涂覆硅晶片。然后将每片晶片放置在干净的特氟龙小瓶和含有3.6mL PI溶液(参见实施例3)，DMF(10.8mL)，MilliQTM纯化H2O(1.8mL)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，0.18g，Sigma)的溶液等分试样中(小晶片为2mL，大晶片为4mL)。反应在室温伴随轻微晃动进行过夜，随后硅晶片在DMF(一日内两次，随后过夜清洗)和纯净水(一日内三次)中清洗，随后在层流柜中干燥。ALAPP涂覆对照样品放入以上不含有EDC或PI的溶液中，并按照以上概述的相同步骤进行清洗。
一亚组以上制备的Si-ALAPP-PI样品载玻片随后放入配有o-环密封石英玻璃盖的用户定制不锈钢室。向该室中加入单体溶液(去抑制的PEGMA(475)，(10％w/v)并密封小室。经向溶液中通入氮气15分钟以从单体溶液中除去氧。然后密封小室的入口和出口，然后将小室密封并采用EXFO Articure 400灯使样品暴露于UV辐射(320-500nm波长；50mWcm-2强度)30分钟。在辐射后，取出样品，用MilliQ纯化水充分地清洗，在MilliQTM纯化水中浸泡两天，其中间歇地更换，最后再用MilliQTM纯化水冲洗。在XPS分析前，将样品在层流柜中干燥。
表28：由Si-ALAPP(n(即，样品点数)＝10，来自一个基材样品)，Si-ALAPP-PI(n＝10，来自三个基材样品)和Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))(n＝16，来自3个基材样品)样品的XPS分析测定的元素比例。
  样品   O/C   N/C   S/C
  Si-ALAPP   0.131±0.002   0.131±0.003   0.0000±0.0000
  Si-ALAPP-PI   0.158±0.003   0.132±0.003   0.0035±0.0003
  Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))   0.462±0.006   0.000±0.000   0.0000±0.0000
表28中列出的元素比例分析和标准偏差量级证实了所形成的样品是平整，组成上是均匀的。代表性高解析度C 1s XPS谱图显示在图28中。
应当指出的是，在本说明书列出的实施例中，在列出的元素比例中存在一些细微差异。这些细微差异源自于由XPS测定的元素组成是相对的。即所有元素的原子百分比必须相加为100％。因此，例如，ALAPP薄膜氧化的变化将影响所有其它元素的原子比例。此外，实验条件的变化对例如S/C比例也能有影响。
实施例28
96孔板中Si-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)共聚物涂层的制备以及在酶联免疫吸附试验中的使用
部分A：涂覆有ALAPP-PI(PS-ALAPP-PI)的聚(苯乙烯)表面上丙烯酰胺以及丙烯酰胺和生物素-MA的接枝聚合
根据实施例15D中的方法用ALAPP薄膜涂覆96孔形式的组织培养聚苯乙烯(PS)板(Nunc，NunclonTM A处理，#167008)。通过XPS分析得到的PS和PS-ALAPP样品的典型元素比例列在表29中。PS孔表面本质上是碳质的，在这些板的制造中所采用的表面改性而加入氧(O/C＝0.152)。采用ALAPP薄膜的PS表面的涂覆导致N的引入(N/C 0.155)，这来自于在ALAPP层中的含氮基团。此外，由于相比PS表面，ALAPP薄膜的较低氧化度，O/C比例减少(由0.152至0.099)。由高解析度C 1s XPS谱图(参见图29(a)：注意到在更高结合能处芳香性‘摇摆’峰的存在)可以确定聚苯乙烯属性(具有适度的氧化度)。由于大量C、N和O物种的存在，在PS表面上的ALAPP薄膜的沉积导致更宽的高解析度C 1s谱图。更高结合能处的芳香性‘摇摆’峰由于ALAPP覆盖层而消失从而证实了全厚度的XPS取样深度(10nm)的涂层。
除使用DMSO替代DMF作为溶剂并且未加入水作为共溶剂之外，按照实施例15B将PI共聚物共价地偶联至PS-ALAPP样品表面。通过XPS分析得到的PS-ALAPP-PI样品的典型元素比例列在表29中。此处，可以观察到相比PS-ALAPP样品，O/C比例增加而N/C比例减少，这与PI共聚物共价地接枝到PS-ALAPP表面上的覆盖层的存在相一致。此外，来自PI共聚物中的半硫代氨基甲酸酯部分的S也存在于PS-ALAPP-PI样品中，但不存在于PS-ALAPP样品中，证实了共价连接。PI共聚物成功共价偶联至PS-ALAPP样品表面的其它证据通过高解析度C 1s XPS谱图(参见图29(c))的分析得到，令人感兴趣的主要特征是由于存在来自于共价连接PI覆盖层的羧酸残基而促成谱图中高结合能的存在。该谱图特征部分在由PS-ALAPP样品(参见图29(b))获得的高解析度C 1s谱图中并不存在。
如上制备96孔板形式的PS-ALAPP-PI涂覆板。制备(i)丙烯酰胺单体(10％ w/v，3mL DMSO中300mg)和(ii)3mL DMSO中的丙烯酰胺单体(150mg)和生物素-MA(87mg，按照实施例15B中所述的方法合成，并使用氮气脱氧20分钟。然后密封装有单体的烧瓶并连同用户定制UV聚合室(配有o-环密封石英玻璃盖的不锈钢)和PS-ALAPP-PI涂覆96孔板转移到手套箱中。然后将单体溶液等分试样(100μL)用移液管转移到PS-ALAPP-PI涂覆96孔板的小孔中。装有单体溶液的96孔板随后转移到UV聚合室中，密封小室并从手套箱中取出。在UV聚合室(其中所述孔部分充满单体溶液)中的PS-ALAPP-PI涂覆96孔板的四分之一(掩模覆盖在板的其余四分之三上)然后依次采用EXFO Articure 400灯进行UV光辐射(320-500nm波长；50mWcm-2)30分钟。在板的所有四分之一部分均用UV光辐射以后，打开小室并取出96孔板。然后用DMSO清洗板的每个孔两次(每次清洗用250μL DMSO 1至1.5小时)，然后在DMSO(每孔中250μL)浸泡过夜。最后，用MilliQTM纯化水充分清洗(三次，1-1.5小时)。所述板然后在XPS分析之前在层流柜中干燥。在一些情况下，用NeutrAvidinTM生物素结合蛋白(Pierce BiotechnologyInc.)(HEPES缓冲液中50μg/mL)部分充满(100μL)小孔，并在室温保温过夜。所述孔然后在1M NaCl(两次，两小时，然后过夜)和HEPES缓冲液(三次，两小时)中冲洗，最后在干燥前，在30分钟时间里在MilliQTM纯化水中冲洗五次。HEPES合成仪含有150mM NaCl和20mM[N-2-羟乙基)-1-哌嗪-N’-2-乙烷磺酸，钠盐](HEPES)并用1M NaOH溶液调整至pH 7.2。对于XPS分析，使用特别设计的不锈钢工具(从板下方)无污染地从板上移去每个孔的底部，然后安装到避免加样的特殊设计XPS样品支架上。
列在表29中的是由PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)和PS-ALAPP-PI-(丙烯酰胺-共-生物素MA)样品的XPS分析计算而得的元素比例。PS-ALAPP-PI样品表面上P(丙烯酰胺)的接枝聚合导致O/C和N/C比例的增加，与P(丙烯酰胺)薄涂层的存在相一致。PS-ALAPP-PI样品表面上P(丙烯酰胺-共-生物素MA)的接枝聚合导致N/C原子比例增加，再次与薄接枝共聚物涂层的存在相一致。此外，S/C比例在接枝聚合反应后增加，表明来自生物素-MA单体的生物素加入到涂层中。应当注意的是接枝聚合物涂层薄于XPS取样深度。通过与硅晶片基材上的相似涂层的XPS分析得到的组成(参见实施例15)进行比较可对此进行确认。这可由相比平整硅晶片基材而言96孔板的孔中较低强度的UV辐射预计到。上述接枝聚合反应成功的确认可通过高解析度XPS图谱分析得到。在图29(d)和(e)中显示的是由PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)和PS-ALAPP-PI-(丙烯酰胺-共-生物素MA)样品表面得到的高解析度C 1s XPS谱图。两张谱图均含有与存在酰胺相一致的特征(来自结合能288eV处的丙烯酰胺单体的聚合)。由于涂层中生物素MA的存在，来自PS-ALAPP-PI-(丙烯酰胺-共-生物素MA)样品的谱图中的酰胺峰不如来自PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)的谱图明显。该趋势也在实施例15中观察到。
也包括在表29中的是由在NA溶液中保温后的PS-ALAPP-PI-(丙烯酰胺-共-生物素MA)样品表面的XPS分析得到的元素比例。观察到显著的O/C和N/C比例增加，与NeutraVidinTM(NA)结合到PS-ALAPP-PI-(丙烯酰胺-共-生物素MA)样品上相一致。在显示于图29(f)中的该样品的高解析度C 1s谱图中存在的特征是表面上存在蛋白(即NA)的特征。
表29：由PS，PS-ALAPP，PS-ALAPP-PI，PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)，PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)和PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)-NA样品的XPS分析计算而得的元素比例
  样品   O/C   N/C   S/C
  PS   0.152   0.000   0.000
  PS-ALAPP   0.099   0.155   0.000
  PS-ALAPP-PI   0.290   0.108   0.009
  PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺)   0.301   0.121   0.009
  PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)   0.288   0.122   0.018
  PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)-NA   0.283   0.189   0.009
部分B：使用PS-ALAPP-PI-丙烯酰胺-共-生物素MA)涂覆96孔板的酶联免疫吸附试验(ELISA)
如上制备其中孔涂覆有P(丙烯酰胺-共-生物素MA)的96孔形式的微滴定板。在测试的11个孔中的三个，如部分A所述也加入NeutrAvidinTM生物素结合蛋白(Pierce Biotechnology，Inc.)(NA)。阻断所有测试的孔。将等分试样(200μL)的TBS缓冲液(25mM 2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇，136mM NaCl，2.7mM KCl，用1M HCl调节至pH 8)中的牛血清白蛋白(BSA)阻断溶液(1％BSA)加入到所述板的孔中，并在4℃进行过夜保温。
向装有结合NA的孔和未装有NA(生物素化IgG(1°Ab)对照)的四个其它孔中，移去BSA阻断溶液并加入100μL生物素-SP-轭合山羊抗-小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，#115-066-072)(1°Ab)溶液，所述溶液已经用含有Tween 20(0.05重量％)的1重量％BSA的TBS缓冲液溶液(TBST缓冲液)以1∶1000稀释至2μg/mL的浓度，加入到板上的一些孔中。覆盖装有生物素化IgG(1°Ab)的孔并在室温保温4小时。从剩余的四个孔(未加入1°Ab)中移去生物素化IgG溶液和BSA阻断溶液，并用TBST缓冲液清洗所述孔三次。
然后向所有11孔中加入100μL猴抗山羊Ig-HRP轭合物(Silenus#UAH)溶液，所述溶液已经用含有1重量％BSA的TBST合成仪以1∶500进行稀释。在保温1.5小时后，移去猴抗山羊Ig-HRP轭合物溶液并用TBST缓冲液清洗所述孔三次。等分试样(100μL)的显影剂(ABTS)随后加入到所有测试的11孔中。ABTS溶液含有溶解在柠檬酸缓冲液(10mL)中的2，2′-偶氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(5mg)，并向其加入20μL过氧化氢。所述溶液在制备后立即使用。15分钟之后，从所有孔中移去ABTS溶液并转移到新微滴定96孔板中以便于在Biotek ELISA板读数器中以405nm的波长进行读数。
测试的孔指定如下：
(i)向其连接有NA并加入1°Ab和2°Ab的孔(+NA，+1°Ab，+2°Ab)。
(ii)不含有NA并加入1°Ab和2°Ab的孔(-NA，+1°Ab，+2°Ab)。
(iii)不含有NA，不加入1°Ab但假如2°Ab的孔(-NA，-1°Ab，+2°Ab)。
含有结合NA的孔按预期将与生物素化IgG(1°Ab)相结合并形成能通过使用ELISA板读数器测量已显影的溶液的吸光度而检测到的HRP轭合物。针对测试孔得到的数据列在图30中。此处，仅对于含有连接到P(丙烯酰胺-共-生物素MA)涂层上的NA的孔(+NA，+1°Ab，+2°Ab)而言测定的吸光度较高(1.05)。对于不含有结合NA但加入1°Ab的孔(-NA，+1°Ab，+2°Ab)，得到的低吸光度(0.089)证实了生物素化IgG(1°Ab)的低非特异性吸附。该数据是PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)涂层结合NA和1°Ab的非特异性吸附较低的明显证据，NA可用ELISA试验进行检测。此外，对于2°Ab对照(-NA，-1°Ab，+2°Ab)得到的吸光度也很低(0.084)，表明2°Ab在PS-ALAPP-PI-P(丙烯酰胺-共-生物素MA)涂层上的非特异性吸附也很低。
实施例29
Si-ALAPP-PI表面上PEGMA(475)的梯度接枝聚合
部分A：Si-ALAPP-PI表面上PEGMA(475)的梯度接枝聚合
按照实施例15制备Si-ALAPP表面，按照实施例4进行将PI共聚物共价偶联到Si-ALAPP表面上。然而，在本实施例中，干净玻璃显微镜载玻片替代硅晶片用作基材。简言之，六片ALAPP处理的玻璃显微镜载玻片放置在含有9mL PI溶液(参见实施例3)，DMF(27mL)，MilliQTM纯化H2O(4.5mL)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，0.45g，Sigma)的溶液中。反应在室温进行过夜，随后玻璃显微镜载玻片在DMF(一日内两次，随后过夜清洗)和纯净水(一日内三次)中清洗，随后在层流柜中干燥。
以上制备的Si-ALAPP-PI载玻片随后放入配有o-环密封石英玻璃盖的用户定制不锈钢室。向该室中加入已经用氮脱气30分钟的单体溶液(去抑制的PEGMA(475)，10％w/v)。然后将盖住大部分不玻璃载玻片面积(1.5cm长度保持暴露)的UV不透明掩膜放置在石英玻璃窗顶部。掩膜和Si-ALAPP-PI样品之间的距离是1cm。使用EXFO Articure 400灯进行五分钟的玻璃载玻片的暴露区域的UV辐射(320-500nm波长；50mWcm-2强度)。在辐射后五分钟后，掩膜沿玻璃载玻片移动1cm并再进行5分钟的UV辐射，等等，得到总共具有不同辐射时间的7个区域(参见图31)。在载玻片的末端，1cm的区域未接受任何UV辐射。因此，在载玻片的中心，总UV辐射是15分钟。在已经进行所有辐射处理之后取出样品，用MilliQ纯化水充分地清洗，在MilliQTM纯化水中浸泡两天，其中间歇地更换，最后再用MilliQTM纯化水冲洗。在XPS分析前，将样品在层流柜中干燥。
列在表30中的是由与沿载玻片7cm处未暴露于UV辐射的对照区域相比的沿Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))涂覆载玻片的区域以及来自实施例5的全厚度Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))样品的XPS分析测定的元素比例。此处，沿载玻片的6、5和4cm分别表示5、10和15分钟的UV辐射。由这些数据可以明确在进行分析的四个区域中得到的元素比例数据相差很大。随着敷设时间增长，O/C比例增加而N/C比例减少。由于存在随着辐射时间增长厚度逐渐增加的P(PEGMA(475))接枝层从而可以预计到这些趋势。这些趋势也存在于图32中，其中空心圆圈表示O/C比例而实心圆圈表示N/C比例。应当指出的是沿载玻片辐射至多为15分钟的所有点的P(PEGMA(475))涂层厚度均小于XPS取样深度(10nm)(参见与表30中来自实施例5的全厚度数据)。P(PEGMA(475)随辐射时间具有不同厚度的进一步证据也可由高解析度C 1s谱图分析得到(参见图33(a)至(c))。此处可以看到C 1s形状以随逐渐增长的UV辐射时间的渐变方式由0 UV辐射时间时Si-ALAPP-PI表面(参见图33(a))所预测的形状的变化至由小于XPS取样深度的Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))涂层所预测的形状(参见图33(b)和(c))。尤其值得注意的是随着辐射时间由0(7cm处)增长至15分钟(4cm处)，C-O部分(结合能286.5)的增加。
表30：由Si-ALAPP-PI(沿载玻片7cm)，Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))(沿载玻片6、5和4cm)和Si-HAPP-PI-P(PEGMA(475))(来自实施例5)的XPS分析测定的元素比例
  样品   O/C   N/C   S/C
  Si-ALAPP-PI(沿载玻片7cm)   0.241   0.126   0.005
  Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))(沿载玻片6cm)   0.257   0.118   0.005
  Si-ALAPP-PI-(P(PEGMA(475))(沿载玻片5cm)   0.354   0.075   0.003
  Si-ALAPP-PI-(P(PEGMA(475))(沿载玻片4cm)   0.372   0.063   0.001
  Si-HAPP-PI-(P(PEGMA(475))(来自实施例5)   0.476   0.001   0.000
可通过停止UV辐射，移动掩模然后继续UV辐射从而增加P(PEGMA(475))涂层厚度的事实是该接枝聚合反应(i)由UV辐射引发和(ii)本质上是活性聚合的直接证据。
部分B：梯度聚合Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475))表面区域中HeLa细胞附着差异的测定
具有掩蔽和未掩蔽区域的接枝聚合物涂覆玻璃载玻片(Si-ALAPP-PI-P(PEGMA(475)))转移到4-室培养盘(Nunc，Roskilde，Denmark)并且在室温，每片载玻片浸没在含有青霉素和链霉素(分别为120μg/mL和200μg/mL)的磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4)，无血清培养基(SFM，Dulbecco′s Modified Eagles Medium/Ham′s F12(50∶50))的无菌溶液中三个半小时。
取出以上步骤的无菌溶液，并将HeLa细胞以1×106细胞/室的密度接种在由添加有10％(v/v)牛胚胎血清(FBS)的SFM构成的培养基中。细胞在37℃，含有5％ CO2的潮湿空气中保温24小时。
在18和24小时保温后，通过相差显微镜(Olympus 1×81，奥林巴斯，日本)观察HeLa细胞并电子记录代表性图像。
正如之前在实施例9中，HeLa细胞在Si-HAPP-PA表面上很好地附着和扩展而在厚Si-HAPP-P(PEGMA(475))表面上不能很好地附着和扩展。该差异可归结于阻挡HeLa细胞附着的接枝P(PEGMA(475))层的存在。由图W(a)至(e)中所显示的低辐射时间(图34(a))从而导致薄P(PEGMA(475))涂层的细胞附着的图像可以清楚地看到，具有相比PS对照(图34(e))略微较低的密度的大量细胞附着。此外，在载玻片的5分钟UV辐射区域中所观察到的细胞扩展非常类似于PS对照。然而，随着辐射时间增长，由此导致涂层厚度增加，细胞附着程度如如期减少。此外，随设辐射时间增长，细胞扩展量明显减少至在20分钟UV辐射区域(图34(d))上具有非常圆的形态的极少量细胞附着的情况。
应当理解在本说明书中公开和限定的本发明扩展至文字或图像所提到的或显而易见的两个或两个以上特征的所有替代性组合。所有这些不同的组合构成了本发明的不同替代性方面。

Claims (17)

1.一种含有高分子的可控聚合物表面涂层，该可控聚合物表面涂层与基材表面共价地连接，所述高分子含有多个聚合引发子和多个表面结合基团；并且含有从至少一些所述聚合引发子上接枝出的侧链聚合物。
2.如权利要求1所述的可控聚合物表面涂层，其中所述高分子含有至少1％的预定摩尔比的聚合引发子。
3.如权利要求1所述的可控聚合物表面涂层，其中所述聚合引发子是受控的自由基聚合引发子。
4.如权利要求1所述的可控聚合物表面涂层，其中通过受控的自由基活性聚合而由所述聚合引发子上接枝出所述侧链聚合物。
5.如权利要求1所述的可控聚合物表面涂层，其中所述可控聚合物表面涂层还含有接枝在所述侧链聚合物上的其它聚合物。
6.如权利要求1所述的可控聚合物表面涂层，其中所述可控聚合物表面涂层还含有连接在所述侧链聚合物上的至少一种生物活性成分。
7.如权利要求1所述的可控聚合物表面涂层，其中所述侧链聚合物具有受控结构。
8.如权利要求1所述的可控聚合物表面涂层，其中所述侧链聚合物调控生物应答。
9.如权利要求8所述的可控聚合物表面涂层，其中所述侧链聚合物调控细胞附着。
10.一种将聚合引发子可控地定位于基材表面上的方法，该方法包括将高分子与所述表面共价地连接，其中所述高分子含有多个聚合引发子和多个表面结合基团。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述高分子含有至少1％的预定摩尔比的聚合引发子。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述聚合引发子是受控的自由基聚合引发子。
13.一种在基材表面上制备可控聚合物表面涂层的方法，该方法包括将含有多个聚合引发子和多个表面结合基团的高分子与所述表面共价地连接，并且从至少一些所述聚合引发子上接枝出侧链聚合物。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述高分子含有至少1％的预定摩尔比的聚合引发子。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述聚合引发子是受控的自由基聚合引发子。
16.如权利要求13所述的方法，其中通过受控的自由基活性聚合而由所述聚合引发子上接枝出所述侧链聚合物。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述方法进一步包括提供接枝在所述侧链聚合物上的其它聚合物。
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