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CN101421419B - 增加谷胱甘肽的物质的筛选方法 - Google Patents

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CN101421419B CN200780013093XA CN200780013093A CN101421419B CN 101421419 B CN101421419 B CN 101421419B CN 200780013093X A CN200780013093X A CN 200780013093XA CN 200780013093 A CN200780013093 A CN 200780013093A CN 101421419 B CN101421419 B CN 101421419B
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Abstract

本发明提供一种用于筛选使谷胱甘肽增加的治疗药的有效成分的物质的方法，该方法是神经变性疾病，恶性肿瘤，感染病等疾病的治疗方法。该方法中，使待测物质与表达GTRAP3-18蛋白质的细胞相接触，将使GTRAP3-18蛋白质的表达量减少或者抑制GTRAP3-18蛋白质功能的物质鉴定为目的物质。

Description

增加谷胱甘肽的物质的筛选方法
技术领域
本发明涉及筛选可成为神经变性疾病，恶性肿瘤，感染病等多种疾病治疗药的有效成分的、增加细胞内谷胱甘肽量的物质的方法。
背景技术
细胞内谷胱甘肽是生物体所具有的主要的抗氧化物质，是生物体防御中极为重要的分子(非专利文献1)。谷胱甘肽由3个氨基酸构成(甘氨酸，半胱氨酸，谷氨酸)构成，通过两个阶段的酶反应合成。但是，通过单独施用谷胱甘肽的原料-3种氨基酸，细胞内的谷胱甘肽没有增加，由此预想其涉及复杂的调节机制。
已知若实验性地使神经细胞内的谷胱甘肽减少，则引起神经变性(非专利文献2)。即使在实际的疾病中，已知在神经变性疾病(帕金森病，阿尔茨海默病等)，恶性肿瘤，感染病等多种疾病中谷胱甘肽减少，人们预想并希望如果有使谷胱甘肽增加的治疗药会非常有用(非专利文献3-6)。但是，现在并不存在这种治疗药。
已发现细胞膜中表达的EAAC1(易刺激的氨基酸载体-1，excitory amino acid carrier-1)是将谷氨酸摄入到细胞内的蛋白质(谷氨酸输送蛋白质)，然而已知其作为谷氨酸输送蛋白质的能力低，其它蛋白质(GLT-1，GLAST)作为谷氨酸输送蛋白质十分重要(非专利文献7-8)。然后，发现EAAC1不仅具有输送谷氨酸还具有输送包括半胱氨酸在内的其它氨基酸的能力(非专利文献9-11)。
而且，最近发现EAAC1是用于维持细胞内谷胱甘肽量所必需的蛋白质(非专利文献12)。因此推想EAAC1具有输送谷胱甘肽的构成氨基酸-谷氨酸和半胱氨酸的能力而对此有贡献。
因此，如果有活化EAAC1的方法，理论上也许可以使细胞内谷胱甘肽量增加。但是，现在，还没有发现通过与EAAC1结合而被活化的分子或混合物。而且，在考虑EAAC1作为目标的药物的开发方面的事实是：与在细胞膜上表达的输送蛋白质结合的分子或化合物菌都是抑制药。例如，有以下这些例子：针对血清素(serotonin)输送蛋白的抗抑郁药SSRI，针对去甲肾上腺素输送蛋白的抗抑郁药地昔帕明，针对神经终末颗粒的胺输送蛋白的降压药利血平等。因此，与其说以EAAC1作为目标的分子或化合物，不如说考虑使谷胱甘肽量减少的可能性大，实际上也存在这种例子(非专利文献13)。
另一方面，作为与EAAC1结合的生物体内的分子，存在称之为GTRAP3-18(谷氨酸盐-转运子相关蛋白3-18)这种蛋白质。这种GTRAP3-18多发现于脑，脊髓，肾脏，心脏，骨骼肌中，已知其通过与EAAC1结合使谷氨酸的输送能力降低(非专利文献14)。但是，由于EAAC1的各氨基酸的输送机制各不相同(非专利文献15，16)，GTRAP3-18与EAAC1结合时，半胱氨酸的输送能力如何变化并不清楚，而且GTRAP3-18的增减对细胞内谷胱甘肽量产生什么影响完全不清楚。而且，GTRAP3-18的氨基酸序列和编码GTRAP3-18的cDNA序列记载于专利文献1中。
专利文献1：美国专利第6,808,893号
非专利文献1：Dringen，Prog Neurobiol 62：649-671，2000
非专利文献2：Jain et al.，Proc Natl Acad Sci88：1913-1917，1991。
非专利文献3：Exner et al.，Wien Klin Wochenschr112：610-616，2000。
非专利文献4：Lomaestro et al.，Ann Pharmacother29：1263-1273，1995。
非专利文献5：Reid and Johoor，Curr Opin Clin Nutr MetabCare4：65-71，2001。
非专利文献6：Towns end and Tew，Oncogene22：7369-7375，2003。
非专利文献7：Kanai et al.Neuroreport 6：2357-2362，1995。
非专利文献8：Robinson and Dowd Adv Pharmacol37：69-115，1997。
非专利文献9：King，et al.Cardiovasc Res 52：84-94，2001。
非专利文献10：Chen and Swanson J Neurochem84：1332-1339，2003。
非专利文献11：Himi et al.，J Neural Transm110：1337-1348，2003。
非专利文献12：Aoyama et al.，Nature Neuroscience9：119-126，2006。
非专利文献13：Esslinger et al.，Neuropharmacology49：850-861，2005。
非专利文献14：Lin et al.，Nature 410：84-88，2001。
非专利文献15：Bendahan，A et al.，J Biol Chem275：37436-37442，2000。
非专利文献16：Borre and Kahner，J Biol Chem279：2513-2519，2004。
发明内容
如前所述，希望开发使谷胱甘肽增加的治疗药作为神经变性疾病，恶性肿瘤，感染病等多种疾病的治疗方法。
本申请发明的课题在于提供用于筛选成为这种使谷胱甘肽增加的治疗药的有效成分的物质的方法。
本申请发明人等着眼于与谷胱甘肽之间关系尚不清楚的GTRAP3-18蛋白质，进行了积极研究，其结果发现，若使GTRAP3-18蛋白质的表达人为减少，则谷胱甘肽量增加，相反若使GTRAP3-18蛋白质的表达增加，则谷胱甘肽量减少。
本发明基于发明人的这种新的认识而形成。
也就是说，本发明是一种筛选使细胞内的谷胱甘肽量增加的物质的方法，其特征在于使待测物质与表达GTRAP3-18蛋白质的细胞接触，将使GTRAP3-18蛋白质的表达量减少或抑制GTRAP3-18蛋白质的功能的物质鉴定为目的物质。
而且，本发明的方法还可以以动物个体内的细胞作为对象来进行。
如果根据本发明，可以鉴定原来完全不存在的可以使细胞内谷胱甘肽量增加的物质。这种物质可以大大促进针对神经变性疾病，恶性肿瘤，感染病等疾病的新治疗药的开发。
在本发明中，所谓“GTRAP3-18蛋白质表达量”是指细胞内GTRAP3-18蛋白质自身减少或编码GTRAP3-18蛋白质的基因的转录量减少，由基因转录产物向GTRAP3-18蛋白质的翻译量减少等。而且，所谓“GTRAP3-18蛋白质的功能抑制”是指抑制GTRAP3-18蛋白质的功能(例如抑制EAAC1活性的功能，进而通过抑制EAAC1活性使谷胱甘肽量减少的功能)。进而，所谓“使待测物质”是指使待测物质与细胞接触以便待测物质在细胞内作用于GTRAP3-18蛋白质表达。
该发明中的其它用于和概念在发明的实施方式的说明和实施例中详细规定。而且，用于实施本发明使用的各种技术，除了特别明示了其出处的技术，只要是本领域技术人员基于公知的技术就可以容易且可靠地实施。例如，基因工程和分子生物学技术可以基于Sambrook和Maniatis在《分子克隆-实验手册》冷泉港实验室出版，纽约，1989；Ausubel，F.M.等人的《Current Protocols in MolecularBiology》，JohnWiley & Sons，New York，N.Y，1995等或其中引用的文献进行。
附图说明
图1：研究GTRAP3-18反义寡核苷酸和甲基-β-环糊精(MeβCD)对HEK293细胞的GTRAP3-18蛋白质表达的影响的结果。在HEK293细胞中导入GTRAP3-18有义寡核苷酸(GTRAP3-18(S))或GTRAP3-18反义寡核苷酸(GTRAP3-18(As))，或者使250μM甲基-β-环糊精(MeβCD)作用于该细胞。A)破碎细胞后，用抗EAAC1抗体，抗GTRAP3-18抗体，抗肌动蛋白抗体进行Western印迹。B)将Western印迹的结果数字化，用相对于肌动蛋白之比来表示。GTRAP3-18由于导入GTRAP3-18反义寡核苷酸而减少，通过MeβCD引起GTRAP3-18增加。EAAC1量没有变化。
图2：在图1的条件下，定量细胞内谷胱甘肽量(GSH)。谷胱甘肽由于导入GTRAP3-18反义寡核苷酸而增加，通过MeβCD而减少。
图3：对GTRAP3-18siRNA对小鼠海马细胞的GTRAP3-18蛋白质表达的影响进行研究的结果。A)破碎细胞后，用抗GTRAP3-18抗体进行Western印迹。B)将Western印迹的结果数字化，用相对于缓冲液给药之比来表示。GTRAP3-18量由于导入GTRAP3-18siRNA而减少。
图4：对EAAC1siRNA对小鼠海马细胞的EAAC1蛋白质表达的影响进行研究的结果。A)破碎细胞后，用抗EAAC1抗体进行Western印迹。B)将Western印迹的结果数字化，用相对于缓冲液给药之比来表示。EAAC1量由于导入EAAC1 siRNA而减少。
图5：在图3和图4的条件下定量海马细胞内谷胱甘肽量的结果。海马细胞的谷胱甘肽量通过在脑室中施用EAAC1 siRNA而减少，但由GTRAP3-18 siRNA会导致增加。
图6：研究甲基-β-环糊精(MeβCD)对小鼠海马细胞的GTRAP3-18蛋白质表达的影响的结果。A)破碎细胞后，用抗EAAC1抗体、抗GTRAP3-18抗体、抗肌动蛋白抗体进行Western印迹。B)将Western印迹的结果数字化，用相对于肌动蛋白之比来表示。GTRAP3-18量由于MeβCD而增加。EAAC1量没有变化。
图7：在图6的条件下，定量细胞内谷胱甘肽量(GSH)。谷胱甘肽会因MeβCD而减少。
用于实施发明的最佳方式
在本发明中使用的“表达GTRAP3-18蛋白质的细胞”是从动物体内分离并培养的表达GTRAP3-18蛋白质的细胞，或动物体内的细胞。在以培养细胞作为对象时为体外筛选，在以动物体内的细胞作为对象时是体内筛选。而且，作为对象的细胞尤为优选来源于表达GTRAP3-18蛋白质较多的脑，脊髓，心脏，骨骼肌等的细胞。
或者，尤其是体外筛选时，还可以使用被编码GTRAP3-18蛋白质的多核苷酸(cDNA)转化的细胞。编码GTRAP3-18蛋白质的cDNA还可以通过以由公知的核苷酸序列或其部分序列构成的DNA片段作为探针筛选基因组DNA文库或cDNA文库分离。获得的cDNA可以通过例如PCR(聚合酶链式反应)法，NASBN(基于核酸序列的扩增)法，TMA(转录介导的扩增)法，SDA(链取代扩增)法等通常进行的基因扩增法进行扩增。而且，还可以使用基于公知的序列合成的引物，以从细胞中分离的mRNA作为模板，通过RT-PCR法获得目的cDNA。而且，人GTRAP3-18的cDNA序列公开于专利文献1(美国专利第6,808,893号)中。而且，转化的细胞优选源于人等哺乳动物细胞，但如果为了确认待测物质对GTRAP3-18表达量的效果，可以是其它动植物细胞或大肠杆菌等原核细胞。
在体外筛选时，通过在培养细胞的培养基中添加待测物质使待测物质与细胞接触。而且，在体内筛选时，在动物个体中施加待测物质(例如经口给药，静脉注射，腹腔注射，皮下注射，脑内注射等)，使待测物质与表达GTRAP3-18多的脑，脊髓，心脏，骨骼肌等细胞接触。
成为筛选对象的待测物质中含有例如有机或无机化合物(尤其是低分子量化合物)，蛋白质，肽等。这些物质，其功能和结构既可以是已知的也可以是未知的。
而且，“组合化学文库”，作为用于有效鉴定目的物质的待测物质组，是一种有效手段。组合化学文库是通过化学合成或生物学合成，通过结合试剂等许多化学“构建模块”而生成的各种化学组合物的集合。例如，肽文库等直线的组合化学文库，通过对于给定的化合物长度(即肽的大小)，用所有可能的方法结合构建块(氨基酸)的组合而形成。就化学的构建块而言，通过这种组合的混合，可以合成多种化学组合物。例如，关于100个可换的化学的构建块的系统的组合的混合，其结果产生1亿个4聚体化合物或100亿个5聚体化合物(参照例如，Gallop et al.，(1994)37(9)：1233-1250)。组合化学文库的制备和筛选是本领域中公知的(例如参照美国专利第6004617号；5985365号)。这种组合化学文库是例如肽文库(例如，参照美国专利第5010175号；Furka(1991)Int.J.Pept.Prot.Res.，37：487-493，Houghton et al.，(1991)Nature，354：84-88)，类胨(peptoids)(例如参照WO91/19735)，密码化肽(例如参照WO93/20242)，随机的生物寡聚物(例如参照WO92/00091)，苯并二氮杂(benzodiazepine)(例如，参照美国专利第5288514号)，乙内酰脲，苯并氮杂(benzoazepine)和二肽(例如参照Hobbs(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6909-6913)等多肽体(diversomer)，插烯性多肽(例如，参照Hagihara(1992)J.Amer.Chem.Soc.114：6568)，具有β-D-葡萄糖骨架的非肽性肽模拟物(例如参照Hirschmann(1992)J.Amer.Chem.Soc.114：9217-9218)，低分子化合物库的类似有机合成(例如参照Chen(1994)J.Amer.Chem.Soc.116：2661)，寡氨基甲酸酯(例如参照Cho(1993)Science 261：1303)，和/或肽酰磷酸酯(例如，参照Campbell(1994)J.Org.Chem.59：658)等。而且，还可以使用核酸文库(例如参照Gordon(1994)J.Med.Chem.37：1385)，肽核酸文库(例如参照美国专利第5539083号)，抗体文库(例如参照Vaughn(1996)Naturebiotechnology14：309-314)，碳水化合物文库(例如，参照Liangetal.，(1996)Science274：1520-1522，美国专利第5593853号)，作为有机低分子文库的异戊烯化合物文库(例如参照美国专利第5569588号)；噻唑烷酮和间噻唑酮(metathiazanones)文库(参照美国专利第5549974号)；吡咯烷文库(参照美国专利Nos.5,525,735和5,519,134)；吗啉代化合物文库(参照美国专利No.5,506,337)；苯并二氮杂文库(参照美国专利No.5,288,514)。而且，还可以使用市售的文库(例如，美国ComGenex公司制，俄罗斯Asinex公司制，美国Tripos，Inc公司制，俄罗斯ChemStar，Ltd公司制，美国3DPharmaceuticals公司制，Martek Biosciences公司制等文库)。
GTRAP3-18的表达可以通过例如测定GTRAP3-18基因的转录产物(mRNA)来定量。例如，可以按照公知的基因工程和分子生物学技术，通过本领域中用于检知测定特定基因表达的已知方法例如原位杂交，Northern印迹，点印迹，RNase保护测试，RT-PCR，实时PCR(Journalof Molecular Endocrinology，25，169-193(2000)及其引用的文献)，DNA阵列分析法(MarkShena编，“Microarray BiochipTechnology”，Eaton Publishing，2000)等检知测定GTRAP3-18mRNA表达量来实施。
例如，使用寡核苷酸探针检测GTRAP3-18mRNA量的方法在Northern印迹分析法时，至少包括以下步骤：
(a)从使待测物质与之接触了的细胞中制备RNA的步骤；
(b)电泳分离步骤(a)中制备的RNA的步骤；
(c)步骤(b)中分离的RNA在严紧条件下与寡核苷酸探针杂交的步骤；
(d)步骤(e)中以与RNA杂交的寡核苷酸探针的标识量作为GTRAP3-18mRNA表达量的指标，与对照细胞的结果比较的步骤。
通过与对照细胞的结果比较，将使细胞产生显著低的GTRAP3-18mRNA表达量的待测物质鉴定为目的物质(使细胞内谷胱甘肽增加的物质)。
寡核苷酸探针为了在严紧条件(例如，特表平10-508186号公报，特表平9-511236号公报中记载的条件)下与GTRAP3-18mRNA杂交，采用由与mRNA的任意区域正确互补的序列构成的DNA序列。这种DNA序列还可以通过例如用适当的限制性酶切断GTRAP3-18cDNA而获得。或者，可以通过记载于Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47：411-418；Adams(1983)J.Am.Chem.Soc.105：661；Belousov(1997)Nucleic Acid Res.25：3440-3444：Frenkel(1995)FreeRadic.Biol.Med.19：373-380；Blommers(1994)Biochemistry33：7886-7896；Narang(1979)Meth.Enzymol.68：90；Brown(1979)Meth.Enzymol.68：109；Beaucage(1981)Tetra.Lett.22：1859；美国专利第4458066号中的公知的化学合成技术，在体外合成。
而且，通过寡核苷酸探针用放射性同位素(RI)法或非RI法标识，但优选使用非RI法。作为非RI法，可以例举荧光标识法，生物素标识法，化学发光法等，但优选使用荧光标识法。作为荧光物质，可以适当选择可以和寡核苷酸的碱基部分结合的物质来使用，可以使用花青色素(例如Cy DyeTM系列的Cy3，Cy5等)，若丹明6G试剂，N-乙酰氧基-N2-乙酰氨基芴(AAF)，AAIF(AAF的碘衍生物)等。而且，作为标识法，可以适当选择本领域公知的方法(例如随机引物法，Nick翻译法，通过PCR进行的DNA扩增，标识/加尾法，体外转录法等)来使用。例如，可以通过在HRF寡核苷酸中导入官能团(例如脂肪族伯氨基，SH基等)，在这种官能团上结合前述标记，制成标识化寡核苷酸探针。
而且，还可以通过使用DNA微阵列测定GTRAP3-18mRNA量。该方法至少包括以下步骤：
(a)从使待测物质与之接触的细胞中制备RNA的步骤；
(b)由步骤(a)中制备的RNA制备标识cDNA的步骤；
(c)使步骤(b)中制备的标识cDNA与DNA微阵列接触的步骤；
(d)以与步骤(c)中DNA微阵列的捕捉探针杂交的标识cDNA的标识量作为GTRAP3-18mRNA量的指标，与对照细胞的结果比较的步骤。
通过与对照细胞的结果比较，将使细胞产生显著低的GTRAP3-18mRNA表达量的待测物质鉴定为目的物质(使细胞内谷胱甘肽增加的物质)。
而且，还可以通过RT-PCR法测定GTRAP3-18mRNA量。该方法至少包括以下步骤：
(a)从使待测物质与之接触的细胞中制备RNA的步骤；
(b)以由步骤(a)中制备的RNA作为模板，使用引物组合成cDNA的步骤；
(c)以使步骤(b)中合成的cDNA量作为GTRAP3-18mRNA量的指标，与对照细胞的结果比较的步骤。
通过与对照细胞的结果比较，将使细胞产生显著低的GTRAP3-18mRNA表达量的待测物质鉴定为目的物质(使细胞内谷胱甘肽增加的物质)。
使用的引物组可以基于公知的GTRAP3-18cDNA序列，采用市售的软件例如Oligo TM[National Bioscience Inc.(美国)制]，GENETYX[软件开发(株)(日本)制]等设计，经合成·纯化各个步骤制备。
测定GTRAP3-18基因表达的其它方法为定量GTRAP3-18基因的表达产物-GTRAP3-18蛋白质的量。这种蛋白质的定量，可以按照公知的基因工程和分子生物学技术，通过本领域中用于检知测定特定蛋白质量的已知方法例如原位杂交，western印迹，各种免疫组织学方法等进行。
具体而言，可以使用特异性识别GTRAP3-18蛋白质的抗体来实施。抗体是多克隆抗体或单克隆抗体，其分别包括可以与GTRAP3-18蛋白质的表位结合的所有分子和Fab，F(ab’)2，Fv片段等。这种抗体，例如在多克隆抗体时，可以以GTRAP3-18蛋白质或其部分片段作为免疫原免疫动物后，从血清中获得。作为动物，可以使用小鼠，大鼠，兔，山羊，鸡等。
而且，单克隆抗体可以按照公知的单克隆抗体制备法(《单克隆抗体》，长宗香明，寺田弘共著，广川书店，1990年；“MonoclonalAntibody”James W.Going，第三版，Academic Press，1996)制备。
而且，抗体的标识物质可以使用酶，放射性同位素或荧光色素。酶如果满足转换数(turnover number)大，即使与抗体结合也稳定，使底物特异性着色等条件，则没有特别的限制，还可以使用通常的EIA中使用的酶，例如过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，碱性磷酸酶，葡糖氧化酶，乙酰胆碱酯酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，苹果酸脱氢酶等。而且，还可以使用酶抑制物质和辅酶等。这些酶与抗体的结合可以使用马来酰亚胺化合物等交联剂，通过公知的方法进行。作为底物，根据使用的酶的种类，可以使用公知的物质。例如，使用过氧化物酶作为酶时，可以使用3，3’，5，5’-四甲基联苯二胺，使用碱性磷酸酶作为酶时，可以使用对硝基酚等。作为放射性同位素，可以使用用125I或3H等通常的RIA中可以使用的放射性同位素。作为荧光色素，可以使用异硫氰酸荧光素(FITC)或异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)等通常的荧光抗体法中可以使用的荧光色素。
使用这种抗体的方法，可以使用例如免疫染色，例如组织或细胞染色，免疫电子显微镜，免疫测试，例如竞争型免疫测试或非竞争型免疫测试，可以使用放射免疫测定法(RIA)，荧光免疫测定法(FIA)，发光免疫测定法(LIA)，酶免疫测定法(EIA)，ELISA法等，还可以进行B-F分离，或者也可以不进行分离就进行测定。优选是RIA，EIA，FIA，LIA，此外，还可以列举三明治型检测。三明治型检测中，还可以是同时三明治型检测，正向三明治型检测或反向三明治型检测等。
通过如上例示的方法，以GTRAP3-18基因的表达作为指标，可以鉴定使细胞内的GTRAP3-18蛋白质量减少的物质(也就是说，使细胞内谷胱甘肽量增加的物质)。
而且，使细胞内谷胱甘肽量增加的物质也可以通过探寻抑制GTRAP3-18蛋白质功能的物质来鉴定。GTRAP3-18蛋白质功能是例如抑制EAAC1活性。因此，在GTRAP3-18和EAAC1共存的细胞中，若EAAC1活性(谷氨酸输送)促进，则可以判定作为原因的待测物质抑制了GTRAP3-18的功能。而且，由于EAAC1活性的促进(GTRAP3-18功能的抑制)引起细胞内谷胱甘肽量的增加，因此还可以通过测定谷胱甘肽量判定GTRAP3-18功能的抑制。
以下，作为实施例，公开形成本发明基础的实验结果。
实施例1
通过在HEK293细胞中瞬间导入GTRAP3-18的反义寡核苷酸，可以使细胞内的GTRAP3-18量减少(图1)。接着，通过ThioGlo-1(Calbiochem公司)测定细胞内谷胱甘肽量。通过western印迹法确认了GTRAP3-18量的增加。使用导入了有义寡核苷酸的细胞作为对照组。
其结果是，在通过导入反义寡核苷酸使GTRAP3-18量减少的细胞中谷胱甘肽量，相对于对照组显著增加(图2)。
其结果显示，由于使GTRAP3-18量减少，可以使细胞内谷胱甘肽增加。
另一方面，一旦使甲基-β-环糊精(MeβCD)作用于HEK293细胞，则通过western印迹法确认了GTRAP3-18量比对照组有所增加(图1)。此时，细胞内谷胱甘肽量与对照组相比，显著减少(图2)。
此结果显示，通过使GTRAP3-18量增大，细胞内谷胱甘肽量减少。
根据以上结果，确认了以细胞内GTRAP3-18量的变化(或者GTRAP3-18的功能变化)作为指标，可以探寻可以使细胞内谷胱甘肽量增加的物质。
实施例2
在小鼠的脑室中施用针对GTRAP3-18的siRNA(10μg/h)。1周后，在海马细胞中，GTRAP3-18量与施加对照(缓冲液)时相比，显著减少(图3)。同样，测定在小鼠脑室内施用针对EAAC1的siRNA时的海马细胞中的EAAC1量，确认了EAAC1量通过该siRNA显著减少(图4)。
然后，这样一来，测定使GTRAP3-18量和EAAC1量减少的海马细胞中谷胱甘肽的量。即，将从海马组织中获得的提取液与含有EDTA(乙二胺四乙酸)，GSH还原酶，DTNB(5，5’-二硫代双-硝基苯甲酸)，NADPH的反应溶液混合后，测定412nm的吸光度。用GSH标准溶液的吸光度求出浓度后，用组织重量补正。
其结果示于图5，在使EAAC1量减少的小鼠海马细胞中谷胱甘肽量比对照中少，在使GTRAP3-18量减少的小鼠海马细胞中谷胱甘肽量相对于对照显著增加。
另一方面，若在小鼠脑室中施用甲基-β-环糊精(MeβCD)，则海马细胞中的GTRAP3-18量比对照组有所增加(图6)，而此时，海马细胞中谷胱甘肽量相较于对照组显著减少(图7)。
根据以上结果，确认了，即使以动物个体内的细胞作为对象，通过以对于GTRAP3-18表达的效果作为指标，也可以筛选使谷胱甘肽量增加的物质。

Claims (1)

1.一种使用体外细胞筛选使细胞内谷胱甘肽量增加的物质的方法，其特征在于使待测物质与表达GTRAP3-18蛋白质的体外细胞接触，将使GTRAP3-18蛋白质的表达量减少、或抑制GTRAP3-18蛋白质功能的物质鉴定为目的物质。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6342288B2 (ja) 2014-10-08 2018-06-13 学校法人帝京大学 ｍｉＲ−９６−５ｐ阻害剤とそのスクリーニング方法
CN110201173B (zh) * 2019-06-21 2020-11-10 周建伟 Jwa基因以及相关化合物的抗衰老用途
WO2023003052A1 (ko) * 2021-07-21 2023-01-26 경상국립대학교산학협력단 Arl6ip5 단백질을 유효성분으로 함유하는 항암제-내성 난소암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5723598A (en) * 1992-03-30 1998-03-03 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
CN1315395A (zh) * 2000-03-28 2001-10-03 上海生元基因开发有限公司 新的人谷胱甘肽结合转运因子及其编码序列
CN1401770A (zh) * 2002-09-29 2003-03-12 复旦大学 一种人氨基酸转运蛋白、其编码序列、制法及用途

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5010175A (en) 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5593853A (en) 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US5652223A (en) 1994-03-14 1997-07-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services DNA encoding CAI resistance proteins and uses thereof
US5525735A (en) 1994-06-22 1996-06-11 Affymax Technologies Nv Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
JPH10508186A (ja) 1994-08-16 1998-08-18 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション Ｇａ４ ｄｎａ、タンパク質および使用方法
US6004617A (en) 1994-10-18 1999-12-21 The Regents Of The University Of California Combinatorial synthesis of novel materials
US5569588A (en) 1995-08-09 1996-10-29 The Regents Of The University Of California Methods for drug screening
US5985365A (en) 1997-10-17 1999-11-16 Galvanizing Services Co., Inc. Method and automated apparatus for galvanizing threaded rods
US6808893B1 (en) 1999-10-23 2004-10-26 The Johns Hopkins University School Of Medicine Glutamate transporter associated proteins and methods of use thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5723598A (en) * 1992-03-30 1998-03-03 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
CN1315395A (zh) * 2000-03-28 2001-10-03 上海生元基因开发有限公司 新的人谷胱甘肽结合转运因子及其编码序列
CN1401770A (zh) * 2002-09-29 2003-03-12 复旦大学 一种人氨基酸转运蛋白、其编码序列、制法及用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BUTCHBACH M E R ET AL.Molecular cloning, gene structure, expression profile and functional characterization of the mouse glutamate transporter (EAAT3) interacting protein GTRAP3-18.《GENE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL》.2002,第292卷(第1-2期),81-90. *

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