KR101128640B1 - 간암 진단용 마커로서의 ｒｐｓ 14의 용도 - Google Patents
간암 진단용 마커로서의 ｒｐｓ 14의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 간암 진단용 마커로서의 RPS 14의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 RPS 14 유전자를 이용한 간암 진단용 마커, 이를 이용한 간암 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이 및 간암의 진단 방법에 관한 것이고, 또한 RPS 14 유전자 또는 단백질의 발현을 억제하여 간암을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법 및 상기 물질을 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 RPS 14 유전자는 비-간암의 조직 또는 세포에 비해 간암의 조직 또는 세포에서 발현양이 증가되는 것으로 확인됨에 따라 RPS 14 유전자를 간암 진단용 마커로 사용할 경우 간암을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 단지 환자의 혈액만으로도 정확한 진단이 가능하며 나아가 간암 치료제의 개발을 위한 표적으로 활용할 수 있는 효과가 있다.
RPS 14, 간암, 진단, 마커, 조성물, 키트, 마이크로어레이
Description
본 발명은 간암을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 신규한 간암 진단용 마커, 간암 진단용 조성물, 간암 진단용 키트, 마이크로어레이 및 상기 간암 진단용 마커를 이용한 간암의 진단 방법에 관한 것이다.
세계보건기구(WHO)가 발표한 최근의 한 보도에 따르면 2010년에는 암이 심장질환을 제치고 인류의 최대 사망원인이 될 것이라고 밝혔으며, 이와 관련해 IARC는 전 세계적으로 암 환자수가 꾸준히 증가하고 있는 가운데 2008년 한해 전 세계의 암 환자수는 1200 만명에 이르고 있고 암으로 인한 사망자는 700 만명에 이른다고 밝혔다.
간암은 세계적으로 발생 빈도가 높고 치명적인 암의 하나로, 매년 100 만명의 환자들이 간암으로 사망하고 있으며, 특히 한국 및 일본 등의 아시아에서 발생되는 가장 흔한 암이다(Parkin, et al., Int . J. Cancer, 80, 827-841, 1999, Luo et al., Basic Biology and Clinical Sciences 1 st Ed., pp. 435-445, 1997, Chen et al., J. Gastroenterol . Hepatol . 12, S294-308, 1997). 간암의 발생은 간 조직 에 B형 간염과 C형 간염 바이러스의 감염 및 아플라톡신 β1의 노출이 그 원인으로 보고되고 있으며(Bosch, et al., Semin. Cancer Dis . 19, 271-285, 1999, Luo, et al., Basic Biology and Clinical Sciences 1 st Ed., pp. 435- 445, 1997), TGF-α(transforming growth factor α) 및 TGF-β와 같은 몇 가지 생장인자(growth factor)들이 간암의 진행기작에 연관됨이 보고되고 있고, 암 억제인자로 잘 알려진 RB 및 p53 단백질도 간암 형성 과정에 중요한 역할을 수행하는 후보 유전자들로 밝혀졌다(Collier, et al., Liver , 13, 151-155, 1993, Naka, et al., Anticancer Res . 18, 555-564, 1998). 이 외에도 DNA 돌연변이와 유전자 발현의 유전적 변화(genetic alteration)등이 간암의 환자조직에서 확인된다는 보고가 있다(Park, et al., Cancer Res. 59, 307-310, 1999).
그러나 간암의 발병 기작에 대한 정확한 원인은 아직까지 밝혀지지 않고 있으며, 간암의 발병과 관련된다고 밝혀진 유전자들 또한 간암 환자들의 외적 특성과 임상 특성을 정확하게 반영하지 못하고 있다.
또한, 지난 수년간 암에 대한 원인규명, 진단방법 및 치료방법에 대한 집중적인 연구가 이루어졌음에도 불구하고 아직까지 암을 효과적으로 치료할 수 있는 확실한 치료제가 개발되지 못하고 있다. 따라서 암을 초기 단계에 발견하여 외과적 수술 또는 약물 치료에 의해 암세포를 제거하거나 성장을 억제하는 것이 가장 효과적인 방법이라 할 수 있다.
최근에는 암을 조기에 진단하기 위하여 종양 마커를 이용한 진단방법이 사용되고 있는데, 이는 종양 마커의 경우, 체내의 특정 암 세포에서 과발현되는 경우가 많기 때문에 종양 마커가 기준치 이상으로 발현되었다는 것이 확인되면 바로 특정 장기의 암을 진단할 수 있기 때문이다. 또한 종양 마커를 이용한 암의 진단은 대부분 항체를 이용한 혈액 검사방법으로 수행되고 있으며, 일부는 조직 추출액, 소변, 대변 등을 이용하여 검사하기도 한다. 그러나 종양 마커는 암이 발생하는 장소에 따라 그 종류가 다양하고, 사람에게 생기는 모든 암을 확인할 수 있는 종양 마커는 없으며, 진단이 가능한 종양 마커가 없는 암의 종류도 많다.
한편, 간암의 대표적인 종양 마커로는 알파-페토프로틴, 즉, 알파태아단백(Alpha-Fetoprotein:AFP)이 사용되고 있는데, AFP는 간세포가 형질전환되어 암세포로 탈분화 되었을 때 비정상적으로 생성되는 당단백질로서, 원발성 간암, 간염, 간경변 및 태아성암 등의 발견과 치료경과의 관찰에 이용되고 있다. 또한, 최근에는 이 외에도 DCP(Des-gamma carboxyprothrombin), PIVKA-II(prothrombin induced by vitamin K absence-II), AFP-L3(lens cularis agglutinin-reactive) 및 GPC3(glypican-3) 등이 간암을 진단할 수 있는지에 관한 연구가 진행되고 있다.
그러나 종래 사용되고 있는 AFP 간암 마커의 경우, 조기 간암 진단시 저감도 및 저특이성을 보이고 있으며, 간경변이나 간염의 악화시에도 발견되고 있어 조기의 간암을 특이적으로 진단하기에는 많은 문제점이 있다.
또한, 간암 치료를 위해 고주파 열 치료나 다양한 방사선 치료법이 개발되었으나 이러한 기술의 개발에도 불구하고 간암 발병 후의 장기 생존율은 매우 낮으며 수술 후에도 재발이 빈번히 발생하고 있다. 그러나 간암의 진단 시기에 따른 예후가 간암 발병 후의 생존율에 큰 영향을 준다는 보고가 발표된 이후 최근에는 간암 의 조기 진단 바이오 마커의 개발이 임상적으로 중요한 이슈로 대두되고 있다. 따라서 조기 간암의 진단율을 효과적으로 증가시킬 수 있는 새로운 종양 마커의 개발이 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은 간암을 조기에 진단할 수 있는 새로운 바이오 마커를 개발하던 중, 역전사 중합효소연쇄반응을 이용하여 간암 조직과 비-간암 조직에서 유전자의 발현 양상을 비교 분석 한 결과, RPS 14(ribosomal protein 14) 유전자가 비-간암 조직에 비해 간암 조직에서 차별적으로 발현이 증가된다는 사실을 확인하고 이를 조기 간암의 진단마커로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 RPS 14(ribosomal protein S14) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질로 이루어진 간암 진단용 마커를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 RPS 14(ribosomal protein S14) 유전자의 수준 또는 RPS 14 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트 및 간암 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 RPS 14 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하는 간암을 예측 및 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 간암을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
나아가, 본 발명의 다른 목적은 RPS 14 유전자의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 RPS 14(ribosomal protein S14) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 RPS 14 단백질로 이루어진 간암 진단용 마커를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RPS 14 유전자는 서열번호 1의 염기서열 을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 RPS 14(ribosomal protein S14) 유전자의 수준 또는 RPS 14 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RPS 14 유전자의 수준을 측정하는 물질은 RPS 14 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RPS 14 단백질의 수준을 측정하는 물질은 RPS 14 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은,
(a) 생물학적 시료에 존재하는 RPS 14 (ribosomal protein S14) 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 RPS 14 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 간암을 예측 및 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RPS 14 (ribosomal protein S14) 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은,
(a) RPS 14(ribosomal protein S14) 유전자 또는 RPS 14 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 RPS 14 유전자의 발현양, RPS 14 단백질의 양 또는 RPS 14 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, RPS 14 유전자의 발현양, RPS 14 단백질의 양 또는 RPS 14 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RPS 14 유전자의 발현양, RPS 14 단백질의 양 또는 RPS 14 단백질의 활성을 측정하는 방법은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것일 수 있다.
나아가, 본 발명은 RPS 14(ribosomal protein S14) 유전자의 염기서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 RPS 14 유전자는 비-간암의 조직 또는 세포에 비해 간암의 조직 또는 세포에서 발현양이 증가되는 것으로 확인됨에 따라 RPS 14 유전자를 간암 진단용 마커로 사용할 경우 간암을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 단지 환자의 혈액만으로도 정확한 진단이 가능하며 나아가 간암 치료제의 개발을 위한 표적으로 활용할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 RPS 14(ribosomal protein S14) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 RPS 14 단백질을 포함하는 신규한 간암 진단용 마커를 제공함에 특징이 있다.
기존에 간암 진단을 위해 사용되고 있는 대부분의 마커의 경우, 간암을 정확하게 진단하는 비율이 비교적 낮고 간암 이외의 다른 질병들과도 뚜렷한 구분을 보이지 않아 간암에 대한 예민도 및 특이도가 낮은 문제점이 있었다. 이에 본 발명자들은 새로운 간암 진단용 마커를 발굴하기 위해 간암 조직 및 비-간암 조직에서 발현의 차이를 보이는 유전자를 조사한 결과, 리보솜 단백질 S14인 RPS 14(ribosomal protein S14)가 비-간암 조직에 비해 간암 조직에서 과발현되는 것을 확인할 수 있 었으며(도 2 참조), 상기 RPS 14 유전자의 염기서열을 서열목록 1에 나타내었다.
한편, 리보솜 단백질(ribosomal protein)은 리보솜 입자에 포함된 단백질로서 세포질과 소포체에서 단백질의 합성에 관여하는 단백질로 알려져 있다. 리보솜 단백질은 고등 동,식물에서 세균에 이르기까지 거의 모든 세포에 존재하고 엽록체나 미토콘드리아에도 각각 고유한 리보솜 단백질이 존재하며, 다양한 종류의 단백질과 복합체의 형성 및 단백질의 합성 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 단백질의 합성이 세포 성장과 밀접한 관련성이 있다는 사실 및 리보솜 단백질의 한 종류인 RPS 14(ribosomal protein S14)가 비-간암 조직에 비해 간암 조직에서 과발현된다는 결과를 기초로 하여 상기 RPS 14 유전자가 간암의 발병을 진단 및 예측할 수 있는 바이오 마커로서 사용할 수 있음을 예상할 수 있었다.
또한, 상기와 같은 예상은 본 발명의 일실시예를 통해 더욱 확실하게 되었는데, 즉, 만성 간염 환자군, 간경변 환자군 및 간세포암 환자군의 조직 및 혈액에서 RPS 14 유전자의 발현양 및 단백질의 양을 정상군과 비교한 결과, 정상군에 비해 간암 환자의 경우 RPS 14 유전자의 발현양이 월등히 증가한 것을 확인할 수 있었다(실시예 6 참조).
따라서 본 발명은 RPS 14(ribosomal protein S14) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 RPS 14 단백질로 이루어지는 간암 진단용 마커를 제공한다.
본 발명에서, 상기“진단”이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 간암 진단 마커의 발현 유무를 확인하 여 간암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 “진단”은 간암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 간암의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.
또한, 상기 “진단용 마커(diagnosis marker)”란 간암의 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 간암의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 간암 진단용 마커는 정상 세포에 비해 간암의 세포에서 발현양이 증가하는 RPS 14 유전자 또는 단백질일 수 있으며, 바람직하게 상기 RPS 14 유전자는 서열번호 1로 기재된 염기서열을 갖는다.
또한, 본 발명은 RPS 14 유전자의 수준 또는 RPS 14 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 RPS 14 유전자의 수준은, 바람직하게 RPS 14 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 RPS 14 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 RPS 14 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1로 나타내는 RPS 14 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.
본 발명에서 상기“프라이머”란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에 서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 RPS 14 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 서열번호 2 및 3으로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다.
상기 “증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기“프로브”라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 RPS 14 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 RPS 14 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 “항체”를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 간암을 진단할 수 있는 마커 단백질로서 RPS 14 단백질이 규명되었으므로, 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하 게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 RPS 14 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
또한, 본 발명은 RPS 14 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 간암 진단용 키트에 포함되는 간암 진단용 조성물은 RPS 14 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.
본 발명의 간암 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 간암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은 RPS 14 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, RPS 14 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은 RPS 14 유전자의 발현수준 또는 RPS 14 단백질 수준을 측정하여 간암을 진단하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 (a) 생물학적 시료에 존재하는 RPS 14 (ribosomal protein S14) 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 RPS 14 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 상기에서 RPS 14 유전자의 발현수준 또는 RPS 14 단백질 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 간암 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 RPS 14 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.
상기 RPS 14 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 RPS 14 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 RPS 14 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 RPS 14 mRNA 발현양 또는 단백질의 양과 간암 환자 또는 간암 의심환자에서의 RPS 14 mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군과 비교함으로써 간암의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 간암 환자를 포함하는 간질환 환자의 혈액을 수득하여 상기 혈액에서 혈청을 분리한 다음, RPS 14의 항체를 이용한 ELISA 방법을 수행하여 각 환자의 시료로부터 RPS 14의 단백질 양을 측정한 다음, 상기 측정치를 대조군과 비교 분석하는 과정을 통해 수행하였다.
나아가 본 발명은 (a) RPS 14(ribosomal protein S14) 유전자 또는 RPS 14 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 RPS 14 유전자의 발현양, RPS 14 단백질의 양 또는 RPS 14 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, RPS 14 유전자의 발현양, RPS 14 단백질의 양 또는 RPS 14 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 먼저 RPS 14 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기“시료”는 RPS 14 유전자의 발현양, RPS 14 단백질의 양 또는 RPS 14 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 RPS 14 유전자의 발현양, RPS 14 단백질의 양 또는 RPS 14 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, RPS 14 유전자의 발현양, RPS 14 단백질의 양 또는 RPS 14 단백질의 활성이 감소되는 것이 측정되면 상기 시료는 간암을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판정될 수 있다.
상기에서 RPS 14 유전자의 발현양, RPS 14 단백질의 양 또는 RPS 14 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time- polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)등을 이용하여 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 RPS 14 유전자의 발현을 억제하거나 또는 RPS 14 단백질의 발현 및 활성을 감소시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 또는 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 RPS 14 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 RPS 14 mRNA에 상보적이고 RPS 14 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, RPS 14 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생 체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 "siRNA”용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(RPS 14 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(DRG2 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 RPS 14 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.
또한, 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.
또한, 상기 RPS 14 단백질의 발현 및 활성을 감소시키는 물질로서 RPS 14 단백질에 특이적인 항체를 사용할 경우, 상기 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 이에 제한되지는 않으나, 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide); 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물; 리신, 아브린, 디프테리아 등과 같은 독소; 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포(예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체; 및 자연적인, 즉, 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.
상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 “투여”란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투 여될 수 있다.
또한, 상기에서 “유효량” 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
간암 조직 및
비간암
조직으로부터 총
RNA
의 분리
본 발명자들은 간암을 조기에 진단할 수 있는 새로운 마커를 발굴하기 위해 가톨릭대학교 의과대학 강남성모병원에 내원하여 원발성 간세포암으로 진단 받고 수술을 받은 환자 3명을 대상으로 원발성 간세포암 조직 및 간암 조직 주위의 비-간암 조직 3쌍에 대한 샘플조직을 수득하였다. 수득한 상기 조직은 “생명윤리 및 안전에 관한 법률”과 Helsinki 선언에 따른 환자의 동의를 받고 사용하였다. 상기 수득한 간암 조직 및 비간암 조직은 각각 0.1g씩 막자사발에서 파쇄시킨 다음 트리졸 시약(인비트로젠) 1ml을 넣고 혼합하여 상온에서 5분간 방치하였다. 이후 0.2ml의 클로로포름을 첨가하여 잘 섞은 후 상온에서 2분간 방치한 다음, 4℃, 12000g에서 15분간 원심 분리하여 상층액을 새 튜브로 옮긴 후, 상기 상층액에 0.5ml의 이소프로판올을 첨가하여 혼합하고 실온에서 10분간 방치하였다. 이후, 다시 4℃, 12000g에서 10분간 원심 분리하여 RNA를 침전시키고 상층액을 제거하였다. 침전된 RNA에 1ml의 75% 에탄올을 잘 혼합한 후, 다시 4℃, 12000g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 실온에서 10분간 건조시켰으며, 건조된 RNA에 100ul의 증류수를 첨가하여 녹인 후 이중 1ul를 취하여 스펙트로미터로 흡광도를 측정하였고 1%의 아가로즈 젤을 전기영동하여 추출한 RNA의 순도를 관찰하였다.
<
실시예
2>
역전사
중합효소연쇄반응을
이용한
cDNA
의 합성
상기 실시예 1에서 추출한 간암 조직 및 비-간암 조직의 총 RNA에 대하여 역전사 중합효소연쇄반응을 수행하여 추출한 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 즉, 실시예 1에서 추출한 총 RNA 3ug을 mRNA의 poly A 부위에 특이적으로 결합하는 dT-ACP를 이용하여 42℃에서 역전사 반응을 수행하여 1차 가닥의 cDNA를 합성하였다. 상 기 역전사 반응은 3ug의 추출한 RNA에 4ul의 5× 반응 버퍼(프로메가, 미국), 5ul의 dNTP(각 2mM씩), 2ul의 10uM dT-ACP1(5'-CGTGAATGCTGCGACTACGATIIIIIT(18)-3'), 0.5ul RNasinRNase 억제제(40U/ul, 프로메가), 1ul의 M-MLV(Moloney murine leukemia virus) 역전사효소 (200U/ul, 프로메가)가 포함된 총 20ul의 반응용액을 42℃에서 90분 동안 반응시켜 수행하였으며, 합성된 cDNA는 180ul의 증류수로 희석한 후 하기의 실험들에 사용하였다.
<
실시예
3>
차별 발현
중합효소연쇄반응을
통한 간암 조직 특이적 발현 유전자 분석
상기 실시예 2에서 합성된 cDNA를 대상으로 GeneFishing DEG 키트(씨젠, 한국)를 사용하여 ACP-기반 PCR 방법을 통해 간암 조직과 비-간암 조직에서 차별 발현되는 유전자들을 분석하였다. 이를 위해, 상기 실시예 2에서 합성된 cDNA 5ng, 1ul의 dT-ACP2(10uM), 1ul의 10uM 임의의 ACP, 10ul의 2×마스터 믹스가 함유된 총 20ul의 반응용액을 94℃에서 1분, 50℃에서 3분, 72℃에서 1분 동안 반응시켜 상기 단일 가닥의 cDNA로부터 이중가닥의 cDNA를 합성하였다. 이후 합성된 이중가닥의 cDNA 증폭반응은 94℃에서 40초, 65℃에서 40초, 72℃에서 40초 및 72℃에서 5분 반응을 40회 반복수행 하였고, 반응 산물은 2%의 아가로스 젤에 전기영동하여 증폭산물을 확인하였다.
그 결과, 비-간암 조직에 비해 간암 조직에서 새롭게 발현되거나 증폭된 유전자 또는 소실되거나 감소된 유전자들이 발견되었으며, 이중 간암 조직과 비-간암 조직에서 최소 1.5배 이상의 발현차이를 보이는 밴드가 35개인 것을 확인할 수 있었다(결과 미도시).
<
실시예
4>
간암 조직 및
비간암
조직에서 발현된 유전자의 분석
상기 실시예 3에서 전기영동을 통해 간암 조직 및 비-간암 조직에서 유전자의 발현 양상이 큰 차이를 보이는 밴드 중, 비-간암 조직에 비해 간암 조직에서 월등히 과발현되는 하나의 밴드를 선택한 후, 이를 젤 추출 키트(퀴아젠)를 사용하여 분리하였고, TOPO TA 클로닝 벡터(인비트로젠, 미국)를 이용하여 상기 제조사에서 공지한 방법대로 유전자 클로닝을 수행하였다. 클로닝 후 발현된 유전자를 플라스미드 정제 키트를 사용하여 분리한 후, BigDye 3.1 버전 키트(어플라이드 바이오시스템, 미국)를 이용하여 염기서열을 증폭시키고 블라스트 프로그램을 이용하여 증폭된 염기서열을 분석하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 비-간암 조직에 비해 간암 조직에서 발현이 월등히 증가한 밴드에 대한 유전자의 염기서열을 분석한 결과, 리보솜 단백질 S14(ribosomal protein S14, RPS 14)인 것으로 나타났으며, 상기 유전자의 진뱅크 번호는 NM_001025070.1이었고, 이의 유전자의 염기서열을 서열번호 1에 기재하였다.
<
실시예
5>
실시간
중합효소연쇄반응을
이용한
RPS
14의 정량 분석
상기 실시예 4에서 비간암 조직에 비해 간암 조직에서 발현이 증가한 유전자로 발굴된 리보솜 단백질 S14(ribosomal protein S14, RPS 14)에 대하여 보다 정확한 발현율의 차이를 확인하기 위하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 상기 반응은 상기 실시예 1에서 추출한 총 RNA 2ug에 실시간 중합효소연쇄반응에 일반적으로 사용되고 있는 oligo-dT 프라이머를 넣고 역전사 반응을 수행하였다. 이후, 상기 역전사 반응으로 합성된 cDNA의 1/10을 주형으로 하고 하기에 기재된 서열로 이루어진 RPS 14를 증폭할 수 있는 서열번호 2 및 3의 프라이머쌍을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행함으로서 RPS 14 유전자의 발현정도를 정량분석 하였다. 이때, 상기 중합효소연쇄반응은 50°C에서 2분 및 95°C에서 2분 반응시킨 후, 95°C에서 15초 및 59°C에서 30초의 반응을 45회 반복 수행하였다.
서열번호 2의 프라이머 서열(RPS14-F)
5‘-ACCATATGCTGCTATGTTGGCTGC-3’
서열번호 3의 프라이머 서열(RPS14-R)
5‘-ATCCTCAATCCGCCCGATCTTCAT-3’
그 결과, 차별 발현 중합효소연쇄반응을 수행하였을 때와 같이 RPS 14의 발현양은 비-간암 조직에 비해 간암 조직의 경우, 약 2배 이상 과발현되는 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해, 본 발명자들은 비-간암 조직에 비해 간암 조직에서 과발현되는 RPS 14를 간암 진단을 위한 바이오마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
<
실시예
6>
간질환별 환자의 혈액에서
RPS
14의
발현양
분석
나아가 본 발명자들은 임상 시료에서 RPS 14의 발현양을 확인하는 방법을 통해 조기에 간암을 진단할 수 있는지를 조사하였다. 상기 임상 시료로는 가톨릭대학교 의과대학 강남성모병원에서 만성 간염환자, 간경변 환자 및 간세포암 환자로 판단 받은 환자들로부터 수득한 혈액을 사용하였으며, 대조군으로 정상인으로부터 수득한 혈액을 사용하였고, 상기 조사는 각 환자들로부터 수득한 혈액에서 혈청을 분리한 다음, RPS 14의 항체(Abcam ab50390)를 이용하여 당업계에 공지된 효소면역학적분석법(ELISA)을 통해, 각 환자의 혈청에서 발현된 RPS 14의 발현양을 비교 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 만성 간염환자의 경우, 혈청 내의 RPS 14의 발현양이 대조군인 정상군에 비해 더 많이 발현된 것을 확인할 수 있었다. 또한 혈청 내에 발현된 RPS 14의 양은 만성 간염환자에 비해 간경변 환자의 경우 더 증가한 것으로 나타났고, 간경변 환자에 비해서는 간세포암 환자의 경우가 더 많이 증가한 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해, 본 발명자들은 간질환이 간세포암으로 그 증세가 더욱 악화될수록 RPS 14의 발현양이 더욱 증가한다는 사실을 알 수 있었다. 또한, 만성 간염환자의 경우, 정상인 보다 RPS 14의 발현양이 더 많다는 사실을 통해 본 발명의 RPS 14가 간암을 조기에 검진할 수 있는 마커로 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 RPS 14의 발현수준을 측정하는 본 발명의 간암 진단 방법이 단지 환자의 혈액 또는 혈청만을 가지고도 충분히 수행할 수 있는 것을 확인함으로써 본 발명에 따른 간암 진단 방법은 조기의 간암을 매우 간편하고 정확하게 예측 및 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 간암 진단용 마커인 RPS 14를 발굴한 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 간암 조직 및 비-간암 조직에서 추출한 RNA를 주형으로 하고 RPS 14에 특이적인 프라이머를 사용한 중합효소연쇄반응을 수행하여 간암 조직 및 비-간암 조직에서의 RPS 14 유전자의 발현양을 비교한 사진이다.
도 3은 만성 간염환자, 간경변 환자, 간세포암 환자 및 대조군인 정상인으로부터 수득한 혈액을 대상으로 RPS 14의 발현양을 ELISA 방법을 이용하여 비교 분석한 그래프이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University
<120> Use of RPS 14 as a hepatocellular carcinoma diagnostic marker
<160> 3
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 787
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)..(787)
<223> RPS 14
<400> 1
ctccgccccc tcccactctc tctttccggt gtggagtctg gagacgacgt gcaggtagga 60
ggcccgggcg cgacaatcgg ggggcatcct gcggcgaggg gaccctgtgg ggcttgggac 120
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gcccacctgg atcctggcca actcgggatt gagttcgttc ctggtctcag aaggcccgtt 240
ttgctttcag ggaggagctt gtgaaaaatg gcacctcgaa aggggaagga aaagaaggaa 300
gaacaggtca tcagcctcgg acctcaggtg gctgaaggag agaatgtatt tggtgtctgc 360
catatctttg catccttcaa tgacactttt gtccatgtca ctgatctttc tggcaaggaa 420
accatctgcc gtgtgactgg tgggatgaag gtaaaggcag accgagatga atcctcacca 480
tatgctgcta tgttggctgc ccaggatgtg gcccagaggt gcaaggagct gggtatcacc 540
gccctacaca tcaaactccg ggccacagga ggaaatagga ccaagacccc tggacctggg 600
gcccagtcgg ccctcagagc ccttgcccgc tcgggtatga agatcgggcg gattgaggat 660
gtcaccccca tcccctctga cagcactcgc aggaaggggg gtcgccgtgg tcgccgtctg 720
tgaacaagat tcctcaaaat attttctgtt aataaattgc cttcatgtaa actgtttcaa 780
aaaaaaa 787
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RPS 14 F primer
<400> 2
accatatgct gctatgttgg ctgc 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RPS 14 R primer
<400> 3
atcctcaatc cgcccgatct tcat 24
Claims (11)
- 삭제
- 삭제
- 혈액 또는 혈청에 존재하는 RPS 14(ribosomal protein S14) 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 원발성 간세포암 진단용 조성물.
- 삭제
- 제3항에 있어서, 상기 RPS 14 단백질의 수준을 측정하는 물질은 RPS 14 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 원발성 간세포암 진단용 조성물.
- (a) 혈액 또는 혈청에 존재하는 RPS 14 (ribosomal protein S14) 단백질의 양을 측정하는 단계; 및(b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 RPS 14 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 원발성 간세포암 진단을 위한 정보제공 방법.
- 삭제
- 제6항에 있어서, 상기 측정은 웨스턴 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 원발성 간세포암 진단을 위한 정보제공 방법.
- 삭제
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