CN101412994B - 使用粒酶b蛋白酶切割融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
通过使用粒酶B蛋白酶(EC3.4.21.79)对融合蛋白进行酶切制备呈真实形式的目标多肽的方法。还提供了包含目标多肽和融合伴侣的融合蛋白，其中在目标多肽和融合伴侣之间的连接区包含紧邻目标多肽的粒酶B蛋白酶切割位点；还提供了人粒酶B蛋白酶变异体，其中第228号的(胰凝乳蛋白酶原编号)半胱氨酸残基突变为苯丙氨酸。
Description
本分案申请是基于申请号为200480014688.3，国际申请日为2004年04月23日，发明名称为“使用粒酶B蛋白酶切割融合蛋白”的中国专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及的是通过使用粒酶B(Granzyme B)蛋白酶对重组产生的融合蛋白进行酶切制备呈真实形式的目标多肽的方法。而且本发明涉及包含粒酶B切割位点的融合蛋白以及人粒酶B变异体。
本发明的背景和先有技术
一般在蛋白质工程，特别是在制药领域中，以高度纯化和经过充分研究的形式制备和纯化重组多肽例如药物蛋白，已经成为一项主要任务。
制备这种重组多肽常常依赖的技术涉及以融合或者杂合蛋白形式生产多肽，其中目标蛋白质或者多肽与载体或者融合伴侣(如多肽或者蛋白质)相融合。
与目标多肽融合的融合伴侣或者载体的存在具有以下优势：它可以使融合蛋白具有更高的抗蛋白酶降解能力；可以促进表达和分泌；可以提高溶解度并使融合蛋白能够进行随后的亲和纯化。而且，通过融合蛋白表达，可能具有生物危害的物质例如肽类激素，可以以无活性的形式产生，然后在体外通过切除融合伴侣使其激活。
但是这种融合蛋白自身通常并不适宜作为最终产物，原因有融合伴侣可能影响目标多肽的生物活性或者稳定性，并且如果将要在临床使用该蛋白，可能会产生抗原性问题。因此有必要切除融合蛋白以释放目标多肽。
原则上这可以通过化学方法或者生化方法例如酶切来实现。但是重要的是切割是高度特异的，且只发生在目标多肽和融合伴侣之间的切割序列处，即连接区，但优选地不在目标多肽自身的内部，因为这可能会例如严重影响目标多肽的生物活性。这种方法使用的试剂通过肽键的水解发生作用，且切割试剂的特异性决定于位于或者靠近被切割肽键的氨基酸残基的特性。
切割融合蛋白的生化方法是以蛋白酶(蛋白水解酶)的使用为基础的。但是如果切割位点特异的氨基酸同时出现在目标多肽自身的内部，则融合蛋白的酶切就受到限制。因此，为了达到切割的目的，酶不仅仅识别氨基酸，而是识别氨基酸序列，这才是特别适宜的，因为识别和切割切割序列所需的氨基酸数目越多，该氨基酸序列除了在目标多肽和融合伴侣之间存在以外还能够再次出现在目标多肽内部的概率就越低。
迄今为止已有数个蛋白酶用于融合蛋白的酶切，切割方法是使融合蛋白与蛋白酶在适当条件下接触。
WO03/010204涉及的是使用泛素切割酶从融合蛋白上分离多肽，根据此发明，泛素切割酶切割与在蛋白质(例如泛素)C端RGG氨基酸序列相邻的肽键。
US6,010,883公开了一种方法，其中使用凝血因子Xa(EC3.4.21.6；通过对酶原因子X进行有限蛋白酶解形成的S1丝氨酸型肽酶)将融合伴侣从融合蛋白上切除。该蛋白酶在氨基酸序列X-Y-Gly-Arg之后进行特异切割，其中X是Ile，Leu，Pro或Ala，Y是Glu，Asp，Gln或Asn。Xa因子优选地在切割序列Ile-Glu-Gly-Arg之后切割。
在特异切割融合蛋白的方法中建议和使用的其它先有技术中的酶包括烟草蚀纹病毒NIa蛋白酶、胶原酶、肠激酶、枯草杆菌蛋白酶和凝血酶。
但是，在融合蛋白系统中使用蛋白酶切割可能会遇到许多问题。一个主要的问题是对融合蛋白的非特异蛋白水解，这会导致在几个不同位置的切割，结果使产物丢失，产生污染性的片段。而且目前已知的酶经常会出现使融合蛋白不充分或者不完全切割。这种不充分切割使产量下降，并且可能在纯化的蛋白中引入异质性，导致目标蛋白只有一小部分被回收。
另一个与许多目前在融合蛋白切割上应用的酶相关的问题是切割后的多肽产物(目标多肽)上经常连有假的或外来的氨基酸。当衔接物被切掉时通常会存在这些氨基酸，无关的氨基酸残基可能对产生的目标多肽的性质有所影响。这对于用于为治疗人类疾病生产的蛋白来说可能是至关重要的。因此，非常需要产生没有外来氨基酸短序列或者残基的真实的纯多肽。
目标多肽在切割后仍然残留外来氨基酸的问题在美国专利4,543,329中予以阐释，该专利描述了使用胶原酶对融合蛋白进行选择性切割的过程。但是，使用这种酶在目标多肽的N端引入了外来氨基酸序列Gly-Pro。为了获得真实形式的目标多肽，随后必须通过使用一种或者更多不同的氨肽酶(例如氨酰色氨酸氨肽酶和色氨酸氨肽酶)在另一个反应步骤中除去这些外来氨基酸(Gly和Pro)。
这一问题还在美国专利5,427,927中予以阐释，该专利描述了使用IgA蛋白酶对融合蛋白进行序列特异切割的过程，其中IgA蛋白酶的识别位点被插入到融合蛋白的连接区，随后用IgA蛋白酶切割融合蛋白。IgA蛋白酶的识别位点是氨基酸序列Y-Pro↓X-Pro，其中X可以是任何氨基酸，Y可以是一个或者几个任意的氨基酸，↓指明了切割位点。但是在使用IgA蛋白酶切割后形成的目标蛋白在其N端具有X-Pro外来氨基酸序列，即产生的目标多肽并不以其本来或者真实的形式存在。
目前用于融合蛋白切割的最广泛使用的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶因子Xa和凝血酶。但是，已知这两种酶对融合蛋白都有非特异性切割。此外，因子Xa需要从牛血清中分离，所以在治疗性应用中用Xa因子切割蛋白之后需要进行大量的纯化和分析以检测可能存在的病原性因子如病毒和朊病毒(例如导致牛海绵状脑病的朊病毒)。而且，这些酶相当昂贵。
考虑到先有技术的缺点和不足之处，因此本发明的目的是提供一种改进的方法用于切割融合蛋白。
本发明的发明者发现可以通过使用粒酶B蛋白酶(EC3.4.21.79)用于切割融合蛋白从而克服上述技术问题。因此，令人惊讶地发现粒酶B蛋白酶可以对具有粒酶B蛋白酶切割位点的融合蛋白进行高效的切割，并且具有高度的切割特异性。特别是已经证明粒酶B蛋白酶与目前广泛使用的蛋白酶因子Xa相比对融合蛋白具有更高的特异性切割。而且已经发现粒酶B在切割具有粒酶B识别序列的融合蛋白(粒酶B识别序列的位置位于N端融合伴侣和C端目标多肽之间，其中切割位点紧邻目标多肽)时产生的目标多肽没有来自切割位点的外来氨基酸，即产生的是真实形式的多肽。这样可以通过粒酶B切割融合蛋白产生具有本来氨基酸序列的重组目标蛋白。而且，粒酶B蛋白酶还可以通过重组制备，这也是它的优势。最后还发现将人粒酶B中的第228号氨基酸(胰凝乳蛋白酶原编号)半胱氨酸替换为苯丙氨酸，在制备重组人粒酶B时可以得到更高的最终蛋白质回收。
发明概述
因此本发明涉及的首先是制备真实形式目标多肽的方法。该方法包含以下步骤：(i)提供融合蛋白，其按N端到其C端的顺序包含(a)融合伴侣，(b)包含粒酶B蛋白酶切割位点的粒酶B蛋白酶识别位点以及(c)目标多肽，其中所述的切割位点紧邻目标多肽；和(ii)使所述融合蛋白与粒酶B蛋白酶(EC3.4.21.79)接触以在所述切割位点处切割产生真实形式的所述目标多肽。
另一方面提供了融合蛋白，其按N端到其C端的顺序包含(a)融合伴侣，(b)包含粒酶B蛋白酶切割位点的粒酶B蛋白酶识别位点以及(c)目标多肽，其中所述的切割位点紧邻目标多肽。
还提供了一个人粒酶B蛋白酶变异体，其中第228号的氨基酸(胰凝乳蛋白酶原编号)半胱氨酸突变为苯丙氨酸。
另一些方面本发明提供了编码这样的融合蛋白或者人粒酶B蛋白酶变异体的分离的核酸序列，包含该分离的核酸序列的重组载体，使用这种载体转化的宿主细胞，以及制备融合蛋白或者人粒酶B蛋白酶变异体的方法，该方法包含以下步骤：(i)提供有效连接于启动子的重组载体；(ii)使用该重组载体转化宿主细胞；(iii)在表达融合蛋白的条件下培养宿主细胞；以及(iv)选择地分离融合蛋白或者人粒酶B蛋白酶变异体。
发明详述
一方面本发明涉及的是通过酶切融合蛋白制备真实形式目标多肽的方法。因此，根据上面提及的，该方法包含提供融合蛋白的步骤，该融合蛋白按照从其N端到其C端的顺序包含融合伴侣、包含粒酶B蛋白酶切割位点的粒酶B蛋白酶识别位点以及目标多肽，其中切割位点的位置紧邻目标多肽。随后使融合蛋白与粒酶B蛋白酶接触，以在粒酶B蛋白酶接切割位点处切割产生真实形式的目标多肽。在此使用的术语“融合蛋白”指包含来自至少两个不同蛋白的蛋白结构域的多肽。
根据本发明，提供一种制备真实形式目标多肽的方法。根据这里所使用的，术语“真实形式”指的是包含多肽自身氨基酸序列的多肽而没有任何额外的氨基酸残基。正如上面所述，与许多目前在融合蛋白切割上应用的酶相关的问题是切割后的多肽产物上经常连有假的或外来的氨基酸，即产生的多肽并不以其“真实形式”存在。因此，在此上下文中，真实形式的目标多肽所指的多肽，其氨基酸一级序列与编码目标多肽的本来基因序列所编码的氨基酸序列相同，即该多肽不含有任何非本来排列的氨基酸。术语“本来基因序列”不一定是天然存在的基因序列，它也可以是部分或者全部人工的序列。类似地应当理解真实形式的目标多肽不一定是天然存在的多肽，它也可以是部分或者全部人工的。相反，“非真实”的多肽含有的氨基酸中至少有一个不是编码目标多肽的本来基因序列所编码的。
根据本发明，目标多肽和融合伴侣之间的连接区包含粒酶B蛋白酶识别位点，它具有粒酶B蛋白酶切割位点。这样的识别位点指的是确定的氨基酸序列，它能够被粒酶B的识别并且在融合伴侣和目标多肽之间的连接区被切割。因此切割位点应当被理解为氨基酸序列的两个氨基酸之间、发生融合蛋白切割的位点。连接区的形式可以是任何适宜长度的不属于目标多肽的衔接物序列。但是为了得到真实形式的目标多肽，粒酶B切割位点的位置紧邻目标多肽的N端，目的是使融合蛋白在N端被特异切割而不会导致假的或者外来的氨基酸仍然附着在产生的目标多肽上。因此，术语“紧邻”暗示粒酶B识别序列(在一些实施方案中识别序列前面是一个衔接物序列或者识别序列自身是衔接物序列的一部分)所处的位置使粒酶B切割位点在目标多肽N端的侧旁。
粒酶是储存于颗粒中的丝氨酸蛋白酶，它们参与靶细胞识别后T细胞和自然杀伤细胞介导的细胞毒性防御反应。粒酶的主要功能是诱导病毒侵染的细胞和其他有潜在危害的细胞的死亡。粒酶B是粒酶的一种类型，在与靶细胞接触后它被定向地分泌到细胞外，并在穿孔素(一种由细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞表达的溶细胞蛋白)的协助下进入靶细胞。粒酶B处理和激活各种不同的半胱天冬酶原，这样诱导靶细胞程序性死亡。根据本发明，术语“粒酶B蛋白酶”(这里也被称为GrB)包括属于或者可能属于酶命名数据库第34期，2004年2月(http://www.expasy.org/enzyme)中酶学委员会编号EC3.4.21.79的酶。因此根据本发明任何适宜的粒酶B蛋白酶都可以使用，包括人粒酶B蛋白酶，小鼠粒酶B蛋白酶和大鼠粒酶B蛋白酶。当根据本发明的方法用于制备人治疗性蛋白产物时，一般优选使用人粒酶B蛋白酶。人粒酶B蛋白酶在大多数人组织中都存在，在那里它们的生物学功能是众所周知的。因此在最终的治疗性蛋白产物中存在痕量的残留粒酶B蛋白酶对施用该治疗性蛋白产物的病人表现为最小的风险。因此已知如果有活性的粒酶B蛋白酶注射到人血流中，它会迅速地被α-2-巨球蛋白所捕获，然后该复合体通过LRP清除受体被清除。粒酶B蛋白酶还有另外一个名字是“细胞毒性T淋巴细胞蛋白酶2”。
已知粒酶B蛋白酶优先选择在天冬氨酸(D)残基之后切割，且粒酶B是已知的哺乳动物丝氨酸蛋白酶中唯一具有这种P1蛋白水解特异性的酶。因此根据本发明设想在有用的实施方案中的粒酶B切割位点在切割位点N端的P1位置至少包含一个天冬氨酸残基。一些目前已知的粒酶B蛋白酶识别位点在Harris等人(1998)中予以公开。因此在有用的实施方案中，识别位点的氨基酸序列具有以下的通式：切割位点的N端为P4P3P2P1↓，其中P4优选的氨基酸为I或V，P3优选的氨基酸为E，Q或M，P2是X，X代表任何氨基酸，P1优选的氨基酸是D，↓是粒酶B蛋白酶的切割位点。
本发明的发明人发现粒酶B蛋白酶能够从融合蛋白上切掉目标多肽而不会在目标多肽上留下任何非本来氨基酸。特别是令人惊奇地发现粒酶B蛋白酶能够从融合蛋白上的P1位置之后识别和切掉多肽，而对P1′-P4′位置，即切割位点后的氨基酸位置的特异氨基酸残基没有任何严格限制。这与先前技术中的发现相反。在例如Sun等人(2001)中，结论是粒酶B底物的P1′-P4′残基对于底物结合是重要的，当存在酸性P4′残基(即天冬氨酸或者谷氨酸)时，可以观察到最高的底物亲和性。此外，Harris等人(1998)的结论是粒酶B对P2′位置上的甘氨酸残基具有强的优选选择。虽然有这些先前技术的发现，但现在已经确定粒酶B蛋白酶一般可以用于从融合蛋白上切除目标多肽，而不需要在P1′-P4′位置上有特异的氨基酸残基。
正如上面提及的，本发明另一个特别的优势是发现粒酶B蛋白酶使具有位于目标多肽N端的粒酶B蛋白酶切割位点的融合蛋白被高效切割，并且具有高度的切割特异性。特别是已经发现粒酶B蛋白酶与目前广泛使用的用于融合蛋白切割的蛋白酶，即Xa相比对融合蛋白具有更高的特异性切割。因此发现当五个以前作为可被Xa因子切割而制备的不同融合蛋白在使用粒酶B蛋白酶切割时，得到的切割结果与因子Xa切割的特异性相当或者更高，正如从以下实施例中可以清楚地看到的那样。这可以从例如实施例8以及相伴随的图11中看到，实施例8和图11对使用因子Xa和粒酶B分别消化融合蛋白H6-IEGR-RAP和H6-IEPD-RAP，不同时间取样进行PAGE分析。从该实验可以清楚地看到，30分钟以后使用两种蛋白酶融合蛋白都基本上被完全切割。但是使用Xa因子比使用粒酶B产生了更多的降解产物。这明显说明粒酶B是高度特异的，特异性甚至高于广泛使用的蛋白酶因子Xa。发现粒酶B既能够从目标多肽上切除相当短的N端标签例如六聚组氨酸尾，又能够在被一个短衔接物序列非常紧密连接的融合伴侣和目标多肽之间产生切割，这里进一步证明了粒酶B高度的多能性和巨大的灵活性。
尽管不是必需的，但是在某些实施方案中最好对目标多肽进行选择，这样如果目标多肽是融合蛋白的一部分时，目标多肽的N端包含氨基酸P1′和P2′，产生粒酶B识别位点的通式P4P3P2P1↓P1′P2′，其中P1′是X，X表示任何氨基酸，而P2′是G。尽管粒酶B蛋白酶对于P1′位置的氨基酸没有严格的限制，但是在此位置一般优选选择大的疏水性氨基酸，包括Trp(T)，Leu(L)，Phe(F)和Ile(I)。这样，在一个有用的实施方案中，P1′位置的氨基酸选自T，L，F和I。在某些实施方案中在P2′位置不包括Pro(P)可能是有利的。本发明的另一个方面对目标多肽进行选择可能是有利的，这样如果目标多肽是融合蛋白的一部分时，目标多肽的N端P4′位置包含酸性氨基酸例如D或E。
在本发明的上下文中，术语“氨基酸”和“氨基酸残基”指的是全部天然存在的L-α-氨基酸。这个定义意味着包括正亮氨酸、鸟氨酸和高半胱氨酸。氨基酸通过三字母或者单字母名称进行确定
Asp，D：天冬氨酸 Ile，I：异亮氨酸
Thr，T：苏氨酸 Leu，L：亮氨酸
Ser，S：丝氨酸 Tyr，Y：酪氨酸
Glu，E：谷氨酸 Phe，F：苯丙氨酸
Pro，P：脯氨酸 His，H：组氨酸
Gly，G：甘氨酸 Lys，K：赖氨酸
Ala，A：丙氨酸 Arg，R：精氨酸
Cys，C：半胱氨酸 Trp，W：色氨酸
Val，V：缬氨酸 Gln，Q：谷氨酰胺
Met，M：甲硫氨酸 Asn，N：天冬酰胺
Nle，J：正亮氨酸 Orn，O：鸟氨酸
Hcy，U：高半胱氨酸 Xxx，X：任何L-α-氨基酸.
在另外的有用实施方案中，粒酶B蛋白酶的识别位点具有的氨基酸序列选自：ICPD↓，IEAD↓，IEPD↓，IETD↓，IQAD↓，ISAD↓，ISSD↓，ITPD↓，VAPD↓，VATD↓，VCTD↓，VDPD↓，VDSD↓，VEKD↓，VEQD↓，VGPD↓，VEID↓，VRPD↓，VTPD↓，LEED↓，LEID↓，LGND↓，LGPD↓，AQPD↓，其中↓是粒酶B的切割位点。这些识别和切割位点以前被Casciola-Rosen等人(1999)有所描述。
根据本发明，术语“目标多肽”或者“所需的多肽”指的是在融合蛋白内需要表达出来的多肽。正如在这里所使用的，术语“多肽”不一定对所需目标多肽的大小提出限制，因此，这个术语应按照其最广义来理解，这样就包括直至50或者更多氨基酸的多肽，包括寡肽如二、三、五和六肽，多肽和蛋白质。目标多肽可以是中间产物或者最终产物，例如可以用于医药领域、研究领域、环保领域或者在工业过程或产物中。正如前面所描述的，在融合蛋白中目标多肽与另外一个蛋白或者蛋白质结构域即融合伴侣相连或者融合，目的是例如提高目标多肽的稳定性以及便于融合蛋白的纯化。在有用的实施方案中目标多肽是蛋白例如分泌蛋白。分泌蛋白具有各种不同的工业应用，包括药物和诊断学。目前可以获得的多数蛋白质药物例如溶栓药剂、干扰素、白介素、红细胞生成素、集落促生长因子以及多种不同的其他细胞因子都是分泌型蛋白。在有用的实施方案中，目标多肽是多肽激素例如生长激素、胰高血糖素、胰岛素或者干扰素、单链抗体可变区片段(scfv)，或者载脂蛋白如载脂蛋白a-i(apoA-I)，载脂蛋白A-II，或载脂蛋白A-IV。
在本发明的另一方面中，目标多肽是一种酶，例如粒酶B。这样，通过提供根据本发明的融合蛋白并且选择粒酶B蛋白酶作为目标多肽，就提供了自我激活的粒酶B蛋白酶，它提供了这样一种可能性，即提供无活性的粒酶B原，随后原则上只要加入一分子的活性粒酶B蛋白酶就可以使粒酶B酶原被激活。这样就可以提供不需要依赖外加例如外源激活剂生物物质来激活的粒酶B原。正如下面的实施例中可以清楚看到的那样，发现粒酶B自我激活是定量进行直至完成的，且自我激活的粒酶B蛋白酶样品继续孵育几天后发现仍然保持稳定的活性水平并且只产生微量的自体分解产物。这清楚地证明了粒酶B蛋白酶自我激活的优势是对自体分解(cannibalism)具有高度稳定性，如实施例5和图3所示。
根据本发明，融合伴侣可以是任何适宜的类型，只要它是一种肽、寡肽、多肽或者蛋白质即可，包括四肽、五肽以及六肽。可以对其进行选择使融合蛋白对蛋白降解具有更高的抵抗力、有助于表达的提高以及融合蛋白的分泌、提高可溶性并且使融合蛋白随后用于亲和纯化。
本发明的融合蛋白在有用的实施方案中可能包含融合伴侣，它是一种亲和标签。这种亲和标签可能是例如一个亲和结构域，它可以使融合蛋白的纯化在亲和树脂上进行。亲和标签还可以是多聚组氨酸标签包括六聚组氨酸标签、多聚精氨酸标签、FLAG标签、Strep标签、c-myc标签、S-标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合肽、几丁质结合结构域、谷胱甘肽硫转移酶标签或者麦芽糖结合蛋白。
正如上面提到的可以根据本发明使用任何适宜的粒酶B蛋白酶，包括人粒酶B蛋白酶、小鼠粒酶B蛋白酶和大鼠粒酶B蛋白酶。但是从以下的实施例中可以看出，发现将人粒酶B中的第228号氨基酸(胰凝乳蛋白酶原编号)半胱氨酸替换为苯丙氨酸，得到人粒酶B蛋白酶变异体，在制备人粒酶B时可以得到更高的最终蛋白质收率，而却没有对切割特异性或者产生的粒酶B的活性有任何可观察到的程度的影响。这一发现与以前的预期相左，因为苯丙氨酸(芳香氨基酸)与半胱氨酸(亲水性氨基酸)在化学上相差很大，所以一般不考虑用它来替代半胱氨酸。这样在现在的优选实施方案中，根据本发明的粒酶B蛋白酶是人粒酶B蛋白酶变异体，其中第228号氨基酸(胰凝乳蛋白酶原编号)半胱氨酸突变为苯丙氨酸。应当理解术语“人粒酶B蛋白酶变异体”还包括在第228号氨基酸(胰凝乳蛋白酶原编号)半胱氨酸突变以外的变异体，在天然人粒酶B蛋白酶全长序列或者不同结构域中具有进一步变异的变异体，例如粒酶B蛋白酶变异体，其中在全长的天然粒酶B氨基酸序列的N或C端加入或者删除了一个或者更多氨基酸残基。例如使用本领域内已知的任何保守和非保守突变的技术和指导方针可以进行这样的进一步的变体。变体可以是编码人粒酶B蛋白酶的一个或者更多密码子的替换、删除或者插入，其结果是与天然的人粒酶B蛋白酶序列相比人粒酶B蛋白酶的氨基酸序列发生改变，优选地，改变对人粒酶B蛋白酶特异性和/或活性没有负面的影响。而且“人粒酶B蛋白酶变异体”的含义中也包括了全长的天然粒酶B氨基酸序列(例如激活的具有第228号半胱氨酸残基突变的形式)的片段。在一个有用的实施方案中，粒酶B蛋白酶变异体是序列编号57显示的变异体。
一般地，融合伴侣的选择通常依据的是使分离简化的性质，最合意的是那些由产生融合蛋白的微生物容易地分泌出来的融合伴侣。例如多聚组氨酸序列、谷胱甘肽硫转移酶以及麦芽糖结合蛋白一般是优选的，因为有现成的结合它们并且进行洗脱的亲和层析柱。
根据本发明的方法在有用的实施方案中可以包括一个随后的分离步骤，用于分离通过融合蛋白酶切产生的目标多肽。这一分离步骤可以通过任何本领域内已知用于蛋白质分离的适宜方法进行，包括使用离子交换、按照大小进行分级和亲和纯化，层析的选择取决于目标多肽的性质。因此为了用于亲和纯化的目的，目标多肽还可以例如包括一个C端连接的亲和标签，目的是使用上述提及的亲和标签系统分离产生的目标多肽。
根据本发明，融合蛋白与粒酶B蛋白酶相接触，以在紧邻目标多肽的粒酶B蛋白酶切割位点处切割融合蛋白，产生真实形式的目标多肽。这一反应可以使用游离的粒酶B分批进行，或者使用固定化形式例如通过吸附、共价结合、截留或者膜限制固定的粒酶B蛋白酶。用于固定粒酶B蛋白酶的适宜载体包括常规载体例如聚丙烯酰胺、几丁质、葡聚糖、κ角叉胶、硅藻土和纤维素。通过共价偶联到不溶性的基质上对酶进行固定化是广泛使用的技术。在使酶共价结合到不溶性支持物方面，赖氨酸残基是最常使用的基团，原因是广泛暴露的表面和高度的反应性。因此在有用的实施方案中，粒酶B蛋白酶通过赖氨酸残基被固定化。另一方面，粒酶B蛋白酶通过其C端被固定化，例如通过多聚组氨酸标签(包括六聚组氨酸标签)。该反应还可以通过游离的粒酶B蛋白酶与膜类型的生物反应器联合使用来进行，或者使用连续类型的生物反应器以及固定化的粒酶B蛋白酶。
正如从以下实施例中可以清楚看到的那样，令人惊奇地发现如果包含一个多聚组氨酸融合伴侣(例如六聚组氨酸)的游离的融合蛋白(即非固定的)在Ni2+离子和氨三乙酸(NTA)的存在下与粒酶B蛋白酶接触，则其切割所需的时间会显著减少。考虑这一切割速度的显著提高主要原因是镍离子与融合蛋白的N端的多聚组氨酸融合伴侣结合并且有助于粒酶B蛋白酶接触到切割位点。此外还考虑到加入NTA会在溶液中包围在镍离子之外，正如在Ni2+-NTA琼脂糖层析柱上的方式一样，这样就避免融合蛋白以及产生的蛋白出现沉淀。当进行这样的切割过程时，一般优选的镍离子浓度范围是1-20mM，NTA的浓度范围是1-20mM。此外，优选的温度范围是15-50℃，包括20-45℃的范围。在一个优选的实施方案中，温度范围是20-30℃，例如大约23℃。在另一个略不优选的实施方案中，温度范围是30-45℃，例如大约37℃。最佳的温度范围可以对每一个融合蛋白分别确定，因为这部分地取决于在不同温度下融合蛋白的稳定性。
根据本发明，已经如上面有所描述的，还提供了融合蛋白，其按N端到其C端的顺序包含(a)融合伴侣(b)包含粒酶B蛋白酶切割位点的粒酶B蛋白酶识别位点以及(c)目标多肽，其中所述的切割位点紧邻目标多肽。在有用的实施方案中，目标多肽是粒酶B，这样就提供了自体激活的粒酶B蛋白酶。特别地，提供了自体激活的人粒酶B酶原融合蛋白，从其N端到其C端的顺序包含具有粒酶B识别位点和切割位点的七氨基酸残基的原序列，之后是激活的人粒酶B氨基酸序列，最后是与粒酶B的C端融合的六聚组氨酸标签(H6)。因此粒酶B切割位点紧邻激活的粒酶B氨基酸序列的Ile16(胰凝乳蛋白酶原编号)。更为特别的是，提供了人自体激活粒酶B融合蛋白pro-IEPD-GrB-H6(序列编号2)和pro-IEAD-GrB-H6(序列编号3)。而且还如前面描述的，发现将第228号残基半胱氨酸(胰凝乳蛋白酶原编号)通过定点突变替换为丙氨酸(A)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)或者苯丙氨酸(F)是有益的。在其他有用的实施方案中提供的自体激活融合蛋白选自以下各项组成的组：pro-IEPD-GrB-H6 C228A(序列编号5)，pro-IEPD-GrB-H6 C228T(序列编号6)，pro-IEPD-GrB-H6 C228V(序列编号7)，和pro-IEPD-GrB-H6 C228F(序列编号8)。
融合蛋白或者本发明的粒酶B蛋白酶变异体可以在任意适宜的标准蛋白质表达系统中通过培养用编码融合蛋白的载体转化的宿主(培养条件是融合蛋白被表达)进行表达。优选地，表达系统是使目标融合蛋白能够在体外容易地分离和重折叠的表达系统。一般来讲，优选原核表达系统，因为可以得到高产量的蛋白，并且有有效的纯化和重折叠策略。但是，可以选择许多宿主细胞作为转化和表达所描述融合蛋白的适宜宿主，包括特别适宜的哺乳动物、昆虫、真菌和细菌宿主细胞。通常使用的细菌菌株包括芽孢杆菌和埃希氏菌，包括大肠杆菌。这样，选择适宜的或者中意的宿主和表达系统，完全是在具有技术从业人员的能力和判断力之内，而不需要过度的实验。类似地，一旦选定了本发明融合蛋白的一级氨基酸序列，本领域内具有普通技术的人员可以很容易地设计出编码本发明融合蛋白或者粒酶B蛋白酶变异体的适当的重组核酸序列或者DNA构建体，同时考虑到的因素包括所选宿主中的密码子偏好、宿主中对分泌信号序列的需要、信号序列中蛋白酶切割位点的引入等等。这些重组DNA构建体可以按照阅读框插入到众多适宜于所选宿主的载体的任何一个中。适宜和中意的表达载体的选择也完全在具有技术从业人员的能力和判断力之内。优选地，表达载体包括强启动子，以引导重组构建体的表达。
最后，提供了一种生产根据本发明的融合蛋白或者粒酶B蛋白酶变异体的方法，包括如下步骤：(i)提供重组载体，该载体包含有效连接于启动子的编码本发明的融合蛋白或者粒酶B蛋白酶变异体的分离的核酸序列；(ii)使用该重组载体转化宿主细胞；(iii)在表达融合蛋白的条件下培养宿主细胞；以及(iv)选择性地分离融合蛋白或者粒酶B蛋白酶变异体。
现在通过在以下非限制性的实施例和图片进行举例说明来描述本发明。
附图描述
图1显示了GrB-H6与FXa孵育几天的活性，使用以下的显色试验：500μl缓冲液(100mM NaCl，50mM Tris-HCl pH8.0)，4μl 100mMAc-IEPD-pNA和5μl GrB-H6。100μl GrB-H6(大约10μg)和1μl FXa(1mg/ml)的混合物置于4℃孵育，在0小时、2小时、5小时、19小时、2天和5天后测定活性。
图2显示GrB-H6和GrB-H6 C228F对几个显色底物的活性：Ac-IEPD-pNA，Ac-LEED-pNA，Ac-VEID-pNA，Ac-YVAD-pNA，和Ac-DEVD-pNA。活性试验在500μl 100mM HEPES pH7.75中进行，底物浓度为400μM，每一次测定加入1μg蛋白酶。所有测定在23℃下进行，且测定3次，通过设置Ac-IEPD-pNA测得的活性为100％，对所有得到的活性进行标准化。
图3(A)显示在100mM HEPES pH7.4下，于4℃，23℃，和37℃孵育的GrB-H6 C228F样品的SDS PAGE结果。
A-N泳道的样品描述：
A：分子量标记
B：GrB-H6 C228F， 孵育前
C：GrB-H6 C228F 4℃ 孵育 1天
D：GrB-H6 C228F 4℃ 孵育 3天
E：GrB-H6 C228F 4℃ 孵育 6天
F：GrB-H6 C228F 4℃ 孵育 15天
G：GrB-H6 C228F 23℃孵育 1天
H：GrB-H6 C228F 23℃孵育 3天
I：GrB-H6 C228F 23℃孵育 6天
J：GrB-H6 C228F 23℃孵育 15天
K：GrB-H6 C228F 37℃孵育 1天
L：GrB-H6 C228F 37℃孵育 3天
M：GrB-H6 C228F 37℃孵育 6天
N：GrB-H6 C228F 37℃孵育 15天
泳道B显示了完好的GrB-H6 C228F。完好蛋白酶的条带在所有的泳道中都可以见到(1)，I-N泳道中出现另外一个条带(2)，该条带必定是蛋白酶降解的产物，很可能是由于在序列IQDD↓FV的Asp50和Phe51之间进行自体切割造成的。
图3(B)显示了在100mM HEPES pH7.4下，于4℃，23℃，和37℃孵育的GrB-H6C228F样品，孵育0、6、(10)和15天后活性测定的结果。活性测定在500μl 100mM HEPES pH7.4中进行，每次测定加入具有从孵育样品中取出的0.2μg GrB-H6 C228F的400μM Ac-IEPD-pNA。
图4显示H6-TripUB IEPD↓SP和H6-IEPD-TN123与GrB-H6一同孵育12小时后样品的SDS PAGE。
泳道A-J的描述：
A：分子量标记
B：H6-TripUB IEPD↓SP自身于12小时孵育之后
C：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+1μl GrB-H6于12小时孵育之后
D：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+10μl GrB-H6于12小时孵育之后
E：H6-FX-TripUB与FXa孵育
F：H6-IEPD-TN123自身于12小时孵育之后
G：200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6于12小时孵育之后
H：200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6于12小时孵育之后
I：与泳道D和H中相同浓度的GrB-H6自身
J：使用FXa切割小鼠H6-FX-TN123
泳道B显示了未切割的H6-TripUB IEPD↓SP(1)，其中没有加入GrB-H6，而泳道C和D显示两次孵育，分别加入1和10微升的GrB-H6。在这两个泳道中，除了未切割的融合蛋白外，还可以看到切割反应的产物，即正确切割的H6-TripUB IEPD↓SP(2)。泳道E中含有FXa识别位点IQGR而不是GrB识别位点IEPD的构建体H6-FX-TripUB用FXa切割，产生的产物与GrB-H6切割的H6-TripUB IEPD↓SP具有相同的大小。
泳道F-J显示GrB-H6+H6-IEPD-TN123孵育12小时后的结果。F泳道显示未切割的H6-IEPD-TN123(3)。泳道G和H显示在没有钙离子存在的条件下，H6-IEPD-TN123是如何被GrB-H6切割的(4)。电泳的带型在图12中给予解释。泳道J中小鼠H6-FX-TN123构建体使用FXa切割显示了正确切割产物的大小。图中标记为(5)的是GrB-H6的位置，与加入10μl GrB-H6的样品中GrB-H6的浓度相同。
图5显示了GrB-H6+H6-TripUB IEPD↓SP孵育12、19和24小时后样品的SDS PAGE结果，以及GrB-H6+H6-IEPD-TN123孵育的样品的SDS PAGE结果。
泳道A-K描述：
A：分子量标记
B：H6-TripUB IEPD↓SP自身于12小时孵育后
C：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+1μl GrB-H6于12小时孵育后
D：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+1μl GrB-H6于19小时孵育后
E：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+1μl GrB-H6于24小时孵育后
F：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+10μl GrB-H6于19小时孵育后
G：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+10μl GrB-H6于24小时孵育后
H：GrB-H6于自身如F和G中一样稀释
I：H6-IEPD-TN123自身于12小时孵育后
J：200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6于12小时孵育后
K：200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6于12小时孵育后
泳道B显示了未切割的H6-TripUB IEPD↓SP(1)。泳道C-E中正确切割的产物在所有的泳道中都有出现，在图中用(2)标记。加入的GrB-H6越多，孵育时间越长，在泳道中出现更多的切割产物。
图3中的I、J和K泳道与图2中具有H6-IEPD-TN123+GrB-H6孵育物的F，G，和H泳道相同，尽管在图3的凝胶上上样量更大。因此条带比图2中的条带更清楚。标记为(3)的条带是未切割的H6-IEPD-TN123，标记为(4)，(5)，(6)和(7)的带型在图12中予以解释。
图6解释了图2和3中观察到的简单带型。当没有GrB-H6加入时，没有出现切割，在凝胶上只看到未切割的融合蛋白。在GrB-H6加入时，小的N端序列被切掉，在凝胶上除了剩余的未切割的融合蛋白以外还有正确切割的产物出现。被GrB-H6切掉的小N端序列由于太小，不能在SDS凝胶上观察到。
图7、8和9显示H6-TripUB IEPD↓SP+GrB-H6在23℃(图5)，37℃(图6)和42℃(图7)下孵育样品的SDS PAGE结果，无添加物(1)，加入4.2mM Ni2+(2)以及加入4.2mM Ni2++5mM NTA(3)。A-K泳道的描述(对所有的温度相同)：
A：分子量标记
B：未切割的H6-TripUB IEPD↓SP
C：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，无添加物
D：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，无添加物
E：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，无添加物
F：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，4.2mM Ni2+
G：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，4.2mM Ni2+
H：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，4.2mM Ni2+
I：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，4.2mM Ni2++5mMNTA
J：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，4.2mM Ni2++5mMNTA
K：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6，4.2mM Ni2++5mMNTA
所有三个图的泳道C-E(1)中没有加入Ni2+或NTA时，H6-TripUBIEPD↓SP融合蛋白的切割在不同温度下进行的速率不同。23℃下22小时后，大约40％的融合蛋白被切割。22小时后，于37℃和42℃下比23℃下有更多的融合蛋白被切割，大约是于37℃为60％，于42℃为50％。
由于在37℃和42℃下加入4.2mM Ni2+时观察到蛋白的沉淀，2小时孵育后在凝胶上没有再观察到融合蛋白的进一步切割。因此在图6(37℃)和图7(42℃)的泳道F-H(2)中看到的蛋白少于图5(23℃)的泳道F-H(2)中看到的蛋白。在图5的泳道F-H(2)中，大约50％的融合蛋白在22小时的孵育后被切割为产物，这比没有加入Ni2+时要多。
孵育时加入4.2mM Ni2++5mM NTA，没有观察到沉淀。在图5的I-K泳道中(3)，比泳道C-E(1)和F-H(2)观察到更多的产物，所以在Ni2+和NTA存在的条件下于23℃孵育22小时后，大约60％的融合蛋白被切割，而没有添加物时切割率是40％，只加入Ni2+时切割率是50％。
进一步提高温度至37℃(图6泳道I-K(3))和42℃(图7泳道I-K(3))，观察到切割率有更大的提高。于37℃孵育22小时后几乎所有的融合蛋白都被切割为正确的产物。于42℃孵育22小时后，与37℃相比只有少量的融合蛋白没有被切割。
图10显示H6-IEPD-RAP与1或10μl GrB-H6的共同孵育后样品的SDS PAGE结果。泳道(A-L)描述如下：
A：分子量标记
B：H6-IEPD-RAP自身于5小时孵育后
C：200μl H6-IEPD-RAP+1μl GrB-H6于5小时孵育后
D：200μl H6-IEPD-RAP+10μl GrB-H6于5小时孵育后
E：H6-IEPD-RAP自身于23小时孵育后
F：200μl H6-IEPD-RAP+1μl GrB-H6于23小时孵育后
G：200μ1 H6-IEPD-RAP+10μl GrB-H6于23小时孵育后
H：H6-IEGR-RAP被FXa部分切割，纯化的
I：H6-IEGR-RAP几乎被FXa完全切割，纯化的
J：H6-IEPD-RAP自身于26小时孵育后
K：200μl H6-IEPD-RAP+1μl GrB-H6于26小时孵育后
L：200μl H6-IEPD-RAP+10μl GrB-H6于26小时孵育后
未切割的H6-IEPD-RAP(1)在泳道B，E，和J中显示。泳道C和D中清楚显示在根据上面描述与1或10μl GrB-H6的共同孵育仅5小时后所有的H6-IEPD-RAP都被切割产生最终产物(2)。还清楚地显示在RAP中至少有一个内部切割位点，在这些泳道中产生两个低分子量的条带，即最终的产物被切割呈两段，在凝胶上都可见(3)。泳道F和G以及泳道K和L与泳道C和D基本相同，尽管取样时间靠后，与GrB-H6共同孵育23和26小时后在RAP的显著内部位点中产生更多的切割。
泳道H和I中显示经过FXa部分切割(泳道H)或者完全切割(泳道I)的H6-IEGR-RAP产生最终的RAP产物的纯化样品。在这些泳道中，已经通过纯化除去来自任何由FXa在内部切割产生的降解产物。
图11显示H6-IEPD-RAP+GrB-H6和H6-IEGR-RAP+FXa孵育样品的SDS PAGE结果。泳道(A-O)的描述：
A：分子量标记
B：H6-IEGR-RAP自身于27小时孵育后
C：400μl H6-IEGR-RAP+1μl FXa于1/2小时孵育后
D：400μl H6-IEGR-RAP+1μl FXa于1小时孵育后
E：400μl H6-IEGR-RAP+1μl FXa于3小时孵育后
F：400μl H6-IEGR-RAP+1μl FXa于5小时孵育后
G：400μl H6-IEGR-RAP+1μl FXa于7小时孵育后
H：400μl H6-IEGR-RAP+1μl FXa于27小时孵育后
I：H6-IEPD-RAP自身于27小时孵育后
J：400μl H6-IEPD-RAP+2μl GrB-H6于1/2小时孵育后
K：400μl H6-IEPD-RAP+2μl GrB-H6于1小时孵育后
L：400μl H6-IEPD-RAP+2μl GrB-H6于3小时孵育后
M：400μl H6-IEPD-RAP+2μl GrB-H6于5小时孵育后
N：400μl H6-IEPD-RAP+2μl GrB-H6于7小时孵育后
O：400μl H6-IEPD-RAP+2μl GrB-H6于27小时孵育后
在泳道B-H中是H6-IEGR-RAP孵育后的样品(1)，其中泳道B显示未切割的H6-IEGR-RAP。泳道C-H显示在仅仅半小时后几乎所有的融合蛋白都已经被FXa切割产生正确的产物。泳道D-G中出现了一些降解产物，在泳道H中27小时的孵育后，所有的融合蛋白都已经被降解，产生不同的小片段，没有剩下正确切割的产物。
泳道I-O显示了H6-IEPD-RAP孵育后的样品(2)。泳道I显示了未切割的H6-IEPD-RAP，与H6-IEGR-RAP相同，在仅仅半小时后几乎所有的H6-IEPD-RAP都已经被GrB-H6切割产生正确的产物，如泳道J中所示。在泳道K-N中，出现了降解产物，但是与H6-IEGR-RAP孵育的结果相比要少。在泳道0中，27小时孵育后仍然有相当多的正确切割的产物剩余。
图12显示H6Ubi-IEPD-ApoAl+GrB-H6C228F和H6Ubi-IEGR-ApoAl+FXa孵育样品的SDS PAGE结果。泳道(A-M)的描述：
A：分子量标记
B：H6Ubi-IEPD-ApoAl自身，0小时孵育
C：400μg H6Ubi-IEPD-ApoAl+0.4μg GrB-H6C228F，1小时孵育
D：400μg H6Ubi-IEPD-ApoAl+0.4μg GrB-H6C228F，3小时孵育
E：400μg H6Ubi-IEPD-ApoAl+0.4μg GrB-H6C228F，6小时孵育
F：400μg H6Ubi-IEPD-ApoAl+0.4μg GrB-H6C228F，24小时孵育
G：400μg H6Ubi-IEPD-ApoAl+0.4μg GrB-H6C228F，48小时孵育
H：H6Ubi-IEGR-ApoAl自身，0小时孵育
I：350μg H6Ubi-IEGR-ApoAl+0.35μg FXa，1小时孵育
J：350μg H6Ubi-IEGR-ApoAl+0.35μg FXa，3小时孵育
K：350μg H6Ubi-IEGR-ApoAl+0.35μg FXa，6小时孵育
L：350μg H6Ubi-IEGR-ApoAl+0.35μg FXa，24小时孵育
M：350μg H6Ubi-IEGR-ApoAl+0.35μg FXa，48小时孵育
在泳道B-G中是H6Ubi-IEPD-ApoAl孵育后的样品(1)，其中泳道B显示未切割的H6Ubi-IEPD-ApoAl制备物。泳道H-M显示H6Ubi-IEGR-ApoAl孵育后的样品(2)，其中泳道H显示未切割的H6Ubi-IEGR-ApoAl制备物。完好的、未经切割的融合蛋白由(3)指示。(4)标记的条带是正确切割的ApoAl产物，而(5)标记的条带是H6Ubi融合伴侣。
图13显示H6-IEPD-TN123+GrB-H6在没有加入Ca2+的情况下孵育12小时和5天后的样品的SDS PAGE结果。一些样品经过还原处理。泳道(A-N)的描述：
A：分子量标记
B：200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H65天孵育后，样品被还原处理
C：200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H65天孵育后，样品被还原处理
D+E：H6-IEPD-TN123自身于5天孵育后
F：200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6于5天孵育后
G：200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6于5天孵育后
H：GrB-H6自身如在C和G中一样稀释
I：H6-IEPD-TN123自身于12小时孵育后
J：200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6于12小时孵育后
K：200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6于12小时孵育后
L：H6-IEPD-TN123自身于12小时孵育后，样品被还原处理
M：200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6于12小时孵育后，样品被还原处理
N：200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6于12小时孵育后，样品被还原处理
泳道I-K与图2中的泳道F-H和图3中的泳道I-K相同，即与0，0.2或2μg GrB-H6孵育12小时后的样品。这里的带型(1)表明H6-IEPD-TN123的TN123部分存在一个内部切割位点，该带型在图12中有进一步的解释。泳道D-G显示5天孵育后的结果，这里大部分的融合蛋白已被切割。泳道G(加入了10μl GrB-H6)中几乎所有的融合蛋白都被切割了两次(2)；在IEPD↓序列处以及在TN123中具有AQPD↓序列的内部位点。
泳道L-N以及泳道B-D分别是相同样品12小时后和5天后的结果，但是这里样品经过还原处理。带型(3)在图12中也有解释，同样几乎所有的融合蛋白在与10μl GrB-H6孵育5天后都被切割了两次，泳道C(4).
图14显示了H6-IEPD-TN123+GrB-H6在加入Ca2+的情况下孵育12小时和两天后样品的SDS PAGE结果。一些样品经过还原处理。泳道(A-K)：的描述：
A：分子量标记
B：200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6以及5mM CaCl2，样品经过还原处理
C：200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6以及5mM CaCl2，样品经过还原处理
D：H6-IEPD-TN123自身
E：200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6以及5mM CaCl2
F：200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6没有CaCl2
G：200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6以及5mM CaCl2
H：200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6没有CaCl2
I：GrB-H6自身如在G和H中一样稀释
J：200μl H6-IEPD-TN123+1μl GrB-H6没有CaCl2孵育两天后
K：200μl H6-IEPD-TN123+10μl GrB-H6没有CaCl2孵育两天后
泳道B-H和J-K显示H6-IEPD-TN123与GrB-H6分别孵育12小时和两天的结果。
泳道D显示未切割的H6-IEPD-TN123。比较泳道E和G(+5mM Ca2+)与泳道F和H(没有Ca2+)，在5mM Ca2+存在时只出现两个条带(1)，而在没有Ca2+时有4个条带(2)，如图2、3、10和12的描述。在Ca2+存在时，与10μl GrB-H6孵育12小时后大约40％的融合蛋白已经被正确切割(泳道G)，而在没有Ca2+存在时，两个位点发生的切割更快一些(泳道H，12小时后；泳道K，2天后)。在泳道K中几乎所有的融合蛋白都被切割了两次(3)。
泳道B和C中的样品经过还原处理且仍然只有两个条带出现(4)；未切割的H6-IEPD-TN123和除去H6后的正确切割产物。
图15显示了在图2、3、10和11中的SDS PAGE凝胶上观察到的带型的示意图。
(A)：当没有Ca2+存在时，H6-IEPD-TN123构建体在两个不同的位置切割，用“GrB-H6→”表示。被切除的小的N端部分太小，所以不能在凝胶上观察到。产生的分子由两条多肽链组成，它们之间由一个二硫键维系。
(1)和(2)：在非还原性凝胶上，(2)中的带型是在切割不完全时得到的。(1)是未切割的H6-IEPD-TN123，在(2)中剩余未切割的融合蛋白是从上数第二条带。(2)中最上方的带是在内部位点AQPD↓切割后的H6-IEPD-TN123，产生的分子与未切割的H6-IEPD-TN123大小相同，但是较不紧密。在底部的带是正确切割的融合蛋白，而从上数第三条带是切割了两次的融合蛋白，即在正确的IEPD↓位点和内部AQPD↓位点的切割。在内部位点切割后，分子的紧密程度降低，因此在凝胶中比正确切割的融合蛋白迁移得要短。
(3)和(4)：如果将样品还原处理，则观察到(4)中的带型。这里任何的二硫键都被打断，所以在凝胶上只能看到单个多肽链。(3)显示了未切割的还原的H6-IEPD-TN123的位置。(4)中最上方的条带是剩余的未切割的H6-IEPD-TN123，而从上数第二条带是正确切割的还原的H6-IEPD-TN123。在还原条件下在内部被切割的分子不再被任何的二硫键所维系，所以在内部切割后两个多肽中只有稍大的多肽才能在凝胶上看到。因此从上数第三条带是融合蛋白内部切割后产生的稍大部分，而底部的条带是在正确的IEPD↓位点和内部位点切割后产生的稍大部分。
(B)：在孵育中加入5mM Ca2+后，观察不到内部的切割。Ca2+离子与H6-IEPD-TN123分子结合的方式阻止了GrB-H6在内部的AQPD↓位点切割融合蛋白。随着AQPD↓不能被切割，切割只在正确的IEPD↓位点发生。
(5)和(6)：当只在正确的位点IEPD↓位点处切割时就看到了(6)中的带型。未切割的H6-IEPD-TN123的位置在(5)中所示，所以(6)中上方的条带是剩余的未切割的H6-IEPD-TN123。底部的条带是只在正确位点切割了仅一次的融合蛋白。小的N端肽太小，所以不能在凝胶上观察到。
图16显示了五个H6-TripUB变异体中的三个与GrB-H6孵育的样品。该三个变异体分别是H6-TripUB IEPD↓SP，H6-TripUB IQAD↓SP和H6-TripUB IQAD↓SG。泳道(A-P)的描述：
A：分子量标记
B：H6-TripUB IEPD↓SP自身于24小时孵育后
C：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6于2小时孵育后
D：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6于6小时孵育后
E：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6于24小时孵育后
F：200μl H6-TripUB IEPD↓SP+5μl GrB-H6于48小时孵育后
G：H6-TripUB IQAD↓SP自身于24小时孵育后
H：200μl H6-TripUB IQAD↓SP+5μl GrB-H6于2小时孵育后
I：200μl H6-TripUB IQAD↓SP+5μl GrB-H6于6小时孵育后
J：200μl H6-TripUB IQAD↓SP+5μl GrB-H6于24小时孵育后
K：200μl H6-TripUB IQAD↓SP+5μl GrB-H6于48小时孵育后
L：H6-TripUB IQAD↓SG自身于24小时孵育后
M：200μl H6-TripUB IQAD↓SG+5μl GrB-H6于2小时孵育后
N：200μl H6-TripUB IQAD↓SG+5μl GrB-H6于6小时孵育后
O：200μl H6-TripUB IQAD↓SG+5μl GrB-H6于24小时孵育后
P：200μl H6-TripUB IQAD↓SG+5μl GrB-H6于48小时孵育后
泳道B中显示了未切割的H6-TripUB IEPD↓SP，在与GrB-H6共同孵育后，在泳道C-F中出现越来越多的正确切割的产物。在泳道F中，48小时孵育后大约2/3起始量的未切割的H6-TripUB IEPD↓SP已经被正确切割。在泳道G-K中，显示的是H6-TripUB IQAD↓SP样品，与H6-TripUB IEPD↓SP的结果大致相同，未切割的H6-TripUB IQAD↓SP在泳道G中，而在泳道H-K中出现越来越多的正确切割的产物。但是切割比对IEPD↓SP序列的切割要慢得多，且在48小时的孵育后只有一小部分被切割。对于泳道L-P中的H6-TripUB IQAD↓SG样品，显然切割的速率要比H6-TripUB IEPD↓SP和H6-TripUB IQAD↓SP都快得多。泳道L显示未切割的H6-TripUB IQAD↓SG在仅仅两小时孵育后大部分的融合蛋白都已经被切割产生正确的产物了。
图17显示五个H6-TripUB变异体中的两个与GrB-H6孵育的样品。该两个剩余的变异体是H6-TripUB VGPD↓SP和H6-TripUB VGPD↓FG。泳道(A-K)的描述：
A：H6-TripUB VGPD↓SP自身于24小时孵育后
B：200μl H6-TripUB VGPD↓SP+5μl GrB-H6于2小时孵育后
C：200μl H6-TripUB VGPD↓SP+5μl GrB-H6于6小时孵育后
D：200μl H6-TripUB VGPD↓SP+5μl GrB-H6于24小时孵育后
E：200μl H6-TripUB VGPD↓SP+5μl GrB-H6于48小时孵育后
F：H6-TripUB VGPD↓FG自身24小时孵育后
G：200μl H6-TripUB VGPD↓FG+5μl GrB-H6于2小时孵育后
H：200μl H6-TripUB VGPD↓FG+5μl GrB-H6于6小时孵育后
I：200μl H6-TripUB VGPD↓FG+5μl GrB-H6于24小时孵育后
J：200μl H6-TripUB VGPD↓FG+5μl GrB-H6于48小时孵育后
K：分子量标记
泳道A中是未切割的H6-TripUB VGPD↓SP，泳道B-E中出现越来越多正确切割的产物，如在H6-TripUB IEPD↓SP中所见到的一样(泳道B-F，图16)。48小时后大约一半量的融合蛋白都已经被切割。在泳道F中显示了未切割的H6-TripUB VGPD↓FG，在泳道G-J中出现H6-TripUB VGPD↓FG的正确切割产物。仅仅2小时孵育后，所有的融合蛋白都已经被正确切割。
图18显示H6-TripUB IEPD↓SP，H6-TripUB IEPD↓TQ和H6-TripUB IEPD↓IV与GrB-H6C228F在23℃孵育的样品，蛋白酶和融合蛋白的比例是1：500。
泳道A-M的描述：
A：分子量标记
B：H6-TripUB IEPD↓SP，0小时孵育
C：250μl H6-TripUB IEPD↓SP+1μl GrB-H6 C228F，4小时孵育
D：250μl H6-TripUB IEPD↓SP+1μl GrB-H6C228F，24小时孵育
E：250μl H6-TripUB IEPD↓SP+1μl GrB-H6 C228F，96小时孵育
F：H6-TripUB IEPD↓TQ，0小时孵育
G：250μl H6-TripUB IEPD↓TQ+1μl GrB-H6C228F，4小时孵育
H：250μl H6-TripUB IEPD↓TQ+1μl GrB-H6 C228F，24小时孵育
I：250μl H6-TripUB IEPD↓TQ+1μl GrB-H6 C228F，96小时孵育
J：H6-TripUB IEPD↓IV，0小时孵育
K：250μl H6-TripUB IEPD↓IV+1μl GrB-H6 C228F，4小时孵育
L：250μl H6-TripUB IEPD↓IV+1μl GrB-H6 C228F，24小时孵育
M：250μl H6-TripUB IEPD↓IV+1μl GrB-H6 C228F，96小时孵育
在泳道B-E中显示了H6-TripUB IEPD↓SP的切割(1)，其中的切割在96小时后几乎是100％的完全。泳道F-I是H6-TripUB IEPD↓TQ的切割(2)，仅在24小时后切割几乎是100％完全了。对于泳道J-M显示的H6-TripUB IEPD↓IV(3)的切割也是相同的情况。完好的和切割的H6-TripUB IEPD↓TQ在凝胶上都位于比H6-TripUB IEPD↓SP的条带略偏下的位置，原因是H6-TripUB IEPD↓TQ是H6-TripUB IEPD↓SP的一个删除突变体。另一个删除突变体H6-TripUB IEPD↓IV的条带位置更靠下，因为删除的片段比H6-TripUB IEPD↓TQ中的删除片段要大。
图19，A显示H6-TripUB IEPD↓SP和H6-TripUB IEPD↓EP与GrB-H6 C228F在21℃和37℃孵育的样品，蛋白酶和融合蛋白的比例是1：500，总体积是200微升。
泳道A-O的描述：
A：分子量标记
B：H6-TripUB IEPD↓SP，0小时孵育
C：24μg H6-TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB-H6 C228F，21℃，4小时
D：24μg H6-TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB-H6 C228F，21℃，24小时
E：24μg H6-TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB-H6 C228F，21℃，48小时
F：24μg H6-TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB-H6 C228F，37℃，4小时
G：24μg H6-TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB-H6 C228F，37℃，24小时
H：24μg H6-TripUB IEPD↓SP+0.048μg GrB-H6 C228F，37℃，48小时
I：H6-TripUB IEPD↓EP，0小时孵育
J：36μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB-H6 C228F，21℃，4小时
K：36μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB-H6 C228F，21℃，24小时
L：36μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB-H6 C228F，21℃，48小时
M：36μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB-H6 C228F，37℃，4小时
N：36μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB-H6 C228F，37℃，24小时
O：36μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.072μg GrB-H6 C228F，37℃，48小时
完好的未切割的H6-TripUB IEPD↓SP在泳道B中显示(1)，而在21℃和37℃的切割分别在泳道C-E(2)和泳道F-H(3)中显示。在两个温度下几乎没有差异。21℃下48小时后大约40％已经被切割。未切割的H6-TripUB IEPD↓EP在泳道I(4)中显示，而在21℃和37℃的切割反应分别在泳道J-L(5)和泳道M-O(6)中显示。同样两个温度间几乎没有差异，21℃下48小时后大约35-40％已经被切割，即GrB-H6C228F对两个底物切割得都很好。
图19，B显示H6-TripUB IEPD↓EG和H6-TripUB IEPD↓EP与GrB-H6 C228F在22℃和37℃孵育的样品，蛋白酶和融合蛋白的比例是1：500，总体积是200微升。
泳道A-O的描述：
A：分子量标记
B：H6-TripUB IEPD↓EG，0小时孵育
C：40μg H6-TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB-H6 C228F，23℃，6小时
D：40μg H6-TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB-H6 C228F，23℃，24小时
E：40μg H6-TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB-H6 C228F，23℃，50小时
F：40μg H6-TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB-H6 C228F，37℃，6小时
G：40μg H6-TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB-H6 C228F，37℃，24小时
H：40μg H6-TripUB IEPD↓EG+0.08μg GrB-H6 C228F，37℃，50小时
I：H6-TripUB IEPD↓EP，0小时孵育
J：38μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB-H6 C228F，23℃，6小时
K：38μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB-H6 C228F，23℃，24小时
L：38μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB-H6 C228F，23℃，50小时
M：38μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB-H6 C228F，37℃，6小时
N：38μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB-H6 C228F，37℃，24小时
O：38μg H6-TripUB IEPD↓EP+0.08μg GrB-H6 C228F，37℃，50小时
完好的未切割的H6-TripUB IEPD↓EG在泳道B中显示(1)，而在21℃和37℃的切割分别在泳道C-E(2)和泳道F-H(3)中显示。在两个温度下几乎没有差异，仅仅6小时后切割就已经完全。未切割的H6-TripUB IEPD↓EP在泳道I(4)中显示，而在21℃和37℃的切割反应分别在泳道J-L(5)和泳道M-O(6)中显示。同图19A中一样，21℃切割50小时后大约40％已经被切割。令人惊奇的是GrB-H6 C228F对IEPD↓EG底物的切割比对IEPD↓SP和IEPD↓EP的切割要好得多。
图20显示H6-TripUB IQAD↓SP或H6-TripUB IQAD↓SG与六个不同的固定化GrB-H6 C228F制备物孵育的样品，实验A-F，在实施例9中描述。
泳道A-M的描述：
A：H6-TripUB IQAD↓SP+固定化的GrB-H6 C228F，实验A
B：H6-TripUB IQAD↓SP+固定化的GrB-H6 C228F，实验B
C：H6-TripUB IQAD↓SP+固定化的GrB-H6 C228F，实验C
D：H6-TripUB IQAD↓SP+固定化的GrB-H6 C228F，实验D
E：H6-TripUB IQAD↓SP+固定化的GrB-H6 C228F，实验E
F：H6-TripUB IQAD↓SP+固定化的GrB-H6 C228F，实验F
G：H6-TripUB IQAD↓SG+固定化的GrB-H6 C228F，实验A
H：H6-TripUB IQAD↓SG+固定化的GrB-H6 C228F，实验B
I：H6-TripUB IQAD↓SG+固定化的GrB-H6 C228F，实验C
J：H6-TripUB IQAD↓SG+固定化的GrB-H6 C228F，实验D
K：H6-TripUB IQAD↓SG+固定化的GrB-H6 C228F，实验E
L：H6-TripUB IQAD↓SG+固定化的GrB-H6 C228F，实验F
M：分子量标记
H6-TripUB IQAD↓SP的孵育在泳道A-F中显示(1)，而H6-TripUBIQAD↓SG的孵育在泳道G-L中显示(2)，代表未切割的融合蛋白(H6-TripUB IQAD↓SP或H6-TripUB IQAD↓SG)的条带由(3)标记，正确切割的产物的条带的位置由(4)标记。
实施例
实施例1
人粒酶B表达载体的设计和构建
为了制备无活性的粒酶B酶原构建体，将编码活化的人粒酶B(E.C.3.4.21.79)的序列，即从Ile21(胰凝乳蛋白酶原编号Ile16)到Tyr246的序列克隆到含有C端六聚His标签(H6)的pT7克隆载体中(pT7C-term H6)，得到表达载体pT7-IEGR-GrB-H6。含有凝血因子Xa(FXa)识别序列IEGR的序列MGSIEGR置于粒酶B中Ile21的N端，在Arg(R)和Ile21之间提供了一个FXa切割位点。产生的融合蛋白粒酶B酶原含有FXa识别序列和C端的六聚His标签，在下面称为pro-IEGR-GrB-H6，在序列编号1中示出。
为了形成自我激活的粒酶B酶原蛋白，构建表达载体pT7-IEPD-GrB-H6和pT7-IEAD-GrB-H6，其中的FXa识别序列IEGR被分别替换为粒酶B的识别序列IEPD或IEAD。产生的自我激活GrB蛋白在下面分别称为pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6，并在序列编号2和序列编号3中示出。在下面的部分中概述了载体的设计和克隆。
在人粒酶B中特别是上面描述的粒酶B蛋白pro-IEGR-GrB-H6、pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6中于氨基酸228位(使用现成的标准胰凝乳蛋白酶原氨基酸编号系统)存在的游离的半胱氨酸，在实施例2中描述的重折叠过程中可能产生问题，降低了活化的酶的稳定性，对含有二硫键的底物产生更高的非酶反应性。因此制备了一些基于pro-IEPD-GrB-H6的重组突变蛋白，其中Cys228氨基酸残基(胰凝乳蛋白酶原氨基酸编号)通过使构建体pT7-IEPD-GrB-H6定点突变，被替换为丝氨酸(S)，丙氨酸(A)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)，或苯丙氨酸(F)，分别得到表达载体pT7-IEPD-GrB-H6 C228S，pT7-IEPD-GrB-H6C228A，pT7-IEPD-GrB-H6 C228T，pT7-IEPD-GrB-H6 C228V和pT7-IEPD-GrB-H6 C228F。产生的突变体蛋白在下面分别称为Pro-IEPD-GrB-H6 C228S(序列编号4)，pro-IEPD-GrB-H6 C228A(序列编号5)，pro-IEPD-GrB-H6 C228T(序列编号6)，pro-IEPD-GrB-H6C228V(序列编号7)，和pro-IEPD-GrB-H6 C228F(序列编号8)，它们被一起称为pro-IEPD-GrB-H6 C228X突变体。所有这些突变体都构建为自我激活的粒酶B蛋白酶。
pT7C-term H6克隆载体的构建
从寡聚核苷酸引物H6C-term fw(序列编号：9)和H6 C-termrev(序列编号：10)得到的DNA片段使用标准的步骤连接到NcoI和EcoRI切割的载体pT7(Christensen JH等人，1991)中构建为克隆载体pT7 C-term H6。
将人粒酶B克隆到克隆载体pT7 C-term H6中
从人骨髓、人白细胞、人淋巴结和淋巴瘤(Raji)细胞(ClontechLaboratories，Inc目录号7181-1，7182-1，7164-1，7167-1)中分离得到的cDNA混合物，用寡聚核苷酸引物GrBfw(序列编号：11)和GrBrev EcoRI(序列编号：12)扩增后产生的DNA片段GrB EcoRI，经BamHI和EcoRI酶切，然后用标准的步骤插入到BamHI和EcoRI切割的pT7C-term H6载体中，构建得到表达载体pT7-IEGR-GrB-H6。得到的核苷酸序列GrB EcoRI在序列编号13中示出。
自我激活的人粒酶B表达载体pro-IEPD-GrB-H6和
pro-IEAD-GrB-H6的构建
根据生产商的说明，使用QuikChangeTM定点突变试剂盒(STRATAGENE，目录编号#200518)构建编码自我激活粒酶B酶原蛋白的表达载体pT7-IEPD-GrB-H6和pT7-IEAD-GrB-H6。用表达载体pT7-IEGR-GrB-H6作为模板。寡聚核苷酸引物GrB GR-PD fw和GrBGR-PD rev(序列编号14和15)用于构建pT7-IEPD-GrB-H6；寡聚核苷酸引物GrB GR-AD fw和GrB GR-AD rev(序列编号16和17)用于构建pT7-IEAD-GrB-H6。
自我激活的pro-IEPD-GrB-H6 C228X突变体表达载体的构建
根据生产商的说明，使用QuikChangeTM定点突变试剂盒(STRATAGENE，目录编号#200518)构建编码自我激活pro-GrB-H6 C228X突变体的表达载体pT7-IEPD-GrB-H6 C228X。使用表达载体pT7-IEPD-GrB-H6作为模板。经简并的核苷酸引物GrB SAT fw和GrBSAT rev(序列编号18和19)用于构建pT7-IEPD-GrB-H6 C228S，pT7-IEPD-GrB-H6 C228A，和pT7-IEPD-GrB-H6 C228S，在表1中所示的GrB SAT fw和GrB SAT rev引物序列中，D＝A，G，或T和H＝T，C，或A。简并核苷酸引物GrB VF fw和GrB VF rev(序列编号20和21)用于构建pT7-IEPD-GrB-H6 C228V和pT7-IEPD-GrB-H6 C228F，在表1中所示的GrB VF fw和GrB VF rev引物序列中，K＝G或T和M＝A或C。
表1：寡聚核苷酸引物
| 引物 | 核苷酸序列 | 序列编号 |
| H6C-term fw | 5’-CATGGACGGAAGCTTGAATTCACATCACCATCACCATCACTAACGC-3’ | 9 |
| H6C-term rev | 5’-AATTGCGTTAGTGATGGTGATGGTGATGTGAATTCAAGCTTCCGCT-3’ | 10 |
| GrBfw | 5’-CATGGGATCCATCGAGGGTAGGATCATCGGGGGACATGAG-3’ | 11 |
| GrBrev EcoRI | 5’-GCGTGAATTCAGGTACCGTTTCATGGTTTTCTTTATCC-3’ | 12 |
| GrB GR-PD fw | 5’-TCCATCGAGCCGGATATCATCGGGGGACATGAG-3’ | 14 |
| GrB GR-PD rev | 5’-CCCCGATGATATCCGGCTCGATGGATCCCATATG-3’ | 15 |
| GrB GR-AD fw | 5’-TCCATCGAGGCTGATATCATCGGGGGACATGAG-3’ | 16 |
| GrB GR-AD rev | 5’-CCCCGATGATATCAGCCTCGATGGATCCCATATG-3’ | 17 |
| GrB SAT fw | 5’-TCCACGAGCADCCACCAAAGTCTCAAG-3’ | 18 |
| GrB SAT rev | 5’-AGACTTTGGTGGHGGCTCGTGGAGGC-3’ | 19 |
| GrB VF fw | 5’-TCCACGAGCCKTCACCAAAGTCTCAAG-3’ | 20 |
| GrB VF rev | 5’-AGACTTTGGTGAMGGCTCGTGGAGGC-3’ | 21 |
实施例2
自我激活的人粒酶B的表达和重折叠
可被FX
a
激活的重组pro-IEGR-GrB-H6
可被FXa激活的重组粒酶B酶原融合蛋白pro-IEGR-GrB-H6(序列编号1)制备如下：根据Studier FW等人(1990)中的描述，实施例1中制备的表达载体pT7-IEGR-GrB-H6在coli BL21细胞中进行中等规模(3×1升)的生长和表达。于37℃以对数生长的培养物在OD600＝0.8时用噬菌体λCE6感染，感染复数约为5。培养物继续在37℃培养，感染后50分钟加入0.1g/L利福平(溶解于甲醇中制成0.1g/mL)。于37℃继续培养3小时，离心收获细胞。通过渗透休克和超声波裂解细胞，将总细胞蛋白抽提到苯酚(用Trisma碱调节pH至8)中。加入2.5倍体积的乙醇离心沉淀酚相中的蛋白质。蛋白质沉淀溶于含6M盐酸胍、50mM Tris-HCl pH8，和100nM二硫苏糖醇的缓冲液中。使用SephadexTMG-25Fine(Amersham Biosciences)凝胶过滤将蛋白洗脱到8M尿素，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl pH8，和5mM2-巯基乙醇中。粗加工蛋白制备物上样于Ni2+-活化的NTA-琼脂糖层析柱(Ni2+-NTA-agarose，Quiagen)上。
粗蛋白提取物上样于Ni2+-NTA-琼脂糖层析柱后，用1柱体积的上样缓冲液；而后1柱体积的8M尿素，0.5M NaCl，50mM磷酸钠pH6.3和5mM 2-巯基乙醇；1/2柱体积的6M盐酸胍，50mM Tris-HCl pH8，和5mM 2-巯基乙醇；最后用1/2柱体积的8M尿素，0.5M NaCl，50mMTris-HCl pH8和3mM还原型谷胱甘肽分别洗柱，将融合蛋白pro-IEGR-GrB-H6从大量E.coli和λ噬菌体蛋白中纯化出来。
使用
等人描述的循环重折叠步骤(国际专利申请号WO9418227)，使融合蛋白pro-IEGR-GrB-H6在Ni2+-NTA-琼脂糖层析柱上重折叠。梯度操作概览在下面的表2中描述，其中缓冲液A是0.5MNaCl，50mM Tris-HCl pH8，2mM还原型谷胱甘肽，和0.2mM氧化型谷胱甘肽；缓冲液B是6M尿素，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl pH8和3mM还原型谷胱甘肽。
表2：
| 步骤 | Time(min) | Flow(mL/min) | ％A | ％B |
| 1 | 0 | 2 | 100 | 0 |
| 2 | 45 | 2 | 100 | 0 |
| 3 | 46 | 2 | 0 | 100 |
| 4 | 52 | 2 | 0 | 100 |
| 5 | 60 | 2 | 100 | 0 |
| 6 | 105 | 2 | 100 | 0 |
| 7 | 106 | 2 | 4 | 96 |
| 8 | 113 | 2 | 4 | 96 |
| 9 | 120 | 2 | 100 | 0 |
| 10 | 165 | 2 | 100 | 0 |
| 11 | 166 | 2 | 8 | 92 |
| 12 | 172 | 2 | 8 | 92 |
| 13 | 180 | 2 | 100 | 0 |
| 14 | 225 | 2 | 100 | 0 |
| 15 | 226 | 2 | 10 | 90 |
| 16 | 232 | 2 | 10 | 90 |
| 17 | 240 | 2 | 100 | 0 |
| 18 | 285 | 2 | 100 | 0 |
| 19 | 286 | 2 | 12 | 88 |
| 20 | 292 | 2 | 12 | 88 |
| 21 | 300 | 2 | 100 | 0 |
| 22 | 345 | 2 | 100 | 0 |
| 23 | 346 | 2 | 14 | 86 |
| 24 | 352 | 2 | 14 | 86 |
| 25 | 360 | 2 | 100 | 0 |
| 26 | 405 | 2 | 100 | 0 |
| 27 | 406 | 2 | 16 | 84 |
| 28 | 412 | 2 | 16 | 84 |
| 29 | 420 | 2 | 100 | 0 |
| 30 | 465 | 2 | 100 | 0 |
| 31 | 466 | 2 | 18 | 82 |
| 32 | 472 | 2 | 18 | 82 |
| 33 | 480 | 2 | 100 | 0 |
| 34 | 525 | 2 | 100 | 0 |
| 35 | 526 | 2 | 20 | 80 |
| 36 | 532 | 2 | 20 | 80 |
| 37 | 540 | 2 | 100 | 0 |
| 38 | 585 | 2 | 100 | 0 |
| 39 | 586 | 2 | 22 | 78 |
| 40 | 592 | 2 | 22 | 78 |
| 41 | 600 | 2 | 100 | 0 |
| 42 | 645 | 2 | 100 | 0 |
| 43 | 646 | 2 | 24 | 76 |
| 44 | 652 | 2 | 24 | 76 |
| 45 | 660 | 2 | 100 | 0 |
| 46 | 705 | 2 | 100 | 0 |
| 47 | 706 | 2 | 30 | 70 |
| 48 | 713 | 2 | 30 | 70 |
| 49 | 720 | 2 | 100 | 0 |
| 50 | 765 | 2 | 100 | 0 |
| 51 | 766 | 2 | 35 | 65 |
| 52 | 772 | 2 | 35 | 65 |
| 53 | 780 | 2 | 100 | 0 |
| 54 | 825 | 2 | 100 | 0 |
| 55 | 826 | 2 | 40 | 60 |
| 56 | 832 | 2 | 40 | 60 |
| 57 | 840 | 2 | 100 | 0 |
| 58 | 885 | 2 | 100 | 0 |
| 59 | 886 | 2 | 45 | 55 |
| 60 | 892 | 2 | 45 | 55 |
| 61 | 900 | 2 | 100 | 0 |
| 62 | 945 | 2 | 100 | 0 |
| 63 | 946 | 2 | 50 | 50 |
| 64 | 952 | 2 | 50 | 50 |
| 65 | 960 | 2 | 100 | 0 |
| 66 | 1005 | 2 | 100 | 0 |
| 67 | 1006 | 2 | 55 | 45 |
| 68 | 1012 | 2 | 55 | 45 |
| 69 | 1020 | 2 | 100 | 0 |
| 70 | 1065 | 2 | 100 | 0 |
| 71 | 1066 | 2 | 60 | 40 |
| 72 | 1072 | 2 | 60 | 40 |
| 73 | 1080 | 2 | 100 | 0 |
| 74 | 1125 | 2 | 100 | 0 |
| 75 | 1126 | 2 | 60 | 40 |
| 76 | 1132 | 2 | 60 | 40 |
| 77 | 1140 | 2 | 100 | 0 |
| 78 | 1185 | 2 | 100 | 0 |
| 79 | 1186 | 2 | 60 | 40 |
| 80 | 1192 | 2 | 60 | 40 |
| 81 | 1200 | 2 | 100 | 0 |
| 82 | 1245 | 2 | 100 | 0 |
| 83 | 1246 | 2 | 65 | 35 |
| 84 | 1252 | 2 | 65 | 35 |
| 85 | 1260 | 2 | 100 | 0 |
| 86 | 1305 | 2 | 100 | 0 |
| 87 | 1306 | 2 | 65 | 35 |
| 88 | 1312 | 2 | 65 | 35 |
| 89 | 1319 | 2 | 100 | 0 |
| 90 | 1364 | 2 | 100 | 0 |
| 91 | 1365 | 2 | 65 | 35 |
| 92 | 1371 | 2 | 65 | 35 |
| 93 | 1378 | 2 | 100 | 0 |
| 94 | 1423 | 2 | 100 | 0 |
循环重折叠步骤完成后，使用含有0.5M NaCl，50mM Tris-HCl pH8和10mM EDTA pH8的缓冲液将pro-IEGR-GrB-H6融合蛋白从Ni2+-NTA-琼脂糖层析柱上洗脱下来。
从Ni2+-NTA-琼脂糖层析柱上洗脱下来之后，用1体积的50mMTris-HCl pH8.0稀释pro-IEGR-GrB-H6蛋白，然后用盐酸调节pH至7。然后蛋白质上样于SP SepharoseTM Fast Flow(AmershamBiosciences)离子交换层析柱上。使用10柱体积以上的250mM NaCl、50mM Tris-HCl pH7.0到1M NaCl、50mM Tris-HCl pH7.0的线性梯度洗脱蛋白。洗脱过程中取样进行SDS-PAGE分析可见一条显著的条带，其为预计分子量27.4kDa的单体pro-IEGR-GrB-H6的迁移。
自我激活的pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6
自我激活的重组粒酶B融合蛋白pro-IEPD-GrB-H6(序列编号：2)和pro-IEAD-GrB-H6(序列编号：3)通过实施例1中制备的载体pT7-IEPD-GrB-H6和pT7-IEAD-GrB-H6的表达产生，其中的表达、重折叠和纯化基本上与上面描述的pro-IEGR-GrB-H6按同样方法进行。
两个酶pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6的自我激活按照以下实施例3中描述的方法进行。
自我激活的pro-IEPD-GrB-H6 C228X突变体
所有的pro-IEPD-GrB-H6 C228X突变体(序列编号4、5、6、7和8)用表达载体pT7-IEPD-GrB-H6 C228X进行表达，基本上与上面描述的pro-IEGR-GrB-H6按同样方法进行。pro-IEPD-GrB-H6 C228X突变体的重折叠也基本上与上面描述的pro-IEGR-GrB-H6按同样方法进行。在阳离子交换层析柱上的激活按照上面描述的用于pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6的方法进行。
在酶原形式的重折叠蛋白上样于阳离子交换层析柱SPSepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)后仅4小时就完成了自我激活的pro-IEPD-GrB-H6 C228X突变体的纯化和完全激活，用250mM NaCl，50mM TrisHCl，pH7.0洗柱4小时，最后用750mM NaCl，50mM TrisHCl，pH7.0洗脱激活的蛋白。洗脱后被激活的突变体称为GrB-H6 C228S，GrB-H6 C228A，GrB-H6 C228T，GrB-H6 C228V，和GrB-H6C228F。
pro-IEPD-GrB-H6 C228X突变体的表达水平与pro-IEPD-GrB-H6的表达水平相似。但是重折叠效率与pro-IEPD-GrB-H6相比最高相差90％。一个突变体pro-IEPD-GrB-H6 C228S的重折叠效率非常低，因此没有进一步进行分析。这与预期的相反，即预期替换半胱氨酸残基最明显的保守选择是丝氨酸，因为丝氨酸在蛋白质中天然存在的所有氨基酸中与半胱氨酸在大小、亲水性和化学性质上最为相似。
其他突变体中的三个pro-IEPD-GrB-H6 C228A，pro-IEPD-GrB-H6C228T，和pro-IEPD-GrB-H6 C228V的重折叠效率与pro-IEPD-GrB-H6的重折叠效率相似。
非常有趣的发现是pro-IEPD-GrB-H6 C228F突变体，比未突变的含有Cys228氨基酸残基的pro-IEPD-GrB-H6在重折叠和纯化后得到了更高的蛋白质回收率，而其中的半胱氨酸替换为苯丙氨酸。因此当70毫克(用Bradford法(Coomassie 
Assay ReagentKit，Pierce Biotechnology)定量，使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准)的pro-IEPD-GrB-H6 C228F或未突变的pro-IEPD-GrB-H6进行上面描述的重折叠和纯化步骤以后，最终产率(蛋白质回收率)分别为1.5％和0.5％。这清楚地说明突变的pro-IEPD-GrB-H6 C228F提供了提高的最终蛋白质回收率。未突变的Pro-IEPD-GrB-H6的低回收率的原因是当蛋白通过阳离子交换层析纯化和激活时，蛋白明显倾向于沉淀这样就降低了活性酶的最终产率(回收率)。pro-IEPD-GrB-H6 C228F没有观察到明显的沉淀。因此，用苯丙氨酸替换半胱氨酸228看来对粒酶B是有利的，特别是对于自我激活的粒酶B。这是非常令人惊奇的，因为苯丙氨酸在化学上与半胱氨酸相差很大，一般不选作半胱氨酸的替代物。
因此在以下的实施例中我们重点研究C228F突变体pro-IEPD-GrB-H6 C228F，与pro-IEGR-GrB-H6进行比较。
实施例3
使用纯化的牛因子Xa激活pro-IEGR-GrB-H6融合蛋白，以及pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6的自我激活
因子Xa激活pro-IEGR-GrB-H6
根据实施例2中的描述制备单体未激活的pro-IEGR-GrB-H6，直接从SP Sepharose离子交换的洗脱物中取样。向1毫克pro-IEGR-GrB-H6(大约10毫升)被如此激活，即加入50μg FXa(50μl的1mg/ml储液)，室温孵育几天。pro-IEGR-GrB-H6被FXa切割/激活产生GrB-H6的程度，通过SDS PAGE进行分析。
此外，pro-IEGR-GrB-H6和FXa孵育的过程中使用以下的显色反应体系对粒酶B活性监测几天：500μl缓冲液(100mM NaCl，50mM Tris-HClpH8.0)，4μl100mM Ac-IEPD-pNA，和5μl孵育混合物。将100μlPro-IEGR-GrB-H6(大约10μg)与1μl FXa(1mg/ml)混和制备孵育混合物，孵育时维持在4℃。结果总结在表3和图1中。
表3：
| 时间 | 时刻(小时) | ΔOD405/min |
| 0小时 | 0 | 0.0073 |
| 2小时 | 2 | 0.0200 |
| 5小时 | 5 | 0.0250 |
| 19小时 | 19 | 0.0829 |
| 2天 | 45 | 0.1325 |
| 5天 | 120 | 0.1832 |
为了除去加入的FXa，将孵育混合物上样于SP SepharoseTMFastFlow(Amersham Biosciences)离子交换层析柱上，用250mM NaCl，50mM Tris-HCl pH7.0洗柱。FXa不与层析介质结合，而产生的GrB-H6用750mM NaCl，50mM Tris-HCl pH7.0从层析柱上洗脱。
呈色活性测定
为了测定加入的FXa是否被正确地从孵育混合物中除去，在FXa加入和除去的前后对GrB-H6和FXa的活性进行测定，使用底物S2222(N-苯甲酰-L-异亮氨酰-L-谷氨酰-甘氨酰-L-精氨酰-p-硝基苯胺，Chromogenix，意大利，目录编号S2222)和Ac-IEPD-pNA(N-乙酰-L-异亮氨酰-L-谷氨酰-L-脯氨酰-L-天冬氨酰-p-硝基苯胺，Calbiochem，La Jolla，美国，目录编号368067)，吸收在405nm测量大约3分钟，计算ΔOD405/min。使用以下的混合物测定FXa活性：500μl缓冲液，25μl3mM S2222，和5μl FXa。使用以下的混合物测定GrB-H6活性：500μl缓冲液，2μμl 100mM Ac-IEPD-pNA，和5μl GrB-H6。
使用的缓冲液是100mM NaCl，50mM Tris-HCl pH8.0或100mMHEPES pH7.4。使用100mM NaCl，50mM Tris-HCl pH8.0缓冲液的实例在下面的表3中示出，其中使用了除去FXa后SP Sepharose洗脱物中的顶层级分(the top fraction)。
表4：
可以从上面的表4中看出，通过SP SepharoseTM Fast Flow离子交换层析，加入的FXa被完全从激活混合物中除去。使用包含100mMHEPES pH7.4的缓冲液得到相同的结果。
pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6的自我激活
根据实施例2中的描述，使用实施例1中描述的表达载体pT7-IEPD-GrB-H6和pT7-IEAD-GrB-H6制备重组的自我激活人粒酶B衍生物IEPD-GrB-H6和IEAD-GrB-H6。从SP Sepharose层析柱上洗脱IEAD-GrB-H6和IEPD-GrB-H6蛋白，在4℃保存2天，然后使用呈色检测对各自洗脱物的顶层级分进行活性测定。对于这一目的使用以下的混合物：500μl缓冲液(100mM HEPES pH7.5)，2μl100mMAc-IEPD-pNA，和5μl蛋白质溶液。吸收的改变在405nm测量3分钟。在4℃继续孵育1天和2天后再次测定活性。结果总结于表5中。
表5：
| 蛋白质 | ΔOD405/min | |
| IEAD-GrB-H6 | 2天 | 0.1372 |
| IEPD-GrB-H6 | 2天 | 0.1284 |
| IEAD-GrB-H6 | 3天 | 0.1607 |
| IEPD-GrB-H6 | 3天 | 0.1375 |
| IEAD-GrB-H6 | 4天 | 0.1983 |
| IEPD-GrB-H6 | 4天 | 0.1351 |
可以从表5中看到，自我激活衍生物pro-IEPD-GrB-H6和pro-IEAD-GrB-H6不需要加入任何事先活化的粒酶B即可被激活，且自我激活过程在4℃下至少三或四天后才能完成。
实施例4
用小的呈色肽底物测定粒酶B的活性
激活和纯化的GrB-H6的活性在不同的缓冲液中使用底物Ac-IEPD-pNA进行测量：500μl缓冲液，2μl 100mM Ac-IEPD-pNA，和5μl GrB-H6。除非特别说明，从第一个0.75分钟开始计算ΔOD405/min。
表6：
TN＝100mM NaCl，50mM Tris-HCl
可以从上面的表6中看到，在所有研究的缓冲液中，100mM HEPESpH7.4-7.5对于GrB-H6的活性是最佳的。
在随后用GrB-H6 C228F进行的pH筛选实验中，对底物Ac-IEPD-pNA的活性最佳的pH是100mM HEPES，pH范围7.5-7.8。
为了测定稳态动力学参数KM和kcat，使用与上面描述相同的呈色检测，检测比色皿中的总体积是500微升。检测缓冲液是100mM HEPESpH7.75，在每一次测定中使用的GrB-H6或GrB-H6 C228F浓度都是20nM。使用以下的底物浓度作Lineweaver-Burk曲线：5，40，150，300，和600μM。得到的结果在下面的表7中示出：
表7：
| GrB-H6 | GrB-H6 C228F | |
| KM(μM) | 66.9 | 27.0 |
| kcat(s-1) | 5.03 | 4.85 |
| kcat/KM(104s-1M-1) | 7.5 | 18.0 |
在上面的表7中示出的GrB-H6和GrB-H6 C228F的KM、kcat和kcat/KM测定数值与重组大鼠GrB的数值(Harris J.L.等人，1998)非常相近。
实施例5
GrB-H6和GrB-H6 C228F特异性以及GrB-H6 C228F稳定性的测定
GrB-H6和GrB-H6 C228F的特异性
除了实施例4中应用的Ac-IEPD-pNA底物以外，使用呈色底物Ac-LEED-pNA、Ac-VEID-pNA、Ac-YVAD-pNA和Ac-DEVD-pNA检测GrB-H6和GrB-H6 C228F蛋白酶的特异性。同样在500μl 100mM HEPES pH7.75中进行活性检测，底物浓度为400μM。每一次测定时在检测比色皿中加入1微克蛋白酶。所有的检测重复三次，设定在Ac-IEPD-pNA上的活性测量为100％对获得的活性数据进行标准化。结果在图2中示出，可以看到GrB-H6蛋白酶的特异性至少与GrB-H6 C228F蛋白酶的特异性相同。
GrB-H6 C228F的稳定性
为了测定GrB-H6 C228F蛋白酶的稳定性，GrB-H6 C228F样品在100mM HEPES pH7.4中于4℃、23℃和37℃下分别孵育15天。选择100mM HEPES缓冲液的目的是检查任何自体切割和降解，但是没有从SDS PAGE观察到明显的“自体裂解”(参见图3A)。在孵育期间还测定了对显色底物Ac-IEPD-pNA的水解活性，参见图3B。
GrB-H6 C228F蛋白酶在4℃和23℃非常稳定。于23℃孵育15天，活性只轻度下降了大约10％，在凝胶中几乎看不见降解的片段。即使于37℃在15天后仍剩余大约20％的活性，在凝胶中只有很少的降解片段。
还发现GrB-H6 C228F蛋白酶在10分钟的短时间内直至50℃都是稳定的(这里没有显示)。在该实验中蛋白酶的样品在给定的温度下孵育10分钟然后放回室温，于23℃孵育10分钟。在23℃测定对Ac-IEPD-pNA的活性。蛋白酶的孵育温度在50℃下，在返回室温(23℃)孵育后活性几乎100％的恢复，但是在50℃以上的温度下孵育，蛋白酶就不能再恢复为活性形式了，只能检测到很少的活性。
实施例6
含有可被GrB-H6和GrB-H6 C228F切割的识别序列的融合蛋白表达载体的设计和构建
为了制备适宜的融合蛋白作为GrB-H6和GrB-H6 C228F的底物，将可以被FXa切割的融合蛋白H6-FX-TripBUB，H6-IEGR-RAP，H6Ubi-IEGR-ApoAl，和H6-FX-TN123(分别由pT7H6-FX-TripBUB，pT7H6-FX-RAP，pT7H6Ubi-FX-ApoAl，和pT7H6-FX-TN123编码)中的FXa识别序列IEGR或IQGR改为IEPD，得到构建体H6-TripUB IEPD↓SP(序列编号22)，H6-IEPD-RAP(序列编号23)，H6Ubi-IEPD-ApoAl(序列编号24)，和H6-IEPD-TN123(序列编号25)。
在构建体H6-TripUB IEPD↓SP中，粒酶B的识别序列是IEPD↓SP，其中↓表示了切割位点。这个识别序列位于构建体中H6和TripUB部分之间，其中位于可被切割的肽键C端的两个氨基酸残基S和P是TripUB的N端部分。
在以下H6-TripUB融合蛋白(称为H6-TripUB变异体)中的识别序列作为它们名称的最后部分，如XXXX↓YY，其中XXXX是位于六聚His和TripUB之间的粒酶B识别序列的一部分，而YY是TripUB的一部分。
H6-TripUB IEPD↓SP构建体中的IEPD↓SP切割位点改变为另外的8个切割位点，得到以下的变异体：H6-TripUB IQAD↓SP(序列编号26)，H6-TripUB IQAD↓SG(序列编号27)，H6-TripUB VGPD↓SP(序列编号28)，H6-TripUB VGPD↓FG(序列编号29)，H6-TripUB IEPD↓TQ(序列编号30)，H6-TripUB IEPD↓IV(序列编号31)，H6-TripUB IEPD↓EP(序列编号32)，和H6-TripUB IEPD↓EG(序列编号33)，其中↓表示切割位点。在这8个构建体的6个中，融合蛋白的P1′和P2′位点(都是TripUB的一部分)被改变，即H6-TripUB IQAD↓SG，H6-TripUB VGPD↓FG，H6-TripUB IEPD↓TQ，H6-TripUB IEPD↓IV，H6-TripUB IEPD↓EP，和H6-TripUB IEPD↓EG。
融合蛋白表达载体的构建
根据生产商的说明，使用QuikChangeTM定点突变试剂盒(STRATAGENE，目录编号200518)构建表达载体pT7H6-TripUB IEPD↓SP，载体pT7H6-FX-TripBUB(国际专利申请WO 9856906)作为模板，寡聚核苷酸引物为：TripUB GrB fw(序列编号：34)和TripUB GrBrev(序列编号：35)。
使用载体pT7H6-FX-RAP(
等人，1992)作为模板以及寡聚核苷酸引物RAPGrB fw(序列编号：36)和RAP GrBr ev(序列编号：37)根据上面的描述通过定点突变构建表达载体pT7H6-IEPD-RAP。
使用载体pT7H6Ubi-FX-ApoAl(国际专利申请W00238609)作为模板以及寡聚核苷酸引物Mut-GrB fw(序列编号：38)和Mut-GrB rev(序列编号：39)根据上面的描述通过定点突变构建表达载体pT7H6Ubi-IEPD-ApoAl。
使用载体pT7H6-FX-TN123(Holtet等人，1997)作为模板以及寡聚核苷酸引物TN GrB fw(序列编号：40)和TN GrB rev(序列编号：41)根据上面的描述通过定点突变构建表达载体pT7H6-IEPD-TN123。
使用载体pT7H6-FX-TripBUB(W09856906)作为模板以及寡聚核苷酸引物PC7TripUB GR-AD fw(序列编号：42)和PC7TripUB GR-AD rev(序列编号：43)根据上面的描述通过定点突变构建表达载体pT7H6-TripUB IQAD↓SP。
使用载体pT7H6-TripUB IQAD↓SP作为模板以及寡聚核苷酸引物PC7TripUB P-G fw(序列编号：44)和PC7TripUB P-G rev(序列编号：45)根据上面的描述通过定点突变构建表达载体pT7H6-TripUB IQAD↓SG。
使用载体pT7H6-TripUB IEPD↓SP作为模板和寡聚核苷酸引物DNATrip IE-VG fw(序列编号：46)和DNATrip IE-VG rev(序列编号：47)根据上面的描述通过定点突变构建表达载体pT7H6-TripUB VGPD↓SP。
使用载体pT7H6-TripUB VGPD↓SP作为模板以及寡聚核苷酸引物DNATrip SP-FG fw(序列编号：48)和DNATrip SP-FG rev(序列编号：49)根据上面的描述通过定点突变构建表达载体pT7H6-TripUB VGPD↓FG。
使用载体pT7H6-TripUB IEPD↓SP作为模板以及寡聚核苷酸引物Trip IEPD-TQ(序列编号：50)和UB3(序列编号：52)通过PCR反应构建表达载体pT7H6-TripUB IEPD↓TQ。产生的PCR产物用BamHI和HindIII酶切然后连接到BamHI-HindII酶切的pT7H6(GS)3载体(Christensen J.H等人，1991)中。
使用载体pT7H6-TripUB IEPD↓SP作为模板以及寡聚核苷酸引物Trip IEPD-IV(序列编号：51)和UB3(序列编号：52)通过PCR反应构建表达载体pT7H6-TripUB IEPD↓IV。产生的PCR产物用BamHI和HindIII酶切然后连接到BamHI-HindII酶切的pT7H6(GS)3载体(Christensen J.H等人，1991)中。
使用载体pT7H6-TripUB IEPD↓SP作为模板和寡聚核苷酸引物TripUB EP fw(序列编号：53)和TripUB EP rev(序列编号：54)根据上面的描述通过定点突变构建表达载体pT7H6-TripUB IEPD↓EP。
使用载体pT7H6-TripUB IEPD↓EP作为模板以及寡聚核苷酸引物TripUB EG fw(序列编号：55)和TripUB EG rev(序列编号：56)根据上面的描述通过定点突变构建表达载体pT7H6-TripUB IEPD↓EG。
表8：寡聚核苷酸引物
| 引物 | 核苷酸序列 | 序列编号 |
| TripUB GrB fw | 5’-GTGGATCCATCGAGCCTGACTCTCCTGGTACCGAGCC-3’ | 34 |
| TripUB GrB rev | 5’-GGTACCAGGAGAGTCAGGCTCGATGGATCCACTACCAC-3’ | 35 |
| RAP GrB fw | 5’-CGGATCCATCGAGCCTGACTACTCGCGGGAGAAG-3’ | 36 |
| RAP GrB rev | 5’-CCCGCGAGTAGTCAGGCTCGATGGATCCGTGATG-3’ | 37 |
| Mut-GrB fw | 5’-CGTGGTGGATCCATCGAGCCGGACGGTGGAGATGAACCCCCC-3’ | 38 |
| Mut-GrB rw | 5’-GGGGGGTTCATCTCCACCGTCCGGCTCGATGGATCCACCACG-3’ | 39 |
| TN GrB fw | 5’-GGATCCATCGAGCCTGACGGCGAGCCACCAACC-3’ | 40 |
| TN GrB rev | 5’-GGCTCGCCGTCAGGCTCGATGGATCCGTGATGG-3’ | 41 |
| PC7TripUB GR-AD fw | 5’-GGATCCATCCAGGCAGACTCTCCTGGTACCGAG-3’ | 42 |
| PC7TripUB GR-AD | 5’-GTACCAGGAGAGTCTGCCTGGATGGATCCACTAC-3’ | 43 |
| rev | ||
| PC7TripUBP-G fw | 5’-GGATCCATCCAGGCAGACTCTGGTGGTACCGAGCCAC-3’ | 44 |
| PC7TripUBP-G rev | 5’-CTCGGTACCACCAGAGTCTGCCTGGATGGATCCACTAC-3’ | 45 |
| DNATrip IE-VG fw | 5’-GTAGTGGATCAGTCGGGCCTGACTCTCCTGGTAC-3’ | 46 |
| DNATrip IE-VG rev | 5’-GAGAGTCAGGCCCGACTGATCCACTACCACTACC-3’ | 47 |
| DNATrip SP-FG fw | 5’-GGCCTGACTTTGGTGGTACCGAGCCACCAAC-3’ | 48 |
| DNATrip SP-FG rev | 5’-GGCTCGGTACCACCAAAGTCAGGCCCGACTG-3’ | 49 |
| Trip IEPD-TQ | 5’-GGGAAAGGATCCATCGAGCCTGACACCCAGAAGCCCAAGAAGATTGTAAATG-3’ | 50 |
| Trip IEPD-IV | 5’-GGGAAAGGATCCATCGAGCCTGACATTGTAAATGCCAAGAAAGATGTTGTGAAC-3’ | 51 |
| UB3 | 5’-CGCAAGCTTGCATGCTTAGGATCCACCACGAAGTCTCAA-3’ | 52 |
| TripUB BP fw | 5’-CGAGCCTGACGAGCCTGGTACCGAGCCAC-3’ | 53 |
| TripUB EP rev | 5’-CGGTACCAGGCTCGTCAGGCTCGATGGATC-3’ | 54 |
| TripUB EG fw | 5’-CCTGACGAGGGTGGTACCGAGCCACCAAC-3’ | 55 |
| TripUB EG rev | 5’-GCTCGGTACCACCCTCGTCAGGCTCGATG-3’ | 56 |
实施例7
含有可被GrB-H6和GrB-H6 C228F切割的识别序列的融合蛋白的表达、纯化和重折叠
融合蛋白的表达
为了制备嵌合融合蛋白H6-TripUB IEPD↓SP，H6-IEPD-RAP，H6-IEGR-RAP，H6Ubi-IEPD-ApoAl，H6Ubi-IEGR-ApoAl，H6-IEPD-TN123和H6-TripUB变异体，对表达载体pT7H6-TripUB IEPD↓SP，pT7H6-IEPD-RAP，pT7H6-FX-RAP，pT7H6Ubi-IEPD-ApoAl，pT7H6Ubi-IEGR-ApoAl，pT7H6-IEPD-TN123，pT7H6-TripUB IQAD↓SP，pT7H6-TripUB IQAD↓SG，pT7H6-TripUB VGPD↓SP，pT7H6-TripUB VGPD↓FG，pT7H6-TripUB IEPD↓TQ，pT7H6-TripUB IEPD↓IV，pT7H6-TripUB IEPD↓EP，和pT7H6-TripUB IEPD↓EG(后面8个是H6-TripUB变异体)在大肠杆菌BL21中进行中等规模的培养(3升；2xTY培养基，5mM MgSO4和0.1mg/ml氨苄青霉素)，根据Studier FW等人(1990)的描述。在37℃生长呈对数生长的培养物于OD600＝0.8时用噬菌体λCE6感染，感染复数约为5。于37℃继续培养4小时，离心收获细胞。将细胞重悬于100毫升750mM NaCl，100mM Tris-HClpH8，1mM EDTA pH8中。加入苯酚(150毫升，用Trima碱调节pH至8)，超声波处理混合物以提取总蛋白。离心(25分钟，10.000g)澄清后，向苯酚相中加入2.5倍体积的96％乙醇离心沉淀粗蛋白质级分。蛋白质沉淀溶于75毫升6M盐酸胍、50mM Tris-HCl pH8，和100mM二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液中。
H6-TripUB IEPD↓SP，H6-IEPD-RAP，H6-IEGR-RAP，
H6Ubi-IEPD-ApoAl，H6Ubi-IEPD-ApoAl以及H6-TripUB变异体的纯化
使用SephadexTMG-25 Fine(Amersham Biosciences)凝胶过滤将蛋白洗脱到8M尿素，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl pH8，和10mM 2-巯基乙醇的缓冲液中后，将H6-IEPD-TripUB和H6-IEPD-RAP融合蛋白的粗蛋白制备物分批上样吸附于Ni2+活化的NTA-琼脂糖层析柱(Ni2+-NTA-agarose，Quiagen)上(柱体积通常为50-75毫升)进行纯化(Hochuli E等人，1988)。层析柱按照以下洗涤：
1.2x柱体积8M尿素，500mM NaCl，50mM Tris-HCl pH8，和10mM 2-巯基乙醇
2.1x柱体积8M尿素，500mM NaCl，50mM磷酸钠pH6.3，和10mM 2-巯基乙醇
3.1x柱体积6M盐酸胍，50mM Tris-HCl pH8，和10mM 2-巯基乙醇
4.2x柱体积500mM NaCl，和50mM Tris-HCl pH8
用500mM NaCl，50mM Tris-HCl pH8，和10mM EDTA洗脱纯化的融合蛋白。
H6-IBPD-TN123融合蛋白的纯化和重折叠
使用SephadexTMG-25Fine(Amersham Biosciences)凝胶过滤将蛋白洗脱到8M尿素，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl pH8，和10mM 2-巯基乙醇的缓冲液中后，将H6-IEPD-TN123融合蛋白的粗蛋白制备物分批上样吸附于Ni2+活化的NTA-琼脂糖层析柱(Ni2+-NTA-agarose，Quiagen)上(柱体积通常为50-75毫升)进行纯化和体外重折叠。层析柱按照以下洗涤：
1.2x柱体积8M尿素，500mM NaCl，50mM Tris-HCl pH8，和10mM 2-巯基乙醇
2.1x柱体积8M尿素，500mM NaCl，50mM磷酸钠pH6.3，和10mM 2-巯基乙醇
3.1x柱体积6M盐酸胍，50mM Tris-HCl pH8，和10mM 2-巯基乙醇
然后使用
等人用于纤溶酶原kringle 4的循环重折叠步骤(国际专利申请WO 9418227)对每一个融合蛋白进行重折叠。重折叠步骤完成之后用500mM NaCl，50mM Tris-HCl pH8，10mM EDTA将每一个重折叠的蛋白从Ni2+-NTA-琼脂糖层析柱上洗脱。
每一个重折叠蛋白的各个级分通过凝胶过滤洗脱到50mM NaCl，25mM乙酸钠pH5.0和1mM CaCl2中，然后进一步使用SP SepharoseTMFast Flow(Amersham Biosciences，1.6厘米直径(i.d.)20厘米长层析柱)离子交换层析进行纯化，使用盐梯度从50mM NaCl，25mM乙酸钠pH5.0，1mM CaCl2到1M NaCl，25mM乙酸钠pH5.0，1mM CaCl2进行洗脱。
每一个正确折叠蛋白产物的最后纯化是通过凝胶过滤将其洗脱到25mM NaCl，10mM Tris-HCl pH8，和1mM CaCl2中，然后进一步使用Q SepharoseTMFast Flow(Amersham Biosciences，1.6厘米直径(i.d.)20厘米长层析柱)离子交换层析进行纯化，使用盐梯度从25mMNaCl，10mM Tris-HCl pH8，和1mM CaCl2到500mM NaCl，10mM Tris-HClpH8，和1mM CaCl2进行洗脱。
实施例8
使用GrB-H6，GrB-H6 C228F和FXa对制备的融合蛋白进行切割
用GrB-H6切割H6-TripUB IEPD↓SP
Ni2+-NTA-琼脂糖层析柱上洗脱的融合蛋白H6-TripUB IEPD↓SP(根据实施例7中的描述制备)通过凝胶过滤洗脱到100mM HEPES pH7.5中，取200微升顶层级分样品分别与0、1或10μl激活的GrB-H6(大约0，0.2和2μg GrB-H6)共同在室温下孵育。
12，19，和24小时孵育后取样，进行SDS PAGE，凝胶示于图4和5中。
只有正确切割的产物在图4的C-D泳道和图5的C-G泳道中出现，孵育时间越长，泳道中出现的切割产物越多，对于加入1和10μlGrB-H6的结果是相同的。观察到的单一带型在图6中予以解释。从这里就很清楚GrB-H6对H6-TripUB IEPD↓SP上的单一位点进行特异性切割。在IEPD序列后的正确位点进行切割在图4的E泳道中得到确证，此处含有FXa识别位点IQGR而不是GrB识别位点IEPD的构建体H6-FX-TripUB被FXa切割产生与被GrB-H6切割的H6-TripUB IEPD↓SP同样大小的产物。
温度以及添加Ni
2+
和NTA对H6-TripUB IEPD↓SP被GrB-H6切割
的影响
用H6-TripUB IEPD↓SP融合蛋白建立以下9个孵育(表9)，每一个孵育使用200μl H6-TripUB IEPD↓SP和5μl GrB-H6(大约1μgGrB-H6)。
表9：
2，7和22小时孵育后取样进行SDS PAGE，参见图7、8和9。
预期Ni2+离子会结合融合蛋白的N端六聚His尾巴(H6)，使GrB-H6更容易接近被其识别的切割位点。此外，Ni2+离子还结合GrB-H6构建体的C端六聚His尾巴。加入NTA罩住了溶液中的Ni2+离子，与在Ni2+-NTA琼脂糖凝胶珠上出现的情况相同，即模拟了Ni2+-NTA琼脂糖层析柱上的环境。
图7显示了于23℃的孵育，图8显示了于37℃的孵育，图9显示了于42℃的孵育。当没有添加Ni2+或NTA时，H6-TripUB IEPD↓SP融合蛋白的切割与在图4和5中观察到的相似，尽管22小时后似乎于37℃的孵育是所检测的三个温度下最佳的孵育温度。
加入4.2mM Ni2+后一些蛋白在较高的温度37℃和42℃下沉淀，但是在23℃下没有看到沉淀。因此在这两个温度下2小时孵育后在凝胶中看不到融合蛋白被进一步切割，似乎一些H6-TripUB IEPD↓SP和GrB-H6都沉淀了。与没有添加Ni2+相比，于23℃下更多的融合蛋白在22小时后被切割。
向孵育混合物中加入5mM NTA消除了观察到的沉淀问题。于23℃下孵育22小时后，与没有添加Ni2+或NTA相比，更多的融合蛋白被切割，所以添加Ni2+和NTA似乎加速了切割反应。通过进一步提高温度至37℃和42℃，观察到切割速率有更大的提高。于37℃下孵育22小时后，几乎所有的融合蛋白都被切割为正确的产物。于42℃孵育22小时后，与37℃相比只有少量的融合蛋白没有被切割。
将在图4和5中显示的实验中最初估计的切割速率与这里观察到的切割速率相比，显然添加Ni2+和NTA以及在37℃孵育极大地加速了GrB-H6对H6-TripUB IEPD↓SP的特异切割。
GrB-H6对H6-IEPD-RAP的切割
Ni2+-NTA-琼脂糖层析柱上洗脱的融合蛋白H6-IEPD-RAP(根据实施例7中的描述制备)通过凝胶过滤洗脱到100mM HEPES pH7.4中，取200微升顶层级分样品分别与0，1或10μl激活的GrB-H6(大约0，0.2和2μg GrB-H6)共同在室温下孵育。5，23和26小时孵育后取样进行SDS PAGE，参见图10。
根据上面的描述，与1或10μl GrB-H6共同孵育仅5小时后，所有的H6-IEPD-RAP都被切割产生正确的最终产物。还很清楚在RAP中至少有一个内部切割位点，但是该内部位点的切割却比IEPD序列的切割慢得多。通过比较纯化的H6-FX-RAP样品被FXa部分切割的产物(泳道H)或者完全切割给出最终的RAP产物(泳道I)的大小，可以看到GrB-H6在IEPD序列处将H6正确地切掉了。在这些泳道中，任何由FXa进行内部切割产生的降解产物都被纯化除去。
GrB-H6切割H6-IEPD-RAP和FX
a
切割H6-IEGR-RAP的比较
将GrB-H6切割H6-IEPD-RAP与FXa切割H6-IEGR-RAP进行比较。H6-IEPD-RAP和H6-IEGR-RAP都溶于100mM HEPES pH7.4中，在室温23℃下进行以下的孵育，蛋白酶和融合蛋白的比例是1:1000。
1.400μl(约500μg)H6-IEGR-RAP+0.5μl FXa(1mg/ml)(约0.5μg)
2.400μl(约400μg)H6-GrB-RAP+2μl GrB-H6(约0.4μg)
0，1/2，1，3，5，7和27小时孵育后取样进行SDS PAGE，参见图11。
显然两种情况下，融合蛋白都被它们相应的蛋白酶迅速地切割。两种孵育中，仅仅半小时后几乎所有的融合蛋白都已经被切割产生正确的产物。
但是27小时后，在H6-IEGR-RAP+FXa的孵育中，所有的融合蛋白都已经被降解产生不同的小片段，而没有剩余的正确切割的产物。
在H6-IEPD-RAP+GrB-H6的孵育中也看到了降解的片段，但是没有在H6-IEGR-RAP+FXa的孵育中那么多。在RAP中的19个可能位点(RAP产物中有19个Asp残基)中似乎只有一个GrB-敏感的位点，而有几个FXa敏感位点(26个可能的位点，26个Arg残基)。这减缓了H6-IEPD-RAP被GrB-H6的降解，所以在27小时孵育后仍然存在相当多的正确切割的产物(大约25％)。
总之，GrB-H6对RAP融合蛋白的正确切割与FXa对RAP融合蛋白的切割一样迅速，但是GrB-H6对RAP融合蛋白的降解要比FXa对RAP融合蛋白的降解慢得多。因此在这个实施例中GrB-H6优于FXa，而且也显示GrB-H6是一个非常特异的蛋白酶。
GrB-H6 C228F切割H6Ubi-IEPD-ApoAl和FX
a
切割H6Ubi-IEGR-ApoAl
的比较
对于H6Ubi-IEPD-ApoAl+GrB-H6 C228F以及H6Ubi-IEGR-ApoAl+FXa的切割反应，蛋白酶和底物的比例是1:1000，切割在100mM HEPESpH7.75中，室温23℃下进行。
1.250μl(约400μg)H6Ubi-IEPD-ApoAl+0.4μg GrB-H6 C228F
2.250μl(约350μg)H6Ubi-IEGR-ApoAl+0.35μg FXa
0，1，3，6，24和48小时在23℃孵育后取样进行SDS PAGE，参见图12。
GrB的底物H6Ubi-IEPD-ApoAl在23℃孵育仅6小时后约100％被切割，而6小时后只有一小部分的FXa的底物H6Ubi-IEGR-ApoAl被切割。还看到FXa需要48小时以上的时间以完全切割FXa底物。
在以上的两个实施例中GrB-H6和GrB-H6C228F蛋白酶，如所提及的，都优于FXa，因为它们比纯化的牛FXa切割时要迅速得多(对H6Ubi-X-ApoAl而言)，或者要特异得多(对于H6-X-RAP而言)(其中的X指的是识别位点IEPD或IEGR)。这两个实施例证明GrB-H6和GrB-H6 C228F可以既切除短的N端标签例如六聚His尾巴(H6-IEPD-RAP中的H6)，又可以在由一个短的衔接物序列(衔接物序列包含紧邻目标多肽的GrB切割位点)非常紧密连接的两个蛋白质结构域之间切割(在这里如H6Ubi-IEPD-ApoAl中的ApoAl，衔接物序列是GGSIEPD，其中IEPD是GrB的识别位点)。在以上两种情况中通过N端测序证实GrB-H6和GrB-H6C228F产生正确切割的产物。
GrB-H6对H6-IEPD-TN123的切割
QSepharose上洗脱的融合蛋白H6-IEPD-TN123(根据实施例7中的描述制备)通过最终纯化经凝胶过滤洗脱到100mM HEPES pH7.5中，取200微升顶层级分样品分别与0，1或10μl激活的GrB-H6(大约0，0.2和2μg GrB-H6)在没有钙存在或者5mM CaCl2存在的条件下共同在室温下孵育。没有CaCl2存在时孵育的样品在12、19、24小时以及5天孵育后取样进行SDS PAGE，参见图4、5和13。有和没有CaCl2存在时孵育的样品在大约20和48小时的孵育后取样进行SDS PAGE，参见图14。
无Ca2+：
当没有Ca2+存在时，H6-IEPD-TN123被GrB-H6切割显示了独特的带型，如图4、5和13所示。H6-IEPD-TN123在IEPD序列处被正确切割，而且与在内部位点AQPD序列处的切割同样迅速。这一带型在图15中予以解释。H6-IEPD-TN123在IEPD↓位点被正确切割可以从图4的泳道J中观察到，图4中小鼠H6-FX-TN123被FXa切割产生的产物的大小与GrB-H6在没有内部切割时切割H6-IEPD-TN123产生的产物大小相同，即带型中四条带中最靠下的条带。
当对样品进行还原处理如图13中的泳道B-D和L-N所示，出现了不同的带型。该带型也在图15中予以解释，并且支持了特异内部切割位点AQPD的观点。
有Ca2+存在：
图11显示了H6-IEPD-TN123与GrB-H6的孵育，其中在某些孵育中加入了5mM CaCl2。这里在钙存在时只出现两个条带(泳道E和G)，而没有钙存在时有四个条带，如图4、5、13和15中描述的。这表明在孵育中加入Ca2+，使GrB-H6不能接触到Tetranectin(TN123)中的内部切割位点AQPD。这是由于在Tetranectin中AQPD序列位于一个环内，其中Q和D残基参与与钙离子的结合。这样就只出现融合蛋白中的特异位点IEPD处被正确切割而TN123中的内部切割位点由于Ca2+的加入而被“关闭”。
H6-TripUB变异体的切割
每一个Ni2+-NTA-琼脂糖层析柱上洗脱的融合蛋白经凝胶过滤洗脱到100mM HEPES pH7.4中，使用五个不同变异体浓度大致相同的级分。五个变异体是H6-TripUB IEPD↓SP，H6-TripUB IQAD↓SP，H6-TripUB IQAD↓SG，H6-TripUB VGPD↓SP和H6-TripUB VGPD↓FG。每一种融合蛋白各取200微升，分别与5μl激活的GrB-H6(大约1μgGrB-H6)共同在室温23℃下孵育。蛋白酶和融合蛋白的比例是1:500。在2，6，24和48小时孵育后取样进行SDS PAGE，凝胶在图16和17中示出。
在图16中显示了H6-TripUB IEPD↓SP，H6-TripUB IQAD↓SP和H6-TripUB IQAD↓SG的样品。在48小时孵育后，大约2/3原来未切割的H6-TripUB IEPD↓SP已经被正确切割。与此相比，序列IQAD↓SP的切割要比H6-TripUB IEPD↓SP中序列IEPD↓SP的切割慢得多。2小时孵育后不能观察到产物，48小时孵育后只有少量被切割。从H6-TripUB IQAD↓SG样品来看，显然切割与H6-TripUB IEPD↓SP和H6-TripUB IQAD↓SP二者相比要快得多。2小时孵育后融合蛋白的大部分已经被切割产生正确的产物。识别序列中P2′位点上的Pro(P)到Gly(G)的单突变已经足以使切割速率发生如此巨大的改变。
在图17中显示了H6-TripUB VGPD↓SP和H6-TripUB VGPD↓FG孵育后的样品。对VGPD↓SP序列的切割几乎与图16中H6-TripUB IEPD↓SP的切割一样迅速。2小时后形成少量的产物而在48小时后大约一半量的融合蛋白已经被切割。在H6-TripUB VGPD↓SP中当P1′和P2′位点从SP改变为FG时，反应速率出现巨大的改变。仅仅2小时孵育后所有的融合蛋白都已经被正确切割。
图18显示了H6-TripUB IEPD↓TQ和H6-TripUB IEPD↓IV切割的样品与H6-TripUB IEPD↓SP切割的比较。两个构建体H6-TripUBIEPD↓TQ和H6-TripUB IEPD↓IV是H6-TripUB IEPD↓SP的Trip部分的删除突变体，其中在H6-TripUB IEPD↓TQ中删除了前7个残基而在H6-TripUB IEPD↓IV中删除了前13个残基。
这里蛋白酶和融合蛋白的比例也是1:500，反应在23℃下进行。4，24，和96小时孵育后取样进行SDS PAGE。
从图18所示的凝胶可以清楚看到对H6-TripUB IEPD↓TQ和H6-TripUB IEPD↓IV二者的切割都比H6-TripUB IEPD↓SP的切割要快得多。如以下得图19所示，这可能是由于H6-TripUB IEPD↓SP中P2′位置上的Pro所致。
图19，A显示了H6-TripUB IEPD↓SP和H6-TripUB IEPD↓EP的切割，而B显示了H6-TripUB IEPD↓EP和H6-TripUB IEPD↓EG的切割。这里蛋白酶与融合蛋白的比例还是1:500，切割反应混合物在23℃和37℃下孵育。对于A图中的凝胶，在0，4，24和48小时后取样进行SDS PAGE；对于B图中的凝胶，在0，6，24和50小时后取样进行SDS PAGE。
从这些凝胶中可以清楚看出P2′位置上的Pro对于使用GrB-H6C228F进行切割的速率是非常不利的。一个意外是GrB-H6 C228F能够切割含有IEPD↓EP位点的底物。它切割这个位点与切割IEPD↓SP具有相同的低效率，但是P1′位置上的一个酸性残基如Glu(E)是很不好的，因为这使大多数丝氨酸蛋白酶(如纯化的牛FXa)都不能切割。
如果我们现在考虑IEPD↓SP，IQAD↓SP，IQAD↓SG，IEPD↓EP，和IEPD↓EG的P1′P2′位置，P2′位置从色氨酸改变为甘氨酸显著增强了切割。Harris JL等人，1998使用噬菌体颗粒上展示的肽底物研究野生型大鼠GrB时也观察到P2′位置对G的偏好。同样GrB-H6 C228F在IEPD↓EG位点处表现出不可思议的有效切割，尽管P1′位置是E，如上所述，E在本领域内是众所周知的阻碍大多数丝氨酸蛋白酶切割的残基。在蛋白酶与底物的比例为1:500时，只需要不到5小时，GrB-H6C228F就能完成对H6-TripUbi IEPD↓EG的切割。在这方面GrB-H6C228F再次优于FXa。
除了这些观察之外，还有重要的一点是注意到即使与GrB-H6或GrB-H6 C228F共同孵育48小时以上，在任何H6-TripUB变异体中也没有发生内部切割，表明GrB-H6和GrB-H6 C228F非常特异地在工程化的识别位点处切割，尽管TripUB序列含有7个另外的Asp(D)残基。
实施例9
粒酶B的固定化
为了能够容易地从切割混合物中除去粒酶B酶，在以下描述的6个实验中使用GrB-H6 C228F变异体固定在凝胶基质上。
使用二乙烯砜活化的基质Mini-Leak(Kem-En-Tec)在0.3MNaHCO3/NaOH，pH8.6中进行固定化。使用两个水平的活化：每升沉降的小珠分别使用2-5毫摩尔和10-50毫摩尔的乙烯基团，对于每个活化水平，使用不同蛋白质浓度以及存在或者不存在PEG 20000的条件下进行三次实验。六次实验的结果总结在表10中。为了进行固定化，GrB-H6 C228F在0.3M NaHCO3/NaOH pH8.6中于蛋白质浓度根据Bradford检测使用牛血清白蛋白为标准品测定为4mg/ml。GrB-H6C228F溶液的酶活性根据实施例4中的描述进行测定，使用0.3MNaHCO3/NaOH、pH8.6缓冲液和30％PEG 20000、0.3M NaHCO3缓冲液作为检测缓冲液。将控干水的凝胶、蛋白质溶液和缓冲液混和起来以提供表10中列出的体积和浓度，随后在室温下混和48小时，进行固定化。
表10：
| 实验 | 活化水平(mM) | 蛋白质浓度(mg/ml) | ％PEG20000 | 效率(％) |
| A | 2-5 | 0.75 | 0 | 10 |
| B | 2-5 | 0.75 | 9 | 18 |
| C | 2-5 | 2 | 0 | 10 |
| D | 10-50 | 0.75 | 0 | 16 |
| E | 10-50 | 0.75 | 9 | 10 |
| F | 10-50 | 2 | 0 | 10 |
在通过离心控干凝胶并且除去上清后通过加入600μl0.2M乙醇胺，pH为9.0阻断多余的活性基团，随后在室温下混和过夜。通过用1M NaCl漂洗凝胶三次除去未结合的蛋白(离心后除去上清)，最后凝胶用250mM NaCl；50mM Tris-HCl，pH8.0漂洗。固定化的GrB-H6C228F的酶活性测定如下：称取控干的凝胶基质与300μl含有100mMHEPES，pH7.75；400μM Ac-IEPD-pNA(Calbiochem)的底物溶液混和，孵育一定时间后测量上清的0D405nm，确定每毫升底物溶液每克干胶的ΔOD405nm/min。使用固定化的GrB-H6 C228F的酶活性确定偶联效率，表达为计算出的酶活性(如果所有上样的酶都被偶联并且具有活性)的百分比。
偶联效率也在表10中列出，两个活化水平的偶联效率没有显著差异，对于两个蛋白浓度，偶联效率也处于相同的范围内，所以在固定化混合物中使用高蛋白质浓度则得到最高的偶联水平。还不能推断在偶联混合物中加入PEG 20000是否有利于固定化，对于高蛋白质浓度也没有对其进行测定。
对使用高蛋白浓度的两个固定化实验(实验C和F)测定了固定化的GrB-H6 C228F对使用尿素和盐酸胍(GdmCl)变性的稳定性。实验C和F的凝胶基质分成三小份，置于旋转小层析柱内，分别与8M尿素；0.5M NaCl；50mM Tris-HCl，pH8.0(尿素)、6M盐酸胍；50mM Tris-HCl，pH8.0(GdmCl)、或者100mM HEPES，pH7.75(HEPES)在室温下共同孵育30分钟，然后用100mM HEPES，pH7.75漂洗并平衡。然后根据上面的描述测定固定化GrB-H6 C228F的酶活性。
得到的酶活性在下面的表11中示出。使用尿素变性似乎有利于固定化的GrB-H6 C228F，因为孵育之后的酶活性与使用无变性能力的HEPES缓冲液孵育后的酶活性相比有所增加，而使用盐酸胍变性似乎使酶活性略微下降。
表11：
通过切割按照实施例6中制备的融合蛋白H6-TripUB IQAD↓SP和H6-TripUB IQAD↓SG证明了固定化的GrB-H6 C228F具有功能。来自六个固定化实验中的50μl凝胶基质进行切割实验。凝胶基质用200μl含有100mM HEPES，pH7.75的缓冲液重悬，并与100μl所述两种融合蛋白的每一种分别在室温下振荡孵育过夜。取出上清通过非还原SDS-PAGE进行分析，参见图20。
对于所有12个切割实验，融合蛋白都被切割产生对应于TripUbi部分的单一产物，H6融合伴侣已经从TripUbi部分上被切掉。正如预期，来自实验C和F的应该具有最高偶联水平的凝胶基质切割了略多的融合蛋白。没有测定切割效率。
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1.人粒酶B蛋白酶变异体，其中胰凝乳蛋白酶原编号228的半胱氨酸残基突变为苯丙氨酸。
2.根据权利要求1的人粒酶B蛋白酶变异体，其氨基酸序列如序列编号57所示。
3.根据权利要求1或2的人粒酶B蛋白酶变异体的用途，其用作为人粒酶B蛋白酶。
4.编码根据权利要求1或2中人粒酶B蛋白酶变异体的分离的核酸。
5.包含根据权利要求4的分离的核酸的重组载体。
6.被根据权利要求5的载体转化的宿主细胞。
7.制备根据权利要求1或2的人粒酶B蛋白酶变异体的方法，该方法包含以下步骤：
(i)提供包含有效连接于启动子的根据权利要求4的分离的核酸的重组载体；
(ii)使用所述的重组载体转化宿主细胞；
(iii)在表达人粒酶B蛋白酶变异体的条件下培养所述的宿主细胞；以及
(iv)选择地分离所述人粒酶B蛋白酶变异体。
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