CN1465702A - 人血管内皮生长因子与颗粒酶b融合蛋白的纯化及应用 - Google Patents
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Abstract
采用基因重组技术对血管内皮生长因子(VEGF)2－5外显子与颗粒酶B(GraB)基因进行重组，使VEGF2－5与GraB通过一段弹性的连接子连接形成融合基因，以期通过VEGF2－5与VEGFR的特异性结合，引导GraB靶向性地作用于新生血管内皮细胞，达到靶向性抗血管生成的目的。用原核细胞分泌型表达系统表达重组VEGF－GraB融合蛋白，用固定化金属亲和层析法结合凝胶过滤法纯化重组融合蛋白。用GraB丝氨酸蛋白酶活性测定实验及鸡胚尿囊膜血管生成药膜抑制实验测定重组VEGF－GraB融合蛋白的生物活性。
Description
技术领域
生物医药基因工程抗血管生成药物
背景技术
血管生成是实体瘤生长和增殖的必要条件，抑制或阻断肿瘤组织的血管生成，切断肿瘤细胞的营养供给，可以有效地抑制肿瘤的生长和转移。血管内皮生长因子(VEGF)是最特异、有效的血管生成刺激因子，VEGF及其受体VEGFR是血管生成的标志性分子，许多实验表明，抑制VEGF及VEGFR可以有效地抑制并阻断血管生成。已知的血管生成抑制剂，如内皮抑素、血管抑素等，主要通过竞争抑制方式抑制血管内皮细胞的生长，只能抑制血管内皮的进一步增生，对已形成的血管效果不好，而且需要较高的血药浓度。VEGF介导的毒素，由于对人体来说毒素是外源蛋白，会产生中和抗体，不适合于临床应用。
细胞免疫室机体抗肿瘤、抗病毒免疫的主要形式。颗粒酶B(granzyme B，GraB)是细胞毒T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)等免疫细胞发挥细胞毒作用的主要效应分子，具有诱导靶细胞凋亡及裂解作用。杀伤细胞识别靶细胞后，释放其特有的杀伤颗粒，其中含有GraB。GraB在穿孔素的协助下进入靶细胞内，通过多条途径诱导靶细胞凋亡。一方面，它激活凋亡蛋白CPP32酶原成为有活性的CASPASE 3，启动一系列蛋白酶级联水解反应；另一方面，它直接进入细胞核内，激活多聚ADP核糖多聚酶(PARP)，凋亡核酸酶复合体CAD/ICAD等使细胞基因组DNA断裂；此外，它还激活其他的caspase，诱导细胞凋亡。
发明内容
用基因重组技术对血管内皮生长因子(VEGF)2-5外显子与颗粒酶B(GraB)基因进行重组，使VEGF2-5与GraB连接形成融合基因，原核分泌型表达系统表达重组VEGF-GraB融合蛋白，金属亲和层析法纯化重组蛋白，获得具有通过VEGF2-5与VEGFR的特异性结合，引导GraB靶向性地作用于新生血管内皮细胞的基因重组特异性抗血管生成药物。
具体实施方式
对血管内皮生长因子(VEGF)2-5外显子与颗粒酶B(GraB)基因进行重组，使VEGF2-5与GraB通过一段弹性的连接子连接形成融合基因。将VEGF-GraB融合基因克隆到原核细胞分泌型表达载体PBAD/GIII的多克隆位点，并让其C-端与载体上的6His标签融合，以利于用固定化金属亲和层析法纯化重组融合蛋白。用重组载体PBAD/GIII-VEGF-GraB转化大肠杆菌，阿拉伯糖诱导重组蛋白表达，离心收集细菌，渗透休克法裂解细菌，获得可溶性重组融合蛋白，金属亲和纯化法结合凝胶过滤法纯化重组VEGF-GraB融合蛋白。高效液相色谱(HPLC)检测重组蛋白，纯度超过95％用于生物学活性检测。重组VEGF-GraB融合蛋白生物学活性的检测采用以下二种方法：(1)用GraB的荧光标记底物及抑制剂测定重组VEGF-GraB融合蛋白的GraB丝氨酸蛋白酶活性及酶解常数(Km)。(2)用鸡胚尿囊膜血管生成药膜抑制实验检测重组VEGF-GraB融合蛋白对血管的特异性抑制作用。并以磷酸缓冲液、单纯的GraB和VEGF2-5蛋白作阴性对照。
重组VEGF-GraB融合蛋白模拟了生理性的细胞免疫机制，不必活化免疫细胞而直接提高机体的细胞免疫水平。它直接抑制和破坏新生的血管，只要有VEGFR存在，就能被重组蛋白识别，作用效率高。通过破坏新生的血管，能在肿瘤组织周边形成一层隔离带，抑制肿瘤的生长和转移。
Claims (4)
1.一种抗血管生成新药，将血管内皮生长因子(VEGF)2-5外显子与颗粒酶B(GraB)基因进行重组融合，用原核或真核细胞表达系统表达重组VEGF-GraB融合蛋白，获得特异性抗血管生成基因工程药物。
2.对血管内皮生长因子(VEGF)2-5外显子与颗粒酶B(GraB)基因进行部分增减后，表达并纯化融合蛋白及其应用技术。
3.让颗粒酶B(GraB)与其他基因进行重组融合，用原核或真核细胞表达系统表达重组融合蛋白的技术。
4.重组GraB蛋白在其他治疗方法的应用技术。
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| CNA021245819A CN1465702A (zh) | 2002-06-21 | 2002-06-21 | 人血管内皮生长因子与颗粒酶b融合蛋白的纯化及应用 |
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| CNA021245819A Pending CN1465702A (zh) | 2002-06-21 | 2002-06-21 | 人血管内皮生长因子与颗粒酶b融合蛋白的纯化及应用 |
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| CN (1) | CN1465702A (zh) |
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|---|---|---|---|---|
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| CN102234332A (zh) * | 2010-04-26 | 2011-11-09 | 浙江海正药业股份有限公司 | 一种重组人血白蛋白及其融合蛋白的分离纯化工艺 |
| CN101412994B (zh) * | 2003-04-23 | 2012-05-30 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 使用粒酶b蛋白酶切割融合蛋白 |
| WO2020143043A1 (zh) * | 2019-01-11 | 2020-07-16 | 深圳市双科生物科技有限公司 | 一种靶细胞的识别与杀伤方法 |
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2002
- 2002-06-21 CN CNA021245819A patent/CN1465702A/zh active Pending
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