CN101405296A

CN101405296A - 编码杀虫蛋白的新基因

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Publication number: CN101405296A
Application number: CNA2007800099867A
Authority: CN
Inventors: J·范里; F·莫伊伦韦特; G·范埃尔迪克
Original assignee: Bayer CropScience NV
Current assignee: Bayer CropScience LP
Priority date: 2006-03-21
Filing date: 2007-03-16
Publication date: 2009-04-08
Anticipated expiration: 2027-03-16
Also published as: EA019029B1; AU2007228981B2; PL1999141T3; WO2007107302A3; CA2646471A1; CA2646471C; EP1999141B1; WO2007107302A2; US20170107534A1; EA200802018A1; AR059995A1; AU2007228981A1; EP1999141A2; US20100235951A1; US11060103B2; CN101405296B

Abstract

本发明涉及编码由苏云金芽孢杆菌产生的杀虫蛋白新的基因序列。特别是，本发明提供了编码Cry1C、Cry1B或Cry1D蛋白的新的嵌合基因，其可用于保护植物免受昆虫损害。这里也包括包含这类基因的植物细胞或植物和制备或使用它们的方法，以及包含这类嵌合基因和至少一种其它的这类嵌合基因的植物细胞或植物。

Description

编码杀虫蛋白的新基因

发明领域

本发明涉及编码由苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株产生的杀虫蛋白的新的基因序列。具体地说，本发明提供了编码Cry1C蛋白的新嵌合基因，其有益于保护植物免受昆虫侵害。此处也包括包含这类基因的植物细胞或植物，和制备或使用它们的方法，还有包含这类Cry1C嵌合基因和至少一种编码杀虫蛋白的其它基因(例如编码Cry1B或Cry1D蛋白的新基因序列)的植物细胞或植物。

背景技术

来自苏云金芽孢杆菌(这里简称为“Bt”)的菌株和蛋白质因其对昆虫害虫的特异毒性而广为所知，并被用于控制植物的昆虫害虫几乎达一个世纪之久。目前能够获得表达Bt蛋白的一些转基因植物物种，其有效地限制了昆虫对植物的损害。

尽管已经分离了许多杀虫Bt蛋白，仅部分Bt蛋白在已经商品化的转基因植物中，且仅在一些农作物中获得表达。多数商品化的转基因Bt植物属于大田作物，例如玉米和棉花。在较小的市场作物(例如蔬菜)中，仅部分植物物种用Bt基因转化以赋予其对主要鳞翅目昆虫害虫的抗性，但是迄今为止，没有解除管制且推向市场的对鳞翅目有抗性的蔬菜Bt植物或种子。Zhao等人(2003)已经描述了表达Cry1Ac或Cry1C Bt毒素的转基因绿花椰菜植物，以及在这些植物之间的杂交从而在相同植物中同时表达Cry1Ac和Cry1C毒素，但是这些植物尚未被商品化。包含Cry3A鞘翅目昆虫活性基因的NewLeaf^TM马铃薯在北美曾经短暂上市，但是在2001年已经撤离市场。

本发明提供编码Cry1C型Bt蛋白的新基因，其理想地与编码Cry1B或Cry1D型Bt蛋白的基因组合。

本发明的cry1C、cry1B或cry1D基因的DNA序列和本发明的修饰的转运肽的DNA序列(在所附的序列表中显示)是人工基因，未在天然中发现，并且与任何已知的DNA序列不同。实际上，SEQ ID No.1、3、10、14或16的任何一种DNA序列与最近似的已知DNA序列显示至多76.6％的序列同一性。

发明目的和概述

在本发明中，提供用于植物的一些新的来自Bt的昆虫控制基因。特别是，这类基因是用于蔬菜植物作物，特别是芸苔属植物，例如花椰菜、甘蓝、大白菜、芜菁、芥、油菜、羽衣甘蓝、绿花椰菜、抱子甘蓝、菠菜等。具体的，在本发明的一个实施方案中通过本发明的新基因保护下列芸苔属物种植物免受昆虫损害：埃塞俄比亚芥(B.carinata)、B.elongata、地中海圆白菜(B.fruticulosa)、芥菜型油菜(B.juncea)、欧洲油菜(B.napus)、瓢儿菜(B.narinosa)、黑芥(B.nigra)、甘蓝(B.oleracea)、B.perviridis、芜青(B.rapa)、B.rupestris、B.septiceps、B.tournefortii等，特别是甘蓝(Brassicaoleraceae)或欧洲油菜(Brassica napus)的植物物种。包含至少一种本发明的新基因的植物或种子可以通过植物细胞的转化和由此产生的包含本发明的基因的植物或种子获得。这里还包括通过与转化的植物杂交以含有至少一种本发明的基因和通过传统育种步骤的应用获得的植物或种子。显然要保护免受本发明新基因编码的Bt蛋白杀死或控制的昆虫物种损害的任何植物物种，都可以用本发明的基因转化以获得对这类昆虫具有增加的抗性的转基因植物和种子。

在一个实施方案中，本发明还提供技术的组合以允许从抗性管理角度而言产生最优化的产物。实际上，在本发明的一个实施方案中，本发明的植物产生至少2种不同的Bt蛋白，且这类蛋白质由稳定整合的本发明高表达cry基因编码，优选整合在植物基因组的单个基因座上。在本发明的一实施方案中，这样的至少2种Bt基因包括cry1C和cry1B基因、cry1C和cry1D基因，或本发明的cry1C、cry1B和cry1D基因的组合。在本发明的一个实施方案中，能够快速鉴定转基因植物的标记基因，优选除草剂抗性基因与本发明的cry基因处在相同的植物中，特别在相同的植物基因座中。在本发明的一个实施方案中，标记基因是编码膦丝菌素乙酰转移酶的基因或对草甘膦不敏感的EPSPS基因。

在发明中还提供新的cry1B和cry1D基因，特别是cry1B或cry1D嵌合基因，其可以在植物中高水平表达，例如cry1B1和cry1B2以及cry1D1和cry1D2基因。而且，这里提供包含任何这些基因的植物细胞、植物或种子，以及产生或单独或组合使用它们的方法。

本发明也提供编码杀虫蛋白的新基因，在其编码序列中包含功能性植物内含子。内含子的存在也保证当在内含子不能被剪接的环境(例如细菌或另外的原核微生物)中时，该基因不表达功能性蛋白。内含子在基因序列中的存在也允许在植物中获得高表达水平。

这里也包括本发明的Cry1C蛋白的变体，其包含从氨基酸位置29至氨基酸位置627的SEQ ID No.2序列，但是与SEQ ID No.2中的位置相比，其中下列位置处的一个、一些或全部的下列氨基酸改变：在氨基酸位置125处是丙氨酸，在氨基酸位置184处是缬氨酸，在氨基酸位置295处是精氨酸，在氨基酸位置454处是天冬氨酸，或在氨基酸位置593处是精氨酸。这里还提供本发明的Cry1B蛋白的变体，其包含从氨基酸位置31至氨基酸位置648的SEQ ID No.11序列，但是其中在SEQ ID No.11中位置151处的氨基酸是酪氨酸，或在SEQ ID No.11中位置353处的氨基酸是精氨酸，或这样的蛋白质：其中在SEQ ID No.11中位置151处的氨基酸是酪氨酸和在SEQ IDNo.11中位置353处的氨基酸是精氨酸。

本发明中还包括编码叶绿体转运肽的新的DNA，特别是包含从核苷酸位置7至核苷酸位置371的SEQ ID No.16序列，尤其是SEQ ID No.16的序列的DNA，以及这样的DNA：其编码蛋白质SEQ ID No.17的变体，例如包含从氨基酸位置3至氨基酸位置124的SEQ ID No.17序列的叶绿体转运肽，其中在位置55处的Cys氨基酸由Tyr替代，和/或其中Gly氨基酸添加在位置51处的Gly氨基酸之后。

特别的，本发明提供包含下列有效连接序列的嵌合基因：a)编码Cry1C蛋白的编码区，包含SEQ ID No.1、3、4或6中任一DNA或其变体，和b)能够在植物细胞中指导表达的启动子区。在一个实施方案中，这类启动子包含SEQ ID No.18或19的序列。在另一实施方案中，嵌合基因还包含3’多聚腺苷酸化和转录终止区，特别是来自黄顶菊(Flaveria bidentis)的NADP苹果酸酶基因的3’多聚腺苷酸化和转录终止区。在另一实施方案中，嵌合基因在启动子和编码区之间还包含来自稻(Oryza sativa)的绒毡层特异性E1基因的前导序列。

本发明也提供包含任意上述嵌合基因、还包含第二嵌合基因的DNA，所述第二嵌合基因包含下列有效连接的序列：a)编码Cry1B蛋白的第二编码区，包含SEQ ID No.8或10的DNA，和b)能够在植物细胞中指导表达的第二启动子区；或提供包含任意上述嵌合基因、还包含第二嵌合基因的DNA，所述第二嵌合基因包含下列有效连接的序列：a)编码Cry1D蛋白的第二编码区，包含SEQ ID No.12或14的DNA，和b)能够在植物细胞中指导表达的启动子区。在一个实施方案中，提供上述DNA，其中所述第二启动子区包含SEQ ID No.18或19的序列并且不同于所述第一启动子区；或其中所述第二嵌合基因还包含3’多聚腺苷酸化和转录终止区，特别是来自黄顶菊NADP苹果酸酶基因的3’多聚腺苷酸化和转录终止区。在一个实施方案中，在这些DNA中的第二嵌合基因在启动子和编码区之间还包含来自稻的绒毡层特异性E1基因的前导序列。

本发明也提供上述DNA，还包含第三嵌合基因，所述第三嵌合基因包含下列有效连接的序列：a)编码Cry1D蛋白的编码区，包含SEQ ID No.12或14的DNA，和b)能够在植物细胞中指导表达的启动子区。

在本发明中也包括包含稳定整合进入其基因组的任何上述基因或DNA的转基因植物细胞或植物，优选细胞或植物是芸苔属物种植物或植物细胞，特别是物种甘蓝的，更特别是卷心菜或花椰菜。

本发明中还包括任意上述嵌合基因或DNA用于控制昆虫害虫，以获得对昆虫具有增加的抗性的植物细胞、植物或种子的用途；任意上述嵌合基因或DNA在表达杀虫蛋白的转基因植物中延迟或阻止试图以这类植物为食的昆虫的昆虫抗性发展的用途；或任意上述嵌合基因或DNA保护卷心菜、油菜或花椰菜免受小菜蛾(Plutella xylostella)损害的用途。

这里也包括控制昆虫的方法，包括在田地中栽培或播种包含任意上述嵌合基因或DNA的植物的步骤；以及在芸苔属物种植物中控制昆虫的方法，包括在植物中表达任意上述嵌合基因或DNA的步骤；或产生对昆虫有抗性的植物或种子的方法，包括步骤a)获得用权利要求1-5中任一项的基因或权利要求6-12中任一项的DNA转化的植物，和b)选择含有所述基因或DNA的所述植物或其种子的子代。

根据本发明还提供包含下列有效连接的序列的嵌合基因：a)编码杀虫蛋白的编码序列的第一片段，b)植物内含子序列，c)所述编码序列的第二片段，d)能够在植物细胞中指导表达的启动子区，并且其中这样的嵌合基因在不剪接所述内含子的给定宿主细胞中不能够产生杀虫蛋白；特别是这样的嵌合基因，其中这类内含子是马铃薯(Solanum tuberosum)的ST-LS1基因的第二内含子。

这里还提供包含任意上述嵌合基因或DNA的微生物，特别是这类微生物属于埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)或农杆菌属(Agrobacterium)。

发明详述

根据本发明，“核酸序列”指单链或双链形式的DNA或RNA分子，优选DNA分子。这里使用的“分离的DNA”指非天然存在的或不在其原始存在的天然环境中的DNA，例如，在嵌合基因中与其它调控元件相连的DNA编码序列，转移进入另一宿主细胞(例如植物细胞)的DNA，或与任何天然存在的DNA序列相比具有不同核苷酸序列的人工、合成制备的DNA序列。

根据本发明，已经构建了编码Bt Cry毒素或其变体的核酸序列，特别是DNA序列。所述新的DNA序列在这里命名为cry1C1-4、cry1B1、cry1B2、cry1D1和cry1D2，其编码的蛋白质在这里命名为Cry1C(例如，Cry1C1、Cry1C3和Cry1C4)、Cry1B(例如Cry1B1和Cry1B2)和Cry1D(例如Cry1D1和Cry1D2)蛋白。这里也提供编码修饰的叶绿体转运肽的新的DNA序列，例如，包含从核苷酸位置7到核苷酸位置371的SEQ ID No.16的序列，特别是SEQ ID No.16序列的DNA，其被设计用于在植物，特别是蔬菜，例如芸苔属植物，特别是卷心菜和花椰菜中优化表达。

根据本发明，“Cry1C蛋白”指包含SEQ ID No.2的氨基酸序列的最小片段的任何杀虫蛋白，所述最小片段保留了杀虫活性(下文称为“最小毒性片段”)，特别是包含SEQ ID No.2中从氨基酸位置29至氨基酸位置627的氨基酸序列的任何蛋白质，优选包含SEQ ID No.2中从氨基酸位置3至氨基酸位置627的氨基酸序列的任何杀虫蛋白。这里也包括包含SEQ ID No.2(这里也称为Cry1C1蛋白)、SEQ ID No.5(这里也称为Cry1C3蛋白)或SEQID No.7(这里也称为Cry1C4蛋白)的氨基酸序列的杀虫蛋白。

Cry1C蛋白包含SEQ ID No.2中从氨基酸位置29至氨基酸位置627的氨基酸序列，其保留了天然产生的整个蛋白质的全部或大部分的杀虫活性，在其N-或C-末端部分添加蛋白质序列不破坏这一活性。因此，以含有或包括此区域的氨基酸序列表征的任何蛋白质是有用的，并构成本发明的部分。这包括包含SEQ ID No.2蛋白质的最小毒性蛋白质片段的杀虫杂合蛋白或嵌合蛋白。这一定义中还包括包含SEQ ID No.2中从氨基酸位置29至氨基酸位置627的氨基酸序列的蛋白质变体，例如杀虫蛋白包含的序列与SEQID No.2这一区域的氨基酸序列水平具有至少95％，特别是至少96％、97％、98％或99％的序列同一性，该序列同一性是在EMBOSS中使用寻找序列全长范围最佳比对的Needleman-Wunsch全局比对算法(Rice等人，2000)确定的，使用缺省设置(空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5；比较氨基酸序列使用EBLOSUM62矩阵)，优选蛋白质具有一些，优选5-10个，特别是少于5个氨基酸添加、替代或缺失，而不显著改变、优选不改变蛋白质的杀虫活性。本发明的Cry1C蛋白的优选的变体包括包含SEQ ID No.2中从氨基酸位置29至氨基酸位置627的序列的蛋白质，但是其中与在SEQ IDNo.2中的位置相比，在下列位置处的一个、一些或全部的下列氨基酸发生改变：在氨基酸位置125处是丙氨酸，在氨基酸位置184处是缬氨酸，在氨基酸位置295处是精氨酸，在氨基酸位置454处是天冬氨酸，或在氨基酸位置593处是精氨酸。这里也包括任何基于Cry1C的蛋白质变体、杂合蛋白或突变体，保留与上文定义的本发明Cry1C蛋白基本相同的杀虫活性。

如这里使用的术语“包含”某序列X的DNA或蛋白质，是指至少包括或含有序列X的DNA或蛋白质，从而可以在5’(或N-末端)和/或3’(或C-末端)端包括其它核苷酸或氨基酸序列，例如在EP 0 193 259公开的可选择标记蛋白(的核苷酸序列)、转运肽(的核苷酸序列)、和/或5’或3’前导序列。

出于本发明的目的，表达为百分比的两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”，是指在两个最佳比对序列中具有相同残基的位置数(×100)除以比较的位置数。空位即这样的位置，其中在比对中的该位置上，残基是在一个序列中存在而不在另一序列中，视为无相同残基的位置。两个序列的比对通过Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)在EMBOSS(Rice等人，2000)中进行，以在全长序列范围寻找最佳比对，使用缺省设置(空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5)。

如这里使用的，本发明Cry蛋白的“最小毒性片段”是保留杀虫活性的Cry蛋白的最小片段或部分，其可以通过例如胰蛋白酶或糜蛋白酶酶促消化全长Cry蛋白获得；或是保留杀虫活性的Cry蛋白的最小片段或部分，其可以通过在编码Cry蛋白的DNA中缺失核苷酸而获得。这样的最小毒性片段还可以通过用来自对这类Cry蛋白敏感的昆虫物种(即，被Cry蛋白杀死或以其它方式抑制其生长或进食)的昆虫肠液，优选中肠液，处理Cry蛋白而获得。

根据本发明，“Cry1D蛋白”指包含SEQ ID No.15的氨基酸序列的最小毒性片段的任何杀虫蛋白，特别是包含SEQ ID No.15中从氨基酸位置21或29至氨基酸位置604的氨基酸序列的任何杀虫蛋白，优选包含SEQ ID No.15中从氨基酸位置3至氨基酸位置604的氨基酸序列的任何杀虫蛋白。这里也包括包含氨基酸序列SEQ ID No.13(这里也称为Cry1D1蛋白)或SEQ IDNo.15(这里也称为Cry1D2蛋白质)的杀虫蛋白。包含SEQ ID No.15中从氨基酸位置29至氨基酸位置604的氨基酸序列的Cry1D蛋白保留天然产生的整个蛋白质的全部或大部分的杀虫活性，并且在其N-或C-末端部分添加蛋白质序列不破坏这一活性。因此，以含有或包括这一区域的氨基酸序列表征的任何蛋白质是有用的并构成本发明的部分。这包括包含SEQ ID No.15的蛋白质的最小毒性蛋白质片段的杀虫杂合蛋白或嵌合蛋白。在这一定义中还包括与SEQ ID No.15中从氨基酸位置29至氨基酸位置604的氨基酸序列不同的蛋白质变体，例如与SEQ ID No.15的这一区域具有至少95％，特别是至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的蛋白质，所述序列同一性的确定是在EMBOSS中使用Needleman-Wunsch全局比对算法(Rice等人，2000)以找到序列全长范围的最佳比对，使用缺省设置(空位开发罚分10，空位延伸罚分0.5；比较氨基酸序列使用EBLOSUM62矩阵)，优选蛋白质在SEQ ID No.15中从氨基酸位置29至氨基酸位置604的区域中具有一些，优选5-10个，特别是少于5个氨基酸添加、替代或缺失，而不显著改变、优选不改变蛋白质的杀虫活性。

根据本发明，“Cry1B蛋白”指包含SEQ ID No.11的氨基酸序列的最小毒性片段的任何杀虫蛋白，特别是包含SEQ ID No.11中从氨基酸位置31至氨基酸位置648的氨基酸序列的任何杀虫蛋白，优选包含SEQ ID No.11中从氨基酸位置3至氨基酸位置648的氨基酸序列的任何杀虫蛋白。这里也包括包含氨基酸序列SEQ ID No.11或SEQ ID No.9的任何杀虫蛋白。包含SEQ ID No.11中从氨基酸位置31至氨基酸位置648的氨基酸序列的Cry1B蛋白保留了天然产生的完整蛋白的全部或大部分的杀虫活性，在其N-或C-末端部分添加蛋白质序列不破坏此活性。因此，以含有或包括这一区域的氨基酸序列表征的任何蛋白质是有用的并构成本发明的部分。这包括包含SEQ ID No.11的蛋白质的最小毒性蛋白质片段的杀虫杂合蛋白或嵌合蛋白。在这一定义中还包括包含SEQ ID No.11中从氨基酸位置31至氨基酸位置648的氨基酸序列变体的杀虫蛋白，例如与SEQ ID No.11这一区域的氨基酸水平具有至少80％的序列同一性，特别是至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性，所述序列同一性的确定是在EMBOSS中使用Needleman-Wunsch全局比对算法(Rice等人，2000)找到序列全长范围的最佳比对，使用缺省设置(空位开发罚分10，空位延伸罚分0.5；比较氨基酸序列使用EBLOSUM62矩阵)，优选蛋白质在SEQ ID No.11中从氨基酸位置31至氨基酸位置648的区域中具有一些，优选5-10个，特别是少于5个氨基酸添加、替代或缺失，而不显著改变、优选不改变蛋白质的杀虫活性。本发明的Cry1B蛋白的优选的变体包括包含SEQ ID No.11中从氨基酸位置31至氨基酸位置648的序列的杀虫蛋白，但是其中在SEQ ID No.11的氨基酸位置151处是酪氨酸或在SEQ ID No.11的氨基酸位置处353是精氨酸，或这样的蛋白质：其中在SEQ ID No.11的氨基酸位置151处是酪氨酸和在SEQ ID No.11的氨基酸位置353处是精氨酸。

如这里使用的，术语DNA或基因，如在“cry1C1 DNA”中，指分别编码如以上定义的Cry1C、Cry1B或Cry1D蛋白的任何DNA序列。这包括编码以上定义的Cry1C、Cry1B或Cry1D蛋白如SEQ ID No.2、5、7、9、11、13、15中任一蛋白的天然存在的、人工的或合成的DNA序列SEQ IDNo.。这里也包括编码杀虫蛋白的DNA序列，其与SEQ ID No.1、3、4、6、8、10、12或14中的任一足够相似，从而它们在严格杂交条件下能够(即，具有能力)与这些DNA序列杂交。如这里使用的，严格杂交条件特别指下列条件：在滤膜上固定相关的DNA序列，滤膜在42℃在50％甲酰胺、5％SSPE、2×Denhardt试剂和0.1％ SDS中预杂交1至2小时，或在68℃在6×SSC、2×Denhardt试剂和0.1％ SDS中预杂交1至2小时。然后直接向预杂交液加入变性的地高辛或放射标记的探针，在以上提到的适合温度孵育16至24小时。孵育之后，接着在室温于2×SSC、0.1％ SDS中洗涤滤膜30分钟，继之各自在68℃在0.5×SSC和0.1％ SDS中洗涤2次，每次30分钟。通过在-70℃用增感屏将滤膜向X-射线胶片(科达XAR-2或等同物)曝光24至48小时完成放射自显影。当然，在此过程中可以使用等同的条件和参数，而仍然保留期望的严格杂交条件。本发明的cry1C、cry1B或cry1D DNA的优选的变体是编码如上所述杀虫Cry1C、Cry1B或Cry1D蛋白变体的DNA。

本文的Cry1C DNA或这里定义的基因也包括：a)包含SEQ ID No.1中从核苷酸位置85至核苷酸位置2073的核苷酸序列的DNA，b)包含SEQ IDNo.3中从核苷酸位置85至核苷酸位置2073的核苷酸序列的DNA，c)包含与SEQ ID No.16的DNA序列融合的、SEQ ID No.1中从核苷酸位置85至核苷酸位置2073SEQ ID No.的核苷酸序列的DNA，d)包含SEQ ID No.4中从核苷酸位置7至核苷酸位置2439的核苷酸序列的DNA，e)包含与SEQ ID No.16的DNA序列融合的、SEQ ID No.3中从核苷酸位置85至核苷酸位置2073SEQ ID No.的核苷酸序列的DNA，或f)包含SEQ ID No.6中从核苷酸位置7至核苷酸位置2439的核苷酸序列的DNA。

本文的Cry1D DNA或这里定义的基因也包括：a)包含SEQ ID No.14中从核苷酸位置85至核苷酸位置1812的核苷酸序列的DNA，或b)包含SEQID No.12中从核苷酸位置7至核苷酸位置2178的核苷酸序列的DNA。

本文的Cry1B DNA或这里定义的基因也包括：a)包含SEQ ID No.8中从核苷酸位置7至核苷酸位置2310的核苷酸序列的DNA，或b)包含SEQ IDNo.10中从核苷酸位置91至核苷酸位置1944的核苷酸序列的DNA。

本发明cry1C、cry1B或cry1D基因的DNA序列(如序列表所示，不带转运肽序列)显示与数据库中可获得的最相似的先前已知的DNA序列具有至多仅76.6％的序列同一性。使用众所周知的BLAST算法检查可获得的序列数据库寻找具有最接近的序列同一性的序列，然后在EMBOSS中使用Needleman-Wunsch全局比对算法(Rice等人，2000)以寻找本发明序列和最接近序列之间的最佳比对(考虑其整体长度，使用缺省设置(空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5)。对于Cry1D DNA，选择已知技术序列的(相等长度的)片段以保证最佳比对，但是甚至那样与在可获得的数据库中列出的任何已知DNA序列仅有72.5％的序列同一性。

因此，这里的cry1C、cry1B或cry1D基因也包括编码杀虫蛋白的DNA序列，其与SEQ ID No.1、3、4、6、8、10、12或14中任一编码序列具有至少80％、90％、优选至少93％至97％、特别是至少98％或至少99％的序列同一性；或这样的编码杀虫蛋白的DNA序列，其在严格杂交条件下与SEQ ID No.1、3、4、6、8、10、12或14中任一杂交，优选与SEQ ID No.1、3、4、6、8、10、12或14中任一DNA序列的部分严格杂交，所述部分是编码本发明蛋白质的最小毒性蛋白质片段所需要的。这里所指的DNA序列同一性是在EMBOSS中使用Needleman-Wunsch全局比对算法计算的(Rice等人，2000)寻找序列整体长度范围的最佳比对，使用缺省设置(空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5；DNA序列比较使用EDNAFULL矩阵)，严格杂交条件如以上定义。

如这里使用的，蛋白质的“杀虫活性”意指当这样的蛋白质被昆虫摄入时，该蛋白质杀死昆虫、抑制其生长或引起昆虫进食减少的能力，优选通过在重组宿主例如植物细胞中表达而实现。应该理解，对一种昆虫物种的昆虫(优选其幼虫)的活性足够使蛋白质具有如这里使用的杀虫活性，尽管通常不同昆虫物种的昆虫受到本发明蛋白质的影响。表达本发明Cry1C、Cry1B或Cry1D蛋白中至少一种的重组宿主通常是开发或靶向用于某农作物的特定主要昆虫害虫物种或其中这样的昆虫物种是害虫的地区，例如，芸苔属植物物种的小菜蛾，但是其它的昆虫通常也将通过本发明的重组宿主得到控制，例如通过转基因植物细胞或植物，例如，本发明示例的根据本发明包含cry1C和/或cry1B基因的转基因芸苔属花椰菜或卷心菜的植物细胞或植物。

如这里使用的，蛋白质或表达本发明蛋白质的重组宿主的“(昆虫)控制量”或“控制”是指蛋白质的量，其足以限制摄入这样的植物的昆虫对植物的损害，例如通过杀死昆虫或通过抑制昆虫发育、受精或生长从而减少昆虫物种对植物的损害。这并非意味不再需要用化学杀虫剂处理植物(例如，为了控制不受本发明蛋白质影响的昆虫物种，例如(第二种)鞘翅目昆虫或双翅类昆虫害虫)，但是通过化学杀虫剂对本发明蛋白质所靶向昆虫的处理可以显著减少或避免，而仍然获得田地中可接受的植物表现和可接受的产量。

根据本发明，使对本发明的新Cry蛋白敏感的昆虫与昆虫控制量、优选昆虫杀死量的这些蛋白质相接触。在本发明的一个实施方案中，本发明的重组宿主，例如本发明的转基因植物细胞或植物，以高水平表达本发明的蛋白质或重组蛋白质，从而获得“高剂量”水平。如这里使用的，当述及重组植物细胞或植物时，“高剂量”水平、“高剂量昆虫抗性”或“高剂量”表达，是指在植物细胞或植物中的杀虫蛋白浓度(通过ELISA测量为总可溶蛋白质的百分数，该总可溶蛋白质是在提取缓冲液中提取可溶蛋白质之后测量(例如，Jansens等人，1997中描述的提取缓冲液)，使用Bradford分析(伯乐公司，Bio-Rad，Richmond，CA；Bradford，1976))，该杀虫蛋白浓度在显著较不敏感的发育阶段杀死靶昆虫，优选所述发育阶段对毒素的敏感性比昆虫一龄期低25至100倍之间，因此可以期望保证完全地控制靶昆虫。在一个实施方案中，这指对四龄期(对于具有五个龄期的昆虫而言)或末龄期(对于具有四个或更少龄期的昆虫而言)靶昆虫获得至少97％，优选至少99％，最优选100％的死亡率，这是使用合适的对照，在常规昆虫生物测定，优选整株植物的测定中对昆虫侵袭这类植物细胞或植物之后10至14天所测量的。针对一种靶昆虫物种(即，昆虫物种，优选其幼虫，其能够导致对植物物种或变种显著的损害，通常是针对之设计和开发转基因Bt植物的昆虫)的存在，根据本发明的转化的植物细胞或植物提供“高剂量”水平的昆虫抗性，足以认定植物提供本发明定义的“高剂量”表达。本发明蛋白质的优选靶昆虫是造成经济损害的植物昆虫害虫。

如这里使用的，术语“Cry1蛋白/DNA”或“本发明的Cry蛋白/DNA”是指如这里定义的任一Cry1C、Cry1B或Cry1D蛋白或任一cry1C、cry1B或cry1D DNA序列。如这里使用的，Cry或Cry1蛋白，可以是全长大小的蛋白质，也称为原毒素；或可以是截短形式，只要保留了杀虫活性即可；或可以是杂合或融合蛋白形式的不同蛋白质的组合。“原毒素”指全长杀虫晶体蛋白，其由天然存在的Bt DNA序列编码，“毒素”指其杀虫片段，特别是其最小毒性片段，通常分子量范围为约50-65kD，特别是约60kD，通过SDS-PAGE电泳与常规使用的分子量标准相比较而确定。

如这里使用的，“嵌合基因”用于指包含至少两个不同DNA片段(例如启动子、5’非翻译前导序列、编码区、内含子、3’非翻译拖尾以及3’端转录形成和多聚腺苷酸化区域)的基因或DNA序列，所述DNA片段不是天然彼此相连或它们来自不同来源。典型的，如这里使用的植物可表达的嵌合基因是包含有效连接于合成的、人造的编码序列如本发明任一cry1C、cry1B或cry1D基因的启动子区的基因。

编码本发明Cry1蛋白的DNA序列能够使用常规技术化学合成，并且能够插入到表达载体中以产生高量的Cry1蛋白。可以使用Cry1蛋白用常规方式(

等人，1988)来制备特异性的单克隆或多克隆抗体，开发免疫测定(例如，ELISA、Western印迹(即蛋白质分析)、抗体包被的试条(dipstick))以检测在任意材料，例如植物材料中这些蛋白质的存在或缺乏。

为了鉴定包含整合进入其基因组的本发明任一cry1基因的转基因植物细胞、植物或植物材料(例如叶或种子)，或含有DNA的产品(其包含或来源于包含本发明cry1基因的植物材料)而开发的工具是基于本发明新基因的特异性序列特征，例如，包含引入的(外源)cry1基因的基因组区的特异性限制酶切图谱、分子标记或整合进入植物基因组的外源DNA序列。

一旦外源DNA的序列，例如本发明的cry1基因是已知的，可以通过分子生物技术开发特异性识别样品核酸(DNA或RNA)中这些序列的引物和探针。例如，可以开发PCR方法以鉴定生物样品中(例如，植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品)的本发明的基因。这类PCR基于至少两个特异性“引物”，例如，一个识别位于cry1基因内的序列，另一个识别的序列位于相连的转运肽序列内或位于调节区内，例如包含本发明所述cry1基因的嵌合基因的启动子或3’末端，或两者都特异性识别本发明的cry1基因。引物优选具有15至35个核苷酸的序列，其在优化的PCR条件下“特异性识别”本发明cry1嵌合基因内的序列，从而从包含本发明cry1基因的核酸样品中扩增特异性片段(“整合片段”或有差别的扩增子)。这意味着在优化的PCR条件下在植物基因组或外源DNA中仅靶向的整合片段而无其它序列被扩增。

适合本发明的PCR引物是长度范围从17个核苷酸至约200个核苷酸的寡核苷酸，包含至少17个连续的核苷酸，优选20个连续的核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列选自转移至本发明的植物细胞或植物中的cry1C、cry1B或cry1D嵌合基因序列。

当然，引物可能长于提到的17个连续的核苷酸，可能，例如，是20、21、30、35、50、75、100、150、200个核苷酸长或甚至更长。引物可以完全由选自cry1核苷酸序列的核苷酸序列组成。然而，引物5’端(即，在位于3’的17个连续的核苷酸外侧)的核苷酸序列是较不重要的。因此，引物的5’序列可以由选自适宜的cry1嵌合基因序列的核苷酸序列组成，但是可以含有几个(例如1、2、5、10)错配。引物的5’序列甚至可以完全由与本发明的cry1基因不相关的核苷酸序列组成，例如，代表一个或多个限制性酶识别位点的核苷酸序列。这样的无关序列或具有错配的侧翼DNA序列应该优选不超过100，更优选不超过50或不超过25个核苷酸。

此外，合适的引物可以包含或由在其3’末端跨越连接区的核苷酸序列组成，所述连接区位于本发明的cry1基因和整合在植物DNA中的cry1嵌合基因中的相连转运肽序列或调控元件(例如，启动子序列、前导序列、拖尾序列或3’转录终止和多聚腺苷酸化序列)之间。对技术人员立即清楚的是正确选择的PCR引物对还应该不包含彼此互补的序列。

如这里使用的术语“引物”涵盖在依赖模板的过程，例如PCR中能够引发新生核酸的合成的任何核酸。通常，引物是从10至30个核苷酸的寡核苷酸，但是可以使用更长的序列。可以以双链形式提供引物，尽管优选单链形式。探针可以被用作引物，但是其是被设计结合靶DNA或RNA而无需用于扩增过程。

如这里使用的术语“识别”当指特异性引物时，指在标准PCR鉴定操作中特异性引物与本发明cry1基因中的核酸序列特异杂交的事实，其中该特异性是通过存在技术领域中众所周知的阳性和阴性对照而确定的。

这里也包括在生物材料中检测本发明cry1基因的试剂盒，以及这样的试剂盒筛选生物材料的用途。如这里使用的“试剂盒”指为了在生物样品中鉴定本发明的cry1基因的目的的一组试剂。更特别的，本发明的试剂盒的优选的实施方案包含如上所述的至少一条或两条特异性引物。任选的，该试剂盒还可以包含这里描述的在PCR鉴定操作中的任何其它试剂。或者，根据本发明的另外的实施方案，该试剂盒可以包含如上所述的特异性探针，其与生物样品的核酸特异性杂交以鉴定其中cry1基因的存在。任选的，该试剂盒还可以包含用于使用特异性探针鉴定生物样品中的cry1基因的任何其它试剂(例如但不限于杂交缓冲液，标记物)。

在本技术领域中，例如“PCR Applications Manual”(Roche MolecularBiochemicals，第二版，1999)描述了标准PCR操作。包括特异性引物序列的PCR的优化条件在对于各含有cry1基因的植物物种的PCR鉴定操作中得到具体说明。然而，应当理解，在PCR鉴定操作中许多参数可能需要根据具体的实验条件调整，可能需要轻微的修改以获得相似的结果。例如，制备DNA的不同方法的使用可能需要调整例如使用的引物量、聚合酶和退火条件。同样的，选择其它的引物可能规定PCR鉴定操作的其它优化的条件。然而，这些调整对于本领域技术人员是显而易见的，而且在(例如以上引用的)现代PCR应用手册中被具体描述。

根据本发明的合适的引物组合的实例是用于本发明cry1B基因的(序列5’-3’)：P1B227(TAC TTC GAA CAG AAA GAA CGA GAA CGA G，SEQ ID No.20)和P1B228(GTC CAG CGA AAG GAA CTC CAA GAA，SEQ ID No.21)，和用于本发明cry1C基因的：P1C247(AAC CTT GAGGGA CTT GGA AAC，SEQ ID No.22)和P1C252(AAG ATG AGG GTTTCT GAT AGC AG，SEQ ID No.23)。因此，这里包括编码杀虫Cry1B或Cry1C蛋白和由这些引物特异性识别的任何基因，以及使用这样的或其它特异性引物检测这类基因的任何方法。

也可以设计特异性标记物或标记的探针检测本发明的DNA序列，这里包括定向于本发明的任何的cry1C、cry1B或cry1D基因的特异性标记物或探针的任意用途。在本发明的一个实施方案中，特异性标记物、引物或标记的探针不检测或识别不含有本发明cry1DNA序列的任何植物[优选与测试植物相同物种的任何植物]，特别是任何这样的标记物、引物或标记的探针不检测或识别表达Cry1C、Cry1D或Cry1B蛋白而其中不含有本发明DNA序列(例如，这里定义的cry1C、cry1D或cry1B DNA，例如，包含SEQID No.1、3、4、6、8、10、12或14中任一核苷酸序列的DNA)的任何植物。

可以轻微修饰本发明的DNA序列以产生更方便的限制酶位点，或产生小的改变而不改变功效，不显著改变(优选不改变)其编码的蛋白质。实际上，因为遗传密码的简并性，众所周知大部分氨基酸密码子可以由其它替代而不改变蛋白质的氨基酸序列。而且，一些氨基酸可以由其它等同的氨基酸取代，而不显著改变(优选不改变)蛋白质的杀虫活性。而且，在分子区域中氨基酸序列或组成的改变，不同于负责结合或形成孔的那些，较不可能引起蛋白质的杀虫活性的变化(例如，可以移去Cry1原毒素的C-末端部分或由另一氨基酸序列替代而不影响本发明Cry1蛋白的杀虫活性)。本发明DNA序列的等同物包括与这里定义的本发明cry1基因相比具有少于20，优选5-10个核苷酸差异的DNA序列，但是其编码如这里定义的本发明的杀虫Cry1蛋白。

例如以上所述的对DNA序列的小的修饰可以常规的，即通过PCR介导的诱变进行(Ho等人，1989，White等人，1989)。使用可获得的技术通过从头DNA合成期望的编码区能够对DNA序列进行常规的更深度的修饰。

如这里使用的术语“编码”，当指编码蛋白质的基因时，是指靶宿主细胞的这类基因中含有的编码序列经转录和翻译而由这类基因产生蛋白质的能力。因此，本发明的cry1C1嵌合基因编码本发明的Cry1C1蛋白，尽管此基因含有由非编码的内含子序列中断的两个编码序列。

当指本发明的Cry1蛋白的氨基酸序列时，使用术语“基本相同”旨在包括与蛋白质的氨基酸序列相比，差异不超过5％，优选不超过2％的氨基酸序列；当指Cry蛋白的毒性时，旨在包括在相同的生物测定条件下(优选在相同的生物测定中使用来自相同群体和合适对照的昆虫)，与所比较蛋白质获得的LC50值相比，其获得的LC50值差异不超过2倍，优选不超过50％的蛋白质。

如这里使用的，“微生物”指仅在显微镜帮助下可以观察到的任何活的微生物，例如细菌、酵母细胞、植物细胞、病毒、真菌。这包括大小在视觉局限之下的全部普遍的单细胞微生物，其能够在实验室繁殖和操作，通常是原核或单细胞真核的生命形式，包括组织培养物和质粒。

从总DNA制备的本发明的cry1 DNA序列能够被连接在合适的表达载体中，和转化到合适的宿主细胞中，然后可以通过常规检测工具来筛选宿主细胞中该毒素的存在和表达。

使用本发明的基因的数据库搜索提示本发明的DNA序列显著不同于任何先前描述的编码具有抗鳞翅目活性毒素的基因或DNA序列(见，例如，2006年1月26日版专利申请中描述的DNA序列(Geneseq release 200602)，

和Whiteley，1989；Crickmore等人，1998；以及与Crickmore等人(1998)出版物对应的Bt命名网站上2005年8月2日更新的内容，参见：http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/index.html)。

在可获得的DNA序列数据库中(来自专利或科学文献)在DNA水平最接近的序列同一性是对于SEQ ID No.1或3的cry1C DNA为76.60％，对于SEQ ID No.10的cry1B DNA为73％，和对于SEQ ID No.14的cry1D DNA为72.5％，在EMBOSS中使用以上定义的Needleman-Wunsch缺省设置。因此，假定可获得的DNA序列数据库是全部已知DNA序列的代表，本发明的DNA序列在其核苷酸上与先前已知的DNA序列差异至少23％。假定在可获得的数据库中含有最接近的序列，这反映了与其相应最接近的公开的DNA序列相比，SEQ ID No.1或3的核苷酸序列有约485个核苷酸的差异，SEQID No.10的核苷酸序列有约524个核苷酸的差异，和SEQ ID No.14的核苷酸序列有约498个核苷酸的差异。这一差异对于SEQ ID No.4、6、8或12的DNA序列甚至更加明显，其编码具有转运肽的融合蛋白。并且，本发明的优化的叶绿体转运肽DNA序列(SEQ ID No.16)(其适合在本发明的靶植物中表达)被发现与在可获得的DNA序列数据库中鉴定的最接近的DNA序列相比具有约76.1％序列同一性(对于与SEQ ID No.16序列等长的部分)，因此是非常不同的。

编码Cry1蛋白的DNA序列的“杀虫有效部分(部分或片段)”这里也称为“截短的基因”或“截短的DNA”，意指编码多肽的DNA序列，其比Cry1蛋白原毒素形式具有更少的氨基酸但是仍然能杀虫的。

为了在重组的宿主(例如大肠杆菌)、在其它Bt菌株或在植物中表达编码本发明Cry蛋白的DNA序列的全部或杀虫有效部分，可以在DNA序列侧翼引入合适的限制酶切位点。可以通过定点诱变，使用众所周知的操作进行(Stanssens等人，1989；White等人，1989)。为了在植物中获得提高的表达，本发明的cry1基因是人工的基因，其中该序列通过DNA合成适用于最佳表达。在这样的序列中，通过设计包含植物(优选靶植物属或物种)优选密码子的DNA序列替代抑制最佳表达的DNA序列而实现。

为了提高在植物中的表达或当其不存在于植物宿主细胞中(例如，在细菌宿主细胞中)时阻止杀虫蛋白的表达，在本发明的一个实施方案中，植物内含子是插入在本发明的嵌合cry1基因中，优选在至少一个本发明的cry1基因的编码序列中。这里可以使用任何已知的植物内含子(例如，Brown，1986，Brown和Simpson，1998，Brown等人，1996)只要它被有效连接于编码序列片段，从而保证正确的剪接即可。通过RT-PCR或Northern印迹(即RNA分析)或通过技术领域内任何可以获得的手段，方便的在靶宿主植物物种或其细胞中对内含子的有效连接和产生的正确剪接进行检查。在一个实施方案中在基因中使用双子叶植物基因的内含子以在双子叶植物细胞中表达，在基因中使用单子叶植物内含子从而在单子叶植物中表达。在一个实施方案中，本发明的内含子是如Eckes等人(1986)所述的马铃薯光诱导型的组织特异性ST-LS1基因的第二内含子，例如，在核苷酸位置672和862之间的SEQ ID No.1的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，植物内含子被引入任意的Bt杀虫蛋白编码序列，特别是SEQ ID No.1核苷酸位置672和862之间的内含子，从而其在植物细胞中被有效剪接。可以使用常规技术，例如RT-PCR、Northern印迹或检测在植物细胞中产生的功能蛋白质来测量在植物细胞中有效的剪接。当然，为了有效的剪接，需要将内含子插入在编码序列的正确位置中，从而在序列中获得功能性的5’和3’剪接位点。本发明的两个cry基因，以SEQ ID No.1和3为例，各自在不同位置含有植物内含子，经RT-PCR分析发现在甘蓝植物细胞中都被有效剪接，产生编码期望的Cry蛋白的mRNA。

根据本发明的一个实施方案，蛋白质靶向于细胞内细胞器，例如质体(优选叶绿体)、线粒体，或从细胞分泌，可能优化蛋白质稳定性和/或表达。为此目的，本发明的嵌合基因包含编码信号或靶向肽的编码区，连接于本发明的Cry蛋白编码区。包括在本发明的蛋白质中的特别优选的肽是靶向叶绿体或其它质体的转运肽，尤其是来自其基因产物是靶向质体的植物基因的重复的转运肽区域，优化的转运肽由Lebrun等人(1996)或Capellades等人(美国专利5,635,618)描述的转运肽、来自菠菜的铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶的转运肽(Oelmuller等人，1993)、Wong等人(1992)描述的转运肽和在公开的PCT专利申请WO 00/26371中的靶向肽。在本发明的一个实施方案中，叶绿体转运肽包含SEQ ID No.17中氨基酸位置3至氨基酸位置124的序列或其变体，例如包含SEQ ID No.17中氨基酸位置3至氨基酸位置124的序列的叶绿体转运肽，其中在SEQ ID No.17中位置55处的Cys氨基酸是由Tyr替代，和/或其中在SEQ ID No.17中位置51处的Gly氨基酸之后添加Gly氨基酸。还优选将与其连接的蛋白质通过信号传递分泌到细胞外的肽，例如马铃薯蛋白水解酶抑制剂II的分泌信号(Keil等人，1986)、水稻α-淀粉酶3基因的分泌信号(Sutliff等人，1991)和烟草PR1蛋白的分泌信号(Cornelissen等人，1986)。

根据本发明特别有用的信号肽包括质体转运肽(例如，Van Den Broeck等人(1985))或将蛋白质转运到叶绿体的美国专利5,510,471和美国专利5,635,618的优化的叶绿体转运肽、分泌信号肽或将蛋白质靶向至其它质体、线粒体、ER或另一细胞器的肽。在天然靶向或分泌的蛋白质中发现了靶向至细胞内细胞器或分泌到植物细胞外或至细胞壁的信号序列，优选由

等人(1989)、

和Weil(1991)、Neuhaus & Rogers(1998)、Bih等人(1999)、Morris等人(1999)、Hesse等人(1989)、Tavladoraki等人(1998)、Terashima等人(1999)、Park等人(1997)、Shcherban等人(1995)描述的那些，其全部在此被并入作为参考，特别是来自芸苔植物物种、玉米、棉花或大豆的靶向或分泌蛋白质的信号肽序列。编码本发明的转运肽的优选的DNA序列是包含SEQ ID No.16中从核苷酸位置7至核苷酸位置371的序列，特别是SEQ ID No.16的序列的DNA。

而且，对于任何靶昆虫害虫，可以使用本领域公知的方法(例如，VanRie等人，1990)，对本发明的Cry蛋白的结合特性进行评估，以确定本发明的Cry蛋白是否结合靶昆虫中肠上其它Cry或非Cry蛋白不能识别(或竞争)的位点。除这里的任一cry1基因之外，也在植物中表达结合有关敏感昆虫中不同结合位点的其它Bt毒素或具有不同作用模式的从Bt菌株或其它来源衍生的其它毒素(例如VIP毒素或昆虫(肠)蛋白水解酶抑制剂)，，这对于阻止或延迟昆虫对表达杀虫毒素植物的抗性发展是非常有价值的。因为新的cry1基因的特征，它们对于转化植物，例如，单子叶植物，例如玉米或小麦，或双子叶植物，例如棉花、大豆和芸苔物种植物，保护这些植物免受昆虫损害是非常有用的。

尤其对于特定昆虫害虫控制昆虫抗性的目的而言，优选将本发明的cry1C基因与编码不同昆虫控制蛋白的其他基因，特别是Bt晶体蛋白组合，所述Bt晶体蛋白不识别在靶昆虫中由这类Cry1C蛋白识别的至少一个结合位点。优选的昆虫控制蛋白与本发明的Cry1C蛋白组合，特别是在植物(优选芸苔物种植物，特别是卷心菜和花椰菜)中同时表达，所述优选的昆虫控制蛋白包括本发明的Cry1B蛋白或本发明的Cry1D蛋白、VIP3Aa蛋白或其毒性片段(如在Estruch等人，1996和美国专利6,291,156中所述)，或来自致病杆菌(Xhenorhabdus)、沙雷菌属(Serratia)或发光杆菌(Photorhabdus)物种菌株的杀虫蛋白(例如，Waterfield等人，2001；ffrench-Constant和Bowen，2000)。在一个实施方案中，通过用本发明的cry1基因转化已经表达昆虫控制蛋白的植物获得这样的共表达，或通过用昆虫控制蛋白转化的植物与用本发明的cry1基因转化的植物杂交获得这样的共表达。对于芸苔物种植物，优选使用cry1基因作为第一基因，使用Cry1B、Cry1D或VIP3Aa蛋白或其变体或衍生物作为第二基因。在最小化或阻止对转基因昆虫抗性植物的抗性发展的努力中，为了在相同植物中获得不同Bt(或类似的，其它昆虫控制蛋白)杀虫蛋白的表达的方法描述在欧洲专利0 408 403中。在本发明的一个实施方案中，在本发明的转基因植物细胞或植物中，本发明的cry1C基因是位于与第二昆虫控制基因，例如Cry1B或Cry1D基因相同的一个基因座上，从而这些基因在这样的植物细胞或植物后代中不分离。

出于选择目的，也为了增加杂草控制选择，优选用DNA转化本发明的转基因植物，所述DNA编码失活广谱除草剂的蛋白质，或编码的蛋白质是除草剂的蛋白质靶标的变体，但是该蛋白质变体对这类除草剂，例如，基于草胺膦或草甘膦的除草剂是不敏感的。

编码Cry原毒素的杀虫有效部分的杀虫有效的cry1基因，优选cry1嵌合基因，能够以常规方式稳定插入植物细胞的细胞核基因组，并且可以以常规方式使用这样转化的植物以产生昆虫抗性的转化植物。在这方面，在农杆菌，例如根癌农杆菌中含有杀虫有效的cry1基因部分的卸甲Ti质粒可用于转化植物细胞，并使用下列方法从转化的植物细胞再生转化的植物，所述方法例如，在EP 0 116 718、EP 0 270 822、PCT公开WO 84/02913和公开的欧洲专利申请(“EP”)0242246和在De Block等人(1989)中所述。优选的Ti质粒载体在Ti质粒的T-DNA的边界序列之间部分，或至少位于Ti质粒的T-DNA的右边界序列的左边，各自含有杀虫有效的cry基因。当然，可以使用其它类型的载体转化植物细胞，使用操作例如直接基因转移(例如如EP 0 233 247所述)、花粉介导的转化(例如如EP 0 270 356、PCT公开WO85/01856和美国专利4,684,611中所述)、植物RNA病毒介导的转化(例如如EP 0 067 553和美国专利4,407,956中所述)、脂质体介导的转化(例如如美国专利4,536,475中所述)和其它方法，例如转化某些玉米品系的方法(例如，美国专利6,140,553；Fromm等人，1990；Gordon-Kamm等人，1990)和广泛转化单子叶植物的方法(PCT公开WO 92/09696)。对于棉花转化，特别优选在PCT专利公开WO 00/71733中描述的方法。对于大豆转化，参考本领域公知的方法，例如，Hinchee等人(1988)和Christou等人(1990)或WO00/42207的方法。

而且，除了细胞核基因组的转化，本发明还包括质体基因组，优选叶绿体基因组的转化。Kota等人(1999)已经描述了在烟草叶绿体中表达Cry2A蛋白的方法，Lin等人(2003)描述了在质体转基因(transplastomic)烟草植物中cry1C基因的表达。

在常规植物培育方案中使用产生的转化的植物来产生具有相同特征的更多转化的植物或在相同或有关植物物种的其它品种中引入有效杀虫的cry基因部分。从转化的植物获得的种子含有有效杀虫的cry基因部分作为稳定的基因组插入片段。

将有效杀虫的cry1基因，优选SEQ ID No.1、3、4或6的序列插入植物细胞基因组，从而使该插入基因位于启动子的下游(即，3′)，在其控制下，所述启动子能够在植物细胞中指导基因的表达(这里称为“植物可表达的启动子”)。这优选是在植物细胞基因组，特别是在细胞核或质体(例如，叶绿体)基因组中通过插入包含植物可表达的启动子的cry1嵌合基因而实现。优选的植物可表达的启动子包括：分离株CM 1841(Gardner等人，1981)、CabbB-S(Franck等人，1980)和CabbB-JI(Hull和Howell，1987)的花椰菜花叶病毒(CaMV)强组成型35S启动子(“35S启动子”)；由Odell等人(1985)所述的35S启动子、来自泛素家族的启动子(例如，玉米泛素启动子，见Christensen等人，1992，也见Cornejo等人，1993)、gos2启动子(de Pater等人，1992)、emu启动子(Last等人，1990)、拟南芥肌动蛋白启动子(例如由An等人(1996)所述的启动子)、稻肌动蛋白启动子(例如由Zhang等人(1991)所述的启动子)；木薯叶脉花叶病毒的启动子(WO 97/48819，Verdaguer等人(1998))、来自地下三叶草矮化病毒的pPLEX系列启动子(WO 96/06932)，特别是由Boevink等人(1995)或Schünmann等人(2003)所述的衍生自地下三叶草矮化病毒基因组区段4或7的重复启动子区(这里称为“S7S7”或“S4S4”启动子)、乙醇脱氢酶启动子(例如，pAdh1S(GenBank登录号X04049、X00581))和分别驱动T-DNA的1’和2’基因表达的TR1’启动子和TR2′启动子(分别是“TR1’启动子”和“TR2’启动子”)(Velten等人，1984)。或者，可以利用非组成型而是对植物的一种或多种组织或器官(例如，叶和/或根)特异的启动子，藉此，插入的cry基因部分仅在特异性组织或器官的细胞中表达。例如，通过将有效杀虫基因部分置于在光诱导型启动子的控制下，有效杀虫的cry基因部分能够在植物(例如，玉米、棉花)的叶中选择性表达，所述光诱导型启动子例如该植物本身或另一植物(例如豌豆)的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基基因的启动子，如在美国专利5,254,799中所公开。或者使用其表达是诱导型的启动子，优选创伤例如昆虫进食诱导型的，例如，由Cordera等人(1994)所述的MPI启动子，或农杆菌TR2’或甘露碱合酶启动子(Velten等人，1984)或化学因子诱导型的启动子。

优选杀虫有效的cry基因部分插入植物基因组从而使插入的基因部分位于适宜3’末端转录调控信号(即，转录形成和多聚腺苷酸化信号)的上游(即，5′)。这优选通过在植物细胞基因组中插入cry1嵌合基因完成。优选的多聚腺苷酸化和转录形成信号包括以下基因3’非翻译区的那些信号：来自黄顶菊的NADP苹果酸酶基因(Marshall等人，1996)、胭脂碱合酶基因(Depicker等人，1982)、章鱼碱合酶基因(Gielen等人，1984)和T-DNA基因7(Velten和Schell，1985)，其在转化的植物细胞中作为3’非翻译DNA序列起作用。

在本发明的一个实施方案中，将至少一种，优选至少2种本发明的基因转化进入植物，所述植物选自：玉米、棉花、水田芥、辣根、芥末、芝麻菜、水芹、萝卜、芸苔、大豆、蔬菜植物、十字花科植物物种、芸苔属植物物种例如花椰菜、卷心菜、大白菜、芜菁、芥、油菜、羽衣甘蓝、绿花椰菜、抱子甘蓝、菠菜等。具体的，在本发明的一个实施方案中通过本发明的基因保护下列芸苔属物种植物免受昆虫损害：埃塞俄比亚芥、B.elongata、地中海圆白菜、芥菜型油菜、欧洲油菜、瓢儿菜、白芥(B.hirta)、塌菜(B.rosularis)、黑芥、甘蓝、B.perviridis、芜青、B.rupestris、B.septiceps、B.tournefortii等，特别是植物种甘蓝(例如亚种花椰菜甘蓝(botrytis)和结球甘蓝(capitata))或欧洲油菜，以及下列属的植物：萝卜属(Raphanus)(例如萝卜(R.sativus))、辣根属(Armoracia)(例如辣根(A.rusticana))、山嵛菜属(Wasabia)(例如日本山嵛菜(W.japonica))、芝麻菜属(Eruca)(例如芝麻菜(E.vesicaria))、豆瓣菜属(Nastrurtium)(例如豆瓣菜(N.officinale))和独行菜属(Lepidium)(例如家独行菜(L.sativum))。本发明包括用本发明的至少一种或两种基因转化的以上列出的芸苔属物种植物，例如本发明的cry1B和cry1C基因，以及与含有本发明基因的有关植物(包括有关植物物种的植物)杂交或育种之后获得的植物。这样的杂交或育种可以使用本领域公知的传统育种技术完成，但是也包括公知的体外操作，例如胚复苏、原生质体融合等。本发明因此还涉及含有本发明基因(例如本发明的cry1B和cry1C基因)的芸苔属植物，例如欧洲油菜、芜青、芥菜或埃塞俄比亚芥，转化的甘蓝植物或其子代杂交而获得，或涉及含有本发明基因(如本发明的cry1B和cry1C基因)的甘蓝植物，与转化的欧洲油菜植物杂交而获得，涉及这样的植物的用途。

还可以使用植物细胞的转化在植物细胞培养物中大量产生本发明的蛋白质，例如，产生Cry1蛋白，在正确形成之后，其然后可以施用于作物。当提到这里制备的转基因植物细胞时，是指如在分离物或组织培养物中的植物细胞(又或植物原生质体)，或指在植物或分化的器官或组织中含有的植物细胞(或原生质体)，这里明确包括两种可能性。因此，在说明书或权利要求书中提到植物细胞并非仅意指在培养物中的分离的细胞，而是指任何植物细胞，其可位于或在其可能存在于任何类型的植物组织或器官中。

也可以使用编码抗鳞翅目蛋白的全部或部分的本发明的cry1基因转化细菌，例如对鳞翅目或鞘翅目具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌。藉此，可以产生转化的Bt菌株，其对于抗击广谱的鳞翅目和鞘翅目昆虫害虫或抗击额外的鳞翅目昆虫害虫是有用的。使用掺入合适的克隆载体中的本发明的cry1基因转化细菌，例如假单胞菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属或埃希氏菌属的细菌，可以以常规的方式进行，优选使用如在Mahillon等人(1989)和在PCT专利公开WO 90/06999中所述的常规的电穿孔技术进行。

可以通过常规方法发酵含有本发明cry基因的芽孢杆菌种菌株(Dulmage，1981；Bernhard和Utz，1993)以提供高产量的细胞。在众所周知的合适的条件下(Dulmage，1981)，这些菌株各自生成孢子以高产量产生含有Cry原毒素的晶体蛋白。

可以使用用cry基因转化的微生物，或优选其相应的Cry蛋白或Cry原毒素、毒素或有效杀虫的原毒素部分作为活性成份，连同合适的载体、稀释剂、乳化剂和/或分散剂以常规方式配制本发明的杀虫的，特别是抗鳞翅目的组合物(例如，由Bernhard和Utz，1993所述)。这种杀虫组合物可以被配制为可湿性粉剂、丸剂、颗粒剂或粉尘剂(dust)或使用水性或非水性溶剂配制为液体剂型，如泡沫剂、凝胶剂、混悬剂、浓缩液等。

根据本发明，控制昆虫，特别是鳞翅目昆虫的方法可以包括向要保护的地方(地区)施用(例如，喷雾)杀虫量的Cry蛋白或用本发明的cry基因转化的宿主细胞。要保护的地方可能包括，例如，昆虫害虫的栖息地或正在生长的植物或其中要培育植物的地区。

在本发明的一个实施方案中，可以使用本发明的cry1基因或Cry1蛋白抑制的昆虫包括选自以下组成的组的昆虫：小菜蛾(Plutella xylostella)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、棉贪夜蛾(Spodoptera littoralis)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、大菜粉蝶(Pieris brassicae)、烟草天蛾(Manduca sexta)、云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)、Choristoneura occidentalis、蔷薇斜条卷叶蛾(Choristoneura rosaceana)、褐卷蛾(Pandemis pyrusana)、荷兰石竹小卷蛾(Platynota stultana)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、白斑天幕毛虫(Orgyia leucostigma)、森林天幕毛虫(Malacosoma disstria)、Lambina fiscellaria、二化螟(Chilo suppressalis)、斑禾草螟(Chilo partellus)、三化螟(Scirpophaga incertulas)、橘带卷蛾(Argyrotaenia citrana)、莱粉蝶(Artogeia rapa)、黑杨叶甲(Chrysomelascripta)、玉米螟(Ostrinia nubilalis)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)和松异带蛾(Thaumetopoea pityocampa)。在一个实施方案中，小菜蛾是优选的靶昆虫害虫。这是在几种具有十字花的植物，特别是十字花科(Brassicacaea)植物中导致重大损失的广泛分布的物种。由本发明的基因编码的Cry1C、Cry1B和Cry1D蛋白对于控制这一昆虫是特别有用的，例如，通过在植物的细胞中表达本发明的基因。

可以通过在田地中栽培或种植包含任一本发明cry1C基因的植物，或通过在被这类昆虫感染的植物中或植物上获得本发明定义的Cry1C蛋白的存在(例如，通过播种或栽培用本发明的cry1C1或cry1C2基因转化的芸苔属物种植物，例如卷心菜或花椰菜植物，或喷洒含有本发明的Cry1C蛋白的组合物)来控制这类昆虫。本发明还涉及本发明的cry1基因，至少是cry1C1或cry1C2基因，在植物中用来保护其对抗鳞翅目昆虫害虫的用途，优选与本发明的cry1B或cry1D基因组合。

在本发明中，还提供编码叶绿体转运肽的修饰的编码序列。这样的编码序列具有适于在植物，特别是十字花科植物例如甘蓝或欧洲油菜，尤其是卷心菜、花椰菜或油菜(芸苔)中高表达的密码子使用。在本发明的一个实施方案中，修饰的转运肽包含SEQ ID No.16中从核苷酸位置7至核苷酸位置371的核苷酸序列，特别是SEQ ID No.16的序列。本发明也包括包含本发明的修饰的转运肽编码序列的植物细胞、植物或种子，以及这种转运肽编码序列将任何蛋白质靶向蔬菜植物的叶绿体，特别是芸苔属物种植物的叶绿体的用途。

在权利要求书的措辞中反映了本发明的这些和/或其它实施方案，其形成本发明的说明部分。

下列实施例举例说明本发明，其并非被提供用于限制本发明或保护的范围。除非另外说明，全部重组DNA技术的执行是根据标准操作，如在以下文献中所述：Sambrook等人(1989)《分子克隆实验指南》(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，第二版，Cold Spring HarbourLaboratory Press，NY和Ausubel等人(1994)Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols，USA的第1和2卷。植物分子工作的标准材料和方法描述于R.D.D.Croy的Plant Molecular Biology Labfax(1993)，由BIOS科学出版公司(UK)和Blackwell科学出版社，UK出版。

在实施例、权利要求书和说明书中述及的所附的序列表如下：

序列表：

SEQ ID No.1：在位置672包含内含子的优化的cry1C1编码序列

SEQ ID No.2：由SEQ ID No.1编码的Cry1C1蛋白的氨基酸序列

SEQ ID No.3：优化的cry1C2编码序列，在位置489包含内含子

SEQ ID No.4：优化的cry1C3编码序列，包含SEQ ID No.1和SEQ IDNo.16的序列，编码具有转运肽的融合蛋白

SEQ ID No.5：由SEQ ID No.4编码的Cry1C3蛋白

SEQ ID No.6：优化的cry1C4编码序列，包含SEQ ID No.3和SEQ IDNo.16的序列，编码具有转运肽的融合蛋白

SEQ ID No.7：由SEQ ID No.6编码的Cry1C4蛋白

SEQ ID No.8：优化的cry1B1编码序列，包括转运肽编码序列

SEQ ID No.9：由SEQ ID No.8的序列编码的Cry1B1蛋白

SEQ ID No.10：优化的cry1B2编码序列

SEQ ID No.11：由SEQ ID No.10的序列编码的Cry1B2蛋白

SEQ ID No.12：优化的cry1D1编码序列，包括转运肽编码序列

SEQ ID No.13：由SEQ ID No.12的序列编码的Cry1D1蛋白

SEQ ID No.14：优化的cry1D2编码序列

SEQ ID No.15：由SEQ ID No.14的序列编码的Cry1D2蛋白

SEQ ID No.16：编码优化的叶绿体转运肽的编码序列

SEQ ID No.17：由SEQ ID No.16的序列编码的叶绿体转运肽

SEQ ID No.18：重复的S7地下三叶草矮化病毒启动子序列(S7S7)

SEQ ID No.19：重复的S4地下三叶草矮化病毒启动子序列(S4S4)

SEQ ID No.20：cry1B基因引物P1B227

SEQ ID No.21：cry1B基因引物P1B228

SEQ ID No.22：cry1C基因引物P1C247

SEQ ID No.23：cry1C基因引物P1C252

实施例

1.嵌合基因和转化载体的构建

使用重组技术设计和组装几种cry1基因以获得在植物中具有最佳表现的基因。

为在植物细胞中最佳表达而设计的cry1C1 DNA是以SEQ ID No.1表示。此DNA编码本发明的杀虫Cry1C1蛋白(SEQ ID No.2)。为了转化植物，构建包含下列有效连接元件(5’至3’)的第一嵌合基因(cry1C1嵌合基因)：包含衍生自地下三叶草矮化病毒基因组区段7的重复的启动子区(S7S7启动子，Boevink等人，1995，SEQ ID No.18)的启动子、稻绒毡层特异性的E1基因(GE1)的前导序列(Michiels等人，1992)、在位置672包含马铃薯光诱导型的组织特异性ST-LS1基因的第二内含子(Eckes等人，1986)的cry1C1DNA(SEQ ID No.1)，和包括来自黄顶菊的NADP苹果酸酶基因的3’非翻译区(3’Me1，Marshall等人，1996)的序列。

制备类似的cry1C嵌合基因，其中ST-LS1内含子2位于cry1C DNA(即，cry1C2 DNA)的位置489，这是cry1C2嵌合基因，其它的构建与cry1C1嵌合基因完全相同。

为了确保将Cry1C蛋白靶向至植物细胞叶绿体，构建cry1C1和cry1C2嵌合基因的变体，其如Lebrun等人(1996)所述包含编码优化的转运肽的修饰序列，该序列有效连接于cry1C编码区从而使转运肽融合蛋白在植物细胞中表达。这些是分别包含cry1C3和cry1C4编码序列的cry1C3和cry1C4嵌合基因，其各自含有SEQ ID No.16的修饰的叶绿体转运肽的序列。Cry1C3 DNA序列显示于SEQ ID No.4，其为SEQ ID No.1的cry1C1序列与SEQ ID No.16的转运肽编码序列的融合。Cry1C4 DNA序列显示于SEQID No.6，其为SEQ ID No.3的cry1C2序列与SEQ ID No.16的转运肽编码序列的融合。

为在植物细胞中最佳表达而设计的cry1B1 DNA表示为SEQ ID No.8。此DNA编码本发明的杀虫Cry1B1蛋白(SEQ ID No.9)。为了转化植物，构建包含下列有效连接的元件(5’至3’)的嵌合基因(cry1B1嵌合基因)：包含衍生自地下三叶草矮化病毒基因组区段4的重复的启动子区(S4S4启动子，Boevink等人，1995，SEQ ID No.19)的启动子、稻E1基因(GE1)的前导序列(Michiels等人，1992)、包含SEQ ID No.16的修饰的叶绿体转运肽序列的cry1B1 DNA、和包括来自黄顶菊的NADP苹果酸酶基因的3’非翻译区(3’Me1，Marshall等人，1996)的序列。

使用cry1B2DNA(SEQ ID No.10)还制备了第二种形式的cry1B嵌合基因，其中不含有编码优化的转运肽的序列，从而植物细胞中发生Cry1B蛋白的细胞质累积。这是Cry1B2嵌合基因。

为在植物细胞中优化表达而设计的cry1D1 DNA表示为SEQ ID No.12。此DNA编码本发明的杀虫Cry1D1蛋白(SEQ ID No.13)。为了转化植物，构建包含下列有效连接的元件(5’至3’)的嵌合基因(cry1D1嵌合基因)：S4S4启动子(SEQ ID No.19)、稻E1基因(GE1)的前导序列(Michiels等人，1992)、包含SEQ ID No.16的修饰的叶绿体转运肽序列的cry1 D1 DNA、和包括来自黄顶菊的NADP苹果酸酶基因的3’非翻译区(3’Me1，Marshall等人，1996)的序列。

使用cry1 D2 DNA还制备了第二种形式的cry1D嵌合基因，其中不含有编码优化的转运肽的序列，从而植物细胞中发生Cry1D蛋白的细胞质累积。这是Cry1D2嵌合基因。

制备DNA转化载体(pT1C4B1)，其在T-DNA边界之间以从头到尾的方向包含cry1C4嵌合基因和cry1B1嵌合基因(3’Me1-cry1C4-GE1前导序列-S7S7-S4S4-GE1前导序列-cry1B1-3’Me1)；以及转移载体(pT1C2B2)，其在T-DNA边界之间以从头到尾的方向包含cry1C2嵌合基因和cry1B2嵌合基因(3’Me1-cry1C2-GE1前导序列-S7S7-S4S4-GE1前导序列-cry1B2-3’Me1)。以这样的方式，利用两种T-DNA载体，本发明的cry1C和cry1B基因将被共转移至植物细胞，将在成功转化之后位于一个基因座上。

构建相似的T-DNA载体，其含有以上cry1C嵌合基因，但是含有cry1D1或cry1D2嵌合基因代替以上cry1B嵌合基因作为第二嵌合基因。还构建了三联cry基因转化载体，同时包含cry1C、cry1D和cry1B基因(全部或者具有或者没有修饰的转运肽)。

含有本发明的基因的转化载体衍生自pGSC1700(Cornelissen和Vandewiele，1989)。该载体骨架含有下列基因元件：

a)质粒核心，包含在大肠杆菌中复制的质粒pBR322(Bolivar等人，1977)的复制起点和在根癌农杆菌中复制的来自假单胞菌质粒pVS1(Itoh等人，1984)的复制起点的限制片段。

b)可选择的标记基因，为在大肠杆菌和根癌农杆菌中增殖和选择该质粒赋予对链霉素和壮观霉素(aadA)的抗性。

c)DNA区，包括来自转座子Tn903(Oka等人，1981)npt1基因的新霉素磷酸转移酶编码序列的片段。

各个转化载体的T-DNA区也含有嵌合的bar基因作为可选择标记基因。表达bar基因使能够产生酶(膦丝菌素乙酰转移酶)，其代谢除草剂草胺膦，因此在植物中赋予其对除草剂的抗性。该嵌合bar基因包含来自花椰菜花叶病毒35S转录物(Odell等人，1985)的35S3启动子区、如Thompson等人(1987)所述吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的膦丝菌素乙酰转移酶基因的bar编码序列、和来自pTiT37(Depicker等人，1982)T-DNA的胭脂碱合酶基因3’非翻译区的3’转录终止和多聚腺苷酸化序列。

还构建了与所述相似的转化载体，其中使用cry1C1或cry1C3嵌合基因(与以上cry1C基因相似，但是在位置489具有ST-LS1内含子)。也构建了含有以上所述的cry1B1或cry1B2嵌合基因、或cry1D1或cry1D2嵌合基因的这些载体。

在用于植物转化之前，通过限制酶消化分析和DNA测序对全部构建的质粒进行确认是正确的。

2.植物转化和再生

使用常规方法将以上含有本发明的cry1C和cry1B基因的转化载体pT1C4B1和pT1C2B2转移进入根癌农杆菌菌株用于转化。

使用农杆菌转化花椰菜和卷心菜植物。通过在70％乙醇中浸泡然后浸没在6％漂白剂中对结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)(卷心菜)或花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)(菜花)的种子灭菌。然后用无菌水清洗种子，转移至含有基于MS的培养基的小培养皿中。将培养皿置于玻璃容器中，在24℃孵育5-8天。切下0.5-0.7cm的下胚轴外植体，置于具有合适激素的液体培养基中。向培养基加入带有目的基因的根癌农杆菌，使终浓度为1×10⁷个细菌/ml。在共培养期之后，在具有合适抗生素和激素的液体培养基中清洗外植体，在滤纸上沾干。

在愈伤组织诱导培养基培养外植体一周，该培养基含有5mg/l硝酸银和250mg/l的Triacillin和羧苄西林，以及10mg/l膦丝菌素用于选择转化事件。

每两周将外植体转移至新鲜的培养基。每周检查外植体的愈伤组织形成。从外植体切下愈伤组织，转移到芽诱导培养基。将芽转移到具有生根培养基的塑料容器中。芽置于此培养基中直至其被标准化或生根。如果它们大小在3-10cm，具有良好发育的根系统，则将它们转移至温室。

也使用根癌农杆菌用cry1C和cry1B基因转化油菜植物。在常规的转化和再生方法，例如由De Block等人(1989)所述的方法中使用欧洲油菜的下胚轴外植体。

3.转化体的分析

转化的植物被一经再生，使用PCR和Southern(即DNA)分析以确认转基因的整合。使用免疫分析，例如Cry1C-和Cry1B-特异性ELISA测定或蛋白质印迹选择显示Cry1C和Cry1B蛋白的最佳表达水平的那些转化的植物。

对采集自用SEQ ID No.1或3的cry1C基因转化的花椰菜植物的RNA的RT-PCR实验证实剪接正确发生和在这些植物中产生功能性的Cry1C蛋白，该SEQ ID No.1或3的cry1C基因在不同位置包含植物内含子。这也通过对这些植物的Northern印迹分析而证实。

并且，使用小菜蛾幼虫在标准昆虫生物测定条件下使用合适的对照与含有Cry1C和Cry1B基因的选择的转化的卷心菜、花椰菜和油菜植物进行昆虫测定，证实在那些选择进行最佳表达的转化植物中这些表达的蛋白质的高杀虫活性和高剂量。并且，已经选择的对Cry1C或Cry1B蛋白具有抗性的小菜蛾昆虫仍然能被本发明的植物有效杀死。

也从本发明的转化、选择的植物获得子代植物和种子，本发明的基因显示以预期的孟德尔方式在这类子代中分离。在温室和大田中多个地点选择转基因植物能鉴定植物株系，所述植物株系具有与最佳农业表现组合的cry1嵌合基因的优化的稳定性和表达。选择的最佳表现的转基因植物与几个不同的商品株系的杂交，和与其重复的回交，致使本发明的(连锁的)cry1B和cry1C基因存在于不同的卷心菜、花椰菜或油菜遗传背景中，优化适合不同区域或气候条件。

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全部引用的参考文献通过参考被并入本说明书。任何这些参考文献的引用不应该被解释为对在这类参考文献中含有的每个陈述精确性的认可，也并非承认这类参考文献是有关的现有技术或在任何领域的普遍常识部分。

序列表

<110>拜尔生物科学公司(Bayer BioScience N.V.)

<120>编码杀虫蛋白的新基因

<130>BCS06-2003

<160>23

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2076

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>修饰序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(672)

<220>

<221>内含子

<222>(673)..(861)

<220>

<221>CDS

<222>(862)..(2073)

<400>1

atg gct gag gag aac aac cag aac cag tgt atc cct tac aac tgt ctt 48

Met Ala Glu Glu Asn Asn Gln Asn Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu

1 5 10 15

tcg aac cct gag gag gtt ctt ctt gat gga gag aga atc tct act gga 96

Ser Asn Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly

20 25 30

aac tct tct atc gat att tct ctt tct ctt gtt cag ttc ctt gtt tct 144

Asn Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu Val Ser

35 40 45

aac ttc gtt cct gga gga gga ttc ctt gtt gga ctt atc gat ttc gtt 192

Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val

50 55 60

tgg gga atc gtt gga cct tct cag tgg gat gct ttc ctt gtt cag atc 240

Trp Gly Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile

65 70 75 80

gag cag ctt atc aac gag aga atc gct gag ttc gct aga aac gct gct 288

Glu Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala

85 90 95

atc gct aac ctt gag gga ctt gga aac aac ttc aac atc tac gtt gag 336

Ile Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu

100 105 110

gct ttc aag gag tgg gag gag gat cct aac aac cct gag act aga act 384

Ala Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Asn Asn Pro Glu Thr Arg Thr

115 120 125

aga gtt atc gat aga ttc aga atc ctt gat gga ctt ctt gag aga gat 432

Arg Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp

130 135 140

att cct tct ttc aga atc tct gga ttc gag gtt cct ctt ctt tct gtt 480

Ile Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val

145 150 155 160

tac gct cag gct gct aac ctt cat ctt gct atc ctt aga gat tct gtt 528

Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val

165 170 175

atc ttc gga gag aga tgg gga ctt act act atc aac gtt aac gag aac 576

Ile Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn

180 185 190

tac aac aga ctt atc aga cat atc gat gag tac gct gat cat tgt gct 624

Tyr Asn Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala

195 200 205

aac act tac aac aga gga ctt aac aac ctt cct aag tct act tac cag 672

Asn Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln

210 215 220

gtaagtttct gcttctacct ttgatatata tataataatt atcattaatt agtagtaata 732

taatatttca aatatttttt tcaaaataaa agaatgtagt atatagcaat tgcttttctg 792

tagtttataa gtgtgtatat tttaatttat aacttttcta atatatgacc aaaatttgtt 852

gatgtgcag gac tgg atc act tac aac aga ctt aga aga gat ctt act ctt 903

Asp Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu

225 230 235

act gtt ctt gat att gct gct ttc ttc cct aac tac gat aac aga aga 951

Thr Val Leu Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg

240 245 250

tac cct atc cag cct gtt gga cag ctt act aga gag gtt tac act gat 999

Tyr Pro Ile Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp

255 260 265 270

cct ctt atc aac ttc aac cct cag ctt cag tct gtt gct cag ctt cct 1047

Pro Leu Ile Asn Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro

275 280 285

act ttc aac gtt atg gag tct tct gct atc aga aac cct cat ctt ttc 1095

Thr Phe Asn Val Met Glu Ser Ser Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe

290 295 300

gat att ctt aac aac ctt act atc ttc act gac tgg ttc tct gtt gga 1143

Asp Ile Leu Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly

305 310 315

aga aac ttc tac tgg gga gga cat aga gtt atc tct tct ctt atc gga 1191

Arg Asn Phe Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Ile Ser Ser Leu Ile Gly

320 325 330

gga gga aac atc act tct cct atc tac gga aga gag gct aac cag gag 1239

Gly Gly Asn Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu

335 340 345 350

cct cct aga tct ttc act ttc aac gga cct gtt ttc aga act ctt tct 1287

Pro Pro Arg Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser

355 360 365

aac cct act ctt aga ctt ctt cag cag cct tgg cct gct cct cct ttc 1335

Asn Pro Thr Leu Arg Leu Leu Gln Gln Pro Trp Pro Ala Pro Pro Phe

370 375 380

aac ctt aga gga gtt gag gga gtt gag ttc tct act cct act aac tct 1383

Asn Leu Arg Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser

385 390 395

ttc act tac aga gga aga gga act gtt gat tct ctt act gag ctt cct 1431

Phe Thr Tyr Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro

400 405 410

cct gag gat aac tct gtt cct cct aga gag gga tac tct cat aga ctt 1479

Pro Glu Asp Asn Ser Val Pro Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu

415 420 425 430

tgt cat gct act ttc gtt cag aga tct gga act cct ttc ctt act act 1527

Cys His Ala Thr Phe Val Gln Arg Ser Gly Thr Pro Phe Leu Thr Thr

435 440 445

gga gtt gtt ttc tct tgg act cat aga tct gct act ctt act aac act 1575

Gly Val Val Phe Ser Trp Thr His Arg Ser Ala Thr Leu Thr Asn Thr

450 455 460

atc gat cct gag agg atc aac cag atc cct ctt gtt aag gga ttc aga 1623

Ile Asp Pro Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg

465 470 475

gtt tgg gga gga act tct gtt atc act gga cct gga ttc act gga gga 1671

Val Trp Gly Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly

480 485 490

gat att ctt aga aga aac act ttc gga gat ttc gtt tct ctt cag gtt 1719

Asp Ile Leu Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln Val

495 500 505 510

aac atc aac tct cct atc act cag aga tac aga ctt aga ttc aga tac 1767

Asn Ile Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr

515 520 525

gct tct tct aga gat gct aga gtt atc gtt ctt act gga gct gct tct 1815

Ala Ser Ser Arg Asp Ala Arg Val Ile Val Leu Thr Gly Ala Ala Ser

530 535 540

act gga gtt gga gga cag gtt tct gtt aac atg cct ctt cag aag act 1863

Thr Gly Val Gly Gly Gln Val Ser Val Asn Met Pro Leu Gln Lys Thr

545 550 555

atg gag atc gga gag aac ctt act tct aga act ttc aga tac act gat 1911

Met Glu Ile Gly Glu Asn Leu Thr Ser Arg Thr Phe Arg Tyr Thr Asp

560 565 570

ttc tct aac cct ttc tct ttc aga gct aac cct gat att atc gga atc 1959

Phe Ser Asn Pro Phe Ser Phe Arg Ala Asn Pro Asp Ile Ile Gly Ile

575 580 585 590

tct gag cag cct ctt ttc gga gct gga tct atc tct tct gga gag ctt 2007

Ser Glu Gln Pro Leu Phe Gly Ala Gly Ser Ile Ser Ser Gly Glu Leu

595 600 605

tac atc gat aaa atc gag atc atc ctt gct gat gct act ttc gag gct 2055

Tyr Ile Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu Ala

610 615 620

gag tct gat tta gag aga tga 2076

Glu Ser Asp Leu Glu Arg

625

<210>2

<211>628

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>合成构建体

<400>2

Met Ala Glu Glu Asn Asn Gln Asn Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu

1 5 10 15

Ser Asn Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly

20 25 30

Asn Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu Val Ser

35 40 45

Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val

50 55 60

Trp Gly Ile Val Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ala Phe Leu Val Gln Ile

65 70 75 80

Glu Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala

85 90 95

Ile Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu

100 105 110

Ala Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Asn Asn Pro Glu Thr Arg Thr

115 120 125

Arg Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp

130 135 140

Ile Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val

145 150 155 160

Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu AlaIle Leu Arg Asp Ser Val

165 170 175

Ile Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile Asn Val Asn Glu Asn

180 185 190

Tyr Asn Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr Ala Asp His Cys Ala

195 200 205

Asn Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro Lys Ser Thr Tyr Gln

210 215 220

Asp Trp Ile Thr Tyr Asn Arg Leu Arg Arg Asp Leu Thr Leu Thr Val

225 230 235 240

Leu Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Asn Arg Arg Tyr Pro

245 250 255

Ile Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu

260 265 270

Ile Asn Phe Asn Pro Gln Leu Gln Ser Val Ala Gln Leu Pro Thr Phe

275 280 285

Asn Val Met Glu Ser Ser Ala Ile Arg Asn Pro His Leu Phe Asp Ile

290 295 300

Leu Asn Asn Leu Thr Ile Phe Thr Asp Trp Phe Ser Val Gly Arg Asn

305 310 315 320

Phe Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Ile Ser Ser Leu Ile Gly Gly Gly

325 330 335

Asn Ile Thr Ser Pro Ile Tyr Gly Arg Glu Ala Asn Gln Glu Pro Pro

340 345 350

Arg Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg Thr Leu Ser Asn Pro

355 360 365

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370 375 380

Arg Gly Val Glu Gly Val Glu Phe Ser Thr Pro Thr Asn Ser Phe Thr

385 390 395 400

Tyr Arg Gly Arg Gly Thr Val Asp Ser Leu Thr Glu Leu Pro Pro Glu

405 410 415

Asp Asn Ser Val Pro Pro Arg Glu Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His

420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

Pro Glu Arg Ile Asn Gln Ile Pro Leu Val Lys Gly Phe Arg Val Trp

465 470 475 480

Gly Gly Thr Ser Val Ile Thr Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile

485 490 495

Leu Arg Arg Asn Thr Phe Gly Asp Phe Val Ser Leu Gln Val Asn Ile

500 505 510

Asn Ser Pro Ile Thr Gln Arg Tyr Arg Leu Arg Phe Arg Tyr Ala Ser

515 520 525

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530 535 540

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545 550 555 560

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565 570 575

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580 585 590

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595 600 605

Asp Lys Ile Glu Ile Ile Leu Ala Asp Ala Thr Phe Glu Ala Glu Ser

610 615 620

Asp Leu Glu Arg

625

<210>3

<211>2076

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>修饰序列

<220>

<221>外显子

<222>(1)..(489)

<220>

<221>内含子

<222>(490)..(678)

<220>

<221>外显子

<222>(679)..(2073)

<400>3

atg gct gag gag aac aac cag aac cag tgt atc cct tac aac tgt ctt 48

Met Ala Glu Glu Asn Asn Gln Asn Gln Cys Ile Pro Tyr Asn Cys Leu

1 5 10 15

tcg aac cct gag gag gtt ctt ctt gat gga gag aga atc tct act gga 96

Ser Asn Pro Glu Glu Val Leu Leu Asp Gly Glu Arg Ile Ser Thr Gly

20 25 30

aac tct tct atc gat att tct ctt tct ctt gtt cag ttc ctt gtt tct 144

Asn Ser Ser Ile Asp Ile Ser Leu Ser Leu Val Gln Phe Leu Val Ser

35 40 45

aac ttc gtt cct gga gga gga ttc ctt gtt gga ctt atc gat ttc gtt 192

Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Leu Val Gly Leu Ile Asp Phe Val

50 55 60

tgg gga atc gtt gga cct tct cag tgg gat gct ttc ctt gtt cag atc 240

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65 70 75 80

gag cag ctt atc aac gag aga atc gct gag ttc gct aga aac gct gct 288

Glu Gln Leu Ile Asn Glu Arg Ile Ala Glu Phe Ala Arg Asn Ala Ala

85 90 95

atc gct aac ctt gag gga ctt gga aac aac ttc aac atc tac gtt gag 336

Ile Ala Asn Leu Glu Gly Leu Gly Asn Asn Phe Asn Ile Tyr Val Glu

100 105 110

gct ttc aag gag tgg gag gag gat cct aac aac cct gag act aga act 384

Ala Phe Lys Glu Trp Glu Glu Asp Pro Asn Asn Pro Glu Thr Arg Thr

115 120 125

aga gtt atc gat aga ttc aga atc ctt gat gga ctt ctt gag aga gat 432

Arg Val Ile Asp Arg Phe Arg Ile Leu Asp Gly Leu Leu Glu Arg Asp

130 135 140

att cct tct ttc aga atc tct gga ttc gaa gtt cct ctt ctt tct gtt 480

Ile Pro Ser Phe Arg Ile Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val

145 150 155 160

tac gct cag gtaagtttct gcttctacct ttgatatata tataataatt 529

Tyr Ala Gln

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Ala Ala Asn Leu His Leu Ala Ile

165 170

ctt aga gat tct gtt atc ttc gga gag aga tgg gga ctt act act atc 750

Leu Arg Asp Ser Val Ile Phe Gly Glu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Ile

175 180 185

aac gtt aac gag aac tac aac aga ctt atc aga cat atc gat gag tac 798

Asn Val Asn Glu Asn Tyr Asn Arg Leu Ile Arg His Ile Asp Glu Tyr

190 195 200

gct gat cat tgt gct aac act tac aac aga gga ctt aac aac ctt cct 846

Ala Asp His Cys Ala Asn Thr Tyr Asn Arg Gly Leu Asn Asn Leu Pro

205 210 215

aag tct act tac cag gac tgg atc act tac aac aga ctt aga aga gat 894

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220 225 230 235

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Leu Thr Leu Thr Val Leu Asp Ile Ala Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp

240 245 250

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Asn Arg Arg Tyr Pro Ile Gln Pro Val Gly Gln Leu Thr Arg Glu Val

255 260 265

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270 275 280

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285 290 295

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300 305 310 315

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Ser Val Gly Arg Asn Phe Tyr Trp Gly Gly His Arg Val Ile Ser Ser

320 325 330

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335 340 345

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Asn Gln Glu Pro Pro Arg Ser Phe Thr Phe Asn Gly Pro Val Phe Arg

350 355 360

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365 370 375

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380 385 390 395

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400 405 410

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415 420 425

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430 435 440

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445 450 455

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460 465 470 475

gga ttc aga gtt tgg gga gga act tct gtt atc act gga cct gga ttc 1662

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480 485 490

act gga gga gat att ctt aga aga aac act ttc gga gat ttc gtt tct 1710

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495 500 505

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510 515 520

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560 565 570

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590 595 600

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Phe Glu Ala Glu Ser Asp Leu Glu Arg

620 625

<210>4

<211>2442

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>修饰序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1038)

<220>

<221>内含子

<222>(1039)..(1227)

<220>

<221>CDS

<222>(1228)..(2439)

<400>4

atg gct tct atc tct tct tct gtt gct act gtt tct aga act gct cct 48

Met Ala Ser Ile Ser Ser Ser Val Ala Thr Val Ser Arg Thr Ala Pro

1 5 10 15

gct cag gct aac atg gtt gct cct ttc act gga ctt aag tct aac gct 96

Ala Gln Ala Asn Met Val Ala Pro Phe Thr Gly Leu Lys Ser Asn Ala

20 25 30

gct ttc cct act act aag aag gct aac gat ttc tct act ctt cct tct 144

Ala Phe Pro Thr Thr Lys Lys Ala Asn Asp Phe Ser Thr Leu Pro Ser

35 40 45

aac gga gga aga gtt cag tgt atg cag gtt tgg cct gct tac gga aac 192

Asn Gly Gly Arg Val Gln Cys Met Gln Val Trp Pro Ala Tyr Gly Asn

50 55 60

aag aag ttc gag act ctt tct tac ctt cct cct ctt tct atg gct cct 240

Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Pro Leu Ser Met Ala Pro

65 70 75 80

act gtt atg atg gct tct tct gct act gct gtt gct cct ttc cag gga 288

Thr Val Met Met Ala Ser Ser Ala Thr Ala Val Ala Pro Phe Gln Gly

85 90 95

ctt aag tct act gct tct ctt cct gtt gct aga aga tct tct aga tct 336

Leu Lys Ser Thr Ala Ser Leu Pro Val Ala Arg Arg Ser Ser Arg Ser

100 105 110

ctt gga aac gtt tct aac gga gga aga atc aga tgt gag gag aac aac 384

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Ser Gly Phe Glu Val Pro Leu Leu Ser Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn

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Leu His Leu Ala Ile Leu Arg Asp Ser Val Ile Phe Gly Glu Arg Trp

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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450 455 460

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Ala Ile Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr Phe Leu Glu Arg

420 425 430

atc tct gga cct aga atc gct gga act gtt ttc tct tgg act cat aga 1344

Ile Ser Gly Pro Arg Ile Ala Gly Thr Val Phe Ser Trp Thr His Arg

435 440 445

tct gct tct cct act aac gag gtt tct cct tct aga atc act cag atc 1392

Ser Ala Ser Pro Thr Asn Glu Val Ser Pro Ser Arg Ile Thr Gln Ile

450 455 460

cct tgg gtt aag gct cat act ctt gct tct gga gct tct gtt atc aag 1440

Pro Trp Val Lys Ala His Thr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Val Ile Lys

465 470 475 480

gga cct gga ttc act gga gga gat atc ctt act aga aac tct atg gga 1488

Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Ile Leu Thr Arg Asn Ser Met Gly

485 490 495

gag ctt gga act ctt aga gtt act ttc act gga aga ctt cct cag tct 1536

Glu Leu Gly Thr Leu Arg Val Thr Phe Thr Gly Arg Leu Pro Gln Ser

500 505 510

tac tac atc aga ttc aga tac gct tct gtt gct aac aga tct gga act 1584

Tyr Tyr Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Val Ala Asn Arg Ser Gly Thr

515 520 525

ttc aga tac tct cag cct cct tct tac gga atc tct ttc cct aag act 1632

Phe Arg Tyr Ser Gln Pro Pro Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Pro Lys Thr

530 535 540

atg gat gct gga gag cct ctt act tct aga tct ttc gct cat aca act 1680

Met Asp Ala Gly Glu Pro Leu Thr Ser Arg Ser Phe Ala His Thr Thr

545 550 555 560

ctt ttc act cct atc act ttc tct aga gct cag gag gag ttc gat cta 1728

Leu Phe Thr Pro Ile Thr Phe Ser Arg Ala Gln Glu Glu Phe Asp Leu

565 570 575

tac atc cag tct gga gtt tac atc gat aga atc gag ttc atc cct gtt 1776

Tyr Ile Gln Ser Gly Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val

580 585 590

act gct act ttc gag gct gag tac gat tta gag aga tga 1815

Thr Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg

595 600

<210>15

<211>604

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>合成构建体

<400>15

Met Ala Glu Ile Asn Asn Gln Asn Gln Cys Val Pro Tyr Asn Cys Leu

1 5 10 15

Ser Asn Pro Lys Glu Ile Ile Leu Gly Glu Glu Arg Leu Glu Thr Gly

20 25 30

Asn Thr Val Ala Asp Ile Ser Leu Gly Leu Ile Asn Phe Leu Tyr Ser

35 40 45

Asn Phe Val Pro Gly Gly Gly Phe Ile Val Gly Leu Leu Glu Leu Ile

50 55 60

Trp Gly Phe Ile Gly Pro Ser Gln Trp Asp Ile Phe Leu Ala Gln Ile

65 70 75 80

Glu Gln Leu Ile Ser Gln Arg Ile Glu Glu Phe Ala Arg Asn Gln Ala

85 90 95

Ile Ser Arg Leu Glu Gly Leu Ser Asn Leu Tyr Lys Val Tyr Val Arg

100 105 110

Ala Phe Ser Asp Trp Glu Lys Asp Pro Thr Asn Pro Ala Leu Arg Glu

115 120 125

Glu Met Arg Ile Gln Phe Asn Asp Met Asn Ser Ala Leu Ile Thr Ala

130 135 140

Ile Pro Leu Phe Arg Val Gln Asn Tyr Glu Val Ala Leu Leu Ser Val

145 150 155 160

Tyr Val Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Ile Leu Arg Asp Val Ser

165 170 175

Val Phe Gly Glu Arg Trp Gly Tyr Asp Thr Ala Thr Ile Asn Asn Arg

180 185 190

Tyr Ser Asp Leu Thr Ser Leu Ile His Val Tyr Thr Asn His Cys Val

195 200 205

Asp Thr Tyr Asn Gln Gly Leu Arg Arg Leu Glu Gly Arg Phe Leu Ser

210 215 220

Asp Trp Ile Val Tyr Asn Arg Phe Arg Arg Gln Leu Thr Ile Ser Val

225 230 235 240

Leu Asp Ile Val Ala Phe Phe Pro Asn Tyr Asp Ile Arg Thr Tyr Pro

245 250 255

Ile Gln Thr Ala Thr Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Leu Asp Leu Pro

260 265 270

Phe Ile Asn Glu Asn Leu Ser Pro Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Phe Ser

275 280 285

Ala Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Ser Pro His Leu Val Asp Phe Leu

290 295 300

Asn Ser Phe Thr Ile Tyr Thr Asp Ser Leu Ala Arg Tyr Ala Tyr Trp

305 310 315 320

Gly Gly His Leu Val Asn Ser Phe Arg Thr Gly Thr Thr Thr Asn Leu

325 330 335

Ile Arg Ser Pro Leu Tyr Gly Arg Glu Gly Asn Thr Glu Arg Pro Val

340 345 350

Thr Ile Thr Ala Ser Pro Ser Val Pro Ile Phe Arg Thr Leu Ser Tyr

355 360 365

Ile Thr Gly Leu Asp Asn Ser Asn Pro Val Ala Gly Ile Glu Gly Val

370 375 380

Glu Phe Gln Asn Thr Ile Ser Arg Ser Ile Tyr Arg Lys Ser Gly Pro

385 390 395 400

Ile Asp Ser Phe Ser Glu Leu Pro Pro Gln Asp Ala Ser Val Ser Pro

405 410 415

Ala Ile Gly Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ala Thr Phe Leu Glu Arg

420 425 430

Ile Ser Gly Pro Arg Ile Ala Gly Thr Val Phe Ser Trp Thr His Arg

435 440 445

Ser Ala Ser Pro Thr Asn Glu Val Ser Pro Ser Arg Ile Thr Gln Ile

450 455 460

Pro Trp Val Lys Ala His Thr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Val Ile Lys

465 470 475 480

Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly AspIle Leu Thr Arg Asn Ser Met Gly

485 490 495

Glu Leu Gly Thr Leu Arg Val Thr Phe Thr Gly Arg Leu Pro Gln Ser

500 505 510

Tyr Tyr Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Val Ala Asn Arg Ser Gly Thr

515 520 525

Phe Arg Tyr Ser Gln Pro Pro Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Pro Lys Thr

530 535 540

Met Asp Ala Gly Glu Pro Leu Thr Ser Arg Ser Phe Ala His Thr Thr

545 550 555 560

Leu Phe Thr Pro Ile Thr Phe Ser Arg Ala Gln Glu Glu Phe Asp Leu

565 570 575

Tyr Ile Gln Ser Gly Val Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val

580 585 590

Thr Ala Thr Phe Glu Ala Glu Tyr Asp Leu Glu Arg

595 600

<210>16

<211>372

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>修饰的转运肽

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(372)

<400>16

atg gct tct atc tct tct tct gtt gct act gtt tct aga act gct cct 48

Met Ala Ser Ile Ser Ser Ser Val Ala Thr Val Ser Arg Thr Ala Pro

1 5 10 15

gct cag gct aac atg gtt gct cct ttc act gga ctt aag tct aac gct 96

Ala Gln Ala Asn Met Val Ala Pro Phe Thr Gly Leu Lys Ser Asn Ala

20 25 30

gct ttc cct act act aag aag gct aac gat ttc tct act ctt cct tct 144

Ala Phe Pro Thr Thr Lys Lys Ala Asn Asp Phe Ser Thr Leu Pro Ser

35 40 45

aac gga gga aga gtt cag tgt atg cag gtt tgg cct gct tac gga aac 192

Asn Gly Gly Arg Val Gln Cys Met Gln Val Trp Pro Ala Tyr Gly Asn

50 55 60

aag aag ttc gag act ctt tct tac ctt cct cct ctt tct atg gct cct 240

Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Pro Leu Ser Met Ala Pro

65 70 75 80

act gtt atg atg gct tct tct gct act gct gtt gct cct ttc cag gga 288

Thr Val Met Met Ala Ser Ser Ala Thr Ala Val Ala Pro Phe Gln Gly

85 90 95

ctt aag tct act gct tct ctt cct gtt gct aga aga tct tct aga tct 336

Leu Lys Ser Thr Ala Ser Leu Pro Val Ala Arg Arg Ser Ser Arg Ser

100 105 110

ctt gga aac gtt tct aac gga gga aga atc aga tgt 372

Leu Gly Asn Val Ser Asn Gly Gly Arg Ile Arg Cys

115 120

<210>17

<211>124

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>合成构建体

<400>17

Met Ala Ser Ile Ser Ser Ser Val Ala Thr Val Ser Arg Thr Ala Pro

1 5 10 15

Ala Gln Ala Asn Met Val Ala Pro Phe Thr Gly Leu Lys Ser Asn Ala

20 25 30

Ala Phe Pro Thr Thr Lys Lys Ala Asn Asp Phe Ser Thr Leu Pro Ser

35 40 45

Asn Gly Gly Arg Val Gln Cys Met Gln Val Trp Pro Ala Tyr Gly Asn

50 55 60

Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Pro Leu Ser Met Ala Pro

65 70 75 80

Thr Val Met Met Ala Ser Ser Ala Thr Ala Val Ala Pro Phe Gln Gly

85 90 95

Leu Lys Ser Thr Ala Ser Leu Pro Val Ala Arg Arg Ser Ser Arg Ser

100 105 110

Leu Gly Asn Val Ser Asn Gly Gly Arg Ile Arg Cys

115 120

<210>18

<211>988

<212>DNA

<213>地下三叶草矮化病毒

<400>18

ctagataatt gttattatca ataaaagaat ttttattgtt attgtgttat ttggtaattt 60

atgcttataa gtaattctat gattaattgt gaattaataa gactaatgag gataataatt 120

gaatttgatt aaattaactc tgcgaagcca tatgtctttc acgtgagagt cacgtgatgt 180

ctccgcgaca ggctggcacg gggcttagta ttacccccgt gccgggatca gagacatttg 240

actaaatgtt gacttggaat aatagccctt ggattagatg acacgtggac gctcaggatc 300

tgtgatgcta gtgaagcgct taagctgaac gaatctgacg gaagagcgga caaacgcaca 360

tggactatgg cccactgctt tattaaagaa gtgaatgaca gctgtctttg cttcaagacg 420

aagtaaagaa tagtggaaaa cgcgttaatt gttattatca ataaaagaat ttttattgtt 480

attgtgttat ttggtaattt atgcttataa gtaattctat gattaattgt gaattaataa 540

gactaatgag gataataatt gaatttgatt aaattaactc tgcgaagcta tatgtctttc 600

acgtgagagt cacgtgatgt ctccgcgaca ggctggcacg gggcttagta ttacccccgt 660

gccgggatca gagacatttg actaaatgtt gacttggaat aatagccctt ggattagatg 720

acacgtggac gctcaggatc tgtgatgcta gtgaagcgct taagctgaac gaatctgacg 780

gaagagcgga caaacgcaca tggactatgg cccactgctt tattaaagaa gtgaatgaca 840

gctgtctttg cttcaagacg aagtaaagaa tagtggaaaa cgcgtaaaga ataagcgtac 900

tcagtacgct tcgtggcttt ataaatagtg cttcgtctta ttcttcgttg tatcatcaac 960

gaagaagtta agctttgttc tgcgtttc 988

<210>19

<211>1042

<212>DNA

<213>地下三叶草矮化病毒

<400>19

taattaatag taattatgat taattatgag ataagagttg ttattaatgc ttatgaggaa 60

taaagaatga ttaatattgt ttaattttat tccgcgaagc ggtgtgttat gtttttgttg 120

gagacatcac gtgactctca cgtgatgtct ccgcgacagg ctggcacggg gcttagtatt 180

acccccgtgc cgggatcaga gacatttgac taaatattga cttggaataa tagcccttgg 240

attagatgac acgtggacgc tcaggatctg tgatgctagt gaagcgctta agctgaacga 300

atctgacgga agagcggaca tacgcacatg gattatggcc cacatgtcta aagtgtatct 360

ctttacagct atatcgatgt gacgtaagat gctttacttc gcttcgaagt aaagtaggaa 420

attgctcgct aagttattct tttctgaaag aaattaattt aattctaatt aaattaaatg 480

agtggcctgc agtaattaat agtaattatg attaattatg agataagagt tgttattaat 540

gcttatgagg aataaagaat gattaatatt gtttaatttt attccgcgaa gcggtgtgtt 600

atgtttttgt tggagacatc acgtgactct cacgtgatgt ctccgcgaca ggctggcacg 660

gggcttagta ttacccccgt gccgggatca gagacatttg actaaatatt gacttggaat 720

aatagccctt ggattagatg acacgtggac gctcaggatc tgtgatgcta gtgaagcgct 780

taagctgaac gaatctgacg gaagagcgga catacgcaca tggattatgg cccacatgtc 840

taaagtgtat ctctttacag ctatatcgat gtgacgtaag atgctttact tcgcttcgaa 900

gtaaagtagg aaattgctcg ctaagttatt cttttctgaa agaaattaat ttaattctaa 960

attaaattaa atgagtggct ataaatagtg tcgatgctac ctcacatcgt attcttcttc 1020

gcatcgtctg ttctggtttt aa 1042

<210>20

<211>28

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>20

tacttcgaac agaaagaacg agaacgag 28

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>21

gtccagcgaa aggaactcca agaa 24

<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>22

aaccttgagg gacttggaaa c 21

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>23

aagatgaggg tttctgatag cag 23

Claims

1.嵌合基因，包含下列有效连接的序列：

a)编码Cry1C蛋白的编码区，包含SEQ ID No.1、3、4或6中的任一DNA，和

b)能够在植物细胞中指导表达的启动子区。

2.权利要求1的嵌合基因，其中所述启动子包含SEQ ID No.18或19的序列。

3.权利要求1或2的嵌合基因，其还包含3’多聚腺苷酸化和转录终止区。

4.权利要求3的嵌合基因，其中所述3’多聚腺苷酸化和转录终止区来自黄顶菊的NADP苹果酸酶基因。

5.权利要求1-4中任一项的嵌合基因，其还包含位于启动子和编码区之间的稻绒毡层特异性E1基因的前导序列。

6.包含权利要求1-5中任一项嵌合基因的DNA，其还包含第二嵌合基因，所述第二嵌合基因包含下列有效连接的序列：

a)编码Cry1B蛋白的第二编码区，包含SEQ ID No.8或10的DNA，和

b)能够在植物细胞中指导表达的第二启动子区。

7.包含权利要求1-5中任一项嵌合基因的DNA，还包含第二嵌合基因，所述第二嵌合基因包含下列有效连接的序列：

a)编码Cry1D蛋白的编码区，包含SEQ ID No.12或14的DNA，和

b)能够在植物细胞中指导表达的启动子区。

8.权利要求6或7的DNA，其中所述第二启动子区包含SEQ ID No.18或19的序列，并与所述第一启动子区不同。

9.权利要求6或7的DNA，其中所述第二嵌合基因还包含3’多聚腺苷酸化和转录终止区。

10.权利要求9的DNA，其中所述3’多聚腺苷酸化和转录终止区来自黄顶菊的NADP苹果酸酶基因。

11.权利要求6-10中任一项的DNA，其中所述第二嵌合基因在启动子和编码区之间还包含稻绒毡层特异性E1基因的前导序列。

12.权利要求6的DNA，还包含第三嵌合基因，所述第三嵌合基因包含下列有效连接的序列：

a)编码Cry1D蛋白的编码区，包含SEQ ID No.12或14的DNA，和

b)能够在植物细胞中指导表达的启动子区。

13.转基因植物细胞，包含稳定整合在其基因组中的权利要求1-5中任一项的基因或权利要求6-12中任一项的DNA。

14.植物，包含稳定整合在其基因组中的权利要求1-5中任一项的基因或权利要求6-12中任一项的DNA。

15.权利要求14的植物或权利要求13的植物细胞，其是芸苔属物种植物或植物细胞。

16.权利要求15的植物，其是甘蓝、欧洲油菜、芜菁、芥菜或埃塞俄比亚芥物种的植物。

17.权利要求16的植物，其为卷心菜或花椰菜。

18.权利要求1-5中任一项的嵌合基因或权利要求6-12中任一项的DNA在控制昆虫害虫中的用途。

19.控制昆虫的方法，包括：在田地中栽培或播种包含权利要求1-5中任一项的嵌合基因或权利要求6-12中任一项的DNA的植物。

20.嵌合基因，包含下列有效连接的序列：

a)编码杀虫蛋白的编码序列的第一片段，

b)植物内含子序列，

c)所述编码序列的第二片段，

d)能够在植物细胞中指导表达的启动子区。

21.在芸苔属物种植物中控制昆虫的方法，包括：在植物中表达权利要求1-5中任一项的嵌合基因、或权利要求6-12中任一项的DNA。

22.产生昆虫抗性植物或种子的方法，包括步骤：

a)获得用权利要求1-5中任一项的嵌合基因、或权利要求6-12中任一项的DNA转化的植物，和

b)选择含有所述基因或DNA的所述植物或其种子的子代。

23.微生物，包含权利要求1-5中任一项的嵌合基因、或权利要求6-12中任一项的DNA。

24.权利要求23的微生物，其为埃希氏菌属、芽孢杆菌属或农杆菌属的微生物。

25.权利要求1-5中任一项的嵌合基因、或权利要求6-12中任一项的DNA在获得对昆虫具有增加的抗性的植物细胞、植物或种子中的用途。

26.权利要求6-12中任一项的DNA在表达杀虫蛋白的转基因植物中延迟或防止试图以这类植物为食的昆虫的昆虫抗性发展中的用途。

27.权利要求1-5中任一项的嵌合基因、或权利要求6-12中任一项的DNA用于获得免受小菜蛾损害的甘蓝、欧洲油菜、芜青、芥菜或埃塞俄比亚芥物种植物的用途。

28.权利要求1-5中任一项的嵌合基因、或权利要求6-12中任一项的DNA，其中Cry1C蛋白是包含从氨基酸位置29至氨基酸位置627的SEQ IDNo.2序列的变体，但是其中在下列位置中一个、一些或全部的下列氨基酸与在SEQ ID No.2的该位置相比发生改变：在氨基酸位置125处是丙氨酸，在氨基酸位置184处是缬氨酸，在氨基酸位置295处是精氨酸，在氨基酸位置454处是天冬氨酸，或在氨基酸位置593处是精氨酸。

29.权利要求6-12中任一项的DNA，其中Cry1B蛋白是包含从氨基酸位置31至氨基酸位置648的SEQ ID No.11序列的变体，但是其中在SEQ IDNo.11中氨基酸位置151处是酪氨酸，或在SEQ ID No.11中氨基酸位置353处是精氨酸；或是这样的蛋白质，其中在SEQ ID No.11中氨基酸位置151处是酪氨酸和在SEQ ID No.11中氨基酸位置353处是精氨酸。

30.权利要求28的嵌合基因或权利要求29的DNA用于获得免受小菜蛾损害的甘蓝、欧洲油菜、芜青、芥菜或埃塞俄比亚芥物种植物的用途。

31.转基因植物细胞，包含稳定整合在其基因组中的权利要求28的基因或权利要求29的DNA。

32.编码优化的叶绿体转运肽的DNA，包含从核苷酸位置7至核苷酸位置371的SEQ ID No.16的序列。

33.权利要求20的嵌合基因，其中植物内含子是马铃薯ST-LS1基因的第二内含子。