CN101336295A

CN101336295A - 用于mRNA稳定的方法

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Publication number: CN101336295A
Application number: CNA2006800523760A
Authority: CN
Inventors: 埃布尔·弗兰德兹; 约翰·B·伯金斯; 米歇尔·沙铂尔
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2005-12-05
Filing date: 2006-12-01
Publication date: 2008-12-31
Anticipated expiration: 2026-12-01
Also published as: JP2009518019A; CN101336295B; KR101376848B1; US8841088B2; WO2007065602A1; US20080299662A1; JP5054025B2; EP1957651B1; KR20080077253A; EP1957651A1

Abstract

本发明公开了通过在编码DNA基因序列的5’端引入下述DNA序列提高微生物中想要的化合物的生产的方法，所述DNA序列能够形成茎环并能够提高来自一个或多个基因的mRNA转录本的稳定性，本发明还公开了由此稳定的mRNA、对应的DNA序列和微生物。

Description

用于mRNA稳定的方法

泛酸是维生素B复合物的一员，其是哺乳动物(包括人和家畜)的营养必需的。在细胞中，泛酸被转化为辅酶A(CoA)和酰基运载体蛋白(辅因子的生物活性形式)。这两种辅酶参与细胞中超过100种不同的酶反应。

公开的PTC专利申请WO 01/21772、WO 02/057474、WO 02/061108和WO 04/005527(均由Omnigene Bioproducts Inc.，USA提交)描述了使用Bacillus subtilis 168的菌株生产泛酸的方法，所述菌株具有对涉及泛酸生产的生物合成基因的更高的表达水平。这些基因包括panB、panC、panD、panE、ilvB、ilvN、ilvC、ilvD、glyA和serA。为了实现这些基因的更高的表达水平，使用本领域已知的标准遗传重组方法去除控制所述基因转录的天然启动子，并将其置换为来自内源噬菌体SPO1的强组成型启动子。提高基因的转录水平在本领域是公知的，其用于产生更高水平的由被过表达的基因编码的蛋白质。

本领域还公知：借助于转录过表达，对蛋白质的过量生产可导致对细胞代谢的不想要的作用(WO 98/07846)。另外，已经描述了蛋白质过量生产可能导致宿主细胞翻译机制中的有害作用(Hengjiang et al.，1995，J.Bacteriol.177：1497-1504)和/或通过胁迫应答介导的对蛋白水解活性的诱导(RamírezD.M.，and W.E.Bentley，1995，Biotechnol.Bioeng.47：596-608)，所述胁迫应答可能是较低生产效价的结果。因此，设计用于蛋白质过量生产的方法，作为使用组成型强启动子的备选方案，对于工业规模生产化学品(例如泛酸)可能是有利的。

转录物降解被微生物用作控制细胞蛋白质含量的手段。另一方面，微生物具有增强给定转录物稳定性的发达机制。为此，转录物被提供有能够形成二级结构的核苷酸序列，所述二级结构对mRNA降解酶发挥其作用设置了障碍。尽管有关于mRNA降解和稳定性的大量知识，但是对于用该知识来更改细菌碳流用于生产精细化学品的所述目的仅有几个例子。

Smolke et al.(2001，Metabolic Engineering.3：313-321)描述了能够形成茎环的人工生产的序列作为mRNA稳定元件的用途，所述稳定元件用于提高由两个质粒带有的crt基因编码的转录物的稳定状态水平，从而提高Escherichia coli中的八氢番茄红素生产。为了使该方法有用，上述mRNA稳定性元件必须被精确地置于距离启动子转录起始位点不多于一个核苷酸处(Carrier and Keasling 1999，Biotechnol.Prob.15：58-64)。或者，如果需要在天然mRNA分子中一个位点切割，则需要将mRNA稳定元件与RNaseE切割位点共同引入，使得Rnase E特异性切割产生类似结构的新mRNA分子，即将RNA稳定性元件置于距5’端一个(1)核苷酸处。上述任何例子都需要费力的实验工作，这限制了方法的有用性。因此，开发不依赖启动子转录起始位点或不依赖于RNase E切割的稳定性mRNA可以提供工程改造下述感兴趣的微生物的更好的备选方案，所述微生物用于以工业水平生产精细化学品和/或蛋白质。

在用于以工业规模制造代谢产物和/或蛋白质的感兴趣的微生物中尚未发现E.coli RNase E的基因直向同源物(Condon，2003，Microbiol.Mol.Biol.Rev.67：157-174)。对Bacillus subtilis而言，证据提示该细菌含有两个可能与E.coli RNase E功能性同源的基因(ykqC[RNAseJ1]和ymfA[RNAseJ2])，但是未显示任何显著的核苷酸或氨基酸序列相似性(Even et al.，2005，Nucleic Acids Res.33：2141-2152)。因此，B.subtilis的转录物降解机制非常不同：17个涉及RNA降解活性的被分析的E.coli样酶中只有6个已经在B.subtilis中被鉴定。

上述mRNA稳定方法首先被应用于仅含有一个基因的基于质粒的复制子。Widner et al.(1999，WO99/43835)公开了通过添加来自B.thuringiensiscryIIIA基因的稳定元件(其插入在随机启动子之间)和编码多肽的结构基因，在B.subtilis中生产多肽的方法。然而，对于达到“mRNA的饱和水平”来说，两个启动子的存在是必需的(WO99/43835)。Hue et al.(1995，J.Bacteriol.177：3465-3471)公开了5’mRNA稳定剂，其通过与16S RNA的3’端同源来稳定mRNA序列。另外，Daguer et al.(2005，Lett.Appl.Microbiol.41：221-226)公开了基于质粒的mRNA稳定方法，其中核糖体与核糖体结合位点结合，产生RNA稳定性。该方法仅在产物形成中达到相当显著的提高(即果聚糖蔗糖酶生产中的1.5倍提高)，而在一些情况下事实上却会降低蛋白质产物的形成。

另外，精细化学品、蛋白质和其它化合物的生物合成通常利用位于染色体上不同位点的复杂多基因簇(即操纵子)，并产生多种mRNA转录物。因此，这类前述mRNA稳定方法可能不适合用于提高蛋白质合成，因为来自质粒的被克隆的多基因簇的表达有时可以是不稳定的(Kim et al.，1982，Han’guk Saenghwa Hakhoechi 15：305-314；Gryczan，1982，TheMolecular Biology of the Bacilli[Dubnau，ed.]，Academic Press，New York，New York，pp 307-329；Piece and Gutteridge，1985，App.Environ.Microbiol.49：1094-1100；Newell et al.，1987，Biochem.Soc.Trans.15：281-282；Haeseleer，1994，Res.Microbiol.145：683-387；Al-Allaf et al.，2005，J.Biochem.Biophys.Methods 64：142-146)。尽管专利申请WO 02/055711公开了通过延长涉及Corynebacterium glutamicum中泛酸生产的基因(即至少ilvBN、ilvC、ilvD、panB、panC和panD之一)的mRNA转录物的寿命来促进其表达的可能性，但是该申请没有公开这如何完成。

因此，本发明的一个目的是提供下述方法，所述方法用于增加微生物中想要的化合物的生产，而不增强调控所述结构基因序列转录的天然启动子信号，即通过在编码DNA基因序列的5’端引入下述DNA序列，所述DNA序列能够形成茎环并能够提高一个或多个基因的mRNA转录物的稳定性。该方法特征在于，成环的DNA序列被引入微生物的相关基因转录起始位点下游七个或更多个DNA未配对核苷酸处。

本发明的另一目的是提供被稳定的mRNA序列，所述序列在其5’端含有稳定元件。稳定元件由DNA序列转录而来，所述DNA序列被引入微生物的相关基因转录起点下游七个或更多DNA未配对核苷酸处。该稳定元件的添加具有下述作用：mRNA不再能够被酶降解或较不能够被酶降解，因此导致对微生物中想要的化合物的更高的生产。

在另一实施方案中，本发明涉及相应的下述DNA序列以及包含这类DNA序列的经转化的微生物，所述DNA序列含有这些mRNA稳定序列并在被微生物转录时得到被稳定的mRNA转录物。

最后，本发明的一些目的是这类DNA或被稳定的mRNA转录物分别在提高一个或多个基因(所述基因产生多个mRNA转录物并位于染色体、质粒或任何其它自主复制的DNA分子上)的mRNA转录物稳定性的方法中的用途，或在提高经转化的微生物对想要的化合物生产的方法中的用途。

术语“化合物”表示来自细胞代谢(即具有生物活性的细胞中由一种或多种酶推动的反应中，一个或多个化学键的断裂和/或形成)的任何以碳为基础的物质。这类化合物的例子是蛋白质、酶、核苷酸、核糖核苷酸、氨基酸、维生素(例如抗坏血酸、泛酸)、维生素样物质(例如辅酶Q10)、类胡萝卜素、脂质和脂肪酸。

术语“微生物”表示微观的、自主复制的、呼吸的生物，其包括但不限于细菌、真菌(包括酵母)和藻类。术语细菌包括革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物二者。革兰氏阴性细菌的例子是来自Escherichia、Gluconobacter、Rhodobacter、Pseudomonas和Paracoccus属的任何。革兰氏阴性细菌选自，但不限于Bacillaceae、Brevibacteriaceae、Corynebacteriaceae、Lactobacillaceae和Streptococaceae科的任何，并特别属于Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Lactobacillus、Lactococcus和Streptomyces属。在Bacillus，B.subtilis，B.amyloliquefaciens属中，B.licheniformis和B.pumilus是本发明上下文中优选的微生物。在Gluconobacter，Rhodobacter和Paracoccus，G.oxydans中，R.sphaeroides和P.zeaxanthinifaciens分别是优选的。酵母的例子是Saccharomyces，特别是S.cerevisiae。优选的其它真菌为Aspergillus niger和Pencilliumchrysogenum.。

短语“增强天然启动子信号”是指与RNA聚合酶相互作用的邻接DNA序列(contiguous DNA sequence)(例如，但不限于“-35”和“-10”结合位点)中一个或多个核苷酸的任何遗传改变，所述改变导致合成与未经修饰的DNA序列相比而言更大量的信使RNA分子(即RNA转录物)。该短语也包括用更强的启动子置换启动子。增强天然启动子信号的方法是公知的并在本领域一般使用。短语“而不增强天然的启动子信号”被用于表示根据本发明在微生物中提高想要的化合物生产的方法与这些公知的方法不同。然而，该短语并不意味着该新方法与公知方法的组合得到的方法不被本发明所包括。

术语“启动子信号”表示与RNA聚合酶特异地相互作用的邻接DNA核苷酸序列(例如，但不限于“-35”和“-10”结合位点)，其允许起始信使RNA合成(即合成RNA转录物)。

术语“天然启动子信号”表示微生物中天然存在的启动子信号。

短语“引入DNA序列”表示DNA序列通过DNA转化、缀合或转导进入微生物染色体中的任何添加或插入。所述添加或插入通过DNA重组发生，这还可或不可导致染色体DNA核苷酸的去除或删除。将DNA序列引入(特别是通过位点特异引入)微生物中的方法是本领域公知的并描述于教科书和科学文献中。它们是本领域技术人员实践的标准流程。能够形成一个或多个茎环的DNA序列被引入微生物相关基因的转录起始位点下游七个或更多(即至少7个，例如8、9、10或11个)未配对的DNA核苷酸处。核苷酸改变的数量和种类收到下述事实的限制：没有形成代表RNase E-特异性核酸酶切割位点的序列。

术语“提高mRNA的稳定性”表示扩展mRNA序列的半衰期或阻断/延迟它们的降解。

待引入的DNA序列(即mRNA稳定元件)可以是能够形成双链茎环的任何序列，即天然存在的或来自天然存在序列的序列，或完全或部分使用本领域公知的方法合成的序列。序列可以是任何长度，但是优选由最少15个核苷酸、更优选23-100个核苷酸组成。茎应由至少6个碱基对，优选至少10个碱基对(可能存在错配核苷酸或凸环(bulge loop))，环可由3-30个核苷酸组成。计算的茎环热力学稳定性(ΔG)应当为-2.8kcal/mol或更低，优选-5kcal/mol或更低，根据Zuker开发的算法(2003，Nucleic AcidsRes.31：3406-3415)，优选更低，即-3、-4、-5或-6，优选低于-7，例如-8、-9、-10、-11或-12kcal/mol。在本发明的一种优选实施方案中，要被引入的DNA序列是基因组序列或来自微生物基因组的序列，所述微生物即要被用于生产想要的化合物的相同或不同的微生物。在本发明特别的/优选的实施方案中，DNA序列来自Bacillus的基因组，特别是来自B.subtilis。这类序列的例子是存在于下述序列中的邻接序列，所述序列为B.subtilis的从基因cggR到基因gapA、从基因hrcA到基因grpE、从基因ilvN到基因ilvC、从基因aprE到基因yhfO、从基因ybdA到基因gsiB和从基因ytxC到基因thrS，特别是SEQ ID Nos.1-6所表示的序列。术语“存在于从基因...到基因...序列中的序列”表示这两个基因之间的序列，即完整序列或其部分，包括延伸到基因自身的序列。

一般而言，如果核酸与能够产生mRNA稳定元件的天然存在的核酸序列至少70％、优选至少80％或最优选至少90％同源的话，认为该核酸在本发明的范围内。这类同源性可以通过Southern杂交分析在以下条件下经实验测定：在5X SSC、10-50％甲酰胺、1X Denhardts溶液、100μg/ml变性的鲑鱼精DNA中于37-42℃下杂交。

SEQ ID No.1表示cggR-gapA基因序列。

SEQ ID No.2表示基因cggR和gapA之间的特异序列。

SEQ ID No.3表示hrcA-grpE基因序列。

SEQ ID No.4表示基因hrcA和grpE之间的特异序列。

SEQ ID No.5表示染色DNA序列，其中cggR-gapA稳定元件被插入操纵子ilvBNC中ilvB基因的5’前导序列中。

SEQ ID No.6表示染色体DNA序列，其中hrcA-grpE稳定元件被插入ilvD基因的5’前导序列中。

尽管本发明的方法中关于泛酸表达的方面将被详细描述，但是本领域技术人员应当明白，该方法可普遍适用于提高要被下述微生物细胞合成的任何微生物代谢产物或任何化合物和/或蛋白质的生产，或提高任何蛋白质的生产，所述微生物细胞利用基因编码的生物合成酶，所述酶将底物(例如葡萄糖)或前体(例如丙酮酸盐)转化为这类化合物。

实施例

一般方法

菌株和质粒。本发明的Bacillus subtilis菌株来自菌株CU550(trpC2ilvC leuC)和1A747(SPβ^c，原养型)，它们是B.subtilis 168(trpC2)的衍生物。两种菌株均得自Bacillus Genetic Stock Center，The Ohio State University，Columbus，Ohio 43210USA。E.coli菌株Top10(Invitrogen)被用于常规克隆的目的。质粒pUC18、pUC19和pBR322(New England Biolabs)被用作一般目的的克隆载体。赋予氯霉素(cat)、四环素(tet)、红霉素(erm)和壮观霉素(spec)抗性的抗生素抗性基因得自质粒pC194(GeneBank M19465，Cat#1E17 Bacillus Genetic Stock Center，The Ohio State University，Columbus，Ohio 43210USA)、pBC16(GeneBank X51366，Cat# 1E9 Bacillus GeneticStock Center)、pDG646和pDG1726(Guérot-Fleury et.al.，1995，Gene167：335-336)。B.subtilis噬菌体SPO1的P₂₆和P₁₅启动子(Lee et al.，1980，Mol.Gen.Genet.180：57-65)分别得自质粒pUC18SP01-26和pXI23roDTD-SPO1-15，其为质粒pX12的衍生物(Hümbelin et al.，1999，J.Ind.Microbiol.Biotech.22：1-7)。

培养基。用于B.subtilis的标准最小培养基(MM)含有1X Spizizen盐、0.04％谷氨酸钠和0.5％葡萄糖。标准的固体完全培养基是Tryptose BloodAgar Broth(TBAB，Difco)。标准的液体完全培养基是Veal Infusion-YeastExtract broth(VY)。这些培养基的组成如下所述：

TBAB培养基：33g Difco Tryptose Blood Agar Base(Catalog#0232)、1L水。高压灭菌。

VY培养基：25g Difco Veal Infusion Broth(Catalog#0344)、5g DifcoYeast Extract(Catalog#0127)、1L水。高压灭菌。

最小培养基(MM)：100ml 10X Spizizen盐；10ml 50％葡萄糖；1ml40％谷氨酸钠；用水补足1L(qsp 1L with water)。

10X Spizizen盐：140g K₂HPO₄；20g(NH₄)₂SO₄；60g KH₂PO₄；10g柠檬酸三钠.2H₂O；2g MgSO₄.7H₂O；用水补足1L。

VFB MMGT培养基：100ml 10X VFB MM；100ml 0.5M Tris(pH6.8)；44ml 50％葡萄糖；2ml微量元素溶液；2ml Fe溶液；2ml CaCl₂溶液；2ml Mg/Zn溶液；748ml无菌蒸馏水。

10X VFB最小培养基(10X VFB MM)：2.5g谷氨酸钠；15.7g KH₂PO₄；15.7g K₂HPO₄；27.4g Na₂HPO₄.12H₂O；40g NH₄Cl；1g柠檬酸；68g(NH₄)₂SO₄；用水补足1L。

微量元素溶液：1.4g MnSO₄·H₂O；0.4g CoCl₂·6H₂O；0.15g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O；0.1g AlCl₃·6H₂O；0.075g CuCl₂·2H₂O；用水补足200ml。

Fe溶液：0.21g FeSO₄.7H₂O；用水补足10ml。

CaCl ₂ 溶液：15.6g CaCl₂.2H₂O；用水补足500ml。

Mg/Zn溶液：100g MgSO₄.7H₂O；0.4g ZnSO₄.7H₂O；用水补足200ml。

SMG培养基：62.78g MOPS、20g Cargill大豆粉(soy four)(200/20)、1ml PSTE-1000X溶液、5g谷氨酸钠和8g(NH₄)₂SO₄，加水至735ml(pH7.2)；高压灭菌(121℃，30分钟)。高压灭菌后，加入100ml1M磷酸钾缓冲液(pH7.2)、120ml 50％葡萄糖、10ml 1M MgSO₄·7H₂O、1.4ml 1M CaCl₂·2H₂O和35ml无菌蒸馏水。

PSTE-1000X溶液：0.2g MnCl.4H₂O；0.15g ZnSO₄.7H₂O；0.2gCoCl₂.6H₂O；0.025g CuSO₄.5H₂O；Na₂MoO₄.2H₂O；用水补足100ml。

抗生素：分别使用100μg/ml和50μg/ml浓度的氨苄西林(Amp)或卡那霉素(Km)，用于在LB复合培养基上生长的E.coli细胞中进行转化和繁殖质粒。为了将含有抗生素基因的DNA片段转化进B.subtilis中，向培养基中添加5μg/ml氯霉素(Cm)、15μg/ml四环素(Tc)和50μg/ml壮观霉素(Spec)。对红霉素(Erm)基因选择而言，使用1μg/ml红霉素/25μg/ml林可霉素。

摇瓶中的泛酸测定：

摇瓶培养条件：使用在富含VY的培养基上过夜生长的细胞培养物接种VFB MMGT培养基(1∶100稀释度)。监测生长直到细胞达到～0.6-0.8的OD₆₀₀，此时在相同的培养基中将它们再次稀释至OD₆₀₀为0.03。再继续生长18小时，之后收集样品，去除细胞并通过HPLC来分析上清液。或者可以使用过夜生长的细胞培养物接种SMG培养基并在生长24小时后通过HPLC来分析上清液。

HPLC测定：使用Agilent 1100HPLC体系在Phenomenex LUNA C8柱上进行对样品的色谱分析，所述体系装备了温控器维持的自动采样器和二极管阵列检测器。柱尺寸为150×4.6mm，颗粒尺寸为5微米。柱温度被维持恒定在20℃。流动相是0.1％醋酸(A)和甲醇(B)的混合物。应用梯度洗脱，所述梯度为15分钟内从1％B到45％B。流速为1ml/分钟。使用220nm处的UV吸收监测泛酸，并在约9.6分钟时洗脱。该方法的校准范围从1到100mg/l泛酸。

分子和遗传技术。标准的遗传和分子生物学技术是本领域普遍已知的，它们先前已被描述过。DNA转化、PBS1普遍性转导和其它标准的B.subtilis遗传技术也是本领域普遍已知的，它们先前已被描述过(Harwoodand Cutting(eds)，1992，Molecular biological methods for Bacillus.New York：John Wiley and Sons)。

Northern印迹分析。在4℃收集在VFB MMGT培养基中生长至对数期(OD₆₀₀＝～0.6)的细胞，并在倾析上清液后立即将其冷冻于液氮中。如下所述来提取总RNA。将沉淀物重悬于冰冷的TE缓冲液(10mM Tris，1mMEDTA，pH8.0)中。在含有硅藻土(macaloid)、苯酚/氯仿、SDS和经酸洗的玻璃珠的混合物中，通过在珠磨研磨器(BioSpec)中摇动2分钟来裂解细胞。离心后对上清液进行三次苯酚/氯仿抽提。在两个沉淀和洗涤步骤后，将总RNA重悬于焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的H₂O中。经DNase I处理后，使用RNeasy Midi Kit(Qiagen)来纯化总RNA。在该步骤中较小的RNA分子如tRNA被清除。为了质量控制，对总RNA的等分试样进行1.2％琼脂糖凝胶分析和/或在RNA6000 NanoChip(Agilent BioAnalyzer)上分析。将等量的RNA上样到1.2％的琼脂糖凝胶上，并通过电泳分离转录物。将RNA从琼脂糖上转移至尼龙膜后，用针对DIG-标记的抗有义mRNA探针对其进行探针标记。探针通过使用引物对从含有合适的T7聚合酶结合位点的PCR片段产生。通过使用DIG Northern Starter Kit(RocheDiagnostics)，按照制造商的说明书，来从这些PCR片段产生探针以及测试被印迹的膜。

实施例I在B.subtilis ilvD的天然启动子下游引入mRNA稳定元件导致提高的蛋白质合成

为了分析由未经修饰的启动子(其表达要从被稳定的转录物翻译的基因)介导的蛋白质过量生产的可能性，将mRNA稳定元件作为5’非翻译前导区插入天然的ilvD启动子和ilvD基因之间。使用PCR产生DNA片段，所述DNA片段包括存在于B.subtilis基因ypgR和ilvD之间的基因间区域。该519bp的片段被工程操作为在ilvD翻译起始密码子上游21bp处包括BglII和HindIII邻接的限制性位点。使用引物PilvD+7和PilvD-2(表1)从B.subtilis DNA扩增下述片段，所述片段跨越从ilvD翻译起始密码子开始250bp的整个ypgR-ilvD基因间区域。将该DNA片段克隆进pCRXLTOPO(Invitrogen)，通过序列分析证实其身份，并将其从载体主链上作为EcoRI/BamHI盒被分离。与同样被消化的质粒pDG1728(Guerout-Fleury et al.，1996，Gene180：57-61)连接后，将得到的pPA475质粒转化进B.subtilis 1A747中，得到含有单拷贝ilvD启动子区的菌株PA494，所述ilvD启动子区与被整合进amyE基因中的lacZ基因转录融合，包括ilvD的推定的RBS上游的BglII和HindIII位点。产生第二个启动子探针以进一步分析引入mRNA稳定原价作为非翻译前导序列对蛋白质生产的作用。因此，通过PCR使用引物2HrcLoop+和2HrcLoop-(表1)从B.subtilis基因组DNA中扩增含有hrcA-grpE基因间区域的DNA片段。用BglII和HindIII消化合成的127bp片段并与经BglII/HindIII消化的pPA475DNA连接。然后将得到的质粒pPA477转化进1A747，针对壮观霉素进行选择。这得到了菌株PA517。菌株PA494和PA517是同基因株(isogenic strain)，除了PA494含有与野生型5’非翻译前导区融合的ilvD-lacZ而PA517含有与带有hrcA-grpE RNA稳定元件的5’非翻译前导区融合的ilvD-lacZ。在本领域技术人员公知的标准ONPG测定中，在最小培养基摇瓶培养物中生长48小时后，菌株PA517生产了是菌株PA494四倍多的β-半乳糖苷酶活性。β-半乳糖苷酶活性的这种提高可以仅有助于在ilvD结构基因之前存在hrcA-grpE稳定元件。

表1.用于工程改造微生物的引物列表，所述微生物在天然存在并未经修饰的启动子调控下过量表达LacZ蛋白质。

实施例II当使用组成型表达的外源启动子或含有mRNA稳定元件的天然启动子过量生产IlvD蛋白质时，可以达到高效价的泛酸生产

为了将通过稳定mRNA(其在天然启动子的调控下表达)介导的酶过表达对代谢物生产的作用与现有技术充分描述的方法(将天然启动子取代为组成型表达的强启动子)进行比较，通过对B.subtilis ilvD基因上游染色体DNA区进行工程操作，获得两种菌株。第一种菌株被构建为在强组成型SP01-26启动子的调控下过表达IlvD蛋白质。为此，将含有泛酸生物合成基因panBCD和panE的启动子修饰的菌株GU550的衍生物(WO2004/113510)——B.subtilis PA49(P₁₅ panBCD P₁₅ panE)进一步修饰为含有ilvD基因，该基因的表达由SP01-26启动子调控。为此，首先通过使用ong侧翼同源性PCR(LFH-PCR)将ilvD(ilvD_p)的启动子区从菌株B.subtilis1A747中删除。使用引物对P1/ilvD/for、P2/ilvD/r/sp和P3/ilvD/f/sp、P4/ilvD/rev(表2)和B.subtilis 1A747染色体DNA作为模板，获得经PCR产生的片段F1和F2。然后在第二PCR反应中使用这些片段作为引物，使用来自质粒pSPEC 12flip(Wade et al.，1999，J Bacteriol.181：4365-4373)的壮观霉素抗性基因盒作为模板。将该最终PCR DNA产物转化进B.subtilis 1A747中，针对壮观霉素抗性(Spec^r)进行选择。复苏许多克隆，并使用引物P1ilvD/for和P4ilvD/rev通过PCR分析证实了若干个克隆删除了ilvD启动子区。使用分离自菌落的DNA探测4000bp的PCR片段(指示ilvD启动子区的删除)，而来自未转化细胞(无删除)的DNA产生了3000bp的片段。还针对异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)和缬氨酸(Val)氨基酸的期望的辅源营养对菌落进行测试：所有的Spec^r，PCR阳性菌落不能在缺乏Ile、Leu和Val氨基酸的最小培养基上生长。一个Spec^r，PCR阳性的Ilv^-营养缺陷型被命名为PA24(P₁₅ panBCD P₁₅ panE ΔilvD_p::spec)并保存用于其它用途。然后用PA24的PBS1裂解物转导PA49，针对壮观霉素抗性(Spec)进行选择。回收Spec^r菌落，并通过PCR和Ilv营养缺陷证实其含有ΔilvD_p::spec突变。该菌落被重新命名为PA60(P₁₅ panBCD P₁₅ panEΔilvD_p::spec)。

然后使用菌株PA24产生在SP01-26启动子表达下的ilvD基因。使用引物对P1/ilvD/for和P2/ilvD/f/26和P3/ilvD/r/26和P4/ilvD/rev和B.subtilis1A747染色体DNA作为模板，通过LFH-PCR分别产生两条DNA片段F1和F2(表2)。然后在第二个PCR反应中使用这些片段，所述PCR反应使用含SP01-26的质粒pUC18SP01-26作为模板。将该最终PCR DNA产物转化进PA24并选择Ilv⁺原养型。许多Ilv⁺菌落被复苏，并显示丧失了壮观霉素抗性的抗性(即Spec^s)，如用P₂₆启动子片段替换spec基因所期望的那样。另外，使用引物P26-seq和P4ilvD/rev对若干Ilv⁺Spec^s菌落的特征PCR分析证实与ilvD结构基因相邻的P₂₆启动子的存在：使用从Ilv⁺Spec^s菌落分离的DNA检测了2000bp的PCR片段(指示P₂₆的存在)，而来自未经转化的细胞(无SP01-26启动子)的DNA用相同引物不产生PCR片段。来自未经转化的细胞的DNA用引物ilvDwt-prom和P4ilvD/rev产生了2000bp的PCR片段(指示P_wt的存在)，而来自Ilv⁺Spec^s菌落的DNA不产生PCR产物。一个Ilv⁺Spec^sPCR阳性菌落被重新命名为PA27(P₂₆ ilvD)。随后使用本领域技术人员已知的方法，通过PBS1转导将P₂₆ilvD经修饰的基因转移至B.subtilis PA60(P₁₅ panBCD P₁₅ panEΔilvD_p::spec)。通过选择Ilv⁺原养型和从Spec^s菌落中筛选，用P₂₆ ilvD替换ΔilvD_p::spec，得到菌株PA62(P₁₅ panBCD P₁₅ panE P₂₆ ilvD)。PA62的染色体P₂₆ ilvD区的DNA测序检测到ilvD编码区中的单点突变，这引起了残基320中Gly到Asp的氨基酸改变。然后如下将ilvD编码序列恢复为野生型：首先去除包含该突变的ilvD基因的内部区段，创建PA26的营养缺陷型IlvD-突变体(重新命名为PA64)，然后通过使用野生型染色体DNA使用本领域技术人员公知的方法将PA64转化为Ilv⁺原养型。这产生了菌株PA73(P₁₅ panBCD P₁₅ panE P₂₆ ilvD)。

按照下文所述，来构建与PA73同基因但是在ilvD基因及其天然启动子(代替强组成型启动子)之间含有未经修饰的ilvD基因启动子区和mRNA稳定元件的第二个菌株。通过PCR产生分别长272bp、1683bp和1102bp的三个重叠DNA片段：片段F1、片段F2和片段F3。通过使用质粒pPA477作为模板，使用合成的寡核苷酸PilvDHrcLoop-和PilvDUP+(表2)作为引物获得片段F1。通过使用B.subtilis 168染色体DNA作为模板，用合成的寡核苷酸P4/ilvD/rev和HrcALoopPilvD+作为引物(表2)获得片段F2。通过使用B.subtilis 168作为模板，用合成的寡核苷酸PilvDUP-和P1/ilvD/for作为引物(表2)获得片段F3。通过琼脂糖凝胶纯化片段F1和F3，混合起来，并在第四个PCR反应中用作模板，所述PCR反应含有寡核苷酸PilvDHrcLoop-和P’1ilvD作为引物。这产生1354bp的片段F13。将片段2凝胶纯化，与片段F1混合，并将混合物在第五个反应中用作模板，所述反应含有寡核苷酸PilvDUP+和P’4ilvD作为引物。这产生1935bp的片段F12。将片段F12和F13根据制造商说明克隆进pCRXLTOPO(Invitrogen)中。这产生质粒pF12(克隆进pCRXLTOPO中的片段F12)和pF13(克隆进pCRXLTOPO中的片段F13)。使用pF13作为模板和寡核苷酸PilvDHcr13+和PilvDHcr13-作为引物再次扩增片段F13。这产生片段F13_2。用PstI和XbaI消化片段F13_2并连接进同样消化的pUC19质粒(New England Biolabs)中。这产生质粒pUCPilvDHcr13。用KpnI和XbaI消化后，将片段F12与同样消化的质粒pUCPilvDHcr13连接。将连接混合物直接转化进PA60感受态细胞中，以该方式获得菌株PA590。SMG培养基中的摇瓶分析揭示对PA49为1.7g/l、对PA73为2.5g/l和对PA590为2.6g/l的生产效价，证明了经工程改造具有被稳定的转录物的菌株产生与经工程改造具有组成型表达的强启动子的菌株相似的效价。

表2.用于在过量生产泛酸的菌株中工程操作ilvD基因的引物列表。

实施例III在ilv操纵子的天然启动子下游引入mRNA稳定元件促进蛋白质的合成

在另一天然启动子的环境下测试mRNA稳定元件诱导蛋白质过量生产的能力，所述启动子表达涉及泛酸合成的基因。为此，含有非翻译前导区的ilvB(ilvB_p)启动子区被工程改造为含有两个限制性位点，以允许随后进行的修饰。这两个限制性位点位于ilvB结构基因翻译起始密码子上游474bp(PshAI)和7bp(NheI)。使用引物对PilvUP2+、PilvUP-和Pilv+、Pilv-(表3)，从染色体DNA产生两个重叠的PCR片段。使用两个较短的重叠片段作为引物，通过第三次PCR反应装配产生单一DNA片段后，依照制造商的说明书，将得到的片段TA克隆进pCRXLTOPO(Invitrogen)中，并确认其序列。然后通过EcoRI/BamHI消化将被克隆的片段取出，并依照本领域技术人员已知的步骤，将其亚克隆进lacZ启动子探针载体pDG1728(Guerout-Fleury et al.，1996，Gene 180：57-61中，得到质粒pPA415。随后将该质粒转化进B.subtilis 1A747中选择壮观霉素抗性，将P_ilvB*-lacZ融合物整合进染色体位点中，产生菌株PA431。

对质粒pPA415进行进一步修饰，使其含有mRNA稳定元件。为此，用PshAI/NheI消化该质粒，将ilv-leu前导区从载体序列的剩余部分释放，所述剩余部分为ilvB天然启动子区和上游区和lacZ结构基因区段(即主链片段)。纯化该主链DNA片段并将其与含有B.subtilis cggR-gapA区的序列连接，所述B.subtilis cggR-gapA区含有稳定mRNA的DNA序列(即稳定元件，Meinken et al.，2003，Microbiology149：751-76)。通过使用引物对CggRLoop+/CggRLoop-(表3)从B.subtilis 168PCR扩增该片段，纯化并用PshAI和NheI消化。将被连接的DNA转化进E.coli感受态细胞，选择氨苄西林抗性。这得到质粒pPA422，其中ilvB启动子和lacZ报告基因之间的非翻译前导区被替换为稳定元件(即P_{ilvΩcggR-gapA}-lacZ)。为了将P_{ilvΩcggR-gapA}-lacZ盒插入amyE染色体位点，将质粒DNA随后转化进1A747，选择壮观霉素抗性。这得到菌株PA432。在用指数生长的摇瓶培养物(其含有最小培养基)进行的标准ONPG测定中，菌株PA432产生了比同基因菌株PA431高7倍的β-半乳糖苷酶水平，所述同基因菌株PA431含有野生型启动子融合物(即P_ilvB*-lacZ)而不含有cggR-gapA基因间区域。

表3.用于工程操作微生物的引物列表，所述微生物在天然存在的和未经修饰的启动子的调控下过量生产LacZ蛋白质。

实施例IV使用其天然启动子和带有5’前导区的外源mRNA稳定元件表达ilvBNC-leuABCD操纵子的菌株能够达到与含有操纵子(其位于组成型强外源启动子的转录调控下)的菌株相似的蛋白质水平

为了用强组成型启动子代替天然的ilvB启动子，或为了在天然ilvB启动子区和ilvB结构基因之间引入mRNA稳定元件，首先如下构建天然ilvB启动子区的缺失(P_ilvB)。首先构建含有氯霉素(cat)抗性基因盒的质粒，该基因盒侧翼被P_ilvB的上游和下游B.subtilis染色体部分包围。为此，使用B.subtilis 168染色体DNA作为模板和引物ysnD3-和ysnD+(表4)，通过PCR合成含有ysnD基因5’端(位于P_ilvB启动子上游)的DNA片段。使用引物ilvBCat+和ilvBCat-(表4)和质粒pDG1661(Guérout-Fleury et al.1996，Gene 57-61)作为模板制备第二个由PCR产生的片段，所述片段含有cat抗性编码基因。该片段与含ysnD的PCR片段的3’端重叠。纯化后，在使用引物ilvBCat+和ysnD3-的第三次PCR反应中使用两种PCR片段作为模板，得到ysdD′-cat片段。使用第四个PCR反应扩增ilvB结构基因的5’端，其在P_ilvB的下游。因此，通过使用引物ilvB+和ilvB-(表4)从B.subtilis 168染色体DNA获得PCR产物。通过pCXLTOPO试剂盒(Invitrogen)依照制造商的说明克隆ilvB′片段。将被克隆的片段作为KpnI/SacI亚克隆进pUC19(New England Biolabs)。此后通过限制性分析证实其完整性，将上述ysnD′-cat片段插入(使用BamHI/KpnI位点)ilvB′区段上游，得到最终的质粒pPA401。对该质粒进行工程操作，使得cat基因序列能够通过KpnI/MluI消化从ysnD′-cat-ilvB′盒被去除并被替换为任何其它DNA元件。然后将质粒pPA401转化进原养型野生型菌株(1A747)并转化进泛酸生产者(PA73)中，选择氯霉素抗性。Cm^r菌落被发现是Ilv-营养缺陷型的(即不能在不添加缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸氨基酸的最小培养基上生长)。得到的菌株被命名为PA401(Δilv_p::cat)和PA441(P₁₅ panBCDP₁₅ panE P₂₆ ilvD Δilv_p::cat)。

为了产生含有ilv-leu操纵子(该操纵子位于其天然启动子调控下但是含有经修饰的前导区)的菌株，使用引物PilvUP3+和CggRLoop2-和pPA422质粒DNA作为模板(见上文)，通过PCR从质粒pPA422(见上文)扩增含有P_{ilvΩcggR-gapA}盒的DNA片段。用KpnI/MluI消化藉此产生的PCR片段，并将其连接进经纯化的pPA401的不含KpnI/MluI cat的片段(即带有结构5′-KpnI-ysnD-载体复制序列-ilvB′-MluI-3′的DNA片段)。将连接混合物直接转化进PA441，并选择在不添加Ile、Val或Leu氨基酸的最小培养基上生长的菌落。获得许多Ilv⁺菌落并通过PCR证实若干种的遗传背景。另外，Ilv⁺PCR⁺菌落也对氯霉素敏感(Cm^s)，如用P_ilvB启动子-mRNA稳定元件区替换cat基因所期望的。一个Ilv⁺PCR⁺Cm^s菌落被保存(PA445)用于进一步研究。

为了产生含有位于SP01-26(P₂₆)调控下的ilv-leu操纵子的菌株，首先使用引物P26+1和P26-，用pUC19SP01-26质粒DNA作为模板，通过PCR扩增含有P₂₆启动子的DNA片段。用KpnI/MluI消化得到的DNA产物并连接进经纯化的pPA401的不含KpnI/MluI cat的片段(即具有严格的5′-KpnI-ysnD-载体复制序列-ilvB′-MluI-3′的DNA片段)中。将连接混合物直接转化进PA401(Δilv_p::cat)中并选择在不添加Ile、Val或Leu的最小培养基上生长的菌落。获得许多Ilv⁺菌落并通过PCR证实若干种的遗传背景。另外，Ilv⁺PCR⁺菌落也对氯霉素敏感(Cm^s)，如用经cggR修饰的P_ilvB启动子区替换cat基因所期望的。一个Ilv⁺PCR⁺Cm^s菌落被保存并命名为PA402。DNA测序证实经修饰的ilv-leu操纵子的存在，所述经修饰的ilv-leu操纵子中cggR-gapA mRNA稳定元件被插入ilvB启动子区下游(即P_{ilvΩcggR-gapA} ilvBNC-leuABCD)。随后以以下方式使用PBS1普遍性转导将P_{ilvΩcggR-gapA} ilvBNC-leuABCD操纵子转移至生产泛酸的菌株PA73：使用PA402和本领域技术人员已知的方法制备PBS1噬菌体裂解物。使用该裂解物感染PA441并选择在不添加Ile、Val或Leu氨基酸的最小培养基上生长的菌落。获得许多Ilv⁺菌落并通过PCR证实若干种的遗传背景。另外，这些Ilv⁺PCR⁺菌落也对氯霉素敏感(Cm^s)，如用P_ilvB启动子-mRNA稳定元件区替换cat基因所期望的。一个Ilv⁺PCR⁺Cm^s菌落被保存(PA444)用于进一步研究。

使用双向蛋白质凝胶(two dimensional protein gel)，使用本领域技术人员已知的方法，在菌株PA444(其含有强组成型SP01-26启动子和野生型5’非翻译前导区)和菌株PA445(其含有野生型启动子和用cggR-gapARNA稳定元件修饰的5‘非翻译前导区)之间比较ilv-和leu-编码的基因的蛋白质合成水平。在PA444和PA445中均观察到关于亲本PA73菌株的蛋白质水平显著提高：

PA444-IlvB 56％，IlvC 473％，LeuA 271％，LeuB 579％，LeuC 153％和LeuD 306％；

PA445，IlvB 60％，IlvC 648％，LeuA 274％，LeuB 499％，LeuC 195％和LeuD 523％。

从这些结果可以概括出：由来自ilv-leu操纵子的基因编码的蛋白质水平的提高对于PA444和PA445菌株而言在相同的范围内。

表4.用于在过量生产泛酸的菌株中工程改造ilvBNC-leuABCD操纵子的引物列表。

实施例V引入内源mRNA稳定元件能够提高由天然启动子编码的 mRNA的转录物丰度

PA444和PA445是同基因株，除了存在调控ilv-leu操纵子转录的不同DNA元件：PA444强组成型SP01-26启动子和野生型5’非翻译前导区，而PA445含有野生型启动子和带有cggR-gapA RNA稳定元件的经修饰的5’非翻译前导区。为了分析两种不同的DNA元件对于ilv-leu操纵子转录的作用，使用标准的Northern印迹，来分析两种菌株的mRNA转录物模式。从使用引物IlvBFor/IlvBRev(IlvB探针)、IlvCFor/IlvCRev(IlvC探针)和LeuDFor/LeuDRev(LeuD探针)(表5)获得的PCR片段产生ilvB、ilvC和leuD基因的被标记的反义mRNA探针，在标准条件下独立地与在变性琼脂糖凝胶上分离的总RNA杂交。结果显示：两种菌株产生不同的转录物模式。在PA445总RNA中检测到与ilvB和ilvC探针均杂交但是不与leuD探针杂交的高丰度3.5kb mRNA种类，但是在PA444总RNA中未观察到。根据

et al，该3.5kb转录物包括ilvB、ilvN和ilvC基因，并不能在来自野生型细菌的总RNA中检测(

et al.，2004，J.Bacteriol.186：2240-2252)。另外，因为该RNA种类不能在PA445中被检测，本领域任何技术人员应当明白该mRNA种类提高的丰度是由cggR-gapA DNA元件提高mRNA信使稳定性引起的，不是由提高转录水平引起的。

同样，PA445菌株中8.5kb和2.5kb的两种额外转录物的丰度大于PA444。因为2.5kb转录物与ilvB探针杂交但是不与ilvC和leuD探针杂交，所以可以推断该mRNA包含ilvB和ilvN基因。因为8.5kb转录物与leuD探针杂交，其必定包括完整的ilv-leu操纵子。使用上文相同的基本原理，这两种RNA种类在PA445中比PA444中更大的丰度仅可归因于它们更高的稳定性，这随后必定是向ilv-leu操纵子的5’前导序列中引入cggR-gapA元件引起的。

表5.用于获得DNA片段的引物列表，所述DNA片段编码与ilvB、ilvC或leuC基因反义的RNA。

实施例VI通过使用mRNA稳定元件提高ilvBNC-leuABCD操纵子编码的蛋白质水平，提高B.subtilis细胞中泛酸的生产

在含有VFB MMGT最小培养基并生长48小时的摇瓶培养物中，针对泛酸生产对菌株PA73、PA444和PA445加以评价。从这些摇瓶培养基制备的不含细胞的上清液的HPLC分析揭示以以下水平存在的泛酸：

PA73，550mg/l；

PA444，150mg/l；

PA445，750mg/l。

结果显示组成型强启动子对ilvBNC-leuABCD操纵子转录水平的提高产生低于亲本菌株的泛酸生产。相反，cggR-gapA稳定元件对ilvBNC-leuABCD mRNA转录物的稳定性的提高导致高于PA73亲本菌株产生的泛酸效价。因为蛋白质含量显示在PA444和PA445中几乎相同，所以使用cggR-gapA稳定来提高ilvBNC-leuABCD转录物的稳定性在增强泛酸生产上比使用组成型SPO1启动子提高转录水平要更加有效。与该结论非常一致的是，菌株PA444比PA445长得慢，并且在延长的生长期间具有更高的细胞裂解率。

实施例VII B.subtilis中mRNA的稳定不依赖于RNase E活性

菌株B.subtilis 168已经被描述为含有编码推定的E.coli RNase E功能类似物的两个基因(ymfA和ykqC)。菌株SSB348是野生型B.subtilis 168的衍生物，其中基因ymfA被缺失，ykqC表达被置于IPTG(isopropylgalactopiranoside)诱导型启动子(P_spac)(Even et al.，2005，NucleicAcids Res 33：2141)的调控下。用从菌株PA431、PA432、PA494和PA517提取的DNA转化菌株SSB348，分别产生菌株PA602(在天然ilvB启动子信号调控下的ilvB-lacZ融合表达)、PA603(通过在5’末端添加cggR-gapA mRNA稳定元件，作为被稳定的转录物表达的ilvB-lacZ融合物，在天然ilvB启动子信号调控下表达)、PA604(通过在5’末端添加cggR-gapA mRNA稳定元件，作为被稳定的转录物表达的ilvB-lacZ融合物，在天然ilvB启动子信号调控下表达)和PA605(通过在5’末端整合hrcA-grpE稳定元件，作为被稳定的转录物在天然启动子信号ilvD基因的调控下表达表达的ilvD-lacZ融合物)。每种菌株在25ml摇瓶培养中于37℃下培养18小时，使用标准(ONPG测定)方法测量β-半乳糖苷酶水平；这些结果总结在表6中。在每个菌株中，细胞在存在或不存在IPTG诱导下生长时未观察到β-半乳糖苷酶水平差异。这些结果证明B.subtilis中mRNA稳定元件发挥作用不需要基因ymfA和ykqC编码的活性。

表6.用菌株PA602、PA603、PA604和PA605进行的实验获得的ONPG测定结果。

实施例VIII mRNA稳定介导的稳定元件的二级结构和未配对的5’序列对增强的蛋白质合成的作用

Sharp and Bechhofer(2005，Molecular Microbiology 57：484-495)证明为了B.subtilis中的有效mRNA稳定，(i)5’端二级结构必须具有最小值(-2.8和-4.7kcal/mol)以下的自由能(ΔG)，和(ii)位于位于从转录物5’端起少于4个和7个未配对的核苷酸(nts)。四个未配对核苷酸(ermC稳定元件上)和七个未配对核苷酸(SP82稳定元件上)的存在导致稳定的完全丧失。

在实施例III中显示lacZ报告基因上游含有cggR-gapA mRNA稳定元件的PA432(P_{ilvΩcggR-gapA}-lacZ)生产是仅含有野生型ilvB启动子lacZ融和物的同基因菌株PA431(P_ilvB-lacZ)7倍多的β-半乳糖苷酶。在PA432中，cggR-gapA mRNA稳定元件的两个稳定茎环结构位于lacZ转录物+1转录起点下游93个核苷酸处。为了预测cggR-gapA稳定元件的二级结构并测量转录物5’端未配对序列的长度，使用Zuker的mfold结构预测程序(2003，Nucleic Acids Research 31：3406-3415)，来分析PA432中lacZ mRNA的前导区。260-nt的前导区(从+1转录起点开始直到，但不包括用于lac翻译的spoVG RBS序列)在转录物5’端含有8个未配对的核苷酸，接着是非常脆弱的茎环(ΔG＝-0.5kcal/mol)。在PA432中cggR-gapA稳定元件的第一个稳定茎环(SL1)被截短(Ludwig et al.，2001，Molecular Microbiology 41：409-422中预测的结构)。被截短的SL1(SL1T)具有下述特性：ΔG＝-4.8kcal/mol；双链经中8nts；1nt凸环；和3nts发夹环。

使用mfold程序预测到，能够通过从PA432中lacZ mRNA的277-nt前导区(SEQ ID No.47)去除75nts(+19nt到+93nt)重建SL1稳定茎环(ΔG＝-11.6kcal/mol；双链茎中11nts；2nts凸环；和3nts发夹环)。为了测试SL1是否赋予比SL1T更高水平的mRNA稳定，在lacZ上游构建了前导区缺失衍生物，称作cggR-gapA#10。首先使用引物GAP#10-FOR和GAP#10-REV(表7)，使用pPA422作为模板DNA，扩增含有cggR-gapA稳定元件的130-bp PCR产物。用PshAI和NheI酶消化PCR产物，并将其克隆进pPA415质粒中的PshAI和NheI位点。转化E.coli TOP10后，选择Amp^r和Spec^r转化体。随后将获得的pBest10转化进B.subtilis1A747中选择Spec^r，以将P_{ilvΩcggR-gapA#10}-lacZ融合物整合进amyE染色体位点中，产生菌株BE10。在摇瓶测定中，培养物在LB培养基和最小培养基中培养，BE10(P_{ilvΩcggR-gapA#10}-lacZ)菌株产生与同基因菌株PA432(P_ilvΩcggR- _gapA-lacZ)相似的β-半乳糖苷酶水平。数据指出cggR-gapA元件介导的有效的mRNA稳定不依赖于(i)从5’端到稳定序列(19nts对93nts)的距离；和(ii)二级结构的强度(SL1Tvs.SL1稳定茎环)。

为了研究所述作用，从PA432中lacZ mRNA的277-nt前导区(SEQ IDNo.47)中去除未配对的5’端核苷酸39nts(+180nt到+218nt)，并使用mfold程序预测238-nt前导缺失衍生物(称作cggR-gapA#14)的结构。在转录物的5’端，277-nt的最初前导序列含有8个未配对的核苷酸，cggR-gapA#14缺失前导序列含有16个未配对的核苷酸。为了构建带有cggR-gapA#14缺失前导序列的B.subtilis突变体，首先用BamHI消化去除pPA422质粒中稳定元件和lacZ基因之间的36-bp片段。将被消化的质粒自身连接并转化E.coli TOP10后，选择Amp^r和Spec^r转化体。然后将得到的pBest14转化进B.subtilis 1A747中选择Spec^r，以将P_{ilvΩcggR-gapA#14}-lacZ融合物整合进amyE染色体位点中，产生菌株BE14。在摇瓶测定中，细菌培养物在LB培养基和最小培养基中培养，BE14(P_{ilvΩcggR-gapA#14}-lacZ)菌株产生与同基因菌株PA432(P_{ilvΩcggR-gapA}-lacZ)相似水平的β-半乳糖苷酶。数据指出当16个未配对的核苷酸位于BE14菌株中lacZ转录物的5’端时，达成了有效的mRNA稳定。

表7.用于研究cggR-gapA稳定元件的二级结构的作用和未配对的5’序列长度的引物列表

序列表

<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司

<120>用于mRNA稳定的方法

<130>24837

<160>49

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>2131

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis

<400>1

atgaaccagt taatacaagc tcaaaaaaaa ttattgcctg atcttctgct cgttatgcaa 60

aagaggtttg aaatcttgca gtatatcagg ctgacagaac ccatcgggcg aagaagcctg 120

tctgccagtc tcggaatcag cgagcgtgtg ctgaggggcg aggttcagtt tttaaaggaa 180

cagaacctgg tcgatattaa gacaaacggc atgacattga cagaagaggg ctatgaactg 240

ctttctgttt tggaagatac gatgaaagat gttttaggtt tgactctttt ggaaaagaca 300

ttaaaagaac gtttaaatct aaaggatgcc attatcgtat ccggagacag cgatcaatcc 360

ccatgggtca aaaaagaaat gggaagagcg gctgtcgcat gtatgaaaaa aagattttca 420

ggcaaaaata tcgtcgctgt aactggcggt acgacaattg aagctgtcgc cgaaatgatg 480

acgccggatt ctaaaaaccg cgagcttttg tttgtgcctg caagaggcgg tttaggcgaa 540

gacgtgaaaa accaggcgaa caccatatgc gcgcatatgg cggagaaggc ttcaggcact 600

taccggcttt tgtttgttcc gggacagctg tcacaaggcg cctattcatc tattattgaa 660

gagccttctg tcaaagaggt gctgaacacc attaaatcag cgagtatgct ggttcacgga 720

atcggcgaag ctaaaactat ggctcagcgc agaaacacgc ctttagaaga tttaaagaaa 780

atagatgata acgacgcggt gacggaagcg ttcggctact attttaacgc ggacggcgaa 840

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taatccctca atataaatat ctctcactta tttaaaggag gaaacaatca tggcagtaaa 1080

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tcctgaagtt gaggtagtag cggttaacga tttaacagat gctaacatgc tggctcacct 1200

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<210>2

<211>167

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis

<400>2

ccgatattat tgcggtagcg ggcggatcat caaaagccga agcgatcgag gcttacttta 60

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<210>3

<211>1664

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis

<400>3

atgttaacaa atcgtcagct gctgatcctt caggttataa tcaacgattt tattaaatcg 60

gcacagccgg tgggatcaag aactctttcg aaaaaagatg aaatcacatt tagctctgca 120

acaataagaa acgagatggc tgacttggag gaattgggct ttattgaaaa aacccattca 180

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ccgattcagc ctgatatggc ggtagcgatt ctcgttacca atacggggca tgtggaaaac 480

aaaacgatta actttccgac caaaatggat ctgtctgata ttgaaaaact ggtaaatata 540

ctgaacgacc gtttaagcgg cgttccaatg gatgaactga atgagcgcat atttaaagaa 600

gttgtcatgt acctaagaca gcacattaaa aactatgaca atatactcga cgcgcttcgt 660

tcaacctttc attccacaaa tcacgttgaa aagttgtttt ttggcgggaa aatcaatatg 720

ctgaaccagc ctgagttcca tgatatcacc cgagttcggt cgctgctttc attaattgag 780

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gtagaccaga agcagatcgg ctcaattgcg attatcggcc cgacccgcat gaattattcc 960

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<210>4

<211>101

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis

<400>4

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<210>5

<211>8566

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis

<400>5

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cggcgtaata tgagttcaac aaaagacaac agtcccgata ttattgcggt agcgggcgga 360

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tctcacttat ttaaaggagg agctagcatg gggactaatg tacaggtgga ttcagcatct 540

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aaagtagaaa tgatcttcgg ttatccgggc ggggctgtgc ttccgattta cgataagcta 660

tacaattcag ggttggtaca tatccttccc cgtcacgaac aaggagcaat tcatgcagcg 720

gagggatacg caagggtctc cggaaaaccg ggtgtcgtca ttgccacgtc agggccggga 780

gcgacaaacc ttgttacagg ccttgctgat gccatgattg attcattgcc gttagtcgtc 840

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gaagccgtga gcagtgcgaa aaaaccggtg atcctggcgg gtgcgggcgt actgcacgga 1200

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cacggtactt atacagccaa tatggccctt catgaatgtg atctattaat cagtatcggc 1380

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gataatgaag aagaaggttt taaacctcag aaattgattg aatatattca tcaatttaca 1680

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gaagacggac ataaagtatt ttcagtaaaa gaagcggcag cccaagccga aatcatcatg 3000

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agacatcatt gaagcgggat ttcccgcttc gtcccgaggt gactttttag ctgttcagga 3960

aatcgcaaga accattaaaa attgttcagt aactggtctg gcccgttgtg taaaaggtga 4020

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tgtttacgat aaatctatcg tccttgacgg caacaaaatt tcccctatgg tgacatgggg 7380

cattaacccg ggaatggttc ttcctgtcga ttctgaagtt cctgcgccgg aaagcttttc 7440

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gccggaaatg ctggcgccaa catcccaaat cgttggaatg ggactcgggc caaaagtggc 1680

attgattacg gacggacgtt tttccggagc ctcccgtggc ctctcaatcg gccacgtatc 1740

acctgaggcc gctgagggcg ggccgcttgc ctttgttgaa aacggagacc atattatcgt 1800

tgatattgaa aaacgcatct tggatgtaca agtgccagaa gaagagtggg aaaaacgaaa 1860

agcgaactgg aaaggttttg aaccgaaagt gaaaaccggc tacctggcac gttattctaa 1920

acttgtgaca agtgccaaca ccggcggtat tatgaaaatc tag 1963

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>7

gcgactccag caagcttgtt cgc 23

<210>8

<211>63

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>8

ttctggatcc atggtgatcc tcctaagatc taagcttcaa ttgtttgatt ggattttatt 60

ttg 63

<210>9

<211>34

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>9

aaaagcatta agctttctgt atgatgaata aggg 34

<210>10

<211>32

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>10

caacggatcc tttttcttct gacattgtgt tc 32

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>11

aaacctgagc aagcagaagg cgca 24

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>12

gcacttgtca caagtttaga ataacg 26

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>13

ctactatttc aacacagcta tctgc 25

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>14

ggagggttca aatcgaaaga aagc 24

<210>15

<211>55

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>15

acatgtattc acgaacgaaa atcgacatga tctgcacctt ttttatcttt attcg 55

<210>16

<211>52

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>16

attttagaaa acaataaacc cttgcaatgg cagaattacg cagtaatatg at 52

<210>17

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>17

ggactgatct ccaagcgatg gcatgatctg cacctttttt atctttattc g 51

<210>18

<211>50

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>18

tcgagaatta aaggagggtt tcatatggca gaattacgca gtaatatgat 50

<210>19

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>19

attctttttc ttctgacatt gtgttcacc 29

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>20

caatattaat agttggaggg 20

<210>21

<211>34

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>21

aatgtcagaa gaaaaagaat ttaggaggat cacc 34

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>22

ccctccaact attaatattg 20

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>23

ggggtatatc acgtctgcag attttcttgc 30

<210>24

<211>39

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>24

ccctccaact atctagatat tgttacttac tataaatag 39

<210>25

<211>41

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>25

ggcgtaatat gagttcaaca aaagacaaat gtcagcttca c 41

<210>26

<211>47

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>26

cctgtacatt agtccccatg ctagctcctc cttttggatt ttcatcc 47

<210>27

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>27

ctttgaattc gcaagatatc attaatgtat gcc 33

<210>28

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>28

gcaagatatc attaatgtat gcc 23

<210>29

<211>35

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>29

gacatagacg ccagtcccga tattattgcg gtagc 35

<210>30

<211>59

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>30

aattagctag ctcctccttt tggatccttt aaataagtga gagatattta tattgaggg 59

<210>31

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>31

agtaggatcc agagggagtg gttaacgggc 30

<210>32

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>32

tatgagataa tgccgactgt acttacgcgt cgccgctttg gacgcagtgt c 51

<210>33

<211>71

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>33

ccacctgtac attagtcccc atatgagttt cacctcctta ctcgaggtac ccgaaaattg 60

gataaagtgg g 71

<210>34

<211>51

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>34

gacactgcgt ccaaagcggc gacgcgtaag tacagtcggc attatctcat a 51

<210>35

<211>71

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>35

cccactttat ccaattttcg ggtacctcga gtaaggaggt gaaactcata tggggactaa 60

tgtacaggtg g 71

<210>36

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>36

tttgagctcg gtttaacacc ccggagcgg 29

<210>37

<211>32

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>37

ctttacgcgt caagatatca ttaatgtatg cc 32

<210>38

<211>42

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>38

ttttggtacc tttaaataag tgagagatat ttatattgag gg 42

<210>39

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>39

gggttacgcg tggccgctaa ctacactaac agc 33

<210>40

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>40

gggttggtac ctttaattct cgagtgttaa g 31

<210>41

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>41

tgtacacaga cgatgagc 18

<210>42

<211>45

<212>DNA

<213>人工

<223>PCR引物

<400>42

ctaatacgac tcactatagg gagttagatt ctgaataacg ttctt 45

<210>43

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>43

agagaacgta ttggctgg 18

<210>44

<211>45

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>44

ctaatacgac tcactatagg gagccactac ttcgatttga tgttc 45

<210>45

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>45

ggttcttcct gtcgattc 18

<210>46

<211>45

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>46

ctaatacgac tcactatagg gaggctgatt ttcaaggtca acagt 45

<210>47

<211>277

<212>DNA

<213>Bacillus subtilis PA432

<400>47

caacaaaaga caacagtccc gatattattg cggtagcggg cggatcatca aaagccgaag 60

cgatcgaggc ttactttaaa aagccacgca acacggttct cgtcacagac gaaggagccg 120

caaagaagtt attaagggat gaataatccc tcaatataaa tatctctcac ttatttaaag 180

gatccaaaag gaggagctag catggggact aatgtacagg atccccagct tgttgataca 240

ctaatgcttt tatataggga aaaggtggtg aactact 277

<210>48

<211>34

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>48

acaaagacaa cagtccggtt ctcgtcacag acga 34

<210>49

<211>37

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR引物

<400>49

cccatgctag ctcctccttt tggatccttt aaataag 37

Claims

1.提高微生物中想要的化合物的生产而不增强天然启动子信号的方法，所述天然启动子信号调控所述结构基因序列的转录，所述方法通过在编码DNA基因序列的5’端引入下述DNA序列来实现，所述DNA序列能够形成茎环并能够提高来自一个或多个基因的mRNA转录物的稳定性，所述方法的特征在于，在所述微生物的相关基因的转录起始位点下游七个或更多DNA核苷酸处引入所述成环DNA序列。

2.根据权利要求1的方法，其中所述形成茎环的DNA序列是天然存在的。

3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述DNA序列由最少15个核苷酸组成，所述核苷酸形成具有以下特征的一个或多个茎环二级结构：

-至少6个碱基对的双链茎结构和3-30个核苷酸的发夹环结构，和

-所述结构的热力学稳定性(ΔG)经计算为-2.8kcl/mol或更低。

4.权利要求2或权利要求3的方法，其中所述成环DNA序列来自微生物的染色体。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述微生物是Bacillus属的。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述微生物是Bacillus subtilis种的。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述DNA序列被定义为Bacillus subtilis的染色体核苷酸区，其由下述序列构成的组中存在的邻接序列组成，所述组由选自从基因cggR到基因gapA、从基因hrcA到基因grpE、从基因ilvN到基因ilvC、从基因aprE到基因yhfO、从基因ybdA到基因gsiB和从基因ytxC到基因thrS的序列构成。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述DNA序列为天然存在的Bacillus subtilis的从cggR到基因gapA的序列，优选地是基因cggR的3’端和cggR基因终止密码子下游再10个核苷酸，由SEQ ID No.1或其部分表示。

9.权利要求8的方法，其中所述DNA序列为SEQ ID No.2。

10.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述DNA序列是天然存在的Bacillus subtilis的从基因hrcA到基因grpE的序列，优选地在这些基因之间的序列，由SEQ ID No.3表示。

11.权利要求10的方法，其中所述DNA序列是ID No.4。

12.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述DNA序列是SEQ ID No.5或SEQ ID No.6。

13.经稳定的mRNA序列，其特征在于它们5’端含有从下述DNA序列转录而来的稳定元件，所述DNA序列被引入所述微生物的所述相关基因转录起点下游七个或更多DNA核苷酸处。

14.权利要求13的mRNA序列，其中所述稳定元件是茎环，所述mRNA序列的特征在于其含有最少15个核苷酸，所述核苷酸形成具有以下特征的一个或多个茎环二级结构：

-所述结构的热力学稳定性(ΔG)经计算为-2.8kcl/mol或更低。

15.DNA序列，其被微生物转录后形成权利要求13或权利要求14中所要求的被稳定的mRNA序列。

16.DNA序列，其特征在于SEQ ID Nos.1-6中任一项。

17.经转化的微生物，其包含权利要求15或权利要求16的DNA序列。

18.权利要求13和14中所述的被稳定的mRNA序列用于促进微生物中想要的化合物生产的用途。

19.权利要求15或16中所述的DNA序列用于在权利要求1-12中任一项所定义的方法中提高来自一个或多个基因的mRNA转录物稳定性的用途。

20.前文所述的本发明，特别是参考所述实施例。