CN101292024A

CN101292024A - 用于表达抗体的真菌突变体的用途

Info

Publication number: CN101292024A
Application number: CNA2006800387770A
Authority: CN
Inventors: 莫根斯·T·汉森; 克里斯琴·I·乔根森; 简·莱姆贝克
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2005-10-17
Filing date: 2006-10-17
Publication date: 2008-10-22
Anticipated expiration: 2026-10-17
Also published as: WO2007045248A1; EP1941025B1; US7858360B2; CN101292024B; EP1941025A1; DK1941025T3; ATE514770T1; US20080248530A1

Abstract

本发明涉及丝状真菌细胞，其中内源碱性蛋白酶活性、内源中性金属蛋白酶活性和枯草杆菌蛋白酶类的内源丝氨酸蛋白酶活性全部或部分失活。特定地，内源碱性蛋白酶活性、内源中性金属蛋白酶活性和枯草杆菌蛋白酶类的内源丝氨酸蛋白酶活性分别由alp、npl和pepC基因编码。所述丝状真菌细胞特别适于产生异源蛋白质，如抗体。

Description

用于表达抗体的真菌突变体的用途

技术领域

本发明涉及丝状真菌细胞，其中内源碱性蛋白酶、内源金属蛋白酶和内源丝氨酸蛋白酶的活性全部或部分失活。此外，本发明涉及在丝状真菌宿主细胞中产生异源多肽的方法。

背景技术

近年来，在异源蛋白质表达中使用重组宿主细胞极大简化了大量商业上有价值的蛋白质的生产，否则这些蛋白质只能通过从它们的天然来源纯化而获得。目前，有很多表达系统的选择，可以从中选择表达系统用于产生任何指定的蛋白质，包括细菌和真核宿主。选择适当的表达系统经常不仅依赖于宿主细胞产生足够量处于活性状态的蛋白质的能力，而且，在很大程度上，还可以由蛋白质预期的最终用途而决定。

经常遇到的一个问题是由给定的宿主细胞产生的或存在于培养基中的高水平的蛋白水解酶。对于在丝状真菌中产生异源蛋白，蛋白酶是主要问题，因为它们存在于分泌过程的每一阶段，几种胞外蛋白酶也是如此。

有人建议可以提供丧失了产生特定蛋白分解化合物能力的宿主生物体。例如，国际专利申请WO 90/00192(Genencor)描述了不能分泌有酶活性的天冬氨酸蛋白酶的丝状真菌宿主，和EP 574 347(Ciba Geigy AG)描述了缺少枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶的曲霉菌宿主。

已报道降低蛋白质产物稳定性的蛋白酶的其它实例包括金属蛋白酶和碱性蛋白酶。

WO 1998/012300描述了异源蛋白质产物稳定性得到改进的真菌宿主，其中已将宿主细胞进行基因修饰，以表达水平显著降低的金属蛋白酶和碱性蛋白酶。

在EP 574 347和Frederick et al.，Gene，12557-64(1993)中已经描述了另一种胞内蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶，其例如由黑曲霉产生并命名为PepC，克隆了表达所述蛋白酶的基因，并描述了缺失突变体。

另一组处理蛋白酶是kexin族的蛋白酶，其识别二元的氨基酸基序，而且与移除N末端前肽有关。Kexin蛋白酶具有窄的底物特异性。已将真菌kexin如成熟酶(maturase)在黑曲霉中(Jalving et al.，2000，Applied and EnvironmentalMicrobiology 66：363-368)、构巢曲霉中(命名为KpcA)(Kwon et al.，2001，Molecular Cell 12：142-147)和米曲霉中(Mizutani et al.，2004，Eukaryotic Cell3：1036-1048)克隆和表征。

对于在真菌宿主中异源产生重组蛋白质，选择合适的宿主得到重组蛋白质的最佳表达和稳定性在很大程度上取决于蛋白质和蛋白质中存在的特定的蛋白酶识别位点。很难预测是否存在这样的识别位点。因此期望鉴定出为产生期望的蛋白质而特殊定制的(specifically tailored)新的突变体真菌菌株。本发明涉及在真菌宿主菌株中鉴定期望的蛋白酶突变用于产生异源蛋白质，并具体涉及这些突变的组合。

发明简述

本发明提供这些有用的蛋白酶缺陷菌株，其中至少三种蛋白酶的表达全部或部分消除。根据本发明受到影响的基因编码内源碱性蛋白酶活性、内源中性金属蛋白酶活性和内源的枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶活性。可选地，内源钙依赖性中性kexin亚族的丝氨酸蛋白酶全部或部分失活。

在第一方面，本发明涉及丝状真菌细胞，其中内源碱性蛋白酶活性、内源中性金属蛋白酶活性和内源的枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶活性全部或部分失活，其中碱性蛋白酶、中性金属蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶由选自下组的核苷酸序列编码：

(a)编码碱性蛋白酶的核苷酸序列，所述碱性蛋白酶具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：30的氨基酸具有至少65％同一性；编码中性金属蛋白酶的核苷酸序列，所述中性金属蛋白酶与SEQ ID NO：31的氨基酸具有至少65％同一性；和编码枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列，所述枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶与SEQ ID NO：32的氨基酸具有至少65％同一性；或

(b)与SEQ ID NO：26具有至少65％同一性的核苷酸序列，与SEQ ID NO：27具有至少65％同一性的核苷酸序列，和与SEQ ID NO：28具有至少65％同一性的核苷酸序列；或

(c)核苷酸序列，其与核苷酸序列SEQ ID NO：26、27或28中的任一个在至少中等严紧条件下杂交。

在第二方面，本发明涉及在根据本发明的丝状真菌宿主细胞中产生异源多肽的方法，其包括：

(a)将编码异源多肽的核苷酸序列引入宿主细胞；

(b)在有益于异源多肽表达的条件下，在合适的生长培养基中培养从(a)得到的细胞；和

(c)分离蛋白质产物。

发明详述

本发明涉及在丝状真菌宿主中表达异源蛋白，所述丝状真菌宿主与亲本真菌宿主相比进行了修饰，以减少内源蛋白酶的表达，否则所述内源蛋白酶会影响异源蛋白质的产率(production yield)和稳定性。

具体地，修饰丝状真菌宿主细胞以降低或优选消除内源碱性蛋白酶、内源金属蛋白酶和内源的枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶的表达。

金属蛋白酶

在本发明的上下文中，金属蛋白酶是包含催化的锌金属中心的蛋白分解酶，所述金属中心参与底物的肽骨架的水解。活性锌中心将这些蛋白酶与活性依赖于钙的存在的钙蛋白酶(calpain)区分开来。通过如下现象将蛋白酶确认为金属蛋白酶：用1mM 1，10-邻二氮杂菲(1，10-phenanthroline)去除锌中心后蛋白分解活性的可逆丢失，和在用Zn²⁺(0.1-100mM)滴定后活性的恢复。

具体地，本发明的上下文中包括的金属蛋白酶是中性金属蛋白酶，其为在中性pH区内(即在大约pH 6-8的范围内，优选在大约pH 6.5-7.5的范围内，更特定的大约pH 7)具有最优蛋白分解活性的金属蛋白酶。更具体地，本发明的上下文中包括的金属蛋白酶是Npl或NpII组的中性曲霉属金属蛋白酶(前述的Tatsumi，et al.，1991)。

在更具体的实施方案中，金属蛋白酶是米曲霉中性金属蛋白酶I(NpI)，其优选由包含如SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列或与其同源的序列的cDNA序列编码。具体地，同源序列与SEQ ID NO：27的同一性程度为至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，和甚至最优选至少97％。

优选地，同源序列编码蛋白酶，其具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：31(即，包括信号肽和前肽的完全多肽)的氨基酸的同一性程度为至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，和甚至最优选至少97％，其具有金属蛋白酶活性(下文称作同源多肽)。

碱性蛋白酶

在本发明的上下文中，碱性蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，其活性的峰值出现在中性至碱性的pH范围。对碱性蛋白酶氨基酸序列的分析显示其与枯草杆菌蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶的subtilase亚组的同源性。如Siezen等(1991.Protein Eng.4：719-737)所总结的，已经从各种生物体中鉴定了多于50种subtilase，从各种细菌，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性菌种，到真菌和酵母，到高等真核生物，包括蠕虫(worm)、昆虫、植物和哺乳动物。已经在多于四十种的这些subtilase中确定了氨基酸序列，并显示酶的成熟区长度从268到1775个氨基酸，N-末端附近的前-原-区长度从27到280个氨基酸。在真菌和酵母中，变化明显较小，相应的范围是：真菌中为279到397和105到121个氨基酸，而酵母中为297到677和126到280个氨基酸。克隆来自米曲霉的碱性蛋白酶完整编码区的cDNA片段，并在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表达(Tatsumi，H，et al.1989.Mol.Gen.Genet.219：33-38)。显示一级结构与其它测序的枯草杆菌蛋白酶共享29％到44％的同源性，而活性位点中的三个残基，枯草杆菌蛋白酶BPN’中的Asp32、His64和Ser221是保守的。

在具体实施方案中，碱性蛋白酶是米曲霉碱性蛋白酶(alp)，优选由包含SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列或与其同源的序列的cDNA序列编码。具体地，同源序列与SEQ ID NO：26具有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，和甚至最优选至少97％的同一性程度。

优选地，同源序列编码蛋白酶，其具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：30(即，包括信号肽和前肽的完全多肽)的氨基酸有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，和甚至最优选至少97％的同一性程度，其具有碱性蛋白酶活性(下文称作同源多肽)。

丝氨酸蛋白酶

在本发明的上下文中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，其由细胞壁部分释放，在pH 4.5-11具有宽的活性范围。对丝氨酸蛋白酶氨基酸序列的分析表明其与枯草杆菌蛋白酶-样丝氨酸蛋白酶的subtilase亚组的同源性。如Siezen等(1991.Protein Eng.4：719-737)所总结的，已经从各种生物体中鉴定了多于50种subtilase，从各种细菌，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性菌种，到真菌和酵母，到高等真核生物，包括蠕虫、昆虫、植物和哺乳动物。已经在多于四十种的这些subtilase中确定了氨基酸序列，显示酶的成熟区长度为268到1775个氨基酸，N-末端附近的前-原-区为27到280个氨基酸。在真菌和酵母中，变化明显较小，相应的范围是：真菌中为279到397和105到121个氨基酸，而酵母中为297到677和126到280个氨基酸。已经克隆出来自米曲霉、烟曲霉和黑曲霉的丝氨酸蛋白酶的完整编码区的基因组克隆(WO97/22705，Reichard et al.2000.Int.J.Med.Microbiol.290，549-558，和Frederick et al 1993.Gene 125.57-64.)。显示一级结构与其它测序的枯草杆菌蛋白酶共享29％到78％的同源性，而活性位点中的三个残基，枯草杆菌蛋白酶BPN’中的Asp32、His64和Ser221是保守的。

在具体实施方案中，枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶是米曲霉丝氨酸蛋白酶(pepC)，优选由包含SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列或与其同源的序列的cDNA序列编码。具体地，同源序列与SEQ ID NO：28具有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，和甚至最优选至少97％的同一性程度。

优选地，同源序列编码蛋白酶，其具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：32(即，包括信号肽和前肽的完全多肽)的氨基酸有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，和甚至最优选至少97％的同一性程度，其具有丝氨酸蛋白酶活性(下文称作同源多肽)。

在具体实施方案中，除了上述内源蛋白酶之外，丝状真菌宿主细胞也具有减弱或消除kexin亚族的丝氨酸蛋白酶的表达。

Kexin亚族的丝氨酸蛋白酶

Kexin是Ca²⁺依赖的跨膜丝氨酸蛋白酶，其在后期高尔基区室(late Golgicompartment)中切割Lys-Arg和Arg-Arg的羧基侧的分泌前蛋白(Fuller andThorner，1989，PNAS 86：1434-1438；Mizuno et al.，1988，Biochem.Biophys.Res.Commun.156：246-254)。Kexin亚族的所有成员都是钙依赖性中性丝氨酸蛋白酶，其通过去除在kexin特异性(自身)加工位点的氨基末端前肽来激活。活性蛋白酶都包含另外两个域，包含催化三联体(triad)的枯草杆菌蛋白酶-样域和大约150个残基的Homo B域或保守的P域。P域在其它枯草杆菌蛋白酶(subtilase)中不存在，它是催化活性和蛋白质稳定性所必需的。在构巢曲霉(Kwon et al.，2001，Mol.Cell 12：142-147)、黑曲霉(Jalving et al.，2000，Appl.Environ.Microbiol.66：363-368)和米曲霉(Mizutani et al.，2004，Eukaryotic Cell3：1036-1048)中发现了曲霉属kexin。

在具体实施方案中，kexin亚族的丝氨酸蛋白酶是米曲霉丝氨酸蛋白酶(kexB)，优选由包含SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列或其同源序列的cDNA序列编码。具体地，同源序列与SEQ ID NO：29具有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，和甚至最优选至少97％的同一性程度。

优选地，同源序列编码蛋白酶，所述蛋白酶具有的氨基酸序列与SEQ IDNO：33(即，包括信号肽和前肽的完整多肽)的氨基酸有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％，和甚至最优选至少97％的同一性程度，其具有丝氨酸蛋白酶活性(后文称作“同源多肽”)。

在具体实施方案中，根据本发明的丝状真菌细胞具有表型alp^-，np1^-，pepC^-和kexB^-，其中alp基因由与SEQ ID NO：26具有至少70％同一性的核苷酸序列编码；npl基因由与SEQ ID NO：27具有至少70％同一性的核苷酸序列编码；pepC基因由与SEQ ID NO：28具有至少70％同一性的核苷酸序列编码；而kexB基因由与SEQ ID NO：29具有至少70％同一性的核苷酸序列编码。

上述所指的核苷酸序列是对应于剪接后成熟mRNA的cDNA序列(无内含子的CDS)。

杂交

就本发明而言，杂交表示核酸序列与SEQ ID NO：26、27、28或29所示至少一个核酸序列，在非常低到非常高严紧条件下杂交。可以使用X-射线片或通过本领域已知的任何其它方法检测在这些条件下与核苷酸序列杂交的分子。在本上下文中使用术语“多核苷酸探针”时，就应该理解为这样的探针包含至少15个核苷酸。

在一个实施方案中，多核苷酸探针是SEQ ID NO：26、27、28或29中所示的核苷酸序列，或SEQ ID NO：26、27、28或29的互补链。

在一个实施方案中，杂交在至少中等严紧条件下进行，更具体在至少中高严紧条件下进行，和甚至更具体在至少高严紧条件下进行。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高严紧条件定义为：根据标准的Southern印迹方法，在5×SSPE、1.0％SDS、5×Denhardt溶液、100μg/ml经过剪切和变性的鲑精DNA中于42℃预杂交和杂交。优选地，至少100个核苷酸的长探针包含的核苷酸不多于1000个。对于长度至少为100个核苷酸的长探针，载体材料最后使用2×SSC、0.1％SDS于42℃洗三次，每次15分钟(非常低严紧性)；优选使用0.5×SSC、0.1％SDS于42℃洗三次，每次15分钟(低严紧性)；更优选使用0.2×SSC、0.1％SDS于42℃洗三次，每次15分钟(中严紧性)；甚至更优选使用0.2×SSC、0.1％SDS于55℃洗三次，每次15分钟(中-高严紧性)；最优选使用0.1×SSC、0.1％SDS于60℃洗三次，每次15分钟(高严紧性)；特别是使用0.1×SSC、0.1％SDS于68℃洗三次，每次15分钟(非常高严紧性)。

尽管不是特别优选，但期望还可以使用更短的探针，例如长度为约15至99个核苷酸的探针，如长度为约15至约70个核苷酸。对于这样的短探针，将严紧条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy的方法计算的T_m(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48：1390)低5到10℃的温度，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH 7.6、6mM EDTA、0.5％NP-40、1×Denhardt溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg/ml酵母RNA中根据标准的Southern印迹方法进行预杂交、杂交和杂交后洗涤(washing post-hybridization)。

对于长度为约15个核苷酸至99个核苷酸的短探针，载体材料在比计算的T_m低5℃至10℃的温度，于6×SSC加0.1％SDS中洗一次15分钟，以及使用6×SSC洗两次，每次15分钟。

宿主细胞的基因修饰

为了表达水平显著降低的金属蛋白酶、碱性蛋白酶和丝氨酸蛋白酶活性(和任选的kexin亚族的丝氨酸蛋白酶)，对本发明的宿主细胞进行基因修饰，所述修饰可以通过使用本领域技术人员公知的标准重组DNA技术实现。可将分别负责产生蛋白酶活性的基因序列失活或者部分或全部消除。因此，本发明的宿主细胞表达金属蛋白酶、碱性蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的水平降低或检测不到，或者表达功能上无活性的蛋白酶。

在具体实施方案中，通过对目的蛋白酶基因中各自编码的结构或调控区域进行修饰而获得所述失活。已知和有用的技术包括，但不仅限于，特定或随机突变；PCR产生的突变；位点特异性的DNA缺失、插入和/或取代；基因破坏或基因取代；反义技术或其组合。

可以使用合适的物理或化学诱变剂进行突变。适用于本目的的物理或化学诱变剂的实例包括，但不仅限于，紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、蚁酸和核苷类似物。当使用这样的试剂时，通常通过如下进行突变：培养细胞使其在合适的条件下在选择的诱变剂存在下诱变，选择显示所选的蛋白酶产生显著降低的细胞。

可以如Markaryan et al(1996)J Bacteriology 178，no 8，2211-2215所述测定碱性和中性金属蛋白酶I的胞外蛋白酶活性。简而言之，将菌株在诱导胞外蛋白酶产生的培养基中培养。然后将培养液与菌丝体(mycelium)分离，并用底物Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNa和Abz-Ala-Ala-Phe-Phe-pNa分别实验测定碱性和金属蛋白酶活性。

可以如Jalving et al(2000)Applied and Environmental Microbiology 66，no1，363-368所述测定胞内Kexin。简而言之，将菌株在基本培养基(COVE(1966)Biochim.Biophys.Acta 113，51-56)中培养，收获并研磨菌丝体，将膜蛋白级分在HEPES缓冲液中悬浮并储存于-20℃直至使用。通过使用底物Boc-Leu-Lys-Arg-MCA分析分离的膜蛋白级分的kexin活性。

可以根据Reihard et al.(2000)Int.J.Med.Microbiol.290，85-96测定与细胞壁结合的pepC。简而言之，将菌株在基本培养基(COVE(1966)Biochim.Biophys.Acta 113，51-56)中培养，收获并研磨菌丝体，将细胞壁部分在柠檬酸钠缓冲液中悬浮并于储存在-20℃直至用于蛋白酶实验。通过偶氮酪蛋白(azocasein)试验(Scharmann and Balke(1974)Physiol.Chem.355，443-450)分析分离的细胞壁的pepC活性。

还可以通过在结构序列或结构序列的转录或翻译所需的调控元件中引入、取代或去除一个或多个核苷而完成修饰。例如，可以插入或去除核苷酸，从而导致引入终止密码子、去除起始密码子或改变结构序列的开放阅读框。可通过依照本领域已知方法进行的定点突变或PCR产生的突变来完成结构序列或其调控元件的修饰或失活。原则上，尽管可以在体内进行修饰，即直接对表达金属蛋白酶、碱性蛋白酶和丝氨酸蛋白酶基因的细胞进行修饰，但是目前优选在体外进行修饰，如下所举例说明的。

在所选的宿主细胞中失活或减少所述蛋白酶产生的方便的方法基于基因阻断(gene interruption)技术。在这种方法中，对应于目的内源基因或基因片段的DNA序列在体外突变。所述DNA序列因此编码缺陷基因，然后将所述DNA序列转化入宿主细胞。通过同源重组，缺陷基因取代内源基因或基因片段。可以期望的是，缺陷基因或基因片段还编码标记，其可用于选择转化子，所述转化子中分别编码金属蛋白酶和/或碱性蛋白酶的基因已被修饰或破坏。

缺失或破坏目的基因的方法由Miller，et al(1985.Mol.Cell.Biol.5：1714-1721)；WO 90/00192；May，G.(1992.Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi.J.R.Kinghorn and G.Turner，eds.，Blackie Academic andProfessional，pp.1-25)；and Turner，G.(1994.Vectors for Genetic Manipulation.S.D.Martinelli and J.R.Kinghorn，eds.，Elsevier，pp.641-665)具体地描述。

或者，可以使用与下述序列互补的核苷酸序列通过已建立的反义技术进行DNA序列的修饰或失活：金属蛋白酶的编码序列，例如SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列，碱性蛋白酶编码序列，例如SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列，或枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶和任选的也是kexin亚族的丝氨酸蛋白酶，例如SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列。在美国专利号5,190,931(纽约大学(University of New York))中详细描述了反义技术及其应用。

因此，由于基因修饰，本发明的宿主细胞表达金属蛋白酶、碱性蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶活性的水平显著降低。在具体实施方案中，宿主细胞另外表达水平显著降低的kexin亚族的丝氨酸蛋白酶。在具体实施方案中，由宿主细胞表达的这些蛋白分解活性的水平各自降低多于大约50％，优选多于大约85％，更优选多于大约90％，和最优选多于大约95％。在另一个具体实施方案中，本发明的宿主细胞中的这些蛋白分解活性可以以任何组合降低。在最具体的实施方案中，由于任何一种上述蛋白酶，由宿主细胞表达的产品基本上没有蛋白分解活性。

产生蛋白质的方法

通过本发明的方法，金属蛋白酶、碱性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶和任选的kexin亚族的丝氨酸蛋白酶的蛋白分解活性显著降低，从而改进由本发明的宿主细胞合成的易感的(susceptible)蛋白质产物的稳定性，并增加其产率。更具体地，通过本发明的方法，在宿主细胞的编码或控制金属蛋白酶、碱性、枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶和任选的kexin亚族蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的结构和/或调控区域内进行基因修饰。

因此，本发明的另一个方面提供在本发明的宿主细胞中产生蛋白质(包括异源多肽)的方法，其中所述方法包括将编码目的蛋白质产物的核酸序列引入所述宿主细胞中，在合适的生长培养基中培养宿主细胞，然后回收蛋白质产物。

因此，本发明的宿主细胞必须包含表达期望的产物所需的结构和调控基因区域。这样的结构和调控区域的性质主要取决于所述产物和宿主细胞。可由本领域的技术人员使用用于转化或转染宿主细胞的标准重组DNA技术来完成本发明的宿主细胞的基因设计(参见，例如，Sambrook et al.等，及其它)。

优选地，通过本领域已知的方法修饰宿主细胞，以引入适当的克隆介质(cloning vehicle)，即质粒或载体，其包含编码期望蛋白质产物的DNA片段。可将克隆介质作为自主复制质粒引入宿主细胞，或整合入染色体。优选地，克隆介质包含与一个或多个适当的调控区可操作连接的一个或多个结构区。

结构区是编码期望蛋白质产物的核苷酸区。调控区包括：启动子区，其包含转录和翻译控制序列；终止子区，其包含终止信号；和多聚腺苷酸化区。启动子，即在所选宿主细胞中显示转录活性的核苷酸序列，可以源自编码胞外或胞内蛋白质的基因，所述蛋白质优选酶，如淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶、氧化还原酶、果胶酶、角质酶或糖酵解酶(glycolytic enzyme)。

用于在丝状真菌宿主细胞中表达异源蛋白质的合适的启动子的实例是从下述酶的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、Fusarium venenatum淀粉葡萄糖苷酶(WO00/56900)、Fusarium venenatum Daria(WO 00/56900)、Fusarium venenatumQuinn(WO 00/56900)、尖镰孢胰岛素样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉β-葡萄糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶；以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的启动子的杂合体)；及其突变的、截短的和杂合启动子。

克隆介质还可以包括选择性标记，如补充宿主细胞中的缺陷的基因产物，或者赋予抗生素抗性的基因产物。作为曲霉属选择标记的有用的抗生素实例包括潮霉素、腐草霉素和basta。曲霉属选择标记的其它实例包括：amdS，其编码与乙酰胺利用有关的酶；pyrG，其编码与尿苷(uridine)生物合成有关的酶；argB，其编码与精氨酸生物合成有关的酶；niaD，其编码与硝酸盐同化途径有关的酶；和sC，其编码与硫酸盐同化途径有关的酶。优选在曲霉属宿主细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记。此外，可以通过共转化完成选择，其中用两个载体的混合物进行转化，仅对一个载体进行选择。

用于分别连接本发明的DNA构建体、启动子、终止子和其它元件，并将它们插入包含复制所需信息的合适的克隆介质中的方法为本领域的技术人员所熟知(参见，例如Sambrook et al.，1989，及其它)。

使用的培养液(culture broth)或培养基可以是任何适于培养本发明的宿主细胞的常规培养基，并根据现有技术的原则配制。培养基优选包含碳源和氮源，以及其它无机盐。合适的培养基，例如基本或复合培养基，可以从商品供应商处得到，或者可以根据出版的配方制备，如在The American TypeCulture Collection出版的The Catalogue of Strains，Rockville MD，USA.1970。

发酵合适的pH常常取决于这样的因素，如所用宿主细胞的性质、生长培养基的组成、目的多肽的稳定性等。因此，尽管可以使用在任何pH进行的任何发酵方法培养本发明的宿主细胞，但有利的是，发酵方法的pH使得宿主细胞的酸性和/中性蛋白酶活性基本上消除或至少显著降低。因此，如WO 90/00192所述，也可以通过提高发酵pH来实现天冬氨酸蛋白酶活性的去除，而对从在碱性pH范围培养的宿主细胞中得到的期望蛋白质的产率不显示任何附加的有利影响。

如果发酵过程的pH在从5至11的范围中，如从6至10.5、7至10或8至9.5，酸性蛋白酶，如天冬氨酸和丝氨酸蛋白酶，和在大于7的pH范围内的中性蛋白酶的活性将下降或阻断(block)。在碱性发酵条件下产生的酶的实例包括内切葡聚糖酶、肌醇六磷酸酶和蛋白质二硫键异构酶。

然而，碱性pH范围将维持未修饰的宿主细胞中的碱性蛋白酶活性，所需细胞则因而可能潜在地导致目的多肽产物的降解。因此，在这样的情况下，将编码碱性蛋白酶的基因失活是特别有利的。

本发明的碱性蛋白酶基因的失活还对某些宿主细胞是特别有利的，因为酸性、中性和碱性蛋白酶活性的水平在不同菌种之间变化。例如，在米曲霉中的碱性蛋白酶活性水平高于黑曲霉中的水平。

在培养后，通过从培养液分离和纯化蛋白质的常规方法回收期望的蛋白质。沿用已久的纯化方法包括：通过离心或过滤从培养基分离细胞，通过盐(如硫酸铵)将培养基中的蛋白质组分沉淀，和色谱方法(如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等)。

产物

由本发明的宿主细胞表达的期望的终产物(即异源蛋白质)可以是任何真细菌或真核蛋白质或肽。

如本文所定义的，“异源蛋白质”是蛋白质或多肽基因产物，其对于宿主细胞不是天然的；或者是天然蛋白质，其中进行了修饰以改变天然序列；或者是天然蛋白质，由于对所述天然蛋白质表达所需的天然调控序列(如启动子、核糖体结合位点等)的操作，或者通过重组DNA技术对宿主细胞的其它操作，导致蛋白质的表达在数量上改变。

序列同一性与比对

在本上下文中，两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的同源性用参数“同一性”描述。

就本发明而言，序列比对和同源性分值的计算可以使用完全的Smith-Waterman比对完成，其适用于蛋白质和DNA比对。默认的计分矩阵BLOSUM50和同一性矩阵分别用于蛋白质和DNA比对。在缺口中第一个残基的罚分对于蛋白质是-12，对于DNA是-16；而缺口中其它残基的罚分对于蛋白质是-2，对于DNA是-4。可以用v20u6版的FASTA软件包进行比对(W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological SequenceAnalysis″，PNAS 85：2444-2448，and W.R.Pearson(1990)″Rapid and SensitiveSequence Comparison with FASTP and FASTA″，Methods in Enzymology，183：63-98)。

可以使用“ClustalW”进行蛋白质序列的多重比对(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.and Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：improving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting，positions-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic Acids Research，22：4673-4680)。可以使用蛋白质比对作为模板，用来自DNA序列的相应密码子代替氨基酸来进行DNA序列的多重比对。

可以使用可替换的不同软件比对氨基酸序列和DNA序列。两个氨基酸序列的对齐，例如通过使用来自2.8.0版的EMBOSS软件包的Needle程序确定(http://emboss.org)。Needle程序运行Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中描述的全局比对算法。使用的置换矩阵(substitutionmatrix)是BLOSUM62，缺口开放罚分是10，而缺口延伸罚分是0.5。

将本发明的氨基酸序列(“发明序列”；例如SEQ ID NO：32)和不同的氨基酸序列(“外源序列”)之间的同一性程度计算为：两个序列的比对中精确匹配的数目，除以“发明序列”的长度或“外源序列”的长度，取其中最短的一个。结果以百分比同一性表示。

当“发明序列”和“外源序列”在重叠的相同位置具有相同的氨基酸残基时，出现精确匹配(在下述比对实例中用“|”表示)。序列的长度是序列中氨基酸残基的数目(例如SEQ ID NO：32的长度是495)。

在下述完全假设的比对实例中，重叠是序列1的氨基酸序列“HTWGER-NL”；或者序列2的氨基酸序列“HGWGEDANL”。在实例中，缺口用“-”表示。

假设的比对实例：

序列1：ACMSHTWGER-NL SEQ ID NO：34

| ||| ||

序列2： HGWGEDANLAMNPS SEQ ID NO：35

就本发明而言，优选通过Wibur-Lipman方法(Wilbur and Lipman，1983，Proceedings of the National Academy of Science USA 80：726-730)，使用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)来确定两个核苷酸序列之间的同一性程度。所述软件带有同一性表，使用下述多重比对参数：缺口罚分为10，缺口长度罚分为10。配对比对参数是K元组(Ktuple)＝3，缺口罚分＝3，和窗口＝20。

在具体的实施方案中，用如下方法确定多肽的氨基酸序列与，或对于，SEQ ID NO：32的氨基酸1-495的同一性的百分比：i)使用Needle程序，比对两个氨基酸序列，所述程序带有BLOSUM62置换矩阵，缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5；ii)计算比对中精确匹配的数目；iii)用精确匹配的数目除以两个氨基酸序列中最短者的长度，和iv)将iii)中除法得到的结果转换成百分比。对于，或与，本发明的其它序列的同一性百分比用类似方式计算。

宿主细胞

本发明的宿主细胞是丝状真菌。在目的多肽的重组产生中使用本发明的宿主细胞是有利的。可以用编码目的多肽的DNA构建体转化细胞，便利地通过将一个或多个拷贝的DNA构建体整合入宿主染色体。通常认为此整合是有利的，因为DNA序列更可能在细胞中稳定地保持。将DNA构建体整合入宿主染色体可以根据常规方法(例如，通过同源或异源重组)来进行。或者，可以用下述实例中所述的与不同类型的宿主细胞有关的表达载体转化细胞。

丝状真菌宿主细胞

本发明的宿主细胞是丝状真菌，其由子囊菌子囊菌(Ascomycota)的下组之一代表，包括，例如，脉孢菌属(Neurospora)、正青霉属(Eupenicillium)(＝青霉属(Pencillium))、裸孢壳属(Emericella)(＝曲霉属(Aspergillus))和散囊菌属(Eurotium)(＝曲霉属)。

在优选实施方案中，丝状真菌属于真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亚门的丝状形式之一，如Hawksworth et al.，In，Ainsworth and Bisby’s DictionaryofThe Fungi，8th edition，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK所定义。丝状真菌表征为：由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的营养菌丝体。营养生长是通过菌丝延长进行，而碳分解代谢是专性好氧的。

在更具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是下述种类的细胞，但不仅限于：枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)和木霉属(Trichoderma)或其有性型(teleomorph)和同物异名(synonym)。在甚至更具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是曲霉属细胞。在另一个甚至更具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是顶孢霉细胞。在另一个甚至更具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是镰孢属细胞。在另一个甚至更具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是腐质霉属细胞。在另一个甚至更具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是毛霉属细胞。在另一个甚至更具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是毁丝霉属细胞。在另一个甚至更具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是脉孢菌属细胞。在另一个甚至更具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是青霉属细胞。在另一个甚至更具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是梭孢壳属细胞。在另一个甚至更具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是弯颈霉属细胞。在另一个甚至更具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是木霉属细胞。在最具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)或米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞。在另一个具体实施方案中，丝状真菌宿主细胞是脱色部分(sectionDiscolor)(也称为镰孢部分(section Fusarium))的镰孢属细胞。例如，丝状真菌宿主细胞可以是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)(完全阶段中称为玉蜀黍赤霉(Gibberellazeae)，先前称为球壳菌(Sphaeria)，与粉红赤霉(Gibberalla roseum)和禾谷粉红赤霉(Gibberalla roseum f.sp.ceralis)同物异名)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)或镶片镰孢(Fusarium venenatum)细胞。在另一个优选实施方案中，丝状真菌宿主细胞是Elegans部分的镰孢属菌株，例如，尖镰孢(Fusarium oxysporum)。在另一个最具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是特异腐质霉(Humicola insolens)或疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)细胞。在另一个最具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是米黑毛霉(Mucor miehei)细胞。在另一个最具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophilum)细胞。在另一个最具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)细胞。在另一个最具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)或绳状青霉(Penicillium funiculosum)(WO 00/68401)细胞。在另一个最具体的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是土生梭孢霉(Thielavia terrestris)细胞。在另一个最具体的实施方案中，木霉细胞是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

在本发明的所有实施方案中，丝状真菌宿主细胞是蛋白酶缺陷或蛋白酶阴性(protease minus)菌株，其中至少三种内源蛋白酶的表达降低或全部消失。

在具体的实施方案中，亲本菌株是WO 00/39322的实施例1中所述的蛋白酶缺陷型米曲霉菌株BECh2，其在WO 98/12300的实施例1中也称作JaL228。所述菌株是alp^-和npl^-型的(缺失碱性蛋白酶Alp和中性金属蛋白酶Npl)，能将其进一步修饰成根据本发明特别有用的菌株，在该菌株中引入了其它的突变，如下述实例所述，以产生根据本发明的丝状真菌菌株，其中额外将命名为PepC的枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶和任选将钙依赖性中性丝氨酸蛋白酶KexB缺失。

丝状真菌宿主细胞的转化

可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化丝状真菌宿主细胞。在EP 238023、EP 184,438和Yelton et al.，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474中描述了转化曲霉属宿主细胞的合适方法。转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier et al.，1989，Gene 78：147-156或共同未决的(co-pending)US Serial No.08/269,449描述。

根据本发明的丝状真菌细胞特别用于表达异源多肽。

在本发明的一个方面，将根据本发明的丝状真菌细胞用于表达异源多肽。因此本发明的又一方面涉及在本发明的丝状真菌宿主细胞中产生异源多肽的方法，其包括步骤：

(a)将编码异源多肽的核酸序列引入宿主细胞；

(b)在有益于异源多肽表达的条件下，在合适的生长培养基中培养来自(a)的细胞；和

(c)分离蛋白质产物。

在一个实施方案中，异源多肽是哺乳动物起源的多肽。具体地，多肽是抗体或抗体片段。在其它具体的实施方案中，抗体或抗体片段选自下组：lgG1、lgG2、lgG3、lgG4、lgM、lgA、lgD、lgE、F(ab’)₂和Fab。

材料与方法

材料

菌株

米曲霉IFO4177：可从Institute for fermentation，Osaka；17-25 JusoHammachi 2-Chome Yodogawa-Ku，Osaka，Japan获得。此菌株也与菌株NBRC4177等同。因此菌株还可从NITE Biological Resource Center以登录号NBRC4177获得。

JaL810在实施例3中描述。

JaL893在实施例7中描述。

JaL895在实施例7中描述。

BECh2在WO 00/39322，实施例1中描述，其在WO 98/12300，实施例1中也称为JaL228。

NZ-2在实施例7中描述。

HowB101在WO 97/3556，实施例1中描述，是IFO4177的pyrG突变体。

JaL352在实施例2中描述。

JAL355在实施例2中描述。

JaL741在实施例7中描述。

MT2874在实施例2中描述。

ToC1418在实施例2中描述。

JaL799在实施例10中描述。

JaL827在实施例11中描述。

基因

pyrG：这个基因编码尿苷(uridine)生物合成中涉及的酶，乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶。

质粒

pBLSK-2-：构建在Short et al，1988，Nucleic acids Res.16：7583-7600中描述。

4Blunt-TOPO来自Invitrogen A/S，Denmark。

pDV8在专利WO 0168864的实施例8中描述。

pNZ-3在实施例5中描述。

pNZ-4在实施例6中描述。

pIC7在Marsh et al，1984，Gene 32：481-485中描述。

pJaL173在专利WO 98/12300，实施例1中描述。

pJaL235在WO 97/22705，实施例1中描述。

pJaL270在实施例1中描述。

pJaL335在专利WO 98/12300，实施例1中描述。

pJaL504在实施例1中描述。

pJaL554在实施例9中描述。

pJaL574在实施例9中描述。

pJaL676在WO 03/008575，实施例5中描述。

pJaL720在实施例4中描述。

pJaL721在WO 03/008575，实施例17中描述。

pJaL723在实施例4中描述。

pJaL728在实施例4中描述。

pJaL784在实施例4中描述。

pJaL790在实施例4中描述。

pJaL800在实施例9中描述。

pJaL818在实施例9中描述。

pJaL819在实施例9中描述。

pJaL835在实施例9中描述。

pJaL836在实施例9中描述。

pMT2830在实施例1中描述。

pMT2833在实施例1中描述。

pMT2835在实施例1中描述。

pSO2在专利WO 9735956，实施例1中描述。

pUC19：构建在Vieira et al，1982，Gene 19：259-268中描述。

引物、DNA序列和氨基酸序列

引物419(SEQ ID NO：1)

引物424(SEQ ID NO：2)

引物423 SEQ ID NO：3)

引物420 SEQ ID NO：4)

引物104025(SEQ ID NO：5)

引物104027(SEQ ID NO：6)

引物104026(SEQ ID NO：7)

引物104028(SEQ ID NO：8)

引物108089(SEQ ID NO：9)

引物108091(SEQ ID NO：10)

引物114839(SEQ ID NO：11)

引物135944(SEQ ID NO：12)

引物B6577F12(SEQ ID NO：13)

引物B6575F12(SEQ ID NO：14)

重链(SEQ ID NO：15)

引物H-N(SEQ ID NO：16)

引物H-C(SEQ ID NO：17)

轻链(SEQ ID NO：18)

引物L-N(SEQ ID NO：19)

引物L-C(SEQ ID NO：20)

引物172450(SEQ ID NO：21)

引物172449(SEQ ID NO：22)

引物T5483H12(SEQ ID NO 23)

引物T5425G10(SEQ ID NO 24)

包含来自米曲霉IFO4177的kexB的SalI片段(SEQ ID NO：25)

alp cDNA(SEQ ID NO：26)

npI cDNA(SEQ ID NO：27)

pepC cDNA(SEQ ID NO：28)

kexB cDNA(SEQ ID NO：29)

Alp氨基酸序列(SEQ ID NO：30)

NpI氨基酸序列(SEQ ID NO：31)

PepC氨基酸序列(SEQ ID NO：32)

KexB氨基酸序列(SEQ ID NO：33)

方法

PCR、克隆、连接核苷酸等的常规方法为本领域的技术人员所熟知，例如，可以在下述文献中找到：“Molecular cloning：A laboratory manual”，Sambrook et al.(1989)，Cold Spring Harbor lab.，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M.et al.(eds.)；“Current protocols in Molecular Biology”，John Wileyand Sons，(1995)；Harwood，C.R.，and Cutting，S.M.(eds.)；“DNA Cloning：APractical Approach，Volumes I and II”，D.N.Glover ed.(1985)；“OligonucleotideSynthesis”，M.J.Gait ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”，B.D.Hames &S.J.Higgins eds(1985)；“A Practical Guide To Molecular Cloning”，B.Perbal，(1984)。

DNA杂交

简而言之，所有DNA杂交在标准杂交缓冲液中在65℃进行16小时，标准杂交缓冲液包括：10×Denhart溶液、5×SSC、0.02M EDTA、1％SDS、0.15mg/ml多聚腺苷酸化RNA(polyA RNA)和0.05mg/ml酵母tRNA。杂交后，将滤膜(filter)在2×SSC、0.1％SDS中在65℃清洗两次，并暴露于X射线片。

PCR扩增

所有PCR扩增都以100μL的体积进行，所述100μL在反应缓冲液中包含：2.5单位Taq聚合酶、100ng pSO2、dNTP各250nM和上述两种引物各10pmol，反应缓冲液包括50mM KCl、10mM Tris-HCl pH 8.0和1.5mMMgCl₂。

扩增在Perkin-Elmer Cetus DNA Termal 480中进行，并且由94℃3分钟的一个循环，之后是94℃1分钟、55℃30秒钟和72℃1分钟的25个循环组成。

实施例1

米曲霉pepC缺失质粒pMT2835的构建

通过用每种限制性内切核酸酶进行接连的两轮切割(two succeedingrounds of cutting with each of the restriction endonucleases)来去除pDV8中单一的限制性内切核酸酶位点BamHI和BglII，并通过用Klenow聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸处理来填平(fill out)游离的突出末端，并连接得到质粒pJaL504。

用SalI消化质粒pJaL235，将5912bp片段重新连接，得到质粒pJaL270。

根据先前测定的克隆于pJaL270中的pepC基因序列，通过PCR从米曲霉BECh2中克隆米曲霉的pepC基因的侧翼序列。使用引物419和424(SEQID NO：1和2)扩增5’侧翼，使用引物423和420(SEQ ID NO：3和4)扩增3’侧翼。扩增的侧翼(分别为0.8kb和1.1kb)不与pepC编码序列有任何重叠。设计引物423和424，以使两个侧翼通过SOE融合，并同时在融合两个侧翼的接头(linker)中引入NheI和XhoI位点。将SOE融合产物克隆入

4-TOPOblunt得到pMT2830。使用NheI和XhoI位点来插入重复连接于侧翼的来自pJaL335的pyrG选择标记(insert the repeat flanked pyrG selection marker frompJaL335)，其先前被克隆入pBLSK 2^-的HindIII位点，使得可将其作为SpeI-XhoI片段移动。将包含pyrG插入物的质粒称作pMT2833。最后，将在pyrG选择标记两侧(either side)包含两段pepC侧翼的pMT的缺失盒，作为NotI-SpeI片段转移到tk反选择性(counter selectable)质粒pJaL504的NotI和XbaI位点，以得到缺失质粒pMT2835。要注意的是pMT2835在紧邻pepC 3’侧翼的下游包含唯一的NotI位点，它可以用来在转化入米曲霉之前将质粒线性化。

实施例2

构建pepC缺失的米曲霉菌株MT2874

为了移除米曲霉菌株BECh2中碱性蛋白酶基因中存在的缺陷pyrG基因，进行下述步骤：

A.分离pyrG^-(pyrG minus)米曲霉菌株ToC1418

筛选米曲霉菌株BECh2(缺失alp和缺失npl)对5-氟-乳清酸(FOA)的抗性，从而在基本培养基平板(Cove D.J.1966.Biochem.Biophys.Acta.113：51-56)上鉴定自发的pyrG突变体，所述基本平板中补加1.0M蔗糖作为碳源，10mM硝酸钠作为氮源，和0.5mg/ml FOA。将一个菌株ToC1418鉴定为缺失pyrG的菌株。ToC1418是尿苷依赖型的，因此可以用野生型pyrG基因转化它，根据在缺少尿苷时生长的能力选择转化子。

B.构建pyrG⁺(pyrG plus)米曲霉菌株JaL352

通过测序确定碱性蛋白酶基因中存在的缺陷pyrG基因中的突变。制备米曲霉菌株BECh2的染色体DNA，并用引物104025(SEQ ID NO：5)和104026(SEQ ID NO：7)通过PCR扩增含有缺陷pyrG基因的编码区的933bp片段。纯化933bp的片段，并用下述引物测序：104025、104026、104027(SEQ ID NO：6)、104028(SEQ ID NO：8)、108089(SEQ ID NO：9)和108091(SEQ ID NO：10)。测序显示在pyrG编码区的514位(从pyrG基因的起始密码子中的A开始计算)插入了一个多余碱基G，因此产生了移码突变。

为了从碱性蛋白酶基因alp中存在的缺陷pyrG基因重新产生野生型pyrG基因，用150pmol 5’末端磷酰基化的寡核苷酸114839(SEQ ID NO：11)，使用标准步骤转化pyrG^-米曲霉菌株ToC1418。寡核苷酸恢复pyrG阅读框，但是同时引入沉默突变由此产生StuI限制性内切核酸酶位点。根据转化子在缺少尿苷的基本平板上生长的能力筛选转化子(Cove D.J.1966.Biochem.Biophys.Acta.113：51-56)，所述基本平板上补加1.0M蔗糖作为碳源，和10mM硝酸钠作为氮源。重新分离后，由8个转化子制备染色体DNA。为了证实所发生的变化，用引物135944(SEQ ID NO：12)和108089(SEQ ID NO：9)通过PCR扩增785bp片段，所述片段覆盖了目的区域。纯化785bp片段，并用引物108089(SEQ ID NO：9)和135944(SEQ ID NO：12)测序。将具有预期的变化的菌株命名为JaL352。

C.分离pyrG^-米曲霉菌株JaL355

为了去除碱性蛋白酶基因中存在的pyrG基因，用携带米曲霉碱性蛋白酶基因的5’和3’侧翼序列的pJaL173的5.6kb BamHI片段通过标准方法转化JaL352。将原生质体在非选择性平板上再生并收集孢子。对109个孢子筛选FOA抗性的约以鉴定pyrG突变体。重新分离后，由14个FOA抗性转化子制备染色体DNA。用BalI消化染色体DNA，并使用来自pJaL173的1kb 32P标记的DNA BalI片段作为探针通过Southern印迹进行分析，所述BalI片段包含米曲霉碱性蛋白酶基因的5’和3’侧翼的部分。根据4.8kb的BalI条带的消失和1kb的BalI条带的出现来鉴定目的菌株。用来自pJaL335的包含米曲霉pyrG基因的3.5kb 32P标记的DNAHindIII片段探测同样的滤膜，结果显示目的菌株中4.8kb BalI条带已经消失。将由这些转化子得到的一个菌株命名为JaL355。

D.构建pepC缺失的米曲霉菌株MT2874

用NotI剪切20μgpMT2835，随后如制造商(New England Biolabs)所推荐的将酶热失活。然后将质粒用乙醇沉淀，并以适于转化入米曲霉的浓度重新溶解于Tris缓冲液(10mM pH 8.0)中。

将线性化的质粒DNA转化入米曲霉JaL355，在FDU平板上进行pyrG的选择和tk基因的反选择(counter selection)，如先前在WO 0168864中所述。重新分离24个转化子克隆两次，最后将它们在液体培养基中培养。如先前在WO 0168864中所述制备染色体DNA，并用于pepC基因座的Southern分析，目的是鉴定在染色体pepC和缺失盒之间发生了彻底的(clean)双交换的转化子。用EcoRI和PvuI消化染色体DNA。首先用5’侧翼(作为从pMT2835切下的0.8kb EcoRI-XhoI片段的5’侧翼)(探针1)探测Southern印迹物。对于完整的野生型(wt)pepC基因座，预期3.1kb EcoRI-PvuI片段与这个探针杂交，而对于由于期望的双交换产生的pepC缺失的衍生物，5.5kb片段将与之杂交。24个转化子中只有一个，即JaL355/pMT2835#5，在Southern印迹分析中显示出3.1kb杂交片段的消失和5.5kb杂交片段的出现。将Southern的第一个5’侧翼探针剥离(strip)，用3’侧翼探针(作为从pMT2835切下的1.1kb EcoRI片段)(探针2)重新探测。对于野生型pepC基因座，再次预期3.1kb与这个片段杂交；而对于由期望的交换得到的pepC缺失菌株，期望1.1kb片段将与之杂交。24个转化子中还是只有一个，即JaL355/pMT2835#5，在Southern印迹分析中显示出3.1kb杂交片段的消失和1.1kb杂交片段的出现。再次对滤膜进行剥离，用第三个探针重新探测。第三个探针是从pJaL270切下的0.7kbAsp718-PstI片段(探针3)。这个片段是pepC编码序列本身的一部分。再次预期此第三个探针与野生型pepC基因座的3.1kb EcoRI-PvuI片段杂交，而预期从期望的pepC缺失衍生物没有杂交信号。包括JaL355/pMT2835#3的少数转化菌株不能与第三个探针杂交。

总之，在24个转化子中，只有JaL355/pMT2835#5包含期望的、彻底的双交换，其导致pepC编码序列的缺失。将JaL355/pMT2835#5保存为米曲霉菌株MT2874。相对于亲本菌株，pepC缺失菌株MT2874看来具有轻微改变的菌落形态和孢子形成程度(sporulation proficiency)。特别是在升高的温度，例如37摄氏度时，孢子形成看起来较差。

实施例3

构建pepC缺失的米曲霉菌株JaL810(A1560-ΔpepC)

在米曲霉菌株HowB101中进行彻底的pepC破坏。制备和验证缺失的方法同实施例2的D部分所述一致。

实施例4

构建曲霉属表达质粒pJaL790

以下述方式构建适于在黑曲霉中性淀粉酶启动子(NA2)的控制下表达目的基因的曲霉属表达质粒pJaL790：

通过用HindIII切割来去除载体pUC19中单一的限制性内切核酸酶HindIII位点，并通过用Klenow聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸处理来填平游离的突出末端，连接得到质粒pJaL720。将包含双黑曲霉NA2启动子的来自pJaL721的1140bp EcoRI-BamHI片段克隆入pJaL720中相应的位点，得到pJaL723。用pJaL676为模板和引物B6577F12(SEQ ID NO：13)和B6575F12(SEQ ID NO：14)通过PCR扩增537bp片段。将此用EcoRI消化，通过用Klenow聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸处理来填平游离的突出末端，并将得到的524bp片段克隆入pJaL723中平端化的HindIII位点，得到质粒pJaL728。通过用HindIII切割来去除载体pJaL728中单一的限制性内切核酸酶HindIII位点，通过用Klenow聚合酶和四种脱氧核苷酸处理来填平自由的突出末端，连接得到质粒pJaL784。将来自pJaL784的1671bp EcoRI-BamHI片段与来自pJaL721的5735bp EcoRI-BamHI片段连接，得到pJaL790。

实施例5

构建天然IgG1重链曲霉属表达质粒

使用SEQ ID NO：15作为模板，以正向引物H-N(SEQ ID NO：16)和反向引物H-C(SEQ ID NO：17)通过PCR扩增人IgG1重链编码序列。为了克隆，引物H-N和H-C分别在翻译起始密码子上游和翻译终止信号后引入BamHI和XhoI限制性位点。纯化1431bp的PCR产物并用限制性内切核酸酶BamHI和XhoI切割。将得到的1419bp片段克隆入pJaL790中相应的位点，产生pNZ-3。将来自克隆pNZ-3的DNA进行测序，验证它是正确的序列。

实施例6

构建天然IgG kappa轻链曲霉属表达质粒

使用SEQ ID NO：18作为模板，以正向引物L-N(SEQ ID NO：19)和反向引物L-C(SEQ ID NO：20)通过PCR扩增人IgG kappa轻链编码序列。为了克隆，引物L-N和L-C分别在翻译起始密码子上游和翻译终止信号后引入BamHI和XhoI限制性位点。纯化732bp的PCR产物并用限制性内切核酸酶BamHI和XhoI切割。将得到的720bp片段克隆入pJaL790中相应的位点以产生pNZ-4。将来自克隆pNZ-4的DNA进行测序，验证它是正确的序列。

实施例7

在米曲霉中表达IgG1抗体

如Christensen et al.；Biotechnology 1988，6：1419-1422所述，用一比一比例(one to one ratio)的表达质粒pNZ-3和pNZ-4转化菌株MT2874、BECh2、IFO4177和JaL810。简而言之，米曲霉菌丝体在丰富营养培养液中生长。通过过滤从培养液中分离菌丝体。在渗透压稳定性(osmotically stabilizing)的缓冲液，如用磷酸钠缓冲至pH 5.0的1.2M MgSO₄中，将酶制剂

(Novo Nordisk)(或者可以使用其它酶混合物，如Glucanex

200G)加入菌丝体。悬浮液在37℃搅拌下温育60分钟。经过mira-cloth过滤原生质体以去除菌丝体碎片。收获原生质体，并用STC(1.2M山梨醇、10mM CaCl₂、10mMTris-HCl pH 7.5)洗涤两次。最后将原生质体重悬于200-1000μl STC中。

为了进行转化，将5μgDNA加入100μl原生质体悬浮液中，然后加入200μl PEG溶液(60％PEG 4000、10mM CaCl₂、10mM Tris-HCl pH 7.5)，将混合物在室温温育20分钟。收获原生质体并用1.2M山梨醇洗涤两次。最后将原生质体重悬于200μl 1.2M山梨醇中。在基本平板上筛选包含存在于pNZ-3或pNZ-4上的amdS基因的转化子(Cove D.J.1966.Biochem.Biophys.Acta.113：51-56)，基本平板上包含1.0M蔗糖作为碳源，10mM乙酰胺作为氮源，15mM CsCl抑制背景生长，和250mM 5-ALA。37℃生长4-5天后，稳定的转化子显示为生长旺盛并形成孢子的菌落。通过分生孢子(conidiospore)将转化子纯化两次。

将来自三株菌的转化子的孢子接种于含10ml YPM培养基(2g/l酵母提取物、2g/l蛋白胨和2％麦芽糖)的摇瓶中，并在30℃、200rpm培养4天。

通过ELISA(Harlow，E.and Lane，D.，Antibodies：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，(New York，1988)，p.579)从上清液筛选完整的IgG1。使用ELISA确定完整的IgG，所述ELISA用山羊抗人IgG(Fc特异性(Fc specific))作为捕获抗体(capture antibody)，用与碱性磷酸酶缀合的山羊抗人kappa链作为检测抗体(detection antibody)。使用人骨髓瘤IgG 1，从人血浆中纯化的kappa作为标准物。ELISA方法是标准规程。

从各个亲本菌株MT2874、BECh2、IFO4177和JaL810选择的一个产生完整IgG1的转化子(包含表达质粒pNZ-3和pNZ-4)，并分别保存为米曲霉菌株JaL741、NZ-2、JaL893和JaL895。

实施例8

从米曲霉产生和表征IgG1

使用标准底物，使经转化的米曲霉菌株JaL741、NZ-2、JaL893和JaL895在发酵罐中生长，培养5天后，收获发酵液。离心全部发酵液，并将上清通过0.22μm PES滤膜(Corning)。

MEP HyperCel柱

将流过滤膜的部分(filter flow through)加载到

explorer系统(Amersham Biosciences)的MEP HyperCel柱(BioSepra)上。用50mM HEPES pH7.5然后是含25mM辛酸盐(Caprylate)的50mM Tris-HCl pH 8清洗柱子。用50mM MES pH 5.5洗脱IgG1。

蛋白质A柱

用1M Tris碱将从MEP HyperCel柱洗脱的IgG1调至pH 7，并加载到

explorer系统(Amersham Biosciences)的nProtein A Sepharose 4 FastFlow柱(Amersham Biosciences)上。用20mM磷酸钠pH 7洗柱子。用100mM柠檬酸pH 4洗脱IgG1。

IgG表征

在还原和非还原条件下，通过SDS-PAGE在4-20％Tris-甘氨酸凝胶上分析纯化的IgG1样品。通过N末端测序鉴定蛋白质条带。为了进行N端测序，将凝胶印迹于PVDF膜，用考马斯蓝(coomassie blue)染色。从所述印迹切下蛋白质条带，直接用于Procise蛋白质测序仪(Applied Biosystems)。

如实施例7中所述，将起始材料以及纯化级分中的完整IgG定量。

SDS-凝胶分析

在SDS-凝胶上分析产生的IgG，以根据降解的程度表征产物。

在NZ-2(具有由pNZ-3和pNZ-4产生的IgG的Bech2)中，观察到明显的(substantial)抗体重链降解，在SDS-PAGE上出现了几个片段，进一步通过N末端测序鉴定。裂解(cleavage)不是序列特定性的，但存在于重链的较少结构化的(less structured)接头区。

在JaL741(具有由pNZ-3和pNZ-4产生的IgG的MT2874)中，与在NZ-2产物中所发现的相比，观察到重链降解水平显著降低。发现裂解是序列特异性的，在重链序列的一个Lys-Arg位点之后出现切割。已知Lys-Arg位点是米曲霉的位点特异性KexB蛋白酶的靶，所述酶只切割Lys-Arg和Arg-Arg的羧基侧。

在PepC失活之前，位点特异性降解(可能由于kexB所致而)不明显(obscured)。

在JaL893(具有由pNZ-3和pNZ-4产生的IgG的IFO4177)中，观察到非常明显的抗体重链降解，在SDS-PAGE上出现了几个片段，进一步通过N末端测序鉴定。裂解不是序列特异性的，但存在于重链的较少结构化的接头区。

在JaL895(具有由pNZ-3和pNZ-4产生的IgG的JaL810)中，观察到非常明显的抗体重链降解，在SDS-PAGE上出现了几个片段，进一步通过N末端测序鉴定。裂解不是序列特异性的，但存在于重链的较少结构化的接头区。这显示单独缺失pepC蛋白酶不足以减少重链降解。

实施例9

构建米曲霉kexB缺失质粒pJaL836

从编码米曲霉ISO4177pyrG基因的质粒pSO2，纯化5336bp SpeI-SspBI片段和316bp Asp718-NheI片段(pyrG启动子的部分)，并连接得到质粒pJaL554。将316bp片段克隆在编码的pyrG基因的下游，由此产生侧翼为316bp的重复序列的pyrG基因。

从pJaL504，用引物172450和172449(SEQ ID NO：21和22)通过PCR扩增2514bp片段，并将该片段克隆入

4Blunt-TOPO，得到质粒pJaL574。

从pJaL574，用引物T5483H12和T5425G10(SEQ ID NO：23和24)通过PCR扩增2587bp片段。用HindIII和NdeI限制性消化此片段，得到2582bp片段，将其克隆入载体pUC19的相应位点，得到质粒pJaL835。

质粒pJaL800包含pUC19中米曲霉IFO4177的编码kexB基因的6968bpSalI片段(SEQ ID NO：25)。将来自pJaL800的4658bp BglII片段亚克隆入载体pIC7的BglII位点，得到pJaL818。将来自pJaL554的重复侧翼的pyrG选择标记作为2313bp SmaI片段移动，并克隆入pJaL818的BalI位点，得到质粒pJaL819。由此pyrG基因取代了编码部分kexB基因的911bp BalI片段，然后pyrG基因侧翼连接kexB的5’末端的1292bp片段和kexB的3’末端的2455bp片段。最后，将在pyrG选择标记的两侧(either side)包含上述两个pepC侧翼的pMT2833缺失盒作为4063bp EcoRI片段，转移到tk反选择质粒pJaL835的EcoRI位点，以得到缺失质粒pJaL836。注意到pJaL836在kexB 5’侧翼下游紧邻处包含唯一的NotI位点，其可用来在转化入米曲霉之前将质粒线性化。

实施例10

构建pepC和kexB缺失的米曲霉菌株JaL799(JaL763-ΔkexB)

A.分离MT2874pyrG^-菌株JaL763(alp^-，npl^-，pepC^-)

在基本平板(Cove D.J.1966.Biochem.Biophys.Acta.113：51-56)上筛选米曲霉菌株MT2874对5-氟-乳清酸(FOA)的抗性，来鉴定自发的pyrG突变体，所述基本平板补加1.0M蔗糖作为碳源，10mM硝酸钠作为氮源，和0.5mg/mlFOA。将一个菌株ToC1418鉴定为pyrG^-。JaL763是尿苷依赖的，因此可以用野生型pyrG基因转化，并根据在缺少尿苷的条件下生长的能力选择转化子。

B.构建pepC和KexB缺失的米曲霉菌株JaL799。

用NotI切割20μg的pJaL836，然后按照制造商(New England Biolabs)所推荐的将酶热失活。之后将质粒用乙醇沉淀，并以适于转化入米曲霉的浓度重新溶解于Tris缓冲液(10mM pH 8.0)中。

如先前在WO 0168864中所述将线性化的质粒DNA转化入米曲霉JaL763，并在FDU平板上进行pyrG选择和tk基因的反选择，。将转化子菌落重新分离两次，最后在液体培养基(YPD)中生长。如先前在WO 0168864中所述制备染色体DNA，用于kexB基因座的Southern分析，目的是鉴定在染色体kexB和缺失盒之间发生完全的双交换的转化子。用BglII和BglII-HindIII消化染色体DNA。首先用作为从pJaL818上切下的1292kb BglII-MluNI片段的5’侧翼为探针(探针1)探测Southern印迹。对于野生型完整的kexB基因座，在BglII和BglII-HindIII消化时，都期望4.6kb的BglII片段与这个探针杂交；而对于由期望的双交换产生的kexB缺失的衍生物，6.0kb片段和1.3kb片段将分别与之杂交。将Southern的第一个5’侧翼探针剥离，并用pJaL818的切割为0.8kb MluNI片段的探针(探针2)再探测(reprobe)。对于野生型kexB基因座，对于两种消化，仍然显示4.6kb片段与这个片段杂交；而对于由期望的交换产生的kexB缺失菌株，没有得到杂交。将具有上述特征的菌株保存为米曲霉菌株JaL799(JaL763-ΔkexB)。

实施例11

在米曲霉JaL799中表达IgG1抗体

用表达质粒pNZ-3和pNZ-4转化菌株JaL799，选择转化子，如实施例7中所述，将转化子命名为JaL827。

如实施例8中所述，将从JaL827产生的所得的IgG进行表征。在JaL827(具有由pNZ-3和pNZ-4产生的IgG的JaL799)中，与在JaL741(实施例8)中所发现的相比，观察到重链降解水平显著降低。发现在JaL741中观察到的主要蛋白质条带是序列特异性降解的结果，裂解发生在重链序列的一个Lys-Arg位点之后。与此相反，在JaL827中没有见到这种序列特异性降解，发现非主要的条带是非特异性降解的结果。结果是JaL827中看到较少的降解产物。

序列表

<110>诺维信公司(Novozymes A/S)

<120>用于表达抗体的真菌突变体的用途

<130>10738.000-DK

<160>35

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>1

cattaccctc ttaccgccat acc 23

<210>2

<211>46

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>2

cgctagcaag actcgagaag agggaaaatc aagttagacc aagggc 46

<210>3

<211>41

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>3

cctcttctcg agtcttgcta gcgtttatgg cagggtatgg g 41

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>4

gattcatgtg actgaacgta ccg 23

<210>5

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>5

cctgaattca cgcgcgccaa catgtcttcc aagtc 35

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>6

accatggcgg cactctgc 18

<210>7

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>7

gttctcgagc tacttattgc gcaccaacac g 31

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>8

gagccgtagg ggaagtcc 18

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>9

cttcagactg aacctcgcc 19

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>10

gactcggtcc gtacattgcc 20

<210>11

<211>38

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>11

cctacggctc cgagagaggc cttttgatcc ttgcggag 38

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>12

gagttagtag ttggacatcc 20

<210>13

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>13

gacgacgaat tcaagcttat ggtgttttga tcatttt 37

<210>14

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>14

gacgacgaat tcatacatcg catcgacaag g 31

<210>15

<211>1410

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>15

atggagtttg tgctgagctg ggttttcctt gttgctatat taaaaggtgt ccagtgtgag 60

ggtcagctgg tgcaatctgg gggaggcttg gtacatcctg gggggtccct gagactctcc 120

tgtgcaggct ctggattcac cttcagtagc tatggtatgc actgggttcg ccaggctcca 180

ggaaaaggtc tggagtgggt atcaggtatt ggtactggtg gtggcacata ctctacagac 240

tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaatgcca agaactcctt gtatcttcaa 300

atgaacagcc tgagagccga ggacatggct gtgtattact gtgcaagagg agattactat 360

ggttcgggga gtttctttga ctgctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcc 420

tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa 720

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 780

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260

gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380

aagagcctct ccctgtcccc gggtaaatga 1410

<210>16

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>16

gacggatcca ccatggagtt tgtgctg 27

<210>17

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>17

gacctcgagt catttacccg gggacag 27

<210>18

<211>711

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>18

atggacatga gggtcctcgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctgttt cccaggtgcc 60

agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctcactgt ctgcatctgt aggagacaga 120

gtcaccatca cttgtcgggc gagtcagggt attagcagct ggttagcctg gtatcagcag 180

aaaccagaga aagcccctaa gtccctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240

ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctg 300

cagcctgaag attttgcaac ttattactgc caacagtata atagttaccc tcccactttt 360

ggccagggga ccaagctgga gatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 420

ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480

ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540

tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600

ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660

cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta g 711

<210>19

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>19

gacggatcca ccatggacat gagggtcc 28

<210>20

<211>28

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>20

gacctcgagc taacactctc ccctgttg 28

<210>21

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>21

gacgaattct ctagaagatc tctcgaggag ctcaagcttc tgtacagtga ccggtgactc 60

<210>22

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>22

gacgaattcc gatgaatgtg tgtcctg 27

<210>23

<211>79

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>23

gcacatatga tttaaatccc taatgttgac cctaatgttg accctaatgt tgagcggccg 60

cgtttaaacg aattcgccc 79

<210>24

<211>71

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>PCR引物

<400>24

cgtaagctta tttaaatccc taatgttgac cctaatgttg accctaatgt tgagaccggt 60

gactctttct g 71

<210>25

<211>6974

<212>DNA

<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400>25

gtcgacggcc cgggcggccg caaggggttc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctatt 240

taggtgacac tatagaatac tcaagctttt gaagaggtga ccgatctgcc gcccaatcat 300

gcttttgctc tgccgtggag cgtaccgtgt tagagcgact caatggtgat tggtgactgt 360

ctctaggtga tgggaccata tgagggtcat ctcgcttcac cgaacttgag atagaaagtc 420

tagaatcagt tatgctgccc cgtgaagtag cgtactcatc gggtgaggca tatgactctg 480

gtggtaatgg cttttccatc cagttttgat gtccttcgca ggacaagtct ttggtcctcg 540

cggagaacga gcgagaagct tgatggccac gagctgcagc agggttgttc ttgtaggaca 600

ccgctcgagt ctgcgggaca tcgacagatc cgtaagtctg atcgctatca gtttcgtaat 660

ccaatgcggt aggtttcatg tcgtgagact gctgccgtcg gtgcgatggt gcgcgtggta 720

cactattcag agggacggat tggggaggta ttgagcctcc attagtaggc ctctgggagc 780

tagctgtagc catccttcaa agctcccgga ttcttcacga cacacactac ccagaaagct 840

tccgtacttt atcaccggta aaaatcaaat gcgcggggaa tagaaaggtt agcgacacca 900

ataaagatcg taaaagaaat caattcgtat ccaaatttat gatagtagca gatgatttga 960

ccagaccagt tcgtgttagt acatggtgat ggcactggaa gaataaatca tcgcttaatt 1020

cgcagagttg aaagttgcgg agtagtatac aagcgatgta gtatatggat tgtaacaagg 1080

gtggatttgt acagtatgag aggaaggtaa gatgatcgaa taccgcgatt tcaaccaggg 1140

gggaaaagaa tggaaaaaat taatgagatg acagaaaaat caacaggcta acaggattat 1200

attggagtga cgaattaatc tcattgtgct ggctaatgag aattaagtcg gtggctggca 1260

atggcgaacc agcacagttc catgcggggc tgactcgtca gtcatcctgc attaaacatg 1320

ctcccgccag gcaccacgac tggctcacgt tccccttttt ctaagaaaag aaattagcta 1380

ttagctttcg aaggagagga attatcggac taggagcatg aaagggtacc tggatagaaa 1440

acatgacgaa aagtatccat cgtgctgtgt cagtaatccg tgtataataa taagtagtac 1500

tgtagtcgtg ttgcagcagc tcaccgactg gatgcatccg ctggtgaatg agcaaatcat 1560

gaatgcaccg agtcagcatt gagcatagtc ggttttagta acattgtaaa gaagataatg 1620

gcattcttgt ttttgagaca tgtttcccat ccgctgtcca tcatgggatg tttcatttag 1680

attctccaat cggcggtgtg atcagtaatc ttatttcaac atctaccgta gattcaatgc 1740

tgcctcttag agcaattagt tacggttgtg aatgggccga gctgttgata taaaaagtaa 1800

ttccgagggg actgttgagg cattttgaaa attacggagc acatacatcg aagggggtat 1860

tgtatggacc gcgatctaga tctgcatacc gacttcgatt tcacaatgtt gattcgtcta 1920

ttgtagtcgt catctcattt tattgtacat acagtaagaa agggaaaact cagaataaga 1980

aaagaagtca ccaaaacagg gctgaatagt cctttcaact ctttttactt ttttttaggt 2040

tcttagtaac tgcctcccgt ccatgttact tagtatacgg agtacttttc atatcatccc 2100

ttcacttgaa gtcagagggg ttttggctgt aaggagtaga ggcttagctg ctgataagtc 2160

aaggaaggta ctctgtacag tgcttattag aattttgcaa gaatgttcat ctagtcgaaa 2220

tctgagacgt ggggccaaaa tcttctagag tatgtactgt aattaattaa tatttagcac 2280

tgaatgaaaa ggctacctga gcactacgat ttaagtcagt ggagaacagg ttaaagttaa 2340

acaatgaatt tgtcgcctaa ggcaaaaggt tccgctgttt ccccgaagtg aacaccattc 2400

tcgaactccg cctccgcaac aacttcaccg agcagtgctc attgaataca taaccatttc 2460

atacccccct tgctgtttat attgcatatt tcttgtcttt atagtactct tttccttgaa 2520

gttgctttct gaatcgcaag ccatctactg aactgtctgg tactgttctt attgatggca 2580

actatcttat ttgtcctcat ctcgccttac tactgatagg agcctatctc gattcacgct 2640

actcccataa tgcggctttc cgaaagtgca acggtagcgt tcggcctttt ttgtgccgcg 2700

acggcatcag cccatcctcg acgctcctac gagacgcgcg atttctttgc tcttcatctt 2760

gacgattcca cctccccaga cgagatcgcc caacgcctcg gagcacgcca cgagggtcaa 2820

gtaggtgaac tcacacaaca ccataccttc tctataccca aggagaacgg tgcagacctc 2880

gatgcgctgc tcgaacatgc acgaatcaga aaaaggtcaa gtcgtgccga aggacgtggc 2940

atgacgttgg acaaggaaag agatttgagt ggtatactct ggtctcaaaa gttagcccca 3000

aaacagcgac tagtaaagag ggctcctcca acaaatgtgg cgtcgagggg gtctgtgaaa 3060

gaagaggacc ccgtagctgc ccaagctcag aaacggattg cctcttcact tgggattaca 3120

gatcccattt tcggcggaca gtggcatctt tacaacactg tccaggttgg ccatgatctc 3180

aatgtttcgg acgtctggtt agaaggtatc accgggaaag gtgtcatcac ggctgtggtc 3240

gatgacggac tggacatgta cagcaacgac ctcaaaccga actactttgc tgagggctcc 3300

tacgatttta acgaccatgt accggagccc agaccgcggc ttggtgatga tagacacggc 3360

acaagatgtg ctggtgaaat tggagcagct aggaatgatg tctgtggagt aggcgttgca 3420

tacgacagcc aagttgccgg aattcggatt ttgtccgcac ccattgacga cgcagatgag 3480

gctgctgcca tcaactatgg ctttcagcgc aatgatatat attcatgctc ttggggccct 3540

ccggatgatg gcgccacgat ggaggcgcca gggattctta tcaaacgagc tatggttaac 3600

ggtatccaaa atggccgagg aggcaaaggt tctattttcg tctttgcagc tggaaatggt 3660

gcagggtacg atgacaactg caatttcgac ggctacacaa acagcattta cagcatcacc 3720

gtcggcgcta ttgatcgaga gggcaaacat cccagctact cggaatcatg ctctgcccag 3780

ttggttgtcg cttatagcag tggctcgagt gacgcgattc ataccactga cgttggaact 3840

gataaatgtt attcacttca cggcggaact tctgccgcag gcccgctagc tgcgggtact 3900

attgccctcg ctcttagtgc ccgaccggaa ctaacttggc gagatgccca gtacctgatg 3960

atagagaccg cagttcccgt ccacgaagac gacgggagct ggcagactac caaaatgggg 4020

aagaagttta gccatgactg ggggtttggg aaagtagatg catattcact ggtacagctg 4080

gccaagacgt gggagctggt gaaaccacag gcgtggttcc actcaccgtg gctgcgggtg 4140

aagcatgaaa tcccacaagg tgaccagggt cttgccagct catacgaaat taccaaggat 4200

atgatgtatc aggccaatat cgagaaactg gaacatgtca ctgtgaccat gaatgtaaat 4260

cacactcgcc gaggcgacat cagtgtggag ttgcgcagcc ccgaaggtat cgtcagtcat 4320

ctgagtacag cgcggcggtc agataatgca aaggctggct atgaagactg gacgtttatg 4380

actgtggctc attggtatgt atttgctccc gtaatttagt tttcgttgtc agtcctgaca 4440

tttccattca ggggtgagtc cggtgttgga aagtggacgg tcattgtgaa ggataccaat 4500

gtcaatgatc atgttggaga attcatcgac tggcggctca acctctgggg actttcgatc 4560

gacggctcca gccagcccct tcatcctatg cccgatgagc atgacgatga ccactcgatt 4620

gaagatgcca ttgttgttac cactagtgtt gatcctctcc caactaagac tgaagcccca 4680

cctgtcccaa ctgatcccgt ggatcgtcct gtgaacgcaa agccatctgc gcagccaacg 4740

acgccttcag aggctcctgc tcaagagaca tctgaagctc ccaccccgac gaaacccagt 4800

tctactgaat caccttctac caccacctct gcggatagct ttttgccgtc cttcttcccc 4860

acgttcggcg cttcaaaacg gacccaggct tggatttacg ctgcgatcag ttcgatcatt 4920

gtattctgta ttggccttgg tgtctacttc cacgtacagc gacgaaagcg tctgcgtaat 4980

gatccgcgtg atgactacga tttcgaaatg atagaagatg aggatgaaac gcaggctatg 5040

aacgggcgtt cgggtcgtac acaacgccgg ggcggcgagc tttacaatgc tttcgctggg 5100

gagagcgacg aagaaccttt gtttagcgac gatgaggatg agccttatag ggatcatgcc 5160

cttagtgaag atcgggaacg gcgagggagc acaagtggtg accatgctcg gtcatagttt 5220

ggactaggct ttgcatttgc ttctacccta taatggtact ccttcggcgc gttcccgcta 5280

tatcagatga gatgtgttac atggatattg tgaattactg atgttgaacg aaggctgctg 5340

tatataattc tgacttgatt gacaaataga ctcataaagg acatgcatag gggtatcgta 5400

aatagctgca aagcgcgcta caagtaaaaa agtggatggg gttgatagag ttgctggata 5460

agccagtctt ggcgcttggg ccgatgacgc tggtgcggcc tcttctccaa ctgccgccat 5520

tgactgctcc actgctgcct ccgcaacttc tcaacctccc atttatcaat ctaccaccag 5580

caaccatagc tcctcatatc ccgaactacg ctatatctgg tctctccggt gatataaatt 5640

gcgtgcgagt ttcttttgac ttgtacaatt acctgtgtga agttgccgct tccctaacgg 5700

caacccctcg atggatcagc acgatgactt tgacaatgtc tcatggagac acgaacctga 5760

gagcgacatc tctcgtccta ccacttcggg tactgatgcc gaagagtcgc ctgcgactag 5820

tcacgatgcc aatggcaagc ggagaatgag ctcagctcat gaaaacccac aagccgggcc 5880

actggcagat gcggtcgatc tagcaggtat cggggatggg gtgttggaat gccgggtgga 5940

ttcgcctctg aaagaaaatg acggtactaa agacgcatac atctcttatt tggttacaac 6000

acaagtgagt tgccccgttt ccccgggagt tacctgcggc ttgttcatgg cagtccactg 6060

tactgacggg agagacatcg cagaccgatt tcaagtcttt ccagaggtca gaatttgcag 6120

tgcgcagacg atttacggat ttcttcttcc tatacaagac actctatcgg gaatatcctg 6180

cttgcgcggt cccacctcta cccgacaagc ataaaatgga atacgtacgg ggggatcggt 6240

tcgggcccga attcactaca cggcgtgcgt ggtcgctaca tcgatttcta aagcgcttgg 6300

cattacatcc ggtgcttcgc cgggctccct tgcttgctat attcctagaa tctcccgact 6360

ggaatgcgca tatgcggctt cacacttctc gcacatccac caatccgtcg gacaacagcg 6420

gtgcccccgg aatttttgac aactttaccg ataccttcgt aaatgcgttt acgaaagtcc 6480

acaagcctga tcgccggttc attgaggttc gagagaaggc agataaattg gatgaagatc 6540

tcaatcacgt agagaaaatc gtcgctaggg ttgctcggcg tgagtccgat ttagagaccg 6600

actataatga gctcgccaca caattccgca agttggtgtc tctggagcca aacgtcgagg 6660

ttcccctaca ggtattcgcg gcgtcggtgg aggagacggg acgtgggctc aaaggtctca 6720

aagatcacac ggatcaaaac taccttggct cgctccggga tatggaggcc tacattctgt 6780

ccctcaaggc gcttctaaaa acccgtgagc agaaacaact cgactttgaa gccctagtgg 6840

attaccgcaa caaagccgtg agcgagcgcg actcgctcgc caccaaccca tcatcctact 6900

atgcctctaa tcccctgacc tcatcgcctg cgtccttcat ccgctccaag atggaagata 6960

tgcgcggggt cgac 6974

<210>26

<211>1212

<212>DNA

<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400>26

atgcagtcca tcaagcgtac cttgctcctc ctcggagcta tccttcccgc ggtcctcggt 60

gcccctgtgc aggaaacccg ccgggccgct gagaagcttc ctggaaagta cattgtcaca 120

ttcaagcccg gcattgacga ggcaaagatt caggagcata ccacctgggc taccaacatt 180

caccagcgca gtctggagcg tcgtggcgcc actggcggtg atcttcctgt cggtattgag 240

cgcaactaca agatcaacaa gttcgccgcc tatgcaggct ctttcgacga tgctaccatt 300

gaggagattc gcaagaacga agatgttgcc tacgtcgagg aggaccagat ctactacctc 360

gatggcctga ctacccagaa gagtgccccc tggggtctgg gcagcatttc ccacaagggc 420

cagcagagca ccgactacat ctacgacact agtgccggcg agggcaccta tgcctacgtg 480

gtggatagcg gtgtcaatgt cgaccatgag gagttcgagg gccgcgccag caaggcctac 540

aacgctgccg gtggtcagca tgtggacagc attggccatg gcacccacgt ttccggcacc 600

attgctggca agacttatgg tatcgccaag aaggccagca tcctttcggt caaagttttc 660

cagggtgaat cgagcagcac ttccgtcatt cttgacggct tcaactgggc tgccaacgac 720

attgttagca agaagcgtac cagcaaggct gcaatcaaca tgagcttggg cggtggctac 780

tctaaggctt tcaacgatgc ggtcgagaac gcattcgagc agggtgttct ctcggttgtc 840

gctgccggta acgagaactc tgatgccggc caaaccagcc ctgcctctgc ccctgatgcc 900

atcactgttg ccgctatcca gaagagcaac aaccgcgcca gtttctccaa ctttggcaag 960

gtcgttgacg tcttcgctcc cggtcaagat atcctttctg cctggattgg ctcttcctct 1020

gccaccaaca ccatctctgg tacctccatg gctactcccc acattgtcgg cctgtccctc 1080

tacctcgctg cccttgagaa cctcgatggc cccgctgccg tgaccaagcg catcaaggag 1140

ttggccacca aggacgtcgt caaggatgtt aagggcagcc ctaacctgct tgcctacaac 1200

ggtaacgctt aa 1212

<210>27

<211>2071

<212>DNA

<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400>27

atgcggggtc ttctactagc tggagccctt ggcctacctt tggccgtcct tgcgcatccg 60

acccatcatg cacatggact tcaacgtcgc acagttgact tgaactcatt ccgtttgcac 120

caggcagcga agtatatcaa tgcgactgag tcttcgagtg atgtttcatc ttctttctct 180

cccttcaccg agcaaagcta cgtggagacg gccactcagc tcgtgaagaa tatcctgcca 240

gatgctacct tccgtgtcgt caaggatcat tacattggta gcaatggggt cgctcatgtc 300

aattttcgtc agacggtcca tggccttgac attgacaatg cggacttcaa tgtcaatgta 360

cgctgcagtc cacctatact atgttcggtg ctaaccactt catttaggtt gggaaaaatg 420

gaaagatctt ttcctatggc cactcatttt atacgggcaa aatccccgat gccaatcctt 480

tgacgaagcg ggattatacc gaccctgtag cggctctcag aggaaccaac gaagctttac 540

agctttctat cactctagat caagtgtcta ctgaggctac cgaggacaaa gagtccttca 600

atttcaaggg agtctctggc accgtttcgg atcccaaggc tcagttggtc tacttggtaa 660

aggaagatgg cagccttgct ttgacctgga aggtggagac agatattgac agcaactggc 720

tgttgaccta catcgatgcc aataccggca aagatgtcca tggtgtggtt gactacgtag 780

ccgaggcaga ttaccaagta tagtgagtat tttaagaatg tgacttggac tgtagaatga 840

agctgacaca ccaccacagt gcatggggta ttaatgatcc cacggagggc cctcgcaccg 900

tcatcagcga tccatgggat tcgtccgcat ctgcgttcac ctggatcagt gacggagaaa 960

acaactatac cacaactcgc ggcaacaacg gtatcgcgca gtcgaaccct accggtggat 1020

cgcagtactt gaagaactac cggcctgata gccccgattt gaaattccaa tacccctatt 1080

cgctcaacgc cacaccccca gagtcctata ttgatgcgtc tatcactcag cttttctaca 1140

ctgccaacac gtaccacgac ctactctaca ctctgggctt caacgaggag gccggtaatt 1200

tccagtacga taacaatgga aaaggaggtg ctggaaacga ctacgtgatc ctcaatgctc 1260

aggacggttc tggcaccaat aacgccaact tcgctacgcc cccggatgga cagcccggcc 1320

gcatgcgcat gtacatttgg accgagtccc agccttaccg tgacggctcc ttcgaggctg 1380

gtattgtgat tcacgagtat actcacggtc tctctaaccg gctcactgga ggacctgcta 1440

actctcgctg cttgaatgcc cttgaatccg gcggaatggg tgaaggttgg ggagacttca 1500

tggccacggc aattcggctc aaggccggcg atactcactc gaccgattat accatgggtg 1560

aatgggctgc aaacaagaaa ggtggcatcc gtgcttaccc attctcaacc tccctggaaa 1620

ccaaccctct cacctacacc agtctcaatg aattggacga agtgcatgcc atcggcgcgg 1680

tgtgggctaa cgtattgtac gagctgttgt ggaacttgat cgataagcac ggcaagaatg 1740

acgggccaaa gcccgagttc aaggatggag ttccgactga cggcaagtat ctcgccatga 1800

agctggtgat tgatggcata gcattgtaag tgccaacctc gtttcctctt tctacctatc 1860

gcaggggcta accttgactt ttaggcaacc ttgcaacccc aactgtgtcc aggctcgcga 1920

cgccatcctc gatgccgata aggctctcac cgatggtgct aacaagtgcg agatttggaa 1980

ggcgtttgct aagcgtggtt tgggtgaagg cgctgaatac catgcgtctc gtcgggtggg 2040

cagtgataag gtgccctctg atgcttgcta g 2071

<210>28

<211>1488

<212>DNA

<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400>28

atgagaggca tcctcggcct ttccctgctg ccactactag cagcggcctc ccccgttgct 60

gttgactcca tccacaacgg agcggctccc attctttcgg cctcaaatgc caaagaggtt 120

ccagactctt acattgtcgt cttcaagaag catgtttccg ctgaaacggc tgctgctcat 180

cacacctggg tgcaggacat ccacgattcg atgactggac gcatcgacct gaagaagcgc 240

tctctttttg gtttcagtga tgacctttac ctcggtctca agaacacctt cgatatcgcc 300

gggtccctag cgggctactc cggacatttc catgaggatg tgatcgagca ggtccggaga 360

catcctgatg ttgaatacat cgagaaagac accgaagtcc acaccatgga ggagacaacc 420

gagaagaatg ctccctgggg cttggctcgt atctctcacc gtgacagcct ctcgttcggt 480

acctttaaca agtacctgta tgcttcggaa ggcggtgagg gtgtcgatgc ttatactatt 540

gacactggta tcaacattga gcatgtcgat ttcgaggatc gagcacactg gggaaagacc 600

atccctagca atgatgagga tgcggatggc aacggacacg gaactcactg ctccggaacc 660

attgctggta agaagtacgg tgttgccaag aaggccaaca tctatgccgt caaggtcttg 720

aggtccagcg gttctggcac tatgtccgat gtcgttctgg gtgtcgagtg ggccgtccag 780

tcccacctca agaaggctaa ggacgccaaa gatgccaagg tcaagggttt caagggcagc 840

gttgccaaca tgagtcttgg tggtgccaag tccaggaccc ttgaggctgc tgtcaatgct 900

ggtgttgagg ctggtcttca cttcgccgtt gctgctggta acgacaatgc cgatgcctgc 960

aactactccc ctgctgccgc tgagaatgcc atcactgtcg gtgcctcgac ccttcaggat 1020

gagcgtgctt acttctccaa ctacggaaag tgcactgaca tctttgcccc gggtcccaac 1080

attctttcca cctggactgg cagcaagcac gctgtcaaca ccatctctgg aacctctatg 1140

gcttctcctc acattgctgg tctgctggcc tacttcgttt ctctgcagcc tgctcaggac 1200

tctgctttcg ctgtcgatga gcttactcct gccaagctca agaaggatat catctccatc 1260

gccacccagg gtgcccttac tgatatccca tctgacaccc ccaaccttct cgcctggaac 1320

ggcggtggtg ccgacaacta cacccagatt gtcgccaagg gtggatacaa ggccggcagt 1380

gacaacctta aggaccgctt tgacggacta gtcaacaagg ccgagaagtt gctcgctgag 1440

gagcttggag ctatttacag tgagatccag ggtgctgttg ttgcatag 1488

<210>29

<211>2511

<212>DNA

<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400>29

atgcggcttt ccgaaagtgc aacggtagcg ttcggccttt tttgtgccgc gacggcatca 60

gcccatcctc gacgctccta cgagacgcgc gatttctttg ctcttcatct tgacgattcc 120

acctccccag acgagatcgc ccaacgcctc ggagcacgcc acgagggtca agtaggtgaa 180

ctcacacaac accatacctt ctctataccc aaggagaacg gtgcagacct cgatgcgctg 240

ctcgaacatg cacgaatcag aaaaaggtca agtcgtgccg aaggacgtgg catgacgttg 300

gacaaggaaa gagatttgag tggtatactc tggtctcaaa agttagcccc aaaacagcga 360

ctagtaaaga gggctcctcc aacaaatgtg gcgtcgaggg ggtctgtgaa agaagaggac 420

cccgtagctg cccaagctca gaaacggatt gcctcttcac ttgggattac agatcccatt 480

ttcggcggac agtggcatct ttacaacact gtccaggttg gccatgatct caatgtttcg 540

gacgtctggt tagaaggtat caccgggaaa ggtgtcatca cggctgtggt cgatgacgga 600

ctggacatgt acagcaacga cctcaaaccg aactactttg ctgagggctc ctacgatttt 660

aacgaccatg taccggagcc cagaccgcgg cttggtgatg atagacacgg cacaagatgt 720

gctggtgaaa ttggagcagc taggaatgat gtctgtggag taggcgttgc atacgacagc 780

caagttgccg gaattcggat tttgtccgca cccattgacg acgcagatga ggctgctgcc 840

atcaactatg gctttcagcg caatgatata tattcatgct cttggggccc tccggatgat 900

ggcgccacga tggaggcgcc agggattctt atcaaacgag ctatggttaa cggtatccaa 960

aatggccgag gaggcaaagg ttctattttc gtctttgcag ctggaaatgg tgcagggtac 1020

gatgacaact gcaatttcga cggctacaca aacagcattt acagcatcac cgtcggcgct 1080

attgatcgag agggcaaaca tcccagctac tcggaatcat gctctgccca gttggttgtc 1140

gcttatagca gtggctcgag tgacgcgatt cataccactg acgttggaac tgataaatgt 1200

tattcacttc acggcggaac ttctgccgca ggcccgctag ctgcgggtac tattgccctc 1260

gctcttagtg cccgaccgga actaacttgg cgagatgccc agtacctgat gatagagacc 1320

gcagttcccg tccacgaaga cgacgggagc tggcagacta ccaaaatggg gaagaagttt 1380

agccatgact gggggtttgg gaaagtagat gcatattcac tggtacagct ggccaagacg 1440

tgggagctgg tgaaaccaca ggcgtggttc cactcaccgt ggctgcgggt gaagcatgaa 1500

atcccacaag gtgaccaggg tcttgccagc tcatacgaaa ttaccaagga tatgatgtat 1560

caggccaata tcgagaaact ggaacatgtc actgtgacca tgaatgtaaa tcacactcgc 1620

cgaggcgaca tcagtgtgga gttgcgcagc cccgaaggta tcgtcagtca tctgagtaca 1680

gcgcggcggt cagataatgc aaaggctggc tatgaagact ggacgtttat gactgtggct 1740

cattggggtg agtccggtgt tggaaagtgg acggtcattg tgaaggatac caatgtcaat 1800

gatcatgttg gagaattcat cgactggcgg ctcaacctct ggggactttc gatcgacggc 1860

tccagccagc cccttcatcc tatgcccgat gagcatgacg atgaccactc gattgaagat 1920

gccattgttg ttaccactag tgttgatcct ctcccaacta agactgaagc cccacctgtc 1980

ccaactgatc ccgtggatcg tcctgtgaac gcaaagccat ctgcgcagcc aacgacgcct 2040

tcagaggctc ctgctcaaga gacatctgaa gctcccaccc cgacgaaacc cagttctact 2100

gaatcacctt ctaccaccac ctctgcggat agctttttgc cgtccttctt ccccacgttc 2160

ggcgcttcaa aacggaccca ggcttggatt tacgctgcga tcagttcgat cattgtattc 2220

tgtattggcc ttggtgtcta cttccacgta cagcgacgaa agcgtctgcg taatgatccg 2280

cgtgatgact acgatttcga aatgatagaa gatgaggatg aaacgcaggc tatgaacggg 2340

cgttcgggtc gtacacaacg ccggggcggc gagctttaca atgctttcgc tggggagagc 2400

gacgaagaac ctttgtttag cgacgatgag gatgagcctt atagggatca tgcccttagt 2460

gaagatcggg aacggcgagg gagcacaagt ggtgaccatg ctcggtcata g 2511

<210>30

<211>403

<212>PRT

<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400>30

Met Gln Ser Ile Lys Arg Thr Leu Leu Leu Leu Gly Ala Ile Leu Pro

1 5 10 15

Ala Val Leu Gly Ala Pro Val Gln Glu Thr Arg Arg Ala Ala Glu Lys

20 25 30

Leu Pro Gly Lys Tyr Ile Val Thr Phe Lys Pro Gly Ile Asp Glu Ala

35 40 45

Lys Ile Gln Glu His Thr Thr Trp Ala Thr Asn Ile His Gln Arg Ser

50 55 60

Leu Glu Arg Arg Gly Ala Thr Gly Gly Asp Leu Pro Val Gly Ile Glu

65 70 75 80

Arg Asn Tyr Lys Ile Asn Lys Phe Ala Ala Tyr Ala Gly Ser Phe Asp

85 90 95

Asp Ala Thr Ile Glu Glu Ile Arg Lys Asn Glu Asp Val Ala Tyr Val

100 105 110

Glu Glu Asp Gln Ile Tyr Tyr Leu Asp Gly Leu Thr Thr Gln Lys Ser

115 120 125

Ala Pro Trp Gly Leu Gly Ser Ile Ser His Lys Gly Gln Gln Ser Thr

130 135 140

Asp Tyr Ile Tyr Asp Thr Ser Ala Gly Glu Gly Thr Tyr Ala Tyr Val

145 150 155 160

Val Asp Ser Gly Val Asn Val Asp His Glu Glu Phe Glu Gly Arg Ala

165 170 175

Ser Lys Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly Gln His Val Asp Ser Ile Gly

180 185 190

His Gly Thr His Val Ser Gly Thr Ile Ala Gly Lys Thr Tyr Gly Ile

195 200 205

Ala Lys Lys Ala Ser Ile Leu Ser Val Lys Val Phe Gln Gly Glu Ser

210 215 220

Ser Ser Thr Ser Val Ile Leu Asp Gly Phe Asn Trp Ala Ala Asn Asp

225 230 235 240

Ile Val Ser Lys Lys Arg Thr Ser Lys Ala Ala Ile Asn Met Ser Leu

245 250 255

Gly Gly Gly Tyr Ser Lys Ala Phe Asn Asp Ala Val Glu Asn Ala Phe

260 265 270

Glu Gln Gly Val Leu Ser Val Val Ala Ala Gly Asn Glu Asn Ser Asp

275 280 285

Ala Gly Gln Thr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Asp Ala Ile Thr Val Ala

290 295 300

Ala Ile Gln Lys Ser Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Asn Phe Gly Lys

305 310 315 320

Val Val Asp Val Phe Ala Pro Gly Gln Asp Ile Leu Ser Ala Trp Ile

325 330 335

Gly Ser Ser Ser Ala Thr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr

340 345 350

Pro His Ile Val Gly Leu Ser Leu Tyr Leu Ala Ala Leu Glu Asn Leu

355 360 365

Asp Gly Pro Ala Ala Val Thr Lys Arg Ile Lys Glu Leu Ala Thr Lys

370 375 380

Asp Val Val Lys Asp Val Lys Gly Ser Pro Asn Leu Leu Ala Tyr Asn

385 390 395 400

Gly Asn Ala

<210>31

<211>634

<212>PRT

<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400>31

Met Arg Gly Leu Leu Leu Ala Gly Ala Leu Gly Leu Pro Leu Ala Val

1 5 10 15

LeuAla His Pro Thr His His Ala His Gly Leu Gln Arg Arg Thr Val

20 25 30

Asp Leu Asn Ser Phe Arg Leu His Gln Ala Ala Lys Tyr Ile Asn Ala

35 40 45

Thr Glu Ser Ser Ser Asp Val Ser Ser Ser Phe Ser Pro Phe Thr Glu

50 55 60

Gln Ser Tyr Val Glu Thr Ala Thr Gln Leu Val Lys Asn Ile Leu Pro

65 70 75 80

Asp Ala Thr Phe Arg Val Val Lys Asp His Tyr Ile Gly Ser Asn Gly

85 90 95

Val Ala His Val Asn Phe Arg Gln Thr Val His Gly Leu Asp Ile Asp

100 105 110

Asn Ala Asp Phe Asn Val Asn Val Gly Lys Asn Gly Lys Ile Phe Ser

115 120 125

Tyr Gly His Ser Phe Tyr Thr Gly Lys Ile Pro Asp Ala Asn Pro Leu

130 135 140

Thr Lys Arg Asp Tyr Thr Asp Pro Val Ala Ala Leu Arg Gly Thr Asn

145 150 155 160

Glu Ala Leu Gln Leu Ser Ile Thr Leu Asp Gln Val Ser Thr Glu Ala

165 170 175

Thr Glu Asp Lys Glu Ser Phe Asn Phe Lys Gly Val Ser Gly Thr Val

180 185 190

Ser Asp Pro Lys Ala Gln Leu Val Tyr Leu Val Lys Glu Asp Gly Ser

195 200 205

Leu Ala Leu Thr Trp Lys Val Glu Thr Asp Ile Asp Ser Asn Trp Leu

210 215 220

Leu Thr Tyr Ile Asp Ala Asn Thr Gly Lys Asp Val His Gly Val Val

225 230 235 240

Asp Tyr Val Ala Glu Ala Asp Tyr Gln Val Tyr Ala Trp Gly Ile Asn

245 250 255

Asp Pro Thr Glu Gly Pro Arg Thr Val Ile Ser Asp Pro Trp Asp Ser

260 265 270

Ser Ala Ser Ala Phe Thr Trp Ile Ser Asp Gly Glu Asn Asn Tyr Thr

275 280 285

Thr Thr Arg Gly Asn Asn Gly Ile Ala Gln Ser Asn Pro Thr Gly Gly

290 295 300

Ser Gln Tyr Leu Lys Asn Tyr Arg Pro Asp Ser Pro Asp Leu Lys Phe

305 310 315 320

Gln Tyr Pro Tyr Ser Leu Asn Ala Thr Pro Pro Glu Ser Tyr Ile Asp

325 330 335

Ala Ser Ile Thr Gln Leu Phe Tyr Thr Ala Asn Thr Tyr His Asp Leu

340 345 350

Leu Tyr Thr Leu Gly Phe Asn Glu Glu Ala Gly Asn Phe Gln Tyr Asp

355 360 365

Asn Asn Gly Lys Gly Gly Ala Gly Asn Asp Tyr Val Ile Leu Asn Ala

370 375 380

Gln Asp Gly Ser Gly Thr Asn Asn Ala Asn Phe Ala Thr Pro Pro Asp

385 390 395 400

Gly Gln Pro Gly Arg Met Arg Met Tyr Ile Trp Thr Glu Ser Gln Pro

405 410 415

Tyr Arg Asp Gly Ser Phe Glu Ala Gly Ile Val Ile His Glu Tyr Thr

420 425 430

His Gly Leu Ser Asn Arg Leu Thr Gly Gly Pro Ala Asn Ser Arg Cys

435 440 445

Leu Asn Ala Leu Glu Ser Gly Gly Met Gly Glu Gly Trp Gly Asp Phe

450 455 460

Met Ala Thr Ala Ile Arg Leu Lys Ala Gly Asp Thr His Ser Thr Asp

465 470 475 480

Tyr Thr Met Gly Glu Trp Ala Ala Asn Lys Lys Gly Gly Ile Arg Ala

485 490 495

Tyr Pro Phe Ser Thr Ser Leu Glu Thr Asn Pro Leu Thr Tyr Thr Ser

500 505 510

Leu Asn Glu Leu Asp Glu Val His Ala Ile Gly Ala Val Trp Ala Asn

515 520 525

Val Leu Tyr Glu Leu Leu Trp Asn Leu Ile Asp Lys His Gly Lys Asn

530 535 540

Asp Gly Pro Lys Pro Glu Phe Lys Asp Gly Val Pro Thr Asp Gly Lys

545 550 555 560

Tyr Leu Ala Met Lys Leu Val Ile Asp Gly Ile Ala Leu Gln Pro Cys

565 570 575

Asn Pro Asn Cys Val Gln Ala Arg Asp Ala Ile Leu Asp Ala Asp Lys

580 585 590

Ala Leu Thr Asp Gly Ala Asn Lys Cys Glu Ile Trp Lys Ala Phe Ala

595 600 605

Lys Arg Gly Leu Gly Glu Gly Ala Glu Tyr His Ala Ser Arg Arg Val

610 615 620

Gly Ser Asp Lys Val Pro Ser Asp Ala Cys

625 630

<210>32

<211>495

<212>PRT

<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400>32

Met Arg Gly Ile Leu Gly Leu Ser Leu Leu Pro Leu Leu Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ser Pro Val Ala Val Asp Ser Ile His Asn Gly Ala Ala Pro Ile Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Asn Ala Lys Glu Val Pro Asp Ser Tyr Ile Val Val Phe

35 40 45

Lys Lys His Val Ser Ala Glu Thr Ala Ala Ala His His Thr Trp Val

50 55 60

Gln Asp Ile His Asp Ser Met Thr Gly Arg Ile Asp Leu Lys Lys Arg

65 70 75 80

Ser Leu Phe Gly Phe Ser Asp Asp Leu Tyr Leu Gly Leu Lys Asn Thr

85 90 95

Phe Asp Ile Ala Gly Ser Leu Ala Gly Tyr Ser Gly His Phe His Glu

100 105 110

Asp Val Ile Glu Gln Val Arg Arg His Pro Asp Val Glu Tyr Ile Glu

115 120 125

Lys Asp Thr Glu Val His Thr Met Glu Glu Thr Thr Glu Lys Asn Ala

130 135 140

Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser His Arg Asp Ser Leu Ser Phe Gly

145 150 155 160

Thr Phe Asn Lys Tyr Leu Tyr Ala Ser Glu Gly Gly Glu Gly Val Asp

165 170 175

Ala Tyr Thr Ile Asp Thr Gly Ile Asn Ile Glu His Val Asp Phe Glu

180 185 190

Asp Arg Ala His Trp Gly Lys Thr Ile Pro Ser Asn Asp Glu Asp Ala

195 200 205

Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ser Gly Thr Ile Ala Gly Lys

210 215 220

Lys Tyr Gly Val Ala Lys Lys Ala Asn Ile Tyr Ala Val Lys Val Leu

225 230 235 240

Arg Ser Ser Gly Ser Gly Thr Met Ser Asp Val Val Leu Gly Val Glu

245 250 255

Trp Ala Val Gln Ser His Leu Lys Lys Ala Lys Asp Ala Lys Asp Ala

260 265 270

Lys Val Lys Gly Phe Lys Gly Ser Val Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly

275 280 285

Ala Lys Ser Arg Thr Leu Glu Ala Ala Val Asn Ala Gly Val Glu Ala

290 295 300

Gly Leu His Phe Ala Val Ala Ala Gly Asn Asp Asn Ala Asp Ala Cys

305 310 315 320

Asn Tyr Ser Pro Ala Ala Ala Glu Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Ser

325 330 335

Thr Leu Gln Asp Glu Arg Ala Tyr Phe Ser Asn Tyr Gly Lys Cys Thr

340 345 350

Asp Ile Phe Ala Pro Gly Pro Asn Ile Leu Ser Thr Trp Thr Gly Ser

355 360 365

Lys His Ala Val Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His

370 375 380

Ile Ala Gly Leu Leu Ala Tyr Phe Val Ser Leu Gln Pro Ala Gln Asp

385 390 395 400

Ser Ala Phe Ala Val Asp Glu Leu Thr Pro Ala Lys Leu Lys Lys Asp

405 410 415

Ile Ile Ser Ile Ala Thr Gln Gly Ala Leu Thr Asp Ile Pro Ser Asp

420 425 430

Thr Pro Asn Leu Leu Ala Trp Asn Gly Gly Gly Ala Asp Asn Tyr Thr

435 440 445

Gln Ile Val Ala Lys Gly Gly Tyr Lys Ala Gly Ser Asp Asn Leu Lys

450 455 460

Asp Arg Phe Asp Gly Leu Val Asn Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Glu

465 470 475 480

Glu Leu Gly Ala Ile Tyr Ser Glu Ile Gln Gly Ala Val Val Ala

485 490 495

<210>33

<211>836

<212>PRT

<213>米曲霉(Aspergillus oryzae)

<400>33

Met Arg Leu Ser Glu Ser Ala Thr Val Ala Phe Gly Leu Phe Cys Ala

1 5 10 15

Ala Thr Ala Ser Ala His Pro Arg Arg Ser Tyr Glu Thr Arg Asp Phe

20 25 30

Phe Ala Leu His Leu Asp Asp Ser Thr Ser Pro Asp Glu Ile Ala Gln

35 40 45

Arg Leu Gly Ala Arg His Glu Gly Gln Val Gly Glu Leu Thr Gln His

50 55 60

His Thr Phe Ser Ile Pro Lys Glu Asn Gly Ala Asp Leu Asp Ala Leu

65 70 75 80

Leu Glu His Ala Arg Ile Arg Lys Arg Ser Ser Arg Ala Glu Gly Arg

85 90 95

Gly Met Thr Leu Asp Lys Glu Arg Asp Leu Ser Gly Ile Leu Trp Ser

100 105 110

Gln Lys Leu Ala Pro Lys Gln Arg Leu Val Lys Arg Ala Pro Pro Thr

115 120 125

Asn Val Ala Ser Arg Gly Ser Val Lys Glu Glu Asp Pro Val Ala Ala

130 135 140

Gln Ala Gln Lys Arg Ile Ala Ser Ser Leu Gly Ile Thr Asp Pro Ile

145 150 155 160

Phe Gly Gly Gln Trp His Leu Tyr Asn Thr Val Gln Val Gly His Asp

165 170 175

Leu Asn Val Ser Asp Val Trp Leu Glu Gly Ile Thr Gly Lys Gly Val

180 185 190

Ile Thr Ala Val Val Asp Asp Gly Leu Asp Met Tyr Ser Asn Asp Leu

195 200 205

Lys Pro Asn Tyr Phe Ala Glu Gly Ser Tyr Asp Phe Asn Asp His Val

210 215 220

Pro Glu Pro Arg Pro Arg Leu Gly Asp Asp Arg His Gly Thr Arg Cys

225 230 235 240

Ala Gly Glu Ile Gly Ala Ala Arg Asn Asp Val Cys Gly Val Gly Val

245 250 255

Ala Tyr Asp Ser Gln Val Ala Gly Ile Arg Ile Leu Ser Ala Pro Ile

260 265 270

Asp Asp Ala Asp Glu Ala Ala Ala Ile Asn Tyr Gly Phe Gln Arg Asn

275 280 285

Asp Ile Tyr Ser Cys Ser Trp Gly Pro Pro Asp Asp Gly Ala Thr Met

290 295 300

Glu Ala Pro Gly Ile Leu Ile Lys Arg Ala Met Val Asn Gly Ile Gln

305 310 315 320

Asn Gly Arg Gly Gly Lys Gly Ser Ile Phe Val Phe Ala Ala Gly Asn

325 330 335

Gly Ala Gly Tyr Asp Asp Asn Cys Asn Phe Asp Gly Tyr Thr Asn Ser

340 345 350

Ile Tyr Ser Ile Thr Val Gly Ala Ile Asp Arg Glu Gly Lys His Pro

355 360 365

Ser Tyr Ser Glu Ser Cys Ser Ala Gln Leu Val Val Ala Tyr Ser Ser

370 375 380

Gly Ser Ser Asp Ala Ile His Thr Thr Asp Val Gly Thr Asp Lys Cys

385 390 395 400

Tyr Ser Leu His Gly Gly Thr Ser Ala Ala Gly Pro Leu Ala Ala Gly

405 410 415

Thr Ile Ala Leu Ala Leu Ser Ala Arg Pro Glu Leu Thr Trp Arg Asp

420 425 430

Ala Gln Tyr Leu Met Ile Glu Thr Ala Val Pro Val His Glu Asp Asp

435 440 445

Gly Ser Trp Gln Thr Thr Lys Met Gly Lys Lys Phe Ser His Asp Trp

450 455 460

Gly Phe Gly Lys Val Asp Ala Tyr Ser Leu Val Gln Leu Ala Lys Thr

465 470 475 480

Trp Glu Leu Val Lys Pro Gln Ala Trp Phe His Ser Pro Trp Leu Arg

485 490 495

Val Lys His Glu Ile Pro Gln Gly Asp Gln Gly Leu Ala Ser Ser Tyr

500 505 510

Glu Ile Thr Lys Asp Met Met Tyr Gln Ala Asn Ile Glu Lys Leu Glu

515 520 525

His Val Thr Val Thr Met Asn Val Asn His Thr Arg Arg Gly Asp Ile

530 535 540

Ser Val Glu Leu Arg Ser Pro Glu Gly Ile Val Ser His Leu Ser Thr

545 550 555 560

Ala Arg Arg Ser Asp Asn Ala Lys Ala Gly Tyr Glu Asp Trp Thr Phe

565 570 575

Met Thr Val Ala His Trp Gly Glu Ser Gly Val Gly Lys Trp Thr Val

580 585 590

Ile Val Lys Asp Thr Asn Val Asn Asp His Val Gly Glu Phe Ile Asp

595 600 605

Trp Arg Leu Asn Leu Trp Gly Leu Ser Ile Asp Gly Ser Ser Gln Pro

610 615 620

Leu His Pro Met Pro Asp Glu His Asp Asp Asp His Ser Ile Glu Asp

625 630 635 640

Ala Ile Val Val Thr Thr Ser Val Asp Pro Leu Pro Thr Lys Thr Glu

645 650 655

Ala Pro Pro Val Pro Thr Asp Pro Val Asp Arg Pro Val Asn Ala Lys

660 665 670

Pro Ser Ala Gln Pro Thr Thr Pro Ser Glu Ala Pro Ala Gln Glu Thr

675 680 685

Ser Glu Ala Pro Thr Pro Thr Lys Pro Ser Ser Thr Glu Ser Pro Ser

690 695 700

Thr Thr Thr Ser Ala Asp Ser Phe Leu Pro Ser Phe Phe Pro Thr Phe

705 710 715 720

Gly Ala Ser Lys Arg Thr Gln Ala Trp Ile Tyr Ala Ala Ile Ser Ser

725 730 735

Ile Ile Val Phe Cys Ile Gly Leu Gly Val Tyr Phe His Val Gln Arg

740 745 750

Arg Lys Arg Leu Arg Asn Asp Pro Arg Asp Asp Tyr Asp Phe Glu Met

755 760 765

Ile Glu Asp Glu Asp Glu Thr Gln Ala Met Asn Gly Arg Ser Gly Arg

770 775 780

Thr Gln Arg Arg Gly Gly Glu Leu Tyr Asn Ala Phe Ala Gly Glu Ser

785 790 795 800

Asp Glu Glu Pro Leu Phe Ser Asp Asp Glu Asp Glu Pro Tyr Arg Asp

805 810 815

His Ala Leu Ser Glu Asp Arg Glu Arg Arg Gly Ser Thr Ser Gly Asp

820 825 830

His Ala Arg Ser

835

<210>34

<211>12

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>比对序列说明(alignment sequence illustration)

<400>34

Ala Cys Met Ser His Thr Trp Gly Glu Arg Asn Leu

1 5 10

<210>35

<211>14

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>比对序列说明

<400>35

His Gly Trp Gly Glu Asp Ala Asn Leu Ala Met Asn Pro Ser

1 5 10

Claims

1.丝状真菌细胞，其中内源碱性蛋白酶活性、内源中性金属蛋白酶活性和枯草杆菌蛋白酶类的内源丝氨酸蛋白酶活性全部或部分失活，其中所述的碱性蛋白酶、中性金属蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶由选自下组的核苷酸序列编码：

(a)编码碱性蛋白酶的核苷酸序列，所述碱性蛋白酶具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：30的氨基酸具有至少65％同一性；编码中性金属蛋白酶的核苷酸序列，所述中性金属蛋白酶与SEQ ID NO：31的氨基酸具有至少65％同一性，和编码枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列，所述枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：32的氨基酸具有至少65％同一性；或

(c)核苷酸序列，其在至少中等严紧条件下与核苷酸序列SEQ ID NO：26、27或28中的任一个杂交。

2.根据权利要求1的丝状真菌细胞，其中碱性蛋白酶活性由alp基因编码，中性金属蛋白酶活性由npl基因编码，枯草杆菌蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶活性由pepC基因编码。

3.根据权利要求1或2的丝状真菌细胞，其中kexin亚族的内源的钙依赖性中性丝氨酸蛋白酶活性全部或部分失活，其中所述钙依赖性中性丝氨酸蛋白酶由选自下组的核苷酸序列编码：

(a)编码kexin亚族的钙依赖中性丝氨酸蛋白酶活性的核苷酸序列，其与SEQ ID NO：33的氨基酸具有至少65％同一性；或

(b)与SEQ ID NO：29具有至少65％同一性的核苷酸序列；或

(c)核苷酸序列，其在至少中等严紧条件下与核酸序列SEQ ID NO：29杂交。

4.根据权利要求3的丝状真菌细胞，其具有表型alp^-、npl^-、pepC^-和kexB^-，其中alp基因由与SEQ ID NO：26有至少70％同一性的核苷酸序列编码；npl基因由与SEQ ID NO：27有至少70％同一性的核苷酸序列编码；pepC基因由与SEQ ID NO：28有至少70％同一性的核苷酸序列编码；而kexB基因由与SEQ ID NO：29有至少70％同一性的核苷酸序列编码。

5.根据前述权利要求中任一项的丝状真菌细胞，其中真菌细胞选自下组：曲霉属、枝顶孢霉属、镰孢属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌属、青霉属、梭孢壳属、弯颈霉属和木霉属。

6.根据权利要求5的丝状真菌细胞，其中曲霉属包括泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、棘孢曲霉、黑曲霉、构巢曲霉或米曲霉。

7.在根据权利要求1-6中任一项的丝状真菌宿主细胞中产生异源多肽的方法，其包括

(a)将编码异源多肽的核酸序列引入宿主细胞；

(b)在有益于表达所述异源多肽的条件下，在合适的生长培养基中培养来自(a)的细胞；和

(c)分离蛋白质产物。

8.根据权利要求7的方法，其中所述异源多肽是哺乳动物多肽。

9.根据权利要求8的方法，其中所述多肽是抗体或抗体片段。

10.根据权利要求9的方法，其中抗体或抗体片段选自下组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE、F(ab’)₂和Fab。

11.根据权利要求10的方法，其中抗体是IgG1。